Методическая статья

Модель ампутации задних конечностей крысы ниже колена и немедленное целенаправленное мышечное реиннервирование

DOI:

10.3791/69119

⸱

22 мая 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Plastic Surgery, Medical College of Wisconsin

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол демонстрирует, как проводить ампутацию ниже колена у крыс и немедленно проводить таргетную мышечную реиннервацию (iTMR) для изучения стратегий лечения и предотвращения боли, связанной с ампутацией, а также для лучшего понимания болевых механизмов, связанных с ампутацией.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Боль, связанная с ампутацией, снижает качество жизни пациента, способствует употреблению опиоидов и может снижать функциональную реабилитацию и использование протезов. Доклинические модели, которые надёжно вызывают боль после ампутации и сохраняют подвижность, необходимы для изучения биологических механизмов, лежащих в основе этих результатов. Здесь мы представляем подробный, воспроизводимый хирургический протокол на грызунах с использованием крыс Спраг-Доули для моделирования ампутации задних конечностей ниже колена. Процедура включает выделение и пересечение ветвей седалищного нерва, включая большеберцовский, общий малокостный и суральный нервы, что приводит к длительной послеампутационной патологии нервов и поведению, связанному с болью. Крысы хорошо восстанавливаются после этой процедуры и могут двигаться сразу после операции без проблем с едой и питвём. Животных впоследствии можно оценивать с помощью рефлекторных и спонтанных мер боли. Болевые поведения, возникающие в результате этой процедуры, со временем устойчивы, и стандартные рефлекторные болевые поведения можно получить из пня. Важно, что сохраненная подвижность позволяет проводить продольные поведенческие тесты без запутанного нарушения моторности. Хотя этот протокол основан на ампутации, его можно легко адаптировать для внедрения целенаправленной мышечной реиннервации (ТМР) в постампутационном вмешательстве путём коапции пересечений нервов к близлежащим моторным ветвям нервов к бицепсу бедра и полумембранозу, что позволит исследовать реиннервационные вмешательства и их влияние на боль после ампутации. Ранее мы успешно использовали эту модель для оценки специфических по полу различий в болевом поведении после ампутации и для изучения эффектов TMR. Этот протокол предоставляет надёжную и гибкую платформу для изучения боли, связанной с ампутацией, формирования невром и функциональных исходов, с применимостью к трансляционным исследованиям, направленным на улучшение боли после ампутации.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хроническая боль — одно из самых тяжёлых осложнений после крупной ампутации конечности, затрагивающее до 70% пациентов 1,2,3. Традиционные методы управления болью, такие как фармакологические вмешательства, физиотерапия, нервные блокады и психологическая терапия, часто обеспечивают ограниченное или временноеоблегчение 4. Таким образом, существует значительная клиническая необходимость в эффективных долгосрочных стратегиях управления болью.

Таргетная мышечная реиннервация (TMR), изначально разработанная для улучшения контроля миоэлектрических протезов, стала перспективным способом облегчения боли после ампутацииконечности 5. Хирургическая техника заключается в перенаправлении пересечених смешанных моторно-сенсорных нервов на близлежащие моторные ветви. Клинически TMR показал значительное снижение фантомной боли в конечностях, остаточной боли в конечности и симптомов, связанных с невромой 6,7,8. Регенеративные периферические нервные интерфейсы (RPNI) — ещё одно хирургическое вмешательство, используемое при повреждении нервов и боли, связанной с ампутацией. Ампутированные нервные концы пришиваются и затем оборачиваются свободным (денервированным, аваскулярным) мышечнымтрансплантатом 9. Ампутированные аксоны нейротизируют денервированные нейромышечные соединения, создавая мышечное сокращение в трансплантате, которое может быть использовано для создания сигнала для контроля миопротеза. В отличие от TMR, RPNI был широко изучен в модели грызунов. Аналогично TMR, RPNI доказано предотвращает образование невром и снижает боль, связанную с повреждением пересечениянервов 10,11. Клинически показано, что RPNI снижает как фантомную, так и остаточную боль в конечности уампутантов 12.

