Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Автоматизированный анализ флуоресцентных изображений C. elegans с помощью SegElegans

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69094

⸱

10 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Basic Sciences, Faculty of Medicine, University of Crete, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, Foundation for Research and Technology-Hellas, 3Instituto de Automática e Informática Industrial, Universitat Politècnica de València

В этой статье

Краткое содержание

Здесь мы даем инструкции по эффективному использованию SegElegans, системы глубокого обучения, которую мы разработали для автоматизированной сегментации отдельных червей на широкопольных микроскопических изображениях, для последующего использования в программном обеспечении для анализа изображений, таком как ImageJ. Мы предоставляем способы использования системы как онлайн, так и офлайн.

Аннотация

Микроскопия, особенно флуоресцентная, является часто используемым инструментом в исследованиях C. elegans . Однако анализ данных микроскопических экспериментов может быть довольно утомительным и трудоемким. Таким образом, автоматизация желательна. Мы разработали SegElegans, двухголовую сверточную нейронную сетевую систему на основе U-net, специально предназначенную для автоматической сегментации червей даже на изображениях с большим количеством соприкасающихся или перекрывающихся особей. Первая часть SegElegans состоит из одного энкодера и двух декодеров. Энкодер, основанный на модели SmaAt AT, применяет двойные слои свертки, за которыми следует модуль сверточного блочного внимания (CBAM). Оба декодера используют сверточные LSTM: один выполняет семантическую сегментацию изображений червя (тело, край, фон или перекрытие), в то время как другой извлекает линейный скелет вдоль каждого червя. Вторая часть представляет собой алгоритм постобработки, который объединяет выходные данные двух декодеров и использует их для создания точной сегментации экземпляров. Затем эти сегментации могут быть переданы в ImageJ или другие соответствующие инструменты анализа изображений. Здесь мы представляем инструкции о том, как получить доступ к этой системе и запустить ее. Мы предоставляем онлайн-реализацию на основе облачных вычислений, а также два метода использования моделей SegElegans в автономном режиме, на локальном компьютере, если необходимое оборудование доступно.

Введение

Caenorhabditis elegans является эукариотическим модельным организмом, широко используемым в области клеточной и молекулярной биологии 1,2,3. Это небольшой (~1 мм для взрослых особей дикого типа) почвенный червь-нематода с быстрым жизненным циклом (~ три недели) и большим количеством потомства (обычно генетически идентичного самоопыляющемуся родителю-гермафродиту). Несмотря на свою относительную простоту, животное все же является сложным многоклеточным организмом с определенными и четко выраженными тканями и органами, которые, благодаря своему небольшому размеру и прозрачности, могут быть изучены in vivo без какой-либо необходимости в фиксации или других инвазивныхметодах лечения. Способность червя к изучению in vivo с помощью микроскопии может быть дополнительно увеличена за счет использования флуоресцентных репортеров, которые позволяют легко различать отдельные клетки или даже непосредственно визуализировать субклеточные органеллы/компоненты, такие как митохондрии, липидные капли или белковые агрегаты, а также такие процессы, как передача сигнала, экспрессия генов, слияние везикул. аутофагия, нейрональные и мышечные потенциалы действия и т.д.5,6,7,8,9,10,11. Кроме того, нематода также хорошо поддается генетическим манипуляциям посредством мутагенеза12, трансгенеза с помощью микроинъекции или бомбардировки микрочастицами13, редактирования CRISPR14 и, что наиболее важно, когда речь идет о простом и экономически эффективном генетическом скрининге, РНК-интерференции15. Эта манипуляция позволяет проводить обширное изучение генов и их роли в самой нематоде, в то же время, благодаря значительной генетической гомологии, которую C. elegans проявляет к другим модельным организмам, делая фундаментальные открытия, имеющие отношение к человеку16,17. Наконец, эта гомология/сохранение также делает червя идеальным начальным полигоном для испытаний лекарств и химических агентов, позволяя прояснить механизмы активности лекарственного средства, идентифицировать потенциальные генетические вариации, модифицирующие активность, и обнаружить потенциальные нежелательные взаимодействия ипобочные эффекты.

