Методическая статья

Генерация индуцированных плюрипотентными стволовыми клетками плоских органоидов кожи, несущих волосы, с использованием системы культивирования границы раздела воздух-жидкость

3.8K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69088

⸱

17 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Anatomy and Embryology, Leiden University Medical Center, 2The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center, 3CEA, Inserm, IRIG, UA13 BGE, Biomics, University of Grenoble Alpes

В этой статье

Краткое содержание

В этом протоколе описан метод производства органоидов кожи, содержащих волосяные фолликулы, из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека с использованием плоской, физиологически значимой системы культивирования воздушно-жидкостного интерфейса для репликации архитектуры и функции кожи.

Аннотация

Индуцированные плюрипотентными стволовыми клетками человека (СО) кожные органоиды (СО), содержащие волосяные фолликулы, обеспечивают сложную модель in vitro для исследования межклеточных взаимодействий в микроокружении кожи. Первоначально разработанные в инвертированной кистозной конфигурации, где дерма подвергается воздействию окружающей среды, а эпидермис обращен внутрь к органоидному центру, SOs впоследствии могут быть перенесены в плоскую конфигурацию в системе культивирования воздушно-жидкостного интерфейса (ALI), которая больше напоминает физиологию кожи человека. В данной рукописи представлен всеобъемлющий протокол генерации и отбора кистозных СО, которые могут быть расчленены на планарные СО и далее развиты в системе культивирования ОЛИ. Протокол включает в себя определенные контрольные точки для макроскопической качественной оценки на критических стадиях развития органоидов, подробно описывает технические шаги, необходимые для уплощения кистозных СО в плоскую кожу, определяет оптимальные условия для культивирования ALI и демонстрирует результаты с помощью молекулярного анализа. На 27-й день иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью линейно-специфических маркеров выявило плуристратифицированный пигментный эпителий с придатками кожи, включая волосяные фолликулы и структуры, похожие на сальные железы. Этот протокол обеспечивает надежный метод генерации планарных SOs с придатками, предлагая физиологически значимую модель in vitro. Эта система поддерживает различные приложения в исследованиях кожи и уже успешно используется для моделирования патогенной инфекции, повреждения тканей, вызванного ультрафиолетовым излучением, и реакции на лекарства.

Введение

Кожа образует важнейший защитный барьер между организмами и окружающей средой, а также регулирует температуру тела, водный баланс и сенсорную информацию. Он состоит из трех основных слоев: эпидермиса, многослойного эпителия кератиноцитов с ороговевшей поверхностью; дерма, соединительная ткань, богатая внеклеточным матриксом, фибробластами, нервами, кровеносными сосудами и иммунными клетками; и гиподерма, которая в первую очередь состоит из подкожных адипоцитов. Функция кожи человека также зависит от специализированных придатков, таких как волосяные фолликулы (HF), сальные железы и потовые железы1.

Кожные заболевания являются одними из наиболее распространенных заболеваний во всем мире 2,3. Исторически сложилось так, что большинство исследований, ориентированных на кожу, проводились с использованием животных моделей4, которые воспроизводят физиологическую сложность органа в системном контексте. Тем неменее, значительные межвидовые различия4, наряду с растущими этическими проблемами, привели к разработке физиологически значимых моделей кожи человека.

Обычные модели человеческой кожи делятся на две категории: реконструированный эпидермис человека, который состоит из стратифицированных кератиноцитов, и реконструированная кожа человека, которая дополнительно включает в себя нижележащий дермальный компартмент, состоящий из фибробластов, встроенных в коллагеновую матрицу. Несмотря на то, что оба типа моделей значительно продвинули наше понимание физиологии кожи, им не хватает полной архитектурной точности и клеточного разнообразия родной человеческой кожи. Основным ограничением этих моделей является отсутствие кожных придатков, таких как HF, что делает их непригодными для исследований и тестирования лекарств, связанных с кожными заболеваниями, связанными с ростоми регенерацией волос. Несмотря на то, что сообщалось о более совершенных системах, включающих ВЧ, они либо не в состоянии полностью воспроизвести сложность структуры ВЧ и микроокружения, либо полагаются на сложные технологии, такие как биопечать или микроформование.

Новой моделью кожи, которая решает некоторые из этих проблем, является органоид кожи (СО), полученный из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК)11. Имитируя эмбриональное развитие, ИПСК могут быть направлены на эктодерму поверхности черепа и линии нервных гребней черепа, самоорганизуясь в кистозные структуры, которые очень напоминают человеческую кожу. Эти СО содержат почти все типы неиммунных клеток кожи, организованные в стратифицированный эпидермис и дерму, богатую внеклеточным матриксом. Важно отметить, что СО поддерживают развитие придатков кожи: СН и сальных желез. Учитывая практически неограниченную масштабируемость гиперПСК, СО позволяют проводить сложную генную инженерию и разрабатывать новые функциональные инструменты. Таким образом, SOs представляют собой значительный шаг вперед в этой области и перспективны для применения в биологии развития, моделировании заболеваний, тестировании лекарств и регенеративной медицине.

