Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Выделение и очистка кардиомиоцитов взрослых мышей с помощью перфузии Лангендорфа и гравитационного осадконакопления

285 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69102

⸱

31 марта 2026 г.

 ,  , 
1Deqing People's Hospital, 2School of Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine, 3Anesthesiology Department, Shanxi Provincial People's Hospital Affiliated Shanxi Medical University

В этой статье

Краткое содержание

Цель данного исследования — оптимизировать и упростить процедуру экстракции кардиомиоцитов взрослых мышей с конечной целью улучшения методологий исследований сердечно-сосудистых заболеваний. Этот протокол эффективно достигает кардиомиоцитов с высокой жизнеспособностью и чистотой при сокращённом времени обработки, что позволяет проводить более надёжные эксперименты и ускоряет терапевтические достижения.

Аннотация

Сердечно-сосудистые заболевания остаются серьёзной глобальной проблемой здравоохранения, создавая острую потребность в надёжных моделях in vitro. В данном исследовании представлен оптимизированный протокол изоляции и культуры кардиомиоцитов взрослых мышей с целью устранения ограничений низкой жизнеспособности и некардиомиоцитного загрязнения в существующих методах. Протокол основан на ретроградной перфузии Лангендорфа, с использованием гепарина натрия для антикоагуляции и исключительно коллагеназы типа II (1,2 мг/мл) для пищеварения. Кардиомиоциты очищались гравитационным осадконакоплением и культивировались на поверхностях, покрытых ламинином. Этот метод стабильно давал 8,75 ± 0,36 × 105 кардиомиоцитов на сердце с высокой долей клеток в форме палочек (91,2% ± 2,11%) и высокой чистотой (доля клеток cTNT⁺DAPI⁺ относительно клеток DAPI⁺ составляла примерно 97,47% ± 1,365%), которые демонстрировали чёткие саркомические структуры. Обеспечивая стандартизированный и воспроизводимый метод получения высококачественных взрослых кардиомиоцитов, этот протокол эффективно сокращает разрыв между исследованиями in vitro и патофизиологической значимостью, тем самым поддерживая передовые сердечно-сосудистые исследования.

Введение

Сердечно-сосудистые заболевания остаются ведущей причиной смертности во всеммире. 1. Кардиомиоциты, являясь центральным направлением кардиологических исследований, давно служат необходимыми инструментами для изучения физиологии и патологиисердца 2. Хотя коммерчески доступные линии кардиомиоцитов и недавно популяризированные человеческие плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hPSC-CMs), предлагают большие преимущества с точки зрения доступности и простотыманипуляции 3,4,5, первичные кардиомиоциты, выделенные ex vivo ex vivo, демонстрируют превосходную структурную и функциональную корреляцию с физиологическими и патологическими механизмами сердца. Поэтому овладение техниками выделения кардиомиоцитов in vitro имеет первостепенное значение.

Кардиомиоциты демонстрируют выраженные морфологические и функциональные трансформации на протяжении всего развития. Примечательно, что эти клетки сохраняют пролиферативный потенциал во время эмбрионального развития и неонатального периода (в течение 7 дней после рождения), но эта регенеративная способность затем навсегдатеряется 6. В процессе постнатального созревания кардиомиоциты проходят значительную морфологическую ремоделизацию, в конечном итоге приобретая свой характерный взрослый фенотип к 2 месяцам — с палочкообразной морфологией с высокоорганизованной саркомическойструктурой 7,8. Эти характеристики, зависящие от стадии развития, подчёркивают критическую важность использования кардиомиоцитов взрослых мышей для механистических исследований патофизиологии сердца.

Критически важным для развития этой области является надёжное получение высокоточных кардиомиоцитов, особенно взрослых клеток, которые точно имитируют физиологию сердца человека. Текущие протоколы изоляции кардиомиоцитов взрослых мышей сталкиваются с несколькими постоянными проблемами: (i) снижением жизнеспособности клеток, (ii) гетерогенными характеристиками популяций и (iii) технически сложными процедурами — все они вместе препятствуют прогрессуисследований 9,10. Это подчёркивает острую необходимость оптимизации методологий изоляции для достижения как повышенного выхода, так и чистоты, тем самым предоставляя более физиологически значимые клеточные платформы для исследования сердечно-сосудистых заболеваний.