Все вышеупомянутые преимущества сделали C. elegans привлекательной моделью для исследований в области клеточной и молекулярной биологии, особенно для ученых, заинтересованных в мониторинге процессов in vivo и часто в режиме реального времени с помощью микроскопии. Такие исследования обычно включают в себя значительный объем анализа изображений с помощью специального программного обеспечения, наиболее широко используемым вариантом является ImageJ 21,22,23. Общей характеристикой анализа с помощью такого программного обеспечения является необходимость для пользователя/исследователя указывать области интереса (ROI) для анализа с помощью инструментов выбора. Довольно часто каждый отдельный червь на изображении выбирается в качестве собственного ROI с целью получения информации для каждого червя о простых морфологических особенностях (таких как размеры тела) или более «продвинутых» экспериментальных данных, таких как уровни экспрессии гена (измеренные с помощью флуоресцентного репортера), показания ратиометрического репортера, количество и размер липидных капель. образование белковых агрегатов, морфология отдельных органелл и их сетей и т.д.5,8,10,24,25,26,27. Этот выбор для каждого червя обычно выполняется вручную, поскольку методы автоматического выбора, основанные на стандартных алгоритмах обработки изображений, обычно недостаточно способны различать формы и особенности червя, особенно на изображениях в темном поле, где контуры червей не видны четко, или на изображениях в светлом поле со значительным количеством животных, которые соприкасаются и накладываются друг на друга. Однако ручной процесс является медленным (от 20 с до 1 минуты на червячок в зависимости от требуемой точности и опыта пользователя), трудоемким и подверженным предвзятости и ошибкам пользователя.

Альтернативным и гораздо более мощным подходом к получению индивидуальных ROI C. elegans (задача, которую в области компьютерного зрения принято называть сегментацией) является ее автоматизация с помощью методов глубокого обучения/нейронных сетей. Сверточные нейронные сети, основанные в первую очередь на архитектуре Маска R-CNN28 и U-net29, показали достойные результаты в задачах сегментации на различных биологических модельных системах 30,31,32, в том числе в C. elegans 33,34,35,36,37,38,39 , но ни один из них не обеспечил удовлетворительного решения проблемы создания сегментации всего тела, которая правильно различает отдельных животных (сегментация экземпляров) на изображениях с высоким разрешением с большим количеством соприкасающихся или полностью перекрывающихся червей. Чтобы удовлетворить эту потребность, мы разработали SegElegans, модель глубокого обучения, специально разработанную и оптимизированную для этой задачи40.

SegElegans состоит из двух основных частей (рис. 1). Первая часть представляет собой двухголовую вариантную сверточную нейронную сеть U-net. Он состоит из одного блока энкодера и двух блоков декодера. Блок энкодера основан на модели SmaAt AT41 и использует двойные блоки свертки для каждого слоя, подающего данные в модуль внимания сверточного блока (CBAM)42. Два блока декодера основаны на сети43 сверточной длинной кратковременной памяти (LSTM). Один декодер отвечает за категоризацию каждого пикселя изображений как часть основного тела червя, часть края червя, часть фона или часть области, где черви перекрываются (это обычно называется семантической сегментацией). Другой декодер отвечает за рисование линейного «скелета» по длине каждого червяка. Вторая часть представляет собой алгоритм постобработки, который объединяет выходные данные двух декодеров и использует их для создания точной сегментации экземпляров. Первоначально он определяет сегменты истинных перекрытий, сравнивая выходные данные семантической сегментации со скелетным. Затем он выводит сегментацию экземпляра непосредственно для червей без перекрытий или путем сборки из сегментов для перекрывающихся40. Эти сегментации сохраняются в виде двоичных масок, а также в виде ROI, совместимых с ImageJ.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

В следующих разделах приведены подробные инструкции по эффективному использованию SegElegans (рис. 2). Они включают в себя инструкции по подготовке к получению изображения (раздел 1), как запустить модель онлайн (раздел 2) или офлайн (разделы 3-5), а также импорту ROI в ImageJ или другие инструменты (раздел 6). Поскольку для оценки изображений с помощью модели требуется ПК с совместимым графическим процессором (GPU), который имеет не менее 6 ГБ (в идеале больше) оперативной памяти видео (VRAM), большинству пользователей (при условии, что у них есть доступ к сервисам Google) рекомендуется использовать онлайн-версию модели, которая удовлетворяет и превосходит эти требования к аппаратному обеспечению с помощью облачных вычислений (раздел 1 > раздел 2 > раздел 6). В качестве альтернативы, пользователи, имеющие доступ к достаточно мощному оборудованию и базовое понимание использования командной строки/терминала (или пользователи, у которых нет доступа к вышеупомянутым опциям облачных вычислений), могут найти локальную работу модели более удобной (раздел 1 > раздел 3 > раздел 4 или 5 > раздел 6).