Тем не менее, остается значительное ограничение: СО образуют перевернутые кистозные структуры, в которых эпидермис расположен внутри дермальной кисты, защищен от механических сил и погружен в водную среду. Такая конфигурация не только физиологически неточна, но и исключает создание воздушно-жидкостной границы раздела (ALI). В результате, кистозные СО имеют ограниченное применение для исследований, связанных с эпидермальным барьером, механическими силами или прямым апикальным лечением. Для решения этой проблемы ниже представлен воспроизводимый метод механического сплющивания кистозных СО и последующего культивирования их в виде плоской кожи в условиях ОПЛ. Этот подход, первоначально описанный Jung et al., реорганизует архитектуру ткани таким образом, что апикальный эпидермис подвергается воздействию воздуха, тем самым способствуя дальнейшему стратификации ибарьерной функции. Полученные плоские органоиды с волосяным покровом сохраняют сложную архитектуру кожи человека, а также отражают физиологически точную ориентацию тканей, обеспечивая экспериментальный доступ к апикальной поверхности. Несмотря на то, что процедура является длительной (~100 дней) и включает в себя некоторые технически сложные этапы, особенно при рассечении кистозных СО на плоские, она может представлять особый интерес для исследователей, уже работающих с СО или другими эквивалентами человеческой кожи, которые хотят повысить физиологическую значимость своих модельных систем.

Протокол

На рисунке 1 представлен рабочий процесс создания планарных SOs с использованием системы ALI culture. В первом разделе описывается генерация кистозных СО из ИПСК на основе методологии, впервые предложенной Карлом Р. Келером11, с незначительными изменениями (Рисунок 2). Во втором разделе подробно описана процедура дальнейшего развития кистозных SOs в планарные SOs с использованием системы культивирования ALI, как описано ранее12, с модификациями (рис. 3). Все химикаты и материалы перечислены в таблице материалов. Три ранее описанные линии hiPSC (LUMCi001-A, LUMCi004-A и WT2) были использованы для генерации SOs (https://hpscreg.eu/)13.

1. Генерация кистозных СО

На рисунке 2 представлена ожидаемая и аберрантная морфология на ключевых этапах.