Благодаря систематической оптимизации параметров перфузии, протоколов ферментативного пищеварения и формул реагентов, это исследование успешно установило усовершенствованную методологию выделения и культивирования кардиомиоцитов взрослых мышей. Оптимизированный протокол даёт кардиомиоциты с хорошо сохранившейся морфологической целостностью, характеризующимися высокими палочкообразными соотношениями и чётко видимыми саркомическими структурами. Эти достижения предоставляют надежную экспериментальную платформу для глубокого изучения патофизиологии кардиомиоцитов, значительно облегчая исследования сердечно-сосудистых заболеваний, сосредоточенных на механизмах клеток миокарда.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных в данном исследовании были выполнены строго в соответствии с руководящими принципами Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC), одобренными Этическим комитетом Народной больницы Deqing. В исследовании использовались самцы мышей C57BL/6 возрастом 8-12 недель, приобретённые у GemPharmatech Co., Ltd. Все животные содержались в барьерных объектах с SPF-классом, при этом экологические параметры соответствовали национальным стандартам (комнатная температура 22 ± 2 °C, относительная влажность 50 ± 10%, цикл свет/тёмный 12/12 час). На протяжении всех экспериментов это исследование строго придерживалось принципов «3R» (замена, редукция, уточнение) и внедряло стандартные процедуры, включая анестезию и обезболивание для минимизации страданий животных.

ПРИМЕЧАНИЕ: Кратко: целое сердце быстро удаляется из грудной полости мыши и подвергается ретроградной перфузии с раствором коллагеназы типа II через аппарат Лангендорфа для ферментативного переваривания внеклеточного матрикса. После полного переваривания тканей размягшийся миокард аккуратно диссоциируется в одноклеточную суспензию. Полученная клеточная суспензия последовательно фильтруется для удаления непереваренных фрагментов ткани, за которым следует гравитационная седиментация для обогащения жизнеспособных кардиомиоцитов. Очищенные кардиомиоциты затем могут использоваться для последующих экспериментальных применений.

1. Подготовка перфузионного устройства Лангендорфа

ПРИМЕЧАНИЕ: Система Лангендорфа имеет общий объём труб 15,5 мл. Скорость перфузионного потока составляет 3,5 мл/мин при сердечной перфузии и 10-15 мл/мин для промывки системы.

  1. Промите перфузионную систему Лангендорфа 50 мл этанола 75%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите ежемесячную чистку стеклянных трубок с помощью 1 M HCl для обеспечения стерильности.
  2. Прополосните 250 мл стерильногоddH 20, чтобы удалить остатки этанола и устранить пузырьки воздуха.
  3. Установите температуру водяной бани на 42 °C. Включите насос для запуска циркуляционного нагрева и наполните внешнюю полость серпантинной трубки теплой водой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это гарантирует, что перфузат достигает сердца при 37 °C.

2. Подготовка буфера

  1. Подготовьте буфер для раствора Кребса-бикарбоната (KB), перфузионный буфер (PB), буфер для пищеварения (DB), среду для миоцитной пластины (MPM) и среду для культуры миоцитов (MCM) согласно формулам, перечисленным в Таблице 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте свежим в день использования.
  2. Предварительное охлаждение 10 мл буфера KB на льду.
  3. Заполните просвет маслом с маслом. Установите расход на 3,5 мл/мин и измерьте температуру стока (оптимально 37 °C).
  4. Промите 7 мл базы данных в конвейер, а затем закройте перфузионную линию.
  5. Приготовьте раствор натрия гепарина (0,5%, 62,5 KU) и заправьте 300 мкл в инсулиновый шприц.
  6. Аликвот 10 мл PB и 10 мл KB в две отдельные чашки Петри и предварительно охладите их на льду.
  7. Поставьте сито для ячейки 100 мкм на крышку центрифугной трубки на 50 мл, предварительно смочите его 1 мл KB и закрепите на центрифугной трубке на 50 мл.

3. Извлечение сердца и канулирование

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе стерильные перчатки, инструменты, марля и ватные палочки использовались на протяжении всей процедуры для минимизации внешнего загрязнения. Хотя полная асептическая техника необходима для первичной клеточной культуры, здесь она служила для поддержания благополучия животных и целостности тканей для последующих гистологических и молекулярных анализов, а не для поддержания стерильности при выделении клеток.