Несмотря на клиническое применение, биологические механизмы, лежащие в основе обезболивающих эффектов TMR и RPNI, остаются плохо изученными. Доклинические модели имеют решающее значение для разъяснения этих механизмов. Ранее использовали модели пересечения нервов с модификацией для поверхностного анализа нерва с целью прямого тестирования на боль приневроме 10,11. Эти модели могут количественно измерить нейроматозную боль с помощью прямой стимуляции и невропатической боли, оценивая поведение спинального рефлекса в нетронутом нервном распределении, оставшееся в стопе. Например, повреждение сохранённого нерва поддерживает суральный нерв, а большеберцовый и общий малокостные нервы перерезаются. Тестирование на поведение боли проводится налатеральной стопе 13. Модель ампутации задних конечностей представляет собой самую тяжёлую возможную травму конечности. В связи с этим наблюдается масштабная потеря нейронов и значительные воспалительные и заживляющие потребности, связанные с подобной травмой. При повреждении нерва здоровые нейроны в DRG помогают поддерживать повреждённые нейроны. При ампутации популяция доступных здоровых нейронов значительно сокращается, и для каждого повреждённого нерва приходится большая потеря нейронов, чем если бы был повреждён только одиннерв 14,15,16. Предыдущие сообщения об ампутации задних конечностей грызуна для выживанияредки 17,18. Однако есть преимущества по сравнению с ампутацией верхней конечности, такие как обильное количество исторических данных, изучающих боль и регенерацию, связанные с седалищным нервом, а также многочисленные амбулаторные поведенческиетесты 19,20.

Чтобы устранить этот пробел, мы недавно разработали модель ампутации задних конечностей крыс с учётом немедленного ТМР (рисунок 1). Техника создания RPNI ранее публиковалась и может быть адаптирована для модели ампутации заднихконечностей 21. Эта модель тесно отражает клинические процедуры, позволяя оценить различные болевые поведения, формирование невром и сохранение нейронов (Рисунок 2)22. Наша работа показала значительные анальгетические преимущества ТМР по сравнению со стандартной ампутацией, профилактику невром и продемонстрировали половые диморфные реакции при холоднойчувствительности 22,23.

Представленный здесь протокол предоставляет детальную, стандартизированную визуальную демонстрацию хирургической техники, обеспечивая воспроизводимость и согласованность экспериментальных подходов. Чётко иллюстрируя ключевые этапы, включая изоляцию нервов, точное пересечение и безнатяжную коаптацию нервов, этот протокол предлагает исследователям надёжную основу для изучения механизмов, лежащих в основе профилактики анальгезии и невромы, опосредованной TMR.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с животными должны быть одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) и соответствовать Руководству Национального института здоровья (NIH) по уходу и использованию лабораторных животных.

1. Предоперационная подготовка

ПРИМЕЧАНИЕ: Использовались самцы и самки крыс рода Спраг-Доули (Charles River Laboratories) возрастом 8–10 недель и весом 250–300 г.

  1. Включите грелку и подготовьте стерильное хирургическое поле. Разместите стерильную подушечку перпендикулярно телу крысы для оптимальной экспозиции.
  2. Организуйте все хирургические инструменты и материалы: стерильный физиологический раствор (0,9% хлорида натрия), антисептик повидон-йод, мелоксикам, коагулятер, микрошов 10-0, впитываемые плетёные швы 4-0, линейка и кожный клей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все хирургические инструменты должны быть стерилизованы с помощью автоклавирования или стерилизации горячими бусинками.
  3. Индуцировать анестезию, поместив крысу в индукционную камеру с 4% изофлураном, кислородом 10 л/мин и воздухом 60%. После 4 минут или одного раза переключитесь на носовой конус и отрегулируйте изофлуран до 1,5–2,0% в зависимости от размера крысы.
  4. Сбрийте место операции от нижней части спины до всей задней конечности. Проведите тройную подготовку, чередуя антисептический раствор повидон-йод и спиртовые мазки, заканчивая спиртом.
  5. Вводите 1 мг/кг мелоксикама подкожно с помощью туберкулинового шприца (обычно 0,2 мл для крысы весом 200 г).