  1. Агрегация клеток (День -2)
    1. Культивируйте ИПСК в стандартном 6-луночном планшете до тех пор, пока они не достигнут 70-80% конфлюенции.
    2. Промойте клетки 1 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS). Добавьте 1 мл реагента для диссоциации клеток (CDR) и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2 в течение ~6 минут, чтобы разрыхлить иПСК без их отделения от матрицы (избегайте переваривания).
    3. Аспирируйте CDR и добавьте 1 мл поддерживающей среды hiPSC (hiMM), содержащей 10 μМ ингибитор ROCK. Аккуратно отделите клетки пипетированием вверх и вниз с помощью пипетки P1000 и приготовьте клеточную суспензию в концентрации 3,5 × 103 клеток/мл.
    4. Диспонируйте 100 мкл клеточной суспензии в каждую лунку 96-луночного U-образного дна планшета со сверхнизким уровнем прикрепления с помощью многоканальной пипетки. Центрифугируйте планшет при 110 × г в течение 6 минут при комнатной температуре и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2.
  2. Разведение ингибитора ROCK (День -1)
    1. Приготовьте hiMM, содержащий 100 мкг/мл антибиотико-антимикотической добавки (ААС).
    2. Дозируйте 100 мкл на лунку и инкубируйте при 37 °C с 5%CO2.
  3. Индукция поверхностной эктодермы (день 0)
    1. Разморозьте соответствующий объем матрицы базальной мембраны на льду, прежде чем переходить к следующему этапу. На льду готовят минимальную среду hiPSC (hiMinM) с добавлением матрицы базальной мембраны (2%), BMP4 (2,5 нг/мл), SB431542 (10 мкМ) и bFGF (4 нг/мл) (далее как hiMinM+SFB).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию BMP4 может потребоваться корректировка в зависимости от используемой клеточной линии (см. обсуждение).
    2. Соберите клеточные агрегаты в пробирку с круглым дном объемом 2 мл с помощью наконечника для пипетки P200 с широким отверстием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте имеющиеся в продаже наконечники с широкими отверстиями. Выбирайте отверстие с внутренним диаметром не менее 2 мм, чтобы свести к минимуму повреждение агрегатов. В качестве альтернативы можно нагреть скальпель с помощью инфракрасного петлевого стерилизатора и использовать его для создания широкого отверстия из обычного наконечника пипетки.
    3. Дайте заполнителям осесть на дне трубки. Тщательно отсадите среду и добавьте 2 мл hiMinM для промывки агрегатов. Повторите стирку в общей сложности 3 раза.
    4. Перенесите агрегаты клеток в холодном режиме hiMinM+SFB в лунку предварительно охлажденного 6-луночного планшета с помощью наконечника для пипетки P1000 с широким отверстием. Затем перенесите каждый агрегат в 100 мкл hiMinM+SFB на 96-луночный U-образный планшет со сверхнизким креплением с помощью наконечника для дозатора P200 с широким отверстием. Поместите планшет обратно в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага используйте стереомикроскоп, помещенный под колпак с ламинарным потоком воздуха (LAF).
  4. Индукция популяций неэпителиальных клеток (день 3)
    1. Приготовьте hiMinM, содержащий LDN193189 (1 мкМ), bFGF (250 нг/мл) и AAS (100 мкг/мл). Дозируйте по 25 мкл в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки.
    2. Аккуратно перемешивайте пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение среды. Поместите планшет обратно в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2.
  5. Снабжение питательными веществами (День 6)
    1. Приготовьте hiMinM, содержащий ААС (100 мкг/мл). Дозируйте по 75 мкл в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки.
    2. Аккуратно перемешивайте пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение среды. Поместите планшет обратно в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2.
  6. Среднее освежение (День 8 и День 10)
    1. Приготовьте hiMinM, содержащий ААС (100 мкг/мл). Осторожно удалите 100 мкл среды из каждой лунки с помощью многоканальной пипетки. Дозируйте по 100 мкл свежей среды в каждую лунку с помощью многоканальной пипетки.
    2. Аккуратно перемешивайте пластину, чтобы обеспечить равномерное распределение среды. Поместите планшет обратно в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2.
  7. Переход на 24-луночные планшеты с низким креплением (день 12)
    1. Разморозьте соответствующий объем матрицы базальной мембраны на льду, прежде чем переходить к следующему этапу. Приготовьте среду для созревания органоидов (ОММ) с использованием усовершенствованной среды (49% v/v), нейронной базальной среды (49% v/v), добавки глютамина (1x), добавки B-27 за вычетом витамина A (0,5x), добавки N2 (0,5x), 2-меркаптоэтанола (0,1 мкм) и AAS (100 мкг/мл). Приготовьте соответствующий объем холодного ОММ, содержащего 1% матрицы базальной мембраны (ОММ1%М) и держите на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте средства индивидуальной защиты и работайте в хорошо проветриваемом помещении при работе с 2-меркаптоэтанолом.
    2. Соберите клеточные агрегаты в пробирку с круглым дном объемом 2 мл с помощью наконечника для дозатора P1000 с широким отверстием.
    3. Дайте заполнителям осесть на дне трубки. Осторожно аспирируйте среду. Добавьте 1,5 мл среды Advanced для промывки заполнителей. Повторите стирку в общей сложности 3 раза.
    4. Перенесите агрегаты клеток в холодном состоянии OMM1%M в лунку предварительно охлажденного 6-луночного планшета с помощью наконечника для пипетки P1000 с широким отверстием. Затем перенесите каждый заполнитель в 500 мкл OMM1%M на 24-луночный планшет с низким уровнем прикрепления с помощью наконечника для дозатора P1000 с широким отверстием. Поместите планшет обратно в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага используйте стереомикроскоп, помещенный под бленду LAF.
  8. Среднее освежение (День 15)
    1. Разморозьте соответствующий объем матрицы базальной мембраны на льду, прежде чем переходить к следующему этапу. Приготовьте соответствующий объем холодного ОММ1%М. Держите на льду.
    2. С помощью наконечников P1000 осторожно удалите 250 мкл среды из каждой лунки. Затем добавьте 250 μL OMM1%M в каждую лунку. Поместите планшет обратно в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 на орбитальный вибростенд, установленный на 65 оборотов в минуту.
  9. В период с 18-го по 45-й день выполняйте половинную среднюю смену (250 мкл) с ОММ по понедельникам, средам и пятницам.
  10. Между 45-м и 90-м днями выполняйте половинную среднюю смену (250 μл) с OMM по понедельникам и средам и полную среднюю смену по пятницам.

2. Переход от кистозных СО к планарным СО

ПРИМЕЧАНИЕ: Кистозные СО демонстрируют инвертированную морфологию, при этом эпидермис обращен внутрь к центру органоида, а дерма контактирует с внешней средой. Между 70-м и 90-м днями, в зависимости от клеточной линии и эффективности дифференцировки, ранняя супрабазальная дифференцировка эпидермиса хорошо прогрессирует, и развиваются волосяные колышки. Это стадия, на которой кистозные SOs переходят в культуральную систему ALI для получения ткани, которая больше похожа на естественную кожу человека.

