Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Радиохимическая оценка активности фермента гликогенсинтазы в тканях животных

436 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69103

⸱

24 октября 2025 г.

 , 
1Indiana University School of Medicine-Muncie and Ball State University

В этой статье

Краткое содержание

В анализе тканей животных используется ядерное сцинтилляционное обнаружение для определения ферментативной активности гликогенсинтазы путем измерения включения радиоактивно меченой глюкозы в гликоген.

Аннотация

Гликоген является важным метаболитом для многих эукариотических клеток, неотъемлемым элементом хранения энергии и быстрого ее высвобождения. Построение молекулы зависит от гликогенсинтазы, высокорегулируемого фермента, основной функцией которого является содействие последовательному присоединению единиц глюкозы в растущем полимере гликогена. Этот фермент аллостерически активируется глюкозо-6-фосфатом и ингибируется в нескольких местах путем фосфорилирования. Знание ферментативной активности гликогенсинтазы является ключевым компонентом понимания метаболизма гликогена, уровня мышечной энергии и метаболических нарушений, таких как диабет и болезни накопления гликогена. Описан высокочувствительный и эффективный метод определения активности гликогенсинтазы в мышечной ткани животных путем измерения количества интегрированной глюкозы из радиоактивно меченной [14C]-UDP-глюкозы в молекулы гликогена. В этой процедуре используется радиоактивный 14С, и для этого потребуется соответствующее разрешение и лабораторное помещение для использования и утилизации. Для этой процедуры также потребуется доступ к жидкостному сцинтилляционному счетчику.

Введение

Гликоген, сильно разветвленный полисахарид, состоящий из единиц глюкозы, служит важным энергетическим резервом в различных тканях, включая мышцы, печеньи мозг. Его синтез и деградация управляются сложной системой специализированных ферментов и регуляторных белков. Жизненно важным для его биосинтеза является фермент гликогенсинтаза (GYS), которого существует две изоформы (GYS1 и GYS2). GYS1 является регуляторным ферментом, непосредственно ответственным за создание гликогена из глюкозы в клетках, не относящихся к печени, в то время как GYS2 функционирует в печени. Этот процесс, известный как гликогенез, представляет собой последовательное добавление отдельной единицы глюкозы в растущую гликогеновую цепь. GYS катализирует перенос глюкозы от промежуточного уридиндифосфата глюкозы (UDP-глюкоза) к концу гликогеновой цепи, создавая альфа-1,4-гликозиднуюсвязь2. В координации с ферментом ветвления гликогена эта реакция удлиняет молекулы гликогена, обеспечивая как эффективное хранение, так и высвобождение энергии.

Существуют методы анализа для измерения активности фермента, причем одна из наиболее распространенных групп методов состоит из спектрофотометрических разновидностей 3,4. Эти анализы обычно основаны на системе непрямых связанных реакций и измеряют поглощение продукта на последующих стадиях, NADH, при длине волны 340 нм. Одна единица НАДН потребляется на каждую единицу УДФ, высвобождаемую из УДФ-глюкозы гликогенсинтазой, производя измеримое возбуждение, которое напрямую коррелирует с активностью гликогенсинтазы 5,6. Несмотря на то, что спектрофотометрические анализы относительно недороги и доступны, они имеют незначительный недостаток, заключающийся в том, что они полагаются на непрямую реакцию, и основные недостатки интерференции из-за мутности образца и более низкой чувствительности, особенно это проблема для небольших образцов или образцов с малым/высоким содержанием фосфорилированной гликогенсинтазы. Флуориметрические анализы с использованием описанных выше сопряженных реакций были разработаны для повышения чувствительности мышечной ткани человека7 и мыши8. Существуют и другие методы количественного определения гликогенсинтазы, такие как иммуноблоттинг9 и иммуногистохимия10; Тем не менее, эти методы позволяют количественно оценить только физическое количество фермента и, в лучшем случае, могут сделать вывод об активности фосфорилирования, но не могут напрямую количественно оценить активность фермента.