1. Получение образцов и направляющих изображений

  1. Используйте SegElegans для получения сегментации взрослых червей от любого штамма червей, независимо от того, какие флуоресцентные репортеры они могут или не могут экспрессировать. Если фенотип(ы)/данные, представляющие интерес, измеряются на светлопольных изображениях, получите их обычно с помощью широкопольного микроскопа и совместимого программного обеспечения с использованием объектива с 4-кратным увеличением или аналогичного объектива.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SegElegans может анализировать изображения с широким диапазоном яркости и контрастности, хотя предпочтительно, чтобы в них не было насыщенных светлых или темных пикселей. Что касается размеров, система была обучена на изображениях 1328 x 1048, но должна работать с любым изображением размером не менее 512 x 512.
  2. Если фенотип(ы)/данные, представляющие интерес, измеряются на изображениях в темном поле (типично при использовании одного или нескольких трансгенных флуоресцентных репортеров или красителей), получите изображения светлого поля вместе с данными, которые будут использоваться в качестве ориентиров (как описано в шаге 1.1). Убедитесь, что направляющие изображения идеально совпадают с темными изображениями флуоресцентных каналов в пространстве и как можно ближе по времени, в идеале с помощью опций многоканального сбора данных, предоставляемых операционным программным обеспечением микроскопа. Сохраните направляющие изображения в отдельной папке от соответствующих изображений данных darkfield, используя одно и то же имя для обоих.

2. Запуск онлайн-версии SegElegans

  1. Войдите в учетную запись Google в веб-браузере. Для этой цели рекомендуется создать новую выделенную учетную запись лаборатории.
  2. Войдите в Google Диск (https://drive.google.com) и загрузите папку с изображениями светлого поля (данные или руководство). Как упоминалось ранее, если направляющие изображения используются для создания ROI для изображений темного поля, не включайте эти изображения данных в эту папку.
  3. Перейдите в https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 и нажмите на файл SegElegans Body Prediction Interface.ipynb . Нажмите кнопку « Открыть в Colab » в верхней части открывшегося файла. Записная книжка/интерфейс Jupyter для SegElegans откроется в Google Colab.
  4. Выполните блок кода 1, нажав кнопку воспроизведения (figure-protocol-1) под заголовком. Предоставьте исполняющей среде разрешение на выполнение кода и наблюдайте за выводом после завершения выполнения (рядом с кнопкой воспроизведения появляется зеленая галочка). Colab должен автоматически запустить правильную, совместимую с CUDA среду выполнения и отобразить таблицу вывода NVIDIA-SMI. В противном случае принудительно используйте среду выполнения T4 GPU через меню Runtime > Change runtime type.
  5. Выполните блок кода 2 для загрузки содержимого Google Drive в среду выполнения. Примите все диалоговые окна подтверждения и предоставьте все запрашиваемые разрешения.
  6. Выполните блок кода 3, затем 4. Блок 3 займет пару минут, поэтому убедитесь, что появилась зеленая галочка, прежде чем переходить к 4.
  7. Откройте иконку с вкладкой папки слева от интерфейса Colab. При этом файлы, загруженные во время выполнения, включая импортированное содержимое Диска, будут отображаться в виде /content/drive/MyDrive. Кликаем правой кнопкой мыши по папке с изображениями, копируем путь и вставляем его в форму ввода test_images кода блока 5. Убедитесь, что он выглядит следующим образом: /content/drive/MyDrive/Imagefolder. Аналогичным образом укажите путь для вывода анализа (например, /content/drive/MyDrive/Imagefolder/Output). Обратите внимание, что пути в этой среде используют косую черту для разделения папок (/).
  8. Выполните блок кода 5.
  9. Укажите точное расширение изображений, которые будут анализироваться моделью, в предоставленном виде в коде блока 6. Для этого введите ".tif", ". TIF" и ".tiff" рассматриваются как разные расширения.
  10. Не регулируйте ввод batch_crop_img в блоке кода 6, если система работает в стандартном времени выполнения графического процессора T4 (которое предоставляется бесплатно всем пользователям на ограниченное количество часов в день, в зависимости от уровня использования). Уменьшите его, если во время выполнения возникают проблемы с доступностью памяти.
  11. Выполните блок кода 6. Это займет некоторое время, поэтому прежде чем продолжить, убедитесь, что появилась зеленая галочка.
  12. Выполните блок кода 7. Не настраивайте его входные данные для времени выполнения T4 по умолчанию, но уменьшите количество подпроцессов или полностью отключите параллельную обработку, если возникают проблемы с доступностью памяти. Это также займет значительное время.
  13. Откройте Google Диск в другом окне или вкладке браузера и перейдите в папку вывода, указанную в версии 2.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе SegElegans завершил первичную оценку и постобработку сегментаций и создал несколько подпапок с результатами. 0_summary результаты содержат графики, обобщающие выходные данные для каждого изображения, с присвоением индексного номера каждому червю. 1_complete_mask содержит тщательно подобранные двоичные маски для всех сегментаций, которые алгоритм считает хорошими для анализа. 1_edge_small_mask содержит двоичные маски для всех сегментаций, которые алгоритм решил отклонить, потому что животные слишком малы или частично скрыты по краю изображения. 1_overlap_mask содержит двоичные маски для всех сегментов червей, которые показали реальное перекрытие и по умолчанию не добавляются в курируемый вывод. 1_all_rois_results содержит сегментации ВСЕХ 3 типов, независимо от курирования, в формате ImageJ (zip-файлы с ROI).
  14. На этом этапе выберите один из трех вариантов:
    1. Используйте ROI, предоставленные в 1_all_rois_results в ImageJ, и отклоняйте нежелательные ROI после импорта туда (см. раздел 6 протокола).
    2. Принимайте тщательно подобранные хорошие маски без какой-либо ручной коррекции (и без включения перекрывающихся червей) (перейти к пункту 2.16).
    3. Вручную отрегулируйте курирование, выбрав черви (включая перекрывающиеся), которые будут включены в вывод (перейдите к пункту 2.15).
  15. Для того, чтобы вручную настроить курирование, используйте блок кода 8. Изучите результаты первоначального курирования на сводных графиках в папке 0_summary результатов . Для каждого изображения, которое нуждается в коррекции, введите полное имя (с расширением) исходного входного изображения в форме "name_image_change" и номера масок, которые должны быть сохранены (из итогового графика), через запятую в форме "index_images". Выполните блок кода 8. Повторите этот шаг для любого другого изображения, которое нуждается в коррекции.
  16. После исправления или если пользователи решают принять первоначальное курирование без исправлений (и без перекрывающихся червей), выполните блок кода 9. В папке outputs на Google Диске будет создана новая подпапка под названием 2_curated_rois_results. Он включает в себя все окончательные курируемые сегментации в формате ImageJ (zip-файлы с ROI).
  17. Для того, чтобы снова выполнить процесс для другой папки с изображениями, сбросьте время выполнения через меню Runtime > Restart Session и начните с самого начала.