  1. Отбор кистозных СО между 70-м и 90-м сутками для перехода на планарные СО
    1. Подбирают кистозные СО диаметром не менее 5 мм и минимальным содержанием побочных продуктов (мезенхимальных клеток, которые накапливаются на одном полюсе кисты и также могут содержать хрящ). Используйте наличие плакодов волос в качестве качественного индикатора развития органоидов кожи (Рисунок 1А и Рисунок 2В).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расплющите 2-4 плоских СО из каждого кистозного СО, в зависимости от их размера.
  2. Приготовление вкладыша, покрытого коллагеном (формат 12 лунок)
    1. Приготовьте раствор NaOH (1 М), растворив соответствующее количество гранул NaOH в дистиллированной воде. Стерилизуйте раствор NaOH с помощью мембранного фильтра размером 0,2 мкм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте средства индивидуальной защиты и работайте в хорошо проветриваемом помещении при работе с раствором NaOH (1 М).
    2. На льду разбавьте раствор коллагена типа I до конечной концентрации 2 мг/мл, используя 10x PBS (до конечной концентрации 1x), NaOH (5 мМ) и дистиллированную воду, чтобы отрегулировать конечный объем. Распределите по 150 мкл раствора коллагена в каждую вставку, помещенную в стандартный 12-луночный планшет. Инкубируйте планшет при температуре 37 °C в течение 30 минут, чтобы коллагеновый гель смог полимеризоваться.
  3. Уплощение кистозного СО (Рисунок 3)
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого шага используйте стереомикроскоп, помещенный под бленду LAF.
    1. Поместите выбранный кистозный СО с небольшим количеством среды на крышку чашки Петри диаметром 10 см с помощью пипетки P1000 с широким отверстием. Тщательно вырежьте побочные продукты СО с помощью стерильного скальпеля. Используйте стерильные щипцы с противоположной стороны, чтобы стабилизировать органоид во время иссечения (рисунок 3А).
      Примечание: На этой стадии кистозная СО напоминает спущенный воздушный шар с двумя слоями кожи, расположенными один над другим.
    2. Отрежьте примерно 1 мм от концов органоида, прилегающих к первому разрезу, с помощью скальпеля (рис. 3B, F). Аккуратно разверните верхний слой кожи с помощью стерильных щипцов (рис. 3C,G).
    3. Разрежьте кусочек ткани на 2-4 части в зависимости от размера. Аккуратно перенесите каждый кусочек ткани и поместите его во вставку с коллагеновым покрытием эпидермисом вверх с помощью стерильных щипцов (рис. 3D,H).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оцените колышки под стереомикроскопом, чтобы убедиться в правильной ориентации эпидермиса.
    4. Перенесите вкладыш обратно в стандартный 12-луночный планшет, содержащий 600 мкл ОММ. Поместите планшет обратно в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 (рис. 3E).
  4. Долгосрочное поддержание культуры на границе раздела воздух-жидкость
    1. Между днем 1 и днем 21 после выравнивания выполняйте полную замену среды (600 μл) с помощью OMM по понедельникам, средам и пятницам. Поместите планшет обратно в инкубатор при температуре 37 °C с 5%CO2 и относительной влажности 95%.
    2. Между 21-м и 27-м днями после сплющивания поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C и 5%CO2 без влажности для укрепления кожного барьера. Ежедневно выполняйте полную замену среды (800 μл) с помощью ОММ.

Результаты

Подробно описана оптимизация и контрольные точки для генерации кистозных СО14. Таким образом, представленный здесь метод фокусируется на ключевых контрольных точках, которые необходимо оценить во время развития кистозных органоидов (рисунок 2A), выборе тех, которые подходят для перехода в планарные SOs (рисунок 2B), и критериях, используемых для оценки качества полученных планарных SOs (рисунок 1B-D и рисунок 4).

Первым ключевым шагом в развитии кистозных СО является формирование единого, плотного клеточного агрегата, который включает в себя большинство клеток, присутствующих в лунке на 0-й день (рис. 2А). Это достигается за счет осторожного и быстрого обращения с ИПСК в сочетании с эффективным центрифугированием, что приводит к равномерному распределению клеток в центре лунки (Рисунок 2А, День -2). Правильная индукция поверхностной эктодермы приводит к образованию тонкого прозрачного эпителия на самом внешнем слое агрегата к 3-му дню (рис. 2А), который впоследствии, после индукции мезенхимальных клеток, развивается в прозрачные кистозные агрегаты, содержащие темное ядро мезенхимальных клеток к 8-му дню. Между 12 и 20 днем эпителиальная киста покрывается тонким слоем мезенхимальных клеток, которые накапливаются на одном полюсе кисты (рисунок 2А, день 12). Успешная совместная индукция эпителиальных и мезенхимальных клеток в конечном итоге приводит к образованию стратифицированного эпителия, что позволяет формировать волосяные плакоды и колышки, которые становятся видимыми между 50 и 80 днями (рис. 2A, B). Выбирая подходящие СО на основе этих контрольных точек развития, можно свести к минимуму морфологическую и размерную изменчивость во время перехода к планарным СО.

Наличие волосяных плакодов или колышков является основным критерием включения при выборе кистозных СО для дальнейшего развития в планарные СО. Отсутствие видимых плакодов обычно является результатом дефекта эпидермальной стратификации, который в этом случае кажется чрезвычайно тонким (Рисунок 2B, День 50, средняя панель). Для сплющивания используются только крупные цисты (не менее 5 мм в диаметре) с побочными продуктами, сосредоточенными на одном полюсе, и общим минимальным количеством побочных продуктов, в то время как цисты с неполяризованными побочными продуктами исключаются (рис. 2B).

В планарной конфигурации первичная проверка качества СО основывается на макроскопическом мониторинге роста СН под стереомикроскопом. HF постепенно удлиняются в течение 27 дней культивирования ОПЛ, при этом сальные железы становятся видимыми примерно на 14-й день, а пигментация постепенно увеличивается с течением времени (рис. 1B, C). Из-за пространственных ограничений, налагаемых мембраной вставки, расположенной непосредственно под тонким коллагеновым гелем, только HF, расположенные на периферии плоской СО, могут полностью расти, и они делают это в ориентации, параллельной вставке (рис. 1C). Примечательно, что стержень волоса редко выступает за поверхность кожи. Для дальнейшей оценки качества разработанных планарных СО они могут быть помещены в парафин или ОКТ, разрезаны и окрашены для изучения их состава и морфологии. Окрашивание H&E показывает, что их структура очень похожа на структуру человеческой кожи (рис. 4A), с полностью стратифицированным эпителием и дермой, разделенной базальной мембраной. Иммунофлуоресцентное окрашивание с использованием специфических маркеров для различных эпидермальных слоев, сальных желез и меланоцитов еще раз подтверждает архитектуру плоских СО, похожую на кожу человека (Рисунок 1D и Рисунок 4B).