Среди этих методов ферментного анализа радиохимические методы остаются наиболее широко используемыми для определения активности гликогенсинтазы в тканях млекопитающих из-за отсутствия помех со стороны мутности образца и их высокой чувствительности 8,9. Эти анализы включают меченую радиоактивными веществами глюкозу из UDP-глюкозы, меченной 14C12 или 3H13, в гликоген, что позволяет напрямую измерять активность фермента в течение определенного периода времени. В последующей процедуре образец ткани, содержащий гликогенсинтазу, подвергают воздействию УДФ-глюкозы и гликоген-праймера. Гликогенсинтаза катализирует реакцию, показанную в уравнении ниже:

УДФ-[14С]глюкоза + (гликоген)n → (гликоген)n+1[14С] + УДФ

По прошествии определенного промежутка времени реакцию прекращают, и гликоген, содержащий меченую радиоактивными метками глюкозу, либо осаждают на фильтровальную бумагу12 (как описано ниже), либо подвергают гель-фильтрации, как описано в работе Niederwanger et al.14 , и измеряют с помощью сцинтилляционного детектора. Этот метод также включает в себя отдельную идентичную реакцию, в состав которой входит глюкозо-6-фосфат (G6P) – аллостерический активатор гликогенсинтазы. В условиях с достаточным уровнем G6P активность гликогенсинтазы максимально активируется, демонстрируя абсолютный потенциал активности гликогенсинтазы данного образца. Описанный здесь метод был модифицирован из Suzuki и коллег15 до 96-луночного формата и оптимизирован для использования в мышечной ткани мыши; Тем не менее, протокол может быть изменен для других тканей и видов животных.

Несмотря на присущие радиоактивным материалам соображения стоимости и безопасности, радиохимические анализы имеют значительные преимущества по сравнению с нерадиоактивными альтернативами, при условии наличия приборов. Следующая процедура подробно описывает высокочувствительные и надежные средства определения активности гликогенсинтазы, ключевого фермента в метаболизме гликогена, в мышечной ткани животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Университета штата Болл. Мужская и женская когорты B6; В качестве репрезентативного примера в данной рукописи используются мыши дикого типа 129-Gaatm1Rabn/J в возрасте 3 месяцев. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Подготовка перед анализом

  1. Забор ткани по вывиху шейки матки16 и немедленное замораживание в жидкости N2 для сохранения запасов гликогена и хранение в жидкости N2 или сверхнизкой морозильной камере до начала анализа.
  2. Готовьте исходные растворы до начала анализа гликогенсинтазы (табл. 1).
  3. Определите количество реплицированных образцов мышей и контрольной группы, желаемых для проведения анализа. Для каждого образца мыши требуется четыре репликации, по две на каждую реакцию (наличие или отсутствие G6P) (см. рисунок 1 и таблицу 2).
  4. Нарежьте хроматографическую бумагу на полоски по 4 см. Гликоген прикрепляется к этой бумаге и остается связанным в процессе стирки. Используя ширину (6 мм) измельчителя бумаги, измельчите хроматографическую бумагу на тонкие отдельные сегменты.
  5. С помощью карандаша пометьте обозначенные бумажные полоски с идентификацией мыши, пробелами и итогами. Избегайте использования чернил.
  6. Загрузите хроматографическую бумагу в шаблон для деревянных блоков. Каждый шаблон вмещает до 12 листов бумаги, что соответствует одному ряду 96-луночного планшета.
  7. Приобретите хроматографические бумажные зажимы (крышки буфера обмена).
  8. Подготовьте по одному зажиму для каждого ряда реакции, зажимая края хроматографических бумаг, оставляя большую часть поверхности бумаги открытой. Убедитесь, что помеченные края видны.
  9. Маркировка 1,7 мл микрофуговых пробирок с идентификацией образца. Две пробирки на образец; один для гомогената и один для надосадочной жидкости.
  10. Перед началом анализа приготовьте реакционные смеси + и - G6P, более подробную информацию см. в таблице 3 . Приготовьте по 2 400 мкл аликвот каждой реакционной смеси.

2. Реакция активности радиохимической гликогенсинтазы

ВНИМАНИЕ: На этом этапе используется [14C]-UDP-глюкоза, которая является радиоактивным материалом. Обрабатывайте, храните и утилизируйте в порядке, одобренном Комиссией по ядерному регулированию (NRC).