2. Ампутация ниже колена (рисунок 1)

  1. Используйте линейку, чтобы отметить линию коленного сустава и сделайте две дополнительные отметки на расстоянии 2 см и 3 см дистально от колена.
  2. Сделайте окружной разрез кожи в 3 см дистальной части колена с помощью скальпеля.
  3. Используйте тупую и резкую диссекцию, чтобы отделить кожу по окружности от подлежащей мышцы, пока она не начнёт свободно втягиваться.
  4. Повторите этот процесс подрыва с подлежащими мышцами, аккуратно рассекая до кости и сохраняя плоскости ткани. Отметьте большеберцовую кость/малоберцовую кость на 1 см проксимально от окружного разреза с помощью стерильного каубера или маркера.
  5. Используйте маленькие костные ножницы, чтобы перерезать большеберцовую и малоберцовую кости в отмеченном месте. Используйте коагулятор для достижения гемостаза. Осмотрите костный конец на наличие острых краёв и притупите или обрежайте по необходимости.
  6. Используя впитываемый шв 4-0, сплотите передний и задний мышечные компартменты над костью, чтобы создать мышечную подушечку. Начните с того, что наложите передний край на большеберцовую кость — основную точку давления. Обычно используется 4–6 прерванных швов.
  7. Закройте кожу латерально прерванными впитывающимися плетёнными швами 4-0, избегая наложения непосредственно на несущий пень. Нанесите кожный клей вдоль линии разреза.

3. Интервенционная операция с помощью ТМР (Рисунок 1)

  1. Сделайте продольный разрез для расщепления ягодичной мышцы диаметром 1,5–2 см примерно на 5 мм позади бедренной кости.
  2. Используйте тупую диссекцию для разделения ягодичной и подколенной мышц, обнажая седалищный нерв непосредственно проксимально от его трифуркации на большеберцовский, общий малокостный (CP) и суральный нервы.
  3. Определите проксимальные моторные ветви: одна большая ветвь проходит под каудофеморальной (CFM), давая начало ветви CFM, полумембранозу (SM) и бицепсу бедра (BF).
  4. Поднимите CFM ватной палочкой и разделите его. Тщательно нейролизуйте ветви SM и BF с помощью тупой диссекции под хирургическим микроскопом с помощью микрохирургических тонких щипцов Dumont.
    1. Используйте щипцы, чтобы схватить эпиневрий, а затем тонкими изогнутыми пружинными ножницами откройте эпиневрий и разделите его по продолу, разделив разные ветви друг от друга.
    2. Сохранить ветку CFM и разделить остальные возле седалищного ствола. Изгибающие моторы ветвятся вниз для облегчения коаптации.
  5. Нейролизуйте ишиас, открыв эпиневрий и разделив его тонкими изогнутыми пружинными ножницами. Аккуратно раздвигайте нервные ветви тонким щипцем. Захватите каждую из трёх ветвей (CP, большеберцовая и соральная) на расстоянии 5–10 мм от трифуркации щипцем.
  6. Напряжите и перерезайте каждый нерв как можно дальше. Захватив срезанный дистальный конец, сделайте чистый разрез до проксимального конца, вырезая не менее 5–10 мм.
  7. Выполняйте коаптации с помощью 10-0 нейлоновых швов: CP в SM с помощью одного шва, большеберцовая ветвь большой BF с одной-двумя швами, а суральная — к малой BF ветви с одним швом. Используйте не менее 3 узлов на шов, обеспечивайте расстановку без натяжения, избегайте достаточного затягивания для сжатия нерва и раскладывайте коаптации без резкого угла.