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочий процесс генерации планарных SO, содержащих HF, из hiPSC с использованием системы культивирования ALI. Показано схематическое изображение и репрезентативные изображения ключевых этапов. (А) Генерация кистозных СО, в основном как описано ранее10, до тех пор, пока примерно на 80-й день не сформируются видимые волосяные плакоды/колышки. (B) Кистозные СО надрезаются и сплющиваются стороной эпидермиса вверх на вставке из клеточной культуры, покрытой коллагеном I типа. Культуры ALI выдерживают в течение 21 дня во увлажненных условиях, а затем 6 дней в сухих условиях. (C) Изображение области с большим увеличением, показанное на рисунке (B), иллюстрирующее рост волосяных фолликулов, развитие структуры, подобной сальной железе (стреловидные наконечники), и прогрессирующую пигментацию с течением времени. (D) Конфокальные изображения планарных участков СО на 27-й день после уплощения, помеченных антителами к коллагену IV типа вместе с антителами к красному Нилу, которым отмечены структуры, подобные сальным железам, или антителами против PMEL, которые окрашивают меланоциты. Ядра окрашиваются с помощью DAPI. Масштабные линейки: 200 μм (А); 500 μм (В,С); 50 μм (D). Сокращения: SOs = органоиды кожи; HF = волосяные фолликулы; hiPSCs = индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека; ALI = граница раздела воздух-жидкость; Col IV = коллаген IV типа; PMEL = премеланасомный белок; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Репрезентативные изображения морфологии клеточных агрегатов на ключевых этапах производства SO. (А) Репрезентативные изображения кистозных СО с подходящей (левая панель) и неадекватной (средняя и правая панели) морфологией на разных стадиях. На 2-й день агрегаты ячеек должны демонстрировать равномерное распределение (левая панель), в то время как неправильное обращение с планшетами после центрифугирования может нарушить распределение клеток (правая панель). На 0-й день хорошо сформированные агрегаты выглядят как компактные, плотные клеточные кластеры (левая панель), в то время как низкая жизнеспособность клеток приводит к широко распространенной гибели клеток и потере компактных 3D-структур (правая панель). На 3-е сутки становится виден отчетливый наружный эпителиальный слой (левая панель), его отсутствие может свидетельствовать о необходимости оптимизации концентрации BMP4 (правая панель). На 12-й день мезенхимальные клетки накапливаются на одном полюсе и мигрируют, чтобы окутать эпителиальную кисту (левая панель), в то время как чрезмерная эпителиальная (средняя панель) или мезенхимальная (правая панель) дифференцировка препятствует правильной стратификации эпителия. На 50-й день СО демонстрируют биполярную морфологию с кистозной кожей с одной стороны и побочными продуктами, преимущественно хрящевыми, с другой (левая панель). Чрезмерная эпителиальная (средняя панель) или мезенхимальная (правая панель) дифференцировка препятствует правильному развитию кожи. (B) Репрезентативные изображения кистозных СО с видимыми колышками примерно на 80-й день. Обратите внимание на переменную пропорцию побочных продуктов (слева от пунктирной кривой) относительно кожи. Три крайние левые панели позволяют генерировать 2-4 планарных SO, в то время как крайняя правая панель показывает SO, качества которого недостаточно для выравнивания. Масштабные линейки: 500 мкм для дня -2, дня 50 и дня 80; 200 мкм для дня 0, дня 3 и дня 12. Аббревиатура: СО = органоид кожи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Схематическое изображение технических этапов создания планарных SO. Выполнение сплющивания кистозных СО под стереомикроскопом в колпаке LAF. (А) Удалите столб, накапливающий побочные продукты из кистозного СО, с помощью стерильного скальпеля. (B) Обрежьте верхние и нижние конечности СО, чтобы облегчить раскрытие тканей. (В) Разрежьте плоскую ткань на 2-4 части. Перенесите и расплющите каждую деталь эпидермальной стороной вверх на вставку, покрытую коллагеном, с помощью стерильных щипцов. (D) Поместите культуральный вкладыш, содержащий сплющенную ткань, в стандартный 12-луночный планшет, содержащий 600 мкл среды. Е) Инкубировать планшет при температуре 37°С с 5%СО2. (F) Схематический поперечный вид органоида кожи, изображенный на рисунке (B). (G) Схематический поперечный вид органоида кожи, изображенный на рисунке (C). (H) Изображение планарного SO, помещенного на коллагеновый гель I типа, налитый на вставку для клеточной культуры, расположенную в 12-луночном планшете, содержащем 600 мкл среды. Сокращения: СО = органоид кожи; LAF = ламинарный поток воздуха. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Характеристика планарных СО, полученных из hiPSC. (A) Репрезентативные светлопольные изображения окрашенного H&E планарного СО на 1-й и 27-й дни после сплющивания. К 27-му дню плоские СО показывают созревание кожи с плуристированным эпидермисом и ВЧ, содержащими структуры, похожие на сальные железы (стреловидные наконечники). (B) Конфокальные изображения планарных участков SO, окрашенных анти-β4 интегрином и антителами к кератину 10 или лорикрину, показывают раннюю надбазальную дифференцировку (клетки KRT10+ ) в 1-й день и позднюю дифференцировку (слой LOR+ ) в 27-й день. Ядра окрашиваются с помощью DAPI. Масштабные линейки: 50 μм (А); 100 μм (В). Сокращения: СО = органоид кожи; hiPSC = индуцированная плюрипотентная стволовая клетка человека; H&E = гематоксилин и эозин; β4 = b4 интегрин; KRT10 = кератин 10; LOR = лорикрин; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Описанный здесь протокол преодолевает ключевое ограничение кистозной системы СО путем восстановления ориентации нативных тканей и окружающей среды за счет уплощения тканей и воздействия воздуха на апикальный эпидермис. Этот метод сохраняет внутреннюю клеточную и структурную сложность органоида, способствует физиологически значимой организации и обеспечивает прямой доступ к плуристированной поверхности эпидермиса для экспериментальных манипуляций.