  1. Добавьте 30 мкл [14C]-UDP-глюкозы (0,1 μCi/μл) к 2400 μL аликвот обеих (+/- G6P) реакционных смесей для получения конечной концентрации 0,0012 μCi/μл. Этот рецепт подходит для 18 образцов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем [14C]-UDP-глюкозы может быть изменен для экономии использования и обеспечения адекватной чувствительности. Например, используйте 50 мкл для тканей мозга мыши и 25 мкл для сердца мыши.
  2. Вихревые реакционные смеси и аликвоты по 50 мкл в каждую лунку 96-луночного планшета, в котором будут содержаться образцы, заготовки и итоги (табл. 2). После этого накройте пленкой для тарелки и поставьте при температуре 4 С.
  3. Разложите ингибиторы протеазы для размораживания при комнатной температуре. Эти ингибиторы перечислены в таблице 4 с дополнительной информацией.
  4. Массуйте 30-50 мг замороженной ткани. ~30 мг оптимально для образцов скелетных мышц и сердца; ~50 мг для мозга. Храните тканевые и микрофуговые пробирки в жидкости N2 и быстро взвешивайте ткань, чтобы убедиться, что ткань остается замороженной. С помощью остывшего пестика измельчите ткань дальше.
  5. Приготовить гомогенизационный буфер с ингибиторами протеазы на льду.
  6. По одному образцу перемещайте пробирку с тканью из жидкого N2 в лед с холодной шапочкой на 1 мин. Добавьте холодный колпачок (колпачок пробирки с тремя маленькими отверстиями, охлажденный в жидкости N2) в пробирку с образцом, еще находясь в жидкости N2. Это предотвращает потерю тканей, так как остаточная жидкость N2 в пробирке испаряется. После выхода из жидкости N2 образцы должны оставаться во льду.
  7. После того, как вы окажетесь на льду, добавьте объем (10-30 мкл/мг ткани) гомогенизационного буфера в образец и гомогенизируйте образец с помощью Tissue-Tearor. После выполнения этих двух шагов переходите к следующему образцу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера, добавляемого к образцам, может быть оптимизирован в зависимости от источника ткани. Например: 30 μЛ/мг для скелетных мышц, 15 μЛ/мг для сердца и 10 μЛ/мг для мозга.
  8. Центрифугируйте образцы в течение 5 мин при 4 °C при 3 600 г и перенесите надосадочную жидкость в чистую микрофуговую пробирку. Будьте осторожны, не прикасайтесь к гранулам. Сделать вихрь и добавить ~150 мкл в соответствующие лунки в 96-луночную пластину с V-образным дном на льду. Оставьте остаток для надосадочной жидкости для анализа по Брэдфорду (см. шаг 2.15)
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании дополнительные аликвоты образца могут быть сохранены для последующих анализов, таких как иммуноблоттинг.
    ВНИМАНИЕ: Шаги с 2.9 по 2.14 требуют обращения с 14C. Утилизируйте все загрязненные материалы способом, одобренным NRC.
  9. Снимите пластину с реакционной смесью с температуры 4 °C и нагрейте до 30 °C на термоамплификаторе со снятой пленкой. За это время получить 1 л -20 °C 66% этанола и добавить в стакан для мытья с помощью палочки для перемешивания на пластине для перемешивания.
  10. Инициируйте реакцию путем добавления 25 мкл надосадочной жидкости образца в реакционные лунки и 25 мкл гомогенизационного буфера в пустые и полные лунки. Используйте многоканальную пипетку, чтобы добавить до 1 ряда на реакционной пластине за раз, ожидая не менее 1 минуты между рядами. Запишите время начала реакции для каждой строки. Для получения дополнительной информации см. Таблицу 2 . Используйте многоканальную пипетку и убедитесь, что в нее добавлено равное количество жидкости.
  11. Дайте 10-15 минут, чтобы реакция прошла; Однако время выполнения должно быть идентичным между строками.
  12. Отасканируйте 55 мкл из каждой лунки с помощью многоканальной пипетки и распределите на соответствующую предварительно подготовленную хроматографическую бумагу. Перемешайте реакцию, пипетируя вверх и вниз перед аспирацией. Пятнистая жидкость в центре хроматографических бумаг.
  13. Удалите листы с итогами с зажима с помощью щипцов после пятнистости жидкости из лунки. Их можно разложить на алюминиевой фольге для безопасной сушки. Бросьте всю остальную хроматографическую бумагу в ванну с 66% этанолом. Гликоген нерастворим в 66% этанола, в то время как [14C]-UDP-глюкоза растворима и смывает хроматографическую бумагу.
  14. Повторите шаги 2.11 и 2.12 для каждого ряда на реакционной пластине. Убедитесь, что время реакции в каждой строке одинаково, записав время начала и окончания реакции.
  15. После того, как все рядки будут добавлены в перемешивающий 66% этанол, вымойте в течение 15 минут.
    Примечание: На этом этапе и последующих этапах промывки могут быть подготовлены аликвоты образца для дополнительных анализов, таких как анализ Брэдфорда, отвечающий за определение общего объема белка для нормализации, что необходимо для расчета ферментативной активности.
  16. Утилизируйте 66% этанола без потери хроматографической бумаги. Умыться с 1 л нового 66% этанола в течение 30 минут. Этот 66% этанол может находиться при комнатной температуре.
  17. Повторите предыдущий шаг в общей сложности три промывки по 30 мин 66% этанолом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При желании 66% этанол из заключительной стадии промывки может быть сохранен и храниться при температуре -20 °C для последующих анализов.
  18. После удаления 66% этанола погрузите всю хроматографическую бумагу в стакан для промывки в ацетон. Ацетон облегчает процесс сушки.
  19. Снимите хроматографические бумаги с ацетона и положите их на алюминиевую фольгу. Сохраните или утилизируйте ацетон.
  20. Просушите хроматографические бумаги под тепловой лампой в течение 15 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сухая бумага может храниться неограниченное время. Бумаги можно безопасно хранить до тех пор, пока они не будут готовы к обнаружению сцинтилляции.