  1. Анестезия мыши с помощью внутрибрюшинной инъекции 80 мг/кг пентобарбитала натрия (фармацевтического класса) в сочетании с 5 МЕ/г гепарина натрия массы тела. Внимательно следите за процессом, пока не будет получена глубокая анестезия. Щипните пальцы мыши и наблюдайте за исчезновением рефлекса «щипка пальцев», чтобы подтвердить успех анестезии.
  2. Удалите грудные волосы с помощью депиляционного крема.
  3. Закрепите мышь на поролоновой доске и продезинфицируйте кожу груди 75% спирта.
  4. Поднимите грудную кожу щипцем и сделайте разрез в отростке модиковидного отростка.
  5. Поднимите ксифовидную кость и разрежьте рёбра в сторону подмышечных областей, затем полностью пересечьте диафрагму.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повреждения сердца.
  6. Обездвижите грудину и ребра гемостатическими щипцами, чтобы полностью обнажить сердце.
  7. Впитывайте кровь и аккуратно перемещайте печень к задним конечностям с помощью тканей. Аккуратно используйте ватные палочки, чтобы манипулировать сердцем и обнажить нижнюю полую вену.
  8. Введите 300 мкл раствора гепарина натрия (начиная с шага 2.5) в нижнюю полую вену с помощью подготовленного инсулинового шприца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы предотвратить появление воздушных пузырьков.
  9. Удалите тимусную ткань, затем перерезайте окружающие вены и артерии. Немедленно перенесите сердце в предварительно охлаждённый буфер с маслом (начиная с шага 2.6).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление тимуса улучшает видимость аорты. Сохраняйте сегмент аорты во время удаления. Сокращение миокарда замедлялось предварительно охлаждённым раствором PB. Удаление сердца под анестезией обеспечивает гуманную эвтаназию.
  10. С помощью микропинцета захватите аорту и закрепите её на канюле перфузионной системы Лангендорфа. Закрепите швом 5-0.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг быстро. Убедитесь, что перфузионная система отключена во время установки сердца.

4. Сердечная перфузия

  1. Включите систему перфузии и запустите тайминг на 2 минуты 30 секунд. В этот период стоки состоят из буфера PB и не требуют сбора.
  2. После прохождения интервала 2 минуты и 30 секунд начните собирать и циркулировать буфер DB, отсчитывая время в течение 15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за состоянием миокарда — оптимальное пищеварение характеризуется снижением эластичности тканей и повышенной прозрачностью. Если пищеварение кажется неполным, длительность может быть умеренно увеличена, но не должна превышать 20 минут в целом, чтобы предотвратить повреждение кардиомиоцитов.
  3. После определённого времени переключитесь с буфера DB на PB и продолжайте перфузию ещё 4 минуты 30 секунд. Стоки в этой фазе содержат буфер DB; Заберите его.
  4. Прекратите перфузию, отключив систему после финального тайминга.

5. Диссоциация и очистка клеток

  1. Вынимите сердце из канюли и переместите его в заранее охлаждённый буфер KB (подготовленный на шаге 2.6).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ферментативное пищеварение было прервано немедленным переносом сердца в буфер KB. Это быстро разбавливает остаточный фермент, предотвращая чрезмерное переваривание и обеспечивая высокую жизнеспособность клеток.
  2. С помощью тонких ножниц аккуратно вырежьте предсердные и аортальные ткани, сохраняя только миокард.
  3. Механически диссоциировать ткань миокарда на мелкие фрагменты (<1мм 3) с помощью микропинцета.
  4. Аккуратно сдувайте фрагменты ткани с помощью пипетки объемом 2 мл, чтобы получить суспензию в одной клеточке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте особенно осторожны во время выдувания, чтобы сохранить морфологию кардиомиоцитов в форме палочки. Избегайте использования стандартных наконечников пипеток, так как их узкий канал может механически нарушить целостность клеточной клетки.
  5. Фильтруйте полученную суспензию ячейки через предварительно увлажнённое сито 100 мкм (собранное на этапе 2.7) в трубку объёмом 50 мл.
  6. Перенесите фильтрованную суспензию в трубку объёмом 15 мл и дайте кардиомиоцитам оседать с помощью гравитационного осадка (15 мин, 4 °C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Уменьшенная базальная поверхность трубок объёмом 15 мл значительно повышает эффективность восстановления клеток по сравнению с трубками 50 мл.
  7. Аккуратно аспирируйте супернатант, ресуспендуйте гранулированные кардиомиоциты в 10 мл ледяного буфера KB с помощью трансферной пипетки объемом 2 мл и повторяйте седиментацию (15 мин, 4 °C).
  8. Повторите шаги 5.4-5.7, чтобы получить очищенный препарат из целых, палочкообразных кардиомиоцитов, подходящих для применения.