Несколько этапов протокола имеют решающее значение для достижения высококачественных планарных СО, начиная с генерации высококачественных кистозных СО. Ключевые проверки контроля качества и потенциальные точки модификации протокола были подробно описаны до12. Вкратце, отправной точкой должны быть хорошо поддерживаемые, недифференцированные культуры hiPSC с конфлюенсацией 70-80%, демонстрирующие плотно упакованные клетки с высоким соотношением ядер к цитоплазме. Генерация кистозных СО требует точной модуляции передачи сигналов BMP4 во время индукции поверхностной эктодермы12. Поскольку чувствительность BMP4 может варьироваться в зависимости от линии hiPSC, для получения оптимальных результатов может потребоваться титрование. Рекомендуется проводить тестирование концентраций BMP4 в диапазоне от 2,5 до 15 нг/мл, поскольку не было зарегистрировано ни одного успешного случая за пределами этого диапазона. Постоянство источника реагента также важно; Поэтому сыпучие запасы от единственного поставщика должны быть подготовлены и храниться в рекомендованных условиях и использоваться до истечения срока их годности для обеспечения полной биологической активности и минимизации изменчивости.

Выбор кистозных СО с соответствующей морфологией и размером имеет решающее значение для успешного уплощения СО. Созревание кистозных СО и, следовательно, образование колышков и волосяных плакодов – может варьироваться между линиями ИПСК, поэтому сроки уплощения могут варьироваться от 70-го до 90-го дня. Можно рассмотреть вопрос о добавлении CHIR99021, ингибитора GSK3 и сигнального агониста WNT, на 3-й день образования кистозного СО, поскольку было показано, что он увеличивает размер органоидов и уменьшает образование хрящей, способствуя пролиферации и ингибируямиграцию нервного гребня. Несмотря на многообещающие результаты, мы не наблюдаем последовательных результатов с этой модификацией в наших культурах.

Процесс сплющивания требует ловкости рук и знакомства с тканями. В частности, во время переноса фрагмента кожи на вставку с покрытием необходимо соблюдать осторожность для обеспечения правильной ориентации тканей. Рекомендуется проверять ориентацию с помощью тонких щипцов под стереомикроскопом и аккуратно корректировать ткань до тех пор, пока апикальная сторона не будет обращена вверх. При правильном расположении колышки/плакоды для волос должны быть обращены вниз. После переноса планарных SOs в культуру ALI HF обычно начинают демонстрировать заметный рост и пигментацию волосяного стержня в течение нескольких дней.

Основными ограничениями описываемой модели являются время и высокий уровень требуемого обслуживания, а также незрелость модели. Развитие кистозных СО, наделенных волосяными колышками, занимает от 70 до 90 дней, после чего следует 4 недели посева ОПЛ. Этот увеличенный срок в сочетании с трудоемкой процедурой выравнивания делает систему менее подходящей для приложений с высокой пропускной способностью, особенно по сравнению с коммерчески доступными аналогами для человеческой кожи. В то время как незначительная оптимизация может немного сократить время культивирования, существенное сокращение маловероятно. Высокое клеточное и структурное разнообразие кожи зависит от сложной последовательности эпителиально-мезенхимальных взаимодействий и механических сигналов, которые, вероятно, не могут быть ускорены добавлением экзогенных факторов in vitro 15,16,17,18. Образование кистозных СО и их прогрессирование в плоскостную форму требуют высокого уровня поддержания. Один из наиболее интенсивных периодов, за исключением первых 18 дней кистозного посева, происходит, когда планарные СО поддерживаются в атмосфере с низкой влажностью и требуют ежедневного восполнения среды. Подобно другим моделям, полученным из hiPSC, SOs сохраняют фетальный фенотип in vitro. Кроме того, потовые железы и мышцы arrector pili в значительной степени отсутствуют в SOs14, вероятно, из-за отсутствия васкуляризации, иммунных клеток и механических сил, таких как напряжение сдвига, растяжение и трение – все это необходимо для правильного созревания 15,16,17,18,19 . Некоторые из этих ограничений могут быть устранены путем увеличения сложности модели. Совместное культивирование с аутологичными макрофагами, полученными из hiPSC17, интеграция перфузионной системы9 или применение механического растяжения17 могут способствовать зрелости модели20,21.