3. Измерение активности с детектированием сцинтилляции

  1. С помощью щипцов переместите хроматографическую бумагу в сцинтилляционные флаконы, расположенные в сцинтилляционных штативах. Запишите, как ориентированы образцы работ.
  2. Добавьте 5 мл сцинтилляционной жидкости в каждый флакон с помощью насоса с крышкой. Закрутите крышки для каждого флакона.
  3. Загрузите образцы в сцинтилляционный детектор и загрузите стойку за образцами. Убедитесь, что выбрана программа для мониторинга 14С. Начните обнаружение, выбрав Автоматический подсчет.
  4. Распечатать результаты
  5. Утилизируйте сцинтилляционные пробирки и их содержимое в порядке, одобренном NRC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

В соответствии с протоколом, распечатка, созданная сцинтилляционным детектором, будет содержать измеренное количество ионизирующего излучения, испускаемого каждой хроматографической бумагой, содержащей флакон, напрямую коррелированное с уровнем активности гликогенсинтазы. Сцинтилляционный детектор вычисляет количество обнаруженного излучения в минуту (CPM) для каждого образца, заготовки и общего количества за определенный период времени. Сначала преобразуйте CPM в DPM (disintegrations pe...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Измерение активности фермента гликогенсинтазы является ценным инструментом для мониторинга метаболизма гликогена при различных метаболических состояниях и заболеваниях. Измерение в отсутствие и в присутствии глюкозо-6-фосфата (G6P) позволяет получить представление о регуляторном статусе фермента и косвенном показателе состояния фосфорилирования. Анализ включения [U-14C]-UDP-глюкозы является эффективным и хорошо документированным методом измерения ферментативной активности глик...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Финансирование было частично предоставлено Государственным университетом Болл, Медицинской школой Университета Индианы в Манси и компанией Aro Biotherapeutics.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
[14C] Уридин 5-дифосфо-глюкозаАмериканские радиомаркированные химикатыARC 0154
31 Статья по хроматографии ETCHRУотман3031 915
Бензамидин гидрохлоридгидратSigmaB6506
Бета-меркаптоэтанолSigmaM3148
Сухая ваннаTorey Pines ScientificSC25
Этанол (200 proof)PharmcoAaper111000200
Тетрауксусная кислота этиленгликоля (EGTA)SigmaE4378
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА)SigmaE5134
Глюкозо-6-фосфат натрия сольSigmaG7879
Гликоген из печени кролика (тип III)SigmaG8876
Микропластина, плоскодонная, 96 колодцаГрейнер655101
Микропластина, PCR, 96 колодецDOT Scientific951-PCR
Многоцелевой сцинтилляционный счётчикБекман КоултерLS 6500
Дигидрат фторида калияSigma221872
Коктейль с ингибиторами протеазыGoldBioGB-108-2
Сцинтилляционный коктейльReasearch Products International111195
Сцинтилляционные флаконыReasearch Products International125509
Фторид натрияSigmaS7920
Tissue TearorПродукты BiospecМодель 398
Тозиллизинхлорметилкетон (TLCK)SigmaT7254
База Тризмы (99,9%)SigmaT1503
Гидрохлорид тризмыSigmaT3253
Уридин 5-дифоспо-глюкозаSigmaU-4625