3. Подготовка офлайн-версии SegElegans перед первым использованием

  1. В качестве альтернативы онлайн-запуску SegElegans на Colab доступна автономная версия SegElegans для пользователей, которые не могут или предпочитают не использовать облачные сервисы Google от Google. Для этого требуется ПК (Windows или Linux) с совместимым с CUDA графическим процессором (https://developer.nvidia.com/cuda-gpus), который имеет не менее 6 ГБ видеопамяти (хотя рекомендуется 16, если это доступно и доступно по цене).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие инструкции в разделах 3-5 относятся к Windows, но программное обеспечение также может работать на системах на базе Linux с небольшими изменениями в используемых командах.
  2. Загрузите установщик набора инструментов CUDA из https://developer.nvidia.com/cuda-downloads следуя инструкциям, чтобы получить версию, подходящую для используемого устройства.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SegElegans был протестирован с версиями 12.9 и 13.0 инструментария и CUDA версии 11 в Windows, однако ожидается, что будущие версии сохранят обратную совместимость.
    1. Установите инструментарий, следуя инструкциям самого установщика. Visual Studio не нужна.
  3. Скачайте соответствующую версию установщика Python для устройства с сайта https://www.python.org/downloads/. Установите Python, следуя инструкциям самого установщика и убедившись, что python.exe добавлен в PATH.
    ПРИМЕЧАНИЕ: SegElegans был собран и протестирован на Python 3.13, но ожидается, что будущие версии сохранят обратную совместимость.
  4. Перейдите в https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOffline/releases/tag/v1 . Нажмите на ссылку Исходный код (zip), чтобы загрузить пакет с необходимыми файлами для локальной настройки и запуска SegElegans.
  5. Извлеките zip-файл. Поместите его в папку верхнего или даже верхнего уровня, например C:\SegElegans. Содержимое zip-файла уже находится внутри подпапки SegElegansOffline-1.
  6. Откройте командную строку Windows (cmd.exe). Введите команду python -m venv "fullsegeleganspath", где "fullsegeleganspath" - это полный путь в кавычках к подпапке SegElegansOffline-1 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, если zip-файл был распакован в C:\SegElegans, полный путь будет C:\SegElegans\SegElegansOffline-1, а команда будет иметь вид python -m venv "C:\SegElegans\SegElegansOffline-1". Обратите внимание, что пути в этой среде используют обратную косую черту для разделения папок («\»).
  7. В командной строке используйте стандартные элементы управления для навигации внутри папки SegElegansOffline-1 и выполните команду Scripts\activate. Метка (SegElegansOffline-1) должна появиться перед следующим курсором приглашения, указывающая на то, что среда Python теперь активна.
  8. Находясь в активной среде (SegElegansOffline-1), выполните команду pip install -r requirements.txt . Процесс займет некоторое время.
  9. Введите и выполните команду python assemblenetworks.py .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь SegElegans готов к запуску. Для этого есть два способа: быстрый скрипт, который автоматически предоставит все сегментации в виде ROI ImageJ без возможности вручную исправить курирование (раздел 4), и локальный блокнот Jupyter, который предоставит возможность просмотреть и исправить курирование (раздел 5). Последний подход рекомендуется для большинства пользователей.