Следует отметить, что формат трансвелловой вставки несколько ограничивает нисходящий рост ВЧ в планарных СО. В результате СН имеют тенденцию распространяться в поперечном направлении и могут подвергаться воздействию воздуха. Поскольку СН обычно защищены кожей in vivo, это следует учитывать при планировании экспериментов. Изменение покрытия вкладыша путем нанесения более толстого гидрогелевого слоя может помочь смягчить эту проблему. Кроме того, в этой модели стержни волос редко выступают за поверхность кожи. Наши наблюдения показывают, что СН в планарных СО остаются в анагене, активной фазе роста, до 27-го дня культивирования ОПЛ. Учитывая увеличенную продолжительность анагена в СН человека, это не является совершенно неожиданным. Хотя долгосрочное культивирование может в конечном итоге поддержать фазовый переход, это маловероятно при отсутствии системных сигналов. Идентификация и дополнение молекулярных сигналов, необходимых для фолликулярного цикла, может обеспечить искусственную индукцию фаз катагена и телогена.

Таким образом, протокол генерации планарных СО позволяет использовать широкий спектр экспериментальных подходов, которые невозможны или неактуальны при кистозных СО. Планарные СО уже были успешно использованы для моделирования бактериальных11 и вирусных инфекций22, повреждений тканей, вызванных ультрафиолетовым излучением22, и связанных с ними реакций на лекарства 12,22,23. Возможность доступа к апикальной поверхности физиологически значимого, сложного кожного эквивалента представляет собой существенный шаг вперед в этой области и открывает двери для множества новых применений в исследованиях кожи.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Мы благодарим наших коллег из отеля hiPSC, Медицинского центра Лейденского университета, за предоставление линий hiPSC. Эта работа была поддержана Центром медицины стволовых клеток Фонда Novo Nordisk при поддержке Фонда Novo Nordisk, Дания (грант No NNF21CC0073729) для K.R. K.R. is Chargé de Recherche в Национальном институте здоровья и медицинских исследований (INSERM).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Продвинутый DMEM/F12Термо Фишер Сайентифик#12634010в тексте это называется продвинутым медиумом.
ALK5, inhib. TGFb тип 1, SB431542Tocris Bioscience#1614Аликвот, хранить при -20 градусах; C и  держать на 4 градусах; C — максимум 7 дней 
Антиантитело к моноклональному клону крыс 439-9B к CD104BD Biosciences#555719NA
антиколлагеновое поликлональное антитело IV типаМеркМиллипор#Ab769NA
Антицитокератин 10 к поликлональному антителу кроликаБиолегенда#905401NA
Антилорикриновое поликлональное антитело кроликаБиолегенда#905101NA
Моноклональное антитело против ПМЕЛ-мышиNovus Biologicals#NBP2-29407 NA
Добавка B-27, без витамина AТермо Фишер Сайентифик#12587010Аликвот, хранить при -20 градусах; C 
Вставки для клеточной культурыBio-one Грейнера#66564112-колодца, поровый размер 0,4 и микро; m; прозрачная (48 вкладок в коробке); https://shop.gbo.com/en/row/products/bioscience/3d-cell-culture/thincert/3d-thincert-cell-culture-inserts/665641.html
Коллаген I типаКорнинг#354249Держите стандартный раствор на 4 градуса; C
Одноразовый скальпель стерильный 0507 No. 21Свонн Мортон#0507NA
Дульбекко Фосфатно-буферный физиологический раствор (DPBS)Термо Фишер Сайентифик#14190094NA
Среда Essential 6 (E6)Термо Фишер Сайентифик#A1516401называется hiPSC минимальной средой (hiMinM)  в тексте.
ФасудилLC Labs#F-4660Аликвотируйте раствор на 1000x и храните при -20 и градусах цельсия. После размораивания держите при температуре 4 и градуса; C — максимум 14 дней 
Мягкая клеточная диссоциация  РеагентТехнологии стволовых клеток#100-0485NA
Добавка GlutaMAXТермо Фишер Сайентифик#35050038NA
Человеческий FGF-2 базовый прениум классMiltenyi Biotec#130-093-842Аликвот, хранение при -80 градусах; C и  держать на 4 градусах; C — максимум 7 дней 
LDN 193189 дигидрохлоридТокрис#6053Aliquot, светочувствительный, хранить при -20 градусах; C 
Матригель фактора роста — матрица редуцированной базальной мембраныКорнинг#354230Аликвот, хранить при -20 градусах; C и  держать на 4 градусах; C — максимум 7 дней 
2-меркаптоэтанолТермо Фишер Сайентифик#21985023Опасные вещества, токсичные, коррозийные, раздражающие, опасные для здоровья и окружающей среды.
Нет,Мерк#567530-250MGОпасное вещество, разъезжающее и раздражающее. Подготовьте решение импровзорно.
Нейробазальная средаТермо Фишер Сайентифик#21103049называется нейронно-базальной средой  в тексте.
Нормоцин 50 мг/млInvivogen#ant-nr-1В тесте это называется антибиотико-антимикотической добавкой. Аликвот, хранить при -20 градусах; C и  держать на 4 градусах; C — максимум 14 дней 
Nunclon Sphera 96-WellU-дно микропластинаТермо Фишер Сайентифик#174929NA
Nunclon Sphera 174930 24-колодцевая многодисковаяТермо Фишер Сайентифик#174930NA
Дополнение N2Термо Фишер Сайентифик#17502048Аликвот, склад при -20 и градусах; C 
Орбитальный встряхивающийТермо Фишер Сайентифик#88881102NA
Пенициллин-стрептомицинТермо Фишер Сайентифик#15070063NA
Рекомбинантный человеческий белок BMP4R& D Systems#314-BP-010Аликвот, хранение при -80 градусах; C и  держать на 4 градусах; C — максимум 7 дней 
Среда StemFlex (SF)Термо Фишер Сайентифик#A3349401называется среда обслуживания hiPSC (hiMM)  в тексте.
SteriMax smart - Инфракрасный петлевый стерилизаторWLD-TEC#4.002.000 Необязательный
ПинцетМерк#T4537-1EAСтиль 5; тонкая игольчая, антимагнитная нержавеющая сталь
ВитронектинТехнологии стволовых клеток#07180NA