Ссылки

  1. Preiss, J., Walsh, D. A. Biology of Carbohydrates. Ginsburg, V., Robbins, P. 1, John Wiley. 199-314 (1981).
  2. Pederson, B. A. Enzymology of Complex Alpha-Glucans. , CRC Press. 84-137 (2021).
  3. Wayllace, N. Z., et al. An enzyme-coupled continuous spectrophotometric assay for glycogen synthases. Mol Biol Rep. 39 (1), 585-591 (2012).
  4. Wilson, W. A. Spectrophotometric Methods for the Study of Eukaryotic Glycogen Metabolism. J Vis Exp. (174), e63046(2021).
  5. Danforth, W. H. Glycogen synthetase activity in skeletal muscle. Interconversion of two forms and control of glycogen synthesis. J Biol Chem. 240, 588-593 (1965).
  6. Leloir, L. F., Olavarria, J. M., Goldemberg, S. H., Carminatti, H. Biosynthesis of glycogen from uridine diphosphate glucose. Arch Biochem Biophys. 81 (2), 508-520 (1959).
  7. Schalin-Jantti, C., Harkonen, M., Groop, L. C. Impaired activation of glycogen synthase in people at increased risk for developing NIDDM. Diabetes. 41 (5), 598-604 (1992).
  8. Huang, X., Hansson, M., Laurila, E., Ahren, B., Groop, L. Fat feeding impairs glycogen synthase activity in mice without effects on its gene expression. Metabolism. 52 (5), 535-539 (2003).
  9. Holt, B. D., et al. A novel CD71 Centyrin: Gys1 siRNA conjugate reduces glycogen synthesis and glycogen levels in a mouse model of Pompe disease. Mol Ther. 33 (1), 235-248 (2025).
  10. Prats, C., et al. Phosphorylation-dependent translocation of glycogen synthase to a novel structure during glycogen resynthesis. J Biol Chem. 280 (24), 23165-23172 (2005).
  11. Perezleon, J. A., Osorio-Paz, I., Francois, L., Salceda, R. Immunohistochemical localization of glycogen synthase and GSK3beta: Control of glycogen content in retina. Neurochem Res. 38 (5), 1063-1069 (2013).
  12. Thomas, J. A., Schlender, K. K., Larner, J. A rapid filter paper assay for UDP-glucose-glycogen glucosyltransferase, including an improved biosynthesis of UDP-14C-glucose. Analytical Biochemistry. 25 (1), 486-499 (1968).
  13. Parker, G. J., Lund, K. C., Taylor, R. P., McClain, D. A. Insulin resistance of glycogen synthase mediated by O-linked N-acetylglucosamine. J Biol Chem. 278 (12), 10022-10027 (2003).
  14. Niederwanger, A., Kranebitter, M., Ritsch, A., Patsch, J. R., Pedrini, M. T. A gel filtration assay to determine glycogen synthase activity. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 820 (1), 143-145 (2005).
  15. Suzuki, Y., et al. Insulin control of glycogen metabolism in knockout mice lacking the muscle-specific protein phosphatase PP1G/RGL. Mol Cell Biol. 21 (8), 2683-2694 (2001).
  16. Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. Quick and humane sacrifice of a mouse by cervical dislocation. CSH Protoc. 2006 (1), prot4357(2006).
  17. Gomes, F. R., et al. Glycogen storage and muscle glucose transporters (GLUT-4) of mice selectively bred for high voluntary wheel running. J Exp Biol. 212 (Pt 2), 238-248 (2009).
  18. Greenberg, C. C., Jurczak, M. J., Danos, A. M., Brady, M. J. Glycogen branches out: new perspectives on the role of glycogen metabolism in the integration of metabolic pathways. Am J Physiol Endocrinol Metab. 291 (1), E1-E8 (2006).
  19. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  20. Gilboe, D. P., Larson, K. L., Nuttall, F. Q. Radioactive method for the assay of glycogen phosphorylases. Anal Biochem. 47 (1), 20-27 (1972).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

6
Радиохимическая оценка активности фермента гликогенсинтазы в тканях животных
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.