4. Группа, ориентированная только на ампутацию

  1. Перевязывайте CP, большеберцовый и суральный нервы швом 5-0. Обрабатывайте шёлк щипцами Dumont для завязывания швов. Убедитесь, что связка складывает нерв и закреплена четырьмя квадратными узлами.
  2. Аккуратно потяните каждый нерв проксимально, используя узел и перерезайте на 1–2 мм дистально от связки. Удалите 10 мм сегмента дистального нерва.
  3. Продолжите ампутацию, как указано в разделе 2.

5. Послеоперационный уход

  1. Верните крысу в тёплую клетку до передвижения. Введите вторую дозу мелоксикама (0,2 мл) подкожно через 24 часа.
  2. Ежедневно следите за целостностью раны, признаками инфекции, болью или страданием в течение 7 дней и при необходимости вмешивайтесь в соответствии с рекомендациями IACUC.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта модель ампутации задних конечностей надёжно вызывала невропатическое поведение, связанное с болью, сохраняя при этом способность к передвижению и исследованию у крыс. Как показано на рисунке 2, пересечение периферического нерва при ампутации без дистальной цели приводит к дезорганизованному росту аксонов и образованию невром в месте перевязки, что визуализируется с помощью иммуноокрашивания, связанного с генами B-тубулина и кальцитонина (CGRP). В отличие...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол подробно описывает основные хирургические шаги для обеспечения воспроизводимости модели ампутации задней конечности и демонстрирует сохранение движения и поведенческого взаимодействия в послеампутационном тестировании. Ключевые хирургические принципы, включая тщательную анатомическую идентификацию, минимальную манипуляцию нервами и безнапряжённое обращение с перерезанными нервами, подчёркиваются для обеспечения согласованности и воспроизводимости среди хирургов. Эти техниче...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликтах интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Это исследование было поддержано Медицинским колледжем Висконсинского исследовательского центра нейронаук, Фондом Риты Аллен и Фондом пластической хирургии. Авторы благодарят отделение сравнительной медицины за уход и поддержку по уходу за животными.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10-0 nylon microsuture (Arosurgical)AROSurgicalT04A10N07-13Мелкая нервная коаптационная шов. 10-0 микрошов. 
4-0 полигликолева кислота шовEthiconAQ1268Закрывающая шов для мышц и кожи. Растворимая 4-0 шов. 
5-0 шелковый хирургический шовGenericGenericШов для лигирования нервов
Взрослые крысы Спрэг-ДоуэлиCharles River LaboratoriesGenericЭкспериментальное животное
Алкогольные подготовительные подушечкиDukal CorporationGenericАнтисептик для кожи
Бетадин 10%Avrio Health LPGenericАнтисептик
Костные ножницыFST16030Инструмент для резки кости
КаuterFST18010-00Инструмент для гемостаза
Вата с наконечником (ProAdvantage)ProAdvantageRef 76100Манипуляция с тканями
Изгибные микродиссекторные ножницыFST15019-10Тонкие ножницы для нейролиза
Пинцет (тонкий Dumont)FST11254-20Инструмент для работы с нервами
Пинцет (Dumont для связывания швов)FST11063-07Инструмент для работы с швами
Марля USP тип VII (Cardinal Health)Cardinal HealthRef 2146Поддерживает стерильное поле
Огревающий подушечный нагреватель (контроллер температуры TC1000)GenericTC1000Устройство для контроля температуры
Индукционная камера (Braintree Scientific)Braintree Scientific Inc.GenericДля индукции анестезии
Изофлуран (Isospire)PhoenixGenericАнестезирующее средство
Мелоксикам (Ostilox)VetONE5 мг/млАналгезирующее средство
ЛинейкаGenericGenericИнструмент для измерения анатомических ориентиров
Стерильный физиологический растворBaxter0.9 Sodium Lot Y425131Раствор для ирригации
Хирургическая лезвие 15 FST10015-00Инструмент для разреза кожи
Туберкулиновая шприцевая игляGenericGenericДля введения лекарственных средств
Испаритель (модель 100 Surgivet)SurgivetModel 100 S/N W2211123Для поддержания анестезии
Ветбонд тканевой клейWorld Precision InstrumentsGenericКлей для кожи