4. Запуск офлайн-версии SegElegans с помощью быстрого скрипта

  1. Откройте командную строку Windows (cmd.exe). Как описано в шаге 3.7, перейдите в папку среды SegElegans и активируйте ее.
  2. Чтобы воспользоваться быстрым скриптом, находясь в командной строке с активным (SegElegansOffline-1) окружением, введите и выполните команду python SegElegansBodyQuickEval.py -i "pathtoinputfolder" -x где "pathtoinputfolder" - это полный путь, в кавычках, к папке с изображениями светлого поля (например, "D:\Data\Experiment12365\Condition 1") и <расширение файла> - это точное расширение файла изображений, которые пользователи хотят проанализировать (Пример". TIF»). Введите команду python SegElegansBodyQuickEval.py -h для получения инструкций по дополнительным параметрам, которые могут быть изменены для ускорения обработки скриптом, если устройство может с этим справиться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выходная папка в этом случае будет создана внутри входной папки (Так, для приведенного выше примера: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output"). Внутри находится ряд подпапок. 0_summary результаты содержат графики, обобщающие выходные данные для каждого изображения, с присвоением индексного номера каждому червю. 1_complete_mask содержит тщательно подобранные двоичные маски для всех неперекрывающихся сегментаций, которые алгоритм считает хорошими для анализа. 1_edge_small_mask содержит двоичные маски для всех сегментаций, которые алгоритм решил отклонить, потому что животные слишком малы или частично скрыты по краю изображения. 1_overlap_mask содержит двоичные маски для всех сегментов червей, которые показали реальные перекрытия. 1_all_rois_results содержит сегментации ВСЕХ 3 типов, независимо от курирования, в формате ImageJ (zip-файлы с ROI). Поскольку здесь нет возможности вручную исправить курирование, 2_curated_rois_results по умолчанию включает все сегментации, которые алгоритм считает хорошими, И все перекрывающиеся сегментации в формате ImageJ (zip-файлы с ROI).

5. Запуск офлайн-версии SegElegans с помощью блокнота Jupyter

  1. Откройте командную строку Windows (cmd.exe). Как описано в шаге 3.7, перейдите в папку среды SegElegans и активируйте ее.
  2. Чтобы использовать интерфейс Jupyter, находясь в командной строке с активным окружением (SegElegansOffline-1), введите и выполните команду jupyter notebook. Откроется окно/вкладка веб-браузера с локально размещенным сайтом. На первом экране выберите файл SegElegansOfflineJupyterInterface.ipynb.
  3. Выполните код в блоке кода 1, выбрав его (щелкните слева за пределами фактического кода) и нажав кнопку воспроизведения (figure-protocol-2) на панели инструментов выше. После завершения выполнения под блоком кода появится сообщение с подтверждением.
  4. Выполните блок кода 2. Это сгенерирует некоторые формы ввода в считывании под блоком кода. Заполните сгенерированные формы путем к папке ввода со светлопольными изображениями (Пример: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1"), желаемым путем для вывода анализа (Пример: "D:\Data\Experiment12365\Condition 1\Output") и точным расширением файла анализируемых изображений (Пример". TIF»). Отрегулируйте дополнительные предоставленные параметры (увеличьте количество подкультур в партии до 9 или 16 и запустите несколько параллельных процессов постобработки), если устройство достаточно способно.
  5. Выполните блок кода 3.
  6. Выполните блок кода 4. Это займет некоторое время, поэтому прежде чем продолжить, убедитесь, что все готово.
  7. Выполните блок кода 5. Опять же, это займет некоторое время. После этого перейдите в папку вывода, указанную выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе SegElegans завершил первичную оценку и постобработку сегментаций и создал несколько подпапок с результатами. 0_summary результаты содержат графики, обобщающие выходные данные для каждого изображения, с присвоением индексного номера каждому червю. 1_complete_mask содержит тщательно подобранные двоичные маски для всех сегментаций, которые алгоритм считает хорошими для анализа. 1_edge_small_mask содержит двоичные маски для всех сегментаций, которые алгоритм решил отклонить, потому что животные слишком малы или частично скрыты по краю изображения. 1_overlap_mask содержит двоичные маски для всех сегментов червей, которые показали реальное перекрытие и по умолчанию не добавляются в курируемый вывод. 1_all_rois_results содержит сегментации ВСЕХ 3 типов, независимо от курирования, в формате ImageJ (zip-файлы с ROI).
  8. Как и в онлайн-версии SegElegans, используйте любой из трех вариантов, перечисленных ниже:
    1. Используйте ROI, предоставленные в 1_all_rois_results в ImageJ, и отклоняйте нежелательные ROI после импорта туда (см. раздел 6 протокола).
    2. Примите автоматически подобранные хорошие маски без какой-либо ручной коррекции (и без включения перекрывающихся червей) (перейдите к шагу 5.11).
    3. Вручную отрегулируйте курирование, выбрав черви (в том числе перекрывающиеся), которые будут включены в вывод (перейдите к шагу 5.9).
  9. Для того, чтобы вручную настроить курирование, используйте блоки кода 6 и 7. Сначала выполните 6. Это создаст формы ввода в считывании под кодом.
  10. Изучите результаты первоначального курирования на сводных графиках во вложенной папке 0_summary результатов . Для каждого изображения, которое нуждается в коррекции, введите полное имя изображения INPUT (с расширением) в форму Изображение для исправления: и номера масок, которые должны быть сохранены (из итогового графика), разделенные запятыми в форме Маски для сохранения. Выполните блок кода 7 и убедитесь, что выполнение завершено. Повторите этот шаг для любого другого изображения, которое нуждается в коррекции.
  11. После того, как коррекция курирования будет выполнена или если пользователи решат принять первоначальную коррекцию без исправлений (и без перекрывающихся червей), выполните блок кода 8. В указанной папке outputs будет создана новая подпапка с именем 2_curated_rois_results. Он включает в себя все окончательные курируемые сегментации в формате ImageJ (zip-файлы с ROI).
  12. Для того, чтобы снова запустить процесс для другой папки с изображениями, сбросьте время выполнения через меню «Ядро» > «Перезагрузить ядро» и «Очистить выходные данные всех ячеек » и начните с самого начала.