6. Культура клеток

  1. Покройте посуды ламинином 10 мкг/мл и инкубируем при 37 °C в течение 2 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы минимизировать механические повреждения палочкообразных кардиомиоцитов и сократить длительное время обработки, связанное с дифференциальной пластиной, в этом исследовании использовалось ламининовое покрытие вместо дифференциального покрытия — стратегия, которая не только повышает эффективность клеточного прикрепления, но и сохраняет естественные физиологические характеристики кардиомиоцитов.
  2. Ресуспендировать кардиомиоциты в 4 мл предварительно нагретого (37 °C) MPM. После удаления раствора ламинина посейте кардиомиоциты в покрытые чашки. Инкубировать при 37 °C с 2%CO2 в течение 1 часа. Наблюдайте морфологию, размер и плотность клеток под микроскопом.
  3. После инкубации аккуратно декантуйте MPM и замените его на предварительно подогретый (37 °C) MCM. Поддерживайте инкубацию при 37 °C с 2%CO2 в течение 24 часов.
  4. Через 24 часа осмотрите кардиомиоциты на структурную целостность и морфологию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соблюдайте строгую асептическую технику на протяжении всей процедуры.
    ВНИМАНИЕ: Коллагеназа типа II может вызывать респираторные аллергии, раздражение кожи и глаз. Обязательно работайте в хорошо проветриваемом помещении и избегайте вдыхания пыли и контакта с кожей и слизистыми. Все выброшенные сердечные ткани, образцы крови и одноразовые материалы, соприкасавшиеся с ними, должны быть собраны как биологически опасные отходы в специализированные, герметичные контейнеры с символом биологической опасности. Эти материалы впоследствии подвергаются централизованным процедурам дезактивации и утилизации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Процедура изоляции и культуры кардиомиоцитов взрослых мышей продемонстрирована в протоколе, при этом необходимые инструменты и система трубок показаны на рисунке 1. Морфологическая оценка показала, что только что выделенные кардиомиоциты, а также культивируемые в течение 1 и 24 часа, все имели характерную палочковидную или веренообразную морфологию с чётко видимыми полосами (рисунки 2A-C). Иммунофлуоресцентн...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Это исследование представляет собой значительный методологический прорыв в кардиологических исследованиях, разработав оптимизированный протокол выделения и культуры кардиомиоцитов взрослых мышей. Систематически уточняя буферный состав и параметры ферментативного пищеварения, этот подход значительно повышает надёжность системы культуры, одновременно повышая чистоту и жизнеспособность кардиомиоцитов. Эти технические достижения предоставляют надёжную платформу для моделирования сердечно-сос...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

Мы с благодарностью выражаем признательность за финансовую поддержку, оказанную Национальным фондом естественных наук Китая (No 82400312).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
BDMAladdin Scientific Corporation, Шанхай, КитайD111028
BSAAladdin Scientific Corporation, Шанхай, КитайB265994
C57BL/6 мыши и bbsp;GemPharmatech Co., Ltd8– 12-недельный самец  
CaCl2Aladdin Scientific Corporation, Шанхай, КитайC431202
Коллагеназа типа IIWorthington Biochemical Corporation (США)LS004176LOT#:43D23502    Единицы активности ферментов: 270u/mg dw
FBSBeyotime Biotechnology, КитайC0226
ГлюкозаAladdin Scientific Corporation, Шанхай, КитайD639737
HEPESСигма-ОлдричH7006
KClAladdin Scientific Corporation, Шанхай, КитайP112134
KH2PO4Aladdin Scientific Corporation, Шанхай, КитайP104075
L-глутаминТермо Фишер Сайентифик25030081
MEMТермо Фишер Сайентифик11095080
MgSO4Aladdin Scientific Corporation, Шанхай, КитайM116444
Na2HPO4Aladdin Scientific Corporation, Шанхай, КитайS274390
NaClAladdin Scientific Corporation, Шанхай, КитайC111547
2PO4Aladdin Scientific Corporation, Шанхай, КитайS108339
NaHCO3Aladdin Scientific Corporation, Шанхай, КитайS112338
Пенициллин-стрептомицин (100 раз)Beyotime Biotechnology, КитайC0222
Микроскоп для инвертированной клеточной культуры Primovert Карл Цейсс
ТауринAladdin Scientific Corporation, Шанхай, КитайT103829