Ссылки

  1. Kolarsick, P. A. J., Kolarsick, M. A., Goodwin, C. Anatomy and physiology of the skin. J Dermatol Nurses Assoc. 3 (4), 203-213 (2011).
  2. Karimkhani, C., et al. Global skin disease morbidity and mortality: An update from the Global Burden of Disease Study 2013. JAMA Dermatol. 153 (5), 406(2017).
  3. Seth, D., et al. Global burden of skin disease: Inequities and innovations. Curr Dermatol Rep. 6 (3), 204-210 (2017).
  4. Grada, A., Mervis, J., Falanga, V. Research techniques made simple: Animal models of wound healing. J Invest Dermatol. 138 (10), 2095-2105.e1 (2018).
  5. Zomer, H. D., Trentin, A. G. Skin wound healing in humans and mice: Challenges in translational research. J Dermatol Sci. 90 (1), 3-12 (2018).
  6. Vig, K., et al. Advances in skin regeneration using tissue engineering. Int J Mol Sci. 18 (4), 789(2017).
  7. Chu, X., et al. Functional regeneration strategies of hair follicles: Advances and challenges. Stem Cell Res Ther. 16 (1), 77(2025).
  8. Motter Catarino, C., Cigaran Schuck, D., Dechiario, L., Karande, P. Incorporation of hair follicles in 3D bioprinted models of human skin. Sci Adv. 9 (41), eadg0297(2023).
  9. Kageyama, T., Miyata, H., Seo, J., Nanmo, A., Fukuda, J. In vitro hair follicle growth model for drug testing. Sci Rep. 13 (1), 4847(2023).
  10. Abaci, H. E., et al. Tissue engineering of human hair follicles using a biomimetic developmental approach. Nat Commun. 9 (1), 5301(2018).
  11. Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
  12. Jung, S., et al. Wnt-activating human skin organoid model of atopic dermatitis induced by Staphylococcus aureus and its protective effects by Cutibacterium acnes. iScience. 25 (10), 105150(2022).
  13. Zhang, M., et al. Recessive cardiac phenotypes in induced pluripotent stem cell models of Jervell and Lange-Nielsen syndrome: Disease mechanisms and pharmacological rescue. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (5), E5383-E5392 (2014).
  14. Lee, J., et al. Generation and characterization of hair-bearing skin organoids from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 17 (5), 1266-1305 (2022).
  15. Hu, M. S., et al. Embryonic skin development and repair. Organogenesis. 14 (1), 46-63 (2018).
  16. Li, K. N., Tumbar, T. Hair follicle stem cells as a skin-organizing signaling center during adult homeostasis. EMBO J. 40 (11), e107135(2021).
  17. Biggs, L. C., Kim, C. S., Miroshnikova, Y. A., Wickström, S. A. Mechanical forces in the skin: Roles in tissue architecture, stability, and function. J Invest Dermatol. 140 (2), 284-290 (2020).
  18. Gopee, N. H., et al. A prenatal skin atlas reveals immune regulation of human skin morphogenesis. Nature. 635 (8039), 679-689 (2024).
  19. Tokuyama, E., Nagai, Y., Takahashi, K., Kimata, Y., Naruse, K. Mechanical stretch on human skin equivalents increases the epidermal thickness and develops the basement membrane. PLoS One. 10 (11), e0141989(2015).
  20. Bai, X., et al. Organoid research: Theory, technology, and therapeutics. Organoid Res. 1 (1), 025040007(2025).
  21. Wang, Y., et al. Organoid research breakthroughs in 2024: A review. Organoid Res. 1 (2), 025040005(2025).
  22. Li, P., et al. Mpox virus infection and drug treatment modelled in human skin organoids. Nat Microbiol. 8 (11), 2067-2079 (2023).
  23. Kim, M. J., Ahn, H. J., Kong, D., Lee, S., Kim, D. H., Kang, K. S. Modeling of solar UV-induced photodamage on the hair follicles in human skin organoids. J Tissue Eng. 15, 20417314241248753(2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

in vitro

Похожие статьи