6. Импорт сегментаций в ImageJ (или альтернативы)

  1. Откройте одно из реальных изображений данных в ImageJ.
  2. Откройте соответствующий zip-файл с ROI этого изображения. При этом выбранные параметры будут загружены в менеджер ROI ImageJ. Если они представляют собой ROI от 2_curated_rois_results выходных данных, они готовы к анализу с использованием желаемых методов, которые обычно используются (предпочтительно с использованием макросов для дальнейшей автоматизации и ускорения процесса).
  3. Если это ROI из 1_all_rois_results выходных данных, удалите ненужные сегментации из менеджера ROI. Выберите их и нажмите кнопку «Удалить » в самом окне менеджера. Не нажимайте клавишу Delete на клавиатуре, так как это приведет к удалению содержимого выделения на изображении.
  4. Если для анализа требуется программное обеспечение, отличное от ImageJ, формат ROI, скорее всего, не будет совместим. В этом случае импортируйте сегментации в универсально используемой форме двоичных масок, которые предоставляются в папках 1_complete_mask и 1_overlap_mask . Обратитесь к инструкциям принимающего программного обеспечения о том, как выполнить этот импорт.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Следуя этому протоколу, исследователи должны иметь возможность извлекать высококачественные сегментации червей, даже для анализа флуоресцентных изображений без видимых границ червей. Как обсуждалось в разделе 6 протокола, эти сегментации могут быть импортированы непосредственно в ImageJ и использованы для быстрого измерения соответствующих свойств, таких как интенсивность флуоресцентных репортеров (обычно используемых для количественного определения экспрессии) или количество, размер и м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Представленная здесь методология должна позволить пользователям анализировать эксперименты с микроскопией C. elegans в значительно более короткие сроки без потери точности. Поскольку он извлекает сегментации из светлых направляющих изображений независимо от фактической флуоресценции (как обсуждалось в разделе 1 протокола), его можно использовать с любым штаммом и для любого применения, требующего измерения фенотипов на основе каждого червя. Они могут включать в себя одноканальны...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Работа в авторской лаборатории финансируется Генеральным секретариатом
Исследования и инновации Министерства развития Греции,
Европейский Союз - NextGenerationEU (код проекта: TAEDR-0535850, аббревиатура:
BrainPrecision) в рамках Акции «Флагманские действия в
Междисциплинарные научные области, представляющие особый интерес для связи
к производственной ткани» в рамках программы «Национальное восстановление и устойчивость»
План «Греция 2.0», Исследовательское исполнительное агентство Европейской комиссии
Excellence Hub "CHAngeing" (GA-101087071) и Греческий фонд
для исследований и инноваций (H.F.R.I.) в рамках «1-го призыва для H.F.R.I.
Исследовательские проекты для поддержки преподавателей и исследователей, а также
закупка дорогостоящего исследовательского оборудования» (Номер проекта:
HFRI-FM17C3-0869, Нейромитофагия).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Компьютер с доступом в интернет (пример: Dell Vostro Desktop)Несколько (например, Dell) -Это позволит запускать SegElegans онлайн через облачные вычисления, как рекомендуется, а также использовать программное обеспечение для анализа изображений, такое как ImageJ.
Совместимый с CUDA графический процессор с не менее 6 ГБ видеопамяти (пример: MSI Geforce RTX  RTX3050 Ventus 2X 6GB) (опционально)NVIDIA + несколько производителей (например, Micro Star International)https://developer.nvidia.com/cuda-gpusЭто позволит запускать SegElegans офлайн на локальном компьютере.
чипсеты GPU, совместимые с CUDA, можно найти здесь:
https://developer.nvidia.com/cuda-gpus
VRAM зависит от фактической реализации чипсета в GPU производителем.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ: Вам понадобится дорогая и мощная CUDA-карта, значительно превышающая минимальные требования (16+ ГБ VRAM), чтобы соответствовать производительности облачной версии.
Эпифлуоресцентный микроскоп (Invitrogen EVOS FL Auto 2)ThermoFisher Scientific AMAFD2000, например,Мы рекомендуем использовать систему, которая может практически одновременно получать изображения как с яркого поля, так и с одного или нескольких флуоресцентных каналов.
ImageJ (опционально)NIHhttps://imagej.net/software/fiji/downloadsРекомендуем дистрибутив Fiji, доступный здесь:
https://imagej.net/software/fiji/downloads
ПК с совместимостью с NVIDIA GPU (пример: Dell Vostro Desktop) (опционально)  Несколько (например, Dell) -Это необходимо вместе с GPU для офлайн-запуска SegElegans на локальном компьютере.
Для GPU потребуется совместимое с Windows аппаратное обеспечение с соответствующими слотами PCI на материнской плате, место для карты и достаточно мощный блок питания.
SegElegans-https://github.com/KonstantinosKounakis/SegElegansOnline/tree/v1.0 См. рукопись для полных инструкций. 