Ссылки

  1. Crea, F. The burden of cardiovascular risk factors: a global perspective. Eur Heart J. 43 (30), 2817-2820 (2022).
  2. Ackers-Johnson, M., et al. A simplified, Langendorff-free method for concomitant isolation of viable cardiac myocytes and nonmyocytes from the adult mouse heart. Circ Res. 119 (8), 909-920 (2016).
  3. Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study. Dev Biol. 80 (2), 466-482 (1980).
  4. Karakikes, I., Ameen, M., Termglinchan, V., Wu, J. C. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: insights into molecular, cellular, and functional phenotypes. Circ Res. 117 (1), 80-88 (2015).
  5. Protze, S. I., Lee, J. H., Keller, G. M. Human pluripotent stem cell-derived cardiovascular cells: From developmental biology to therapeutic applications. Cell Stem Cell. 25 (3), 311-327 (2019).
  6. Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
  7. Mohamed, T. M. A., et al. Regulation of cell cycle to stimulate adult cardiomyocyte proliferation and cardiac regeneration. Cell. 173 (1), 104-116.e12 (2018).
  8. Wang, W. E., et al. Dedifferentiation, proliferation, and redifferentiation of adult mammalian cardiomyocytes after ischemic injury. Circulation. 136 (9), 834-848 (2017).
  9. Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell Biochem Biophys. 61 (1), 93-101 (2011).
  10. Li, D., Wu, J., Bai, Y., Zhao, X., Liu, L. Isolation and culture of adult mouse cardiomyocytes for cell signaling and in vitro cardiac hypertrophy. J Vis Exp. (87), e51357(2014).
  11. Alam, P., Maliken, B. D., Ivey, M. J., Jones, S. M., Kanisicak, O. Isolation, transfection, and long-term culture of adult mouse and rat cardiomyocytes. J Vis Exp. (164), e61073(2020).
  12. Kruppenbacher, J. P., May, T., Eggers, H. J., Piper, H. M. Cardiomyocytes of adult mice in long-term culture. Naturwissenschaften. 80 (3), 132-134 (1993).
  13. Dambrot, C., et al. Serum supplemented culture medium masks hypertrophic phenotypes in human pluripotent stem cell derived cardiomyocytes. J Cell Mol Med. 18 (8), 1509-1518 (2014).
  14. Karliner, J. S., Simpson, P. C., Taylor, J. E., Honbo, N., Woloszyn, W. Adrenergic receptor characteristics of cardiac myocytes cultured in serum-free medium: comparison with serum-supplemented medium. Biochem Biophys Res Commun. 128 (1), 376-382 (1985).
  15. Zheng, X., et al. Proteomic analysis for the assessment of different lots of fetal bovine serum as a raw material for cell culture. Part IV. Application of proteomics to the manufacture of biological drugs. Biotechnol Prog. 22 (5), 1294-1300 (2006).
  16. O'Connell, T. D., Rodrigo, M. C., Simpson, P. C. Isolation and culture of adult mouse cardiac myocytes. Methods Mol Biol. 357, 271-296 (2007).
  17. Gong, Y., et al. Mitochondrial tumor suppressor 1A attenuates myocardial infarction injury by maintaining the coupling between mitochondria and endoplasmic reticulum. Circulation. 152 (3), 183-201 (2025).
  18. Xiao, C., et al. FMO2 prevents pathological cardiac hypertrophy by maintaining the ER-mitochondria association through interaction with IP3R2-Grp75-VDAC1. Circulation. 151 (23), 1667-1685 (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Изоляция кардиомиоцитовсердце взрослой мышиочистка кардиомиоцитовколлагеназное перевариваниепокрытие ламининомжизнеспособность клетоксаркомерная структурасердечно-сосудистые исследования
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.