Ссылки

  1. Kaletta, T., Hengartner, M. O. Finding function in novel targets: C. elegans as a model organism. Nat Rev Drug Discov. 5 (5), 387-398 (2006).
  2. Markaki, M., Tavernarakis, N. Caenorhabditis elegans as a model system for human diseases. Curr Opin Biotechnol. 63, 118-125 (2020).
  3. Zuryn, S. C. elegans as a model for health and disease. Semin Cell Dev Biol. 154 (Pt A), 1-3 (2024).
  4. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  5. Kerr, R. A. Imaging the activity of neurons and muscles. WormBook. , 1-13 (2006).
  6. Feinberg, E. H., et al. GFP reconstitution across synaptic partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems. Neuron. 57 (3), 353-363 (2008).
  7. Hammarlund, M., Jin, Y. Axon regeneration in C. elegans. Curr Opin Neurobiol. 27, 199-207 (2014).
  8. Daniele, J. R., et al. UPR(ER) promotes lipophagy independent of chaperones to extend life span. Sci Adv. 6 (1), eaaz1441(2020).
  9. Yemini, E., et al. NeuroPAL: A multicolor atlas for whole-brain neuronal identification in C. elegans. Cell. 184 (1), 272-288.e11 (2021).
  10. Sinnige, T., et al. Kinetic analysis reveals that independent nucleation events determine the progression of polyglutamine aggregation in C. elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (11), e2021888118(2021).
  11. Gkikas, I., Daskalaki, I., Kounakis, K., Tavernarakis, N., Lionaki, E. MitoSNARE assembly and disassembly factors regulate basal autophagy and aging in C. elegans. Int J Mol Sci. 24 (4), 4230(2023).
  12. Kutscher, L. M., Shaham, S. Forward and reverse mutagenesis in C. elegans. WormBook. , 1-26 (2014).
  13. Praitis, V., Maduro, M. F. Transgenesis in C. elegans. Methods Cell Biol. 106, 161-185 (2011).
  14. Kim, H. M., Colaiacovo, M. P. CRISPR-Cas9-guided genome engineering in Caenorhabditis elegans. Curr Protoc Mol Biol. 129 (1), e106(2019).
  15. Kamath, R. S., Ahringer, J. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  16. Lai, C. H., Chou, C. Y., Ch'ang, L. Y., Liu, C. S., Lin, W. Identification of novel human genes evolutionarily conserved in Caenorhabditis elegans by comparative proteomics. Genome Res. 10 (5), 703-713 (2000).
  17. Kuwabara, P. E., O'Neil, N. The use of functional genomics in C. elegans for studying human development and disease. J Inherit Metab Dis. 24 (2), 127-138 (2001).
  18. Ranganathan, R., Sawin, E. R., Trent, C., Horvitz, H. R. Mutations in the Caenorhabditis elegans serotonin reuptake transporter MOD-5 reveal serotonin-dependent and -independent activities of fluoxetine. J Neurosci. 21 (16), 5871-5884 (2001).
  19. Lackner, M. R., et al. Chemical genetics identifies Rab geranylgeranyl transferase as an apoptotic target of farnesyl transferase inhibitors. Cancer Cell. 7 (4), 325-336 (2005).
  20. Yoon, S., et al. Microfluidics in high-throughput drug screening: Organ-on-a-chip and C. elegans-based innovations. Biosensors (Basel). 14 (1), 55(2024).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Schindelin, J., Rueden, C. T., Hiner, M. C., Eliceiri, K. W. The ImageJ ecosystem: An open platform for biomedical image analysis. Mol Reprod Dev. 82 (7-8), 518-529 (2015).
  23. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  24. Valente, A. J., Maddalena, L. A., Robb, E. L., Moradi, F., Stuart, J. A. A simple ImageJ macro tool for analyzing mitochondrial network morphology in mammalian cell culture. Acta Histochem. 119 (3), 315-326 (2017).
  25. Ramki, K., Thiruppathi, G., Ramasamy, S. K., Sundararaj, P., Sakthivel, P. An aggregation-induced emission-based ratiometric fluorescent chemosensor for Hg(II) and its application in Caenorhabditis elegans imaging. Methods. 221, 1-11 (2024).
  26. Boulin, T., Etchberger, J. F., Hobert, O. Reporter gene fusions. WormBook. , 1-23 (2006).
  27. Braeckman, B. P., Smolders, A., Back, P., De Henau, S. In vivo detection of reactive oxygen species and redox status in Caenorhabditis elegans. Antioxid Redox Signal. 25 (10), 577-592 (2016).
  28. He, K., Gkioxari, G., Dollár, P., Girshick, R. Mask R-CNN. arXiv. , (2017).
  29. Ronneberger, O., Fischer, P., Brox, T. U-Net: Convolutional networks for biomedical image segmentation. arXiv. , (2015).
  30. Exploring deep learning architectures in NAECON 2018. Proc IEEE NAECON. Alom, M. Z., Yakopcic, C., Taha, T. M., Asari, V. K. IEEE National Aerospace and Electronics Conference, , 228-233 (2018).
  31. Micallef, N., Seychell, D., Bajada, C. J. Exploring the U-Net++ model for automatic brain tumor segmentation. IEEE Access. 9, 125523-125539 (2021).
  32. Plebani, E., et al. High-throughput segmentation of unmyelinated axons by deep learning. Sci Rep. 12 (1), 1198(2022).
  33. Fudickar, S., Nustede, E. J., Dreyer, E., Bornhorst, J. Mask R-CNN based C. elegans detection with a DIY microscope. Biosensors (Basel). 11 (8), 257(2021).
  34. Lalit, M., Tomancak, P., Jug, F. EmbedSeg: Embedding-based instance segmentation for biomedical microscopy data. Med Image Anal. 81, 102523(2022).
  35. Layana Castro, P. E., Garvi, A. G., Sanchez-Salmeron, A. J. Automatic segmentation of Caenorhabditis elegans skeletons in worm aggregations using improved U-Net in low-resolution image sequences. Heliyon. 9 (4), e14715(2023).
  36. A convolutional neural network model for worm imaging in 2020. Proc IEEE ISBI. Chen, L., et al. IEEE 17th International Symposium on Biomedical Imaging (ISBI), , 508-512 (2020).
  37. Guan, G., et al. Cell lineage-resolved embryonic morphological map reveals signaling associated with cell fate and size asymmetry. Nat Commun. 16 (1), 3700(2025).
  38. Cao, J., et al. Establishment of a morphological atlas of the Caenorhabditis elegans embryo using deep-learning-based 4D segmentation. Nat Commun. 11 (1), 6254(2020).
  39. Zhao, C., et al. EmbSAM: Cell boundary localization and Segment Anything Model for fast images of developing embryos. bioRxiv. , (2024).
  40. Castro, P. E. L., et al. SegElegans: Instance segmentation using dual convolutional recurrent neural network decoder in Caenorhabditis elegans microscopic images. Comput Biol Med. 190, 110012(2025).
  41. Trebing, K., Stańczyk, T., Mehrkanoon, S. SmaAt-UNet: Precipitation nowcasting using a small attention-UNet architecture. Pattern Recognit Lett. 145, 178-186 (2021).
  42. Woo, S., Park, J., Lee, J. Y., Kweon, I. S. CBAM: Convolutional block attention module. arXiv. , (2018).
  43. Shi, X., et al. Convolutional LSTM network: A machine learning approach for precipitation nowcasting. arXiv. , (2015).
  44. Stuhr, N. L., et al. Rapid lipid quantification in Caenorhabditis elegans by Oil Red O and Nile Red staining. Bio Protoc. 12 (5), e4340(2022).
  45. Kuzmic, M., et al. In situ visualization of carbonylation and its co-localization with proteins, lipids, DNA and RNA in Caenorhabditis elegans. Free Radic Biol Med. 101, 465-474 (2016).
  46. Fang, E. F., et al. In vitro and in vivo detection of mitophagy in human cells, C. elegans, and mice. J Vis Exp. (129), e56301(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

C elegansU NetImageJLSTM
Автоматизированный анализ флуоресцентных изображений C. elegans с помощью SegElegans
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.