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Balakhanlou, E., Webster, J., Borgia, M., Resnik, L. Frequency and severity of phantom limb pain in veterans with major upper limb amputation: results of a national survey. PM R. 13 (8), 827-835 (2021).
  2. Resnik, L., Ekerholm, S., Borgia, M., Clark, M. A national study of veterans with major upper limb amputation: survey methods, participants, and summary findings. PLoS One. 14 (3), e0213578(2019).
  3. Ephraim, P. L., Wegener, S. T., MacKenzie, E. J., Dillingham, T. R., Pezzin, L. E. Phantom pain, residual limb pain, and back pain in amputees: results of a national survey. Arch Phys Med Rehabil. 86 (10), 1910-1919 (2005).
  4. R, L., et al. Prosthesis satisfaction in a national sample of veterans with upper limb amputation. Prosthet Orthot Int. 44 (2), 81-91 (2020).
  5. Kuiken, T. A., et al. Targeted muscle reinnervation for real-time myoelectric control of multifunction artificial arms. JAMA. 301 (6), 619-628 (2009).
  6. Valerio, I. L., et al. Preemptive treatment of phantom and residual limb pain with targeted muscle reinnervation at the time of major limb amputation. J Am Coll Surg. 228 (3), 217-226 (2019).
  7. Chang, B., Mondshine, J., Attinger, C., Kleiber, G. Targeted muscle reinnervation improves pain and ambulation outcomes in highly comorbid amputees. Plast Reconstr Surg. 148 (2), 376-386 (2021).
  8. Dumanian, G. A., et al. Targeted muscle reinnervation treats neuroma and phantom pain in major limb amputees: a randomized clinical trial. Ann Surg. 270 (2), 238-246 (2019).
  9. Woo, S. L., et al. Regenerative peripheral nerve interfaces for the treatment of postamputation neuroma pain: a pilot study. Plast Reconstr Surg Glob Open. 4 (12), e1038(2016).
  10. Dehdashtian, A., et al. Sexually dimorphic pattern of pain mitigation following prophylactic regenerative peripheral nerve interface (RPNI) in a rat neuroma model. Neurosurgery. 93 (5), 1192-1201 (2023).
  11. Senger, J., et al. A direct comparison of targeted muscle reinnervation and regenerative peripheral nerve interfaces to prevent neuroma pain. Neurosurgery. 93 (5), 1180-1191 (2023).
  12. Kuniak, C. A., et al. Prophylactic regenerative peripheral nerve interfaces to prevent postamputation pain. Plast Reconstr Surg. 144 (3), 421e-430e (2019).
  13. Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87 (2), 149-158 (2000).
  14. Hu, P., McLachlan, E. M. Selective reactions of cutaneous and muscle afferent neurons to peripheral nerve transection in rats. J Neurosci. 23 (33), 10559-10567 (2003).
  15. Welin, D., et al. Survival and regeneration of cutaneous and muscular afferent neurons after peripheral nerve injury in adult rats. Exp Brain Res. 186 (2), 315-323 (2008).
  16. Jivan, S., Novikova, L. N., Wiberg, M., Novikov, L. N. The effects of delayed nerve repair on neuronal survival and axonal regeneration after seventh cervical spinal nerve axotomy in adult rats. Exp Brain Res. 170 (2), 245-254 (2006).
  17. Garg, R., Uygur, S., Cwykiel, J., Siemionow, M. Development of targeted muscle reinnervation model in hind limb amputated rats. J Reconstr Microsurg. 34 (7), 509-513 (2018).
  18. Lago, N., Navarro, X. Evaluation of the long-term regenerative potential in an experimental nerve amputee model. J Peripher Nerv Syst. 12 (2), 108-120 (2007).
  19. Hogan, Q. Animal pain models. Reg Anesth Pain Med. 27 (4), 385-401 (2002).
  20. Sadler, K. E., Mogil, J. S., Stucky, C. L. Innovations and advances in modelling and measuring pain in animals. Nat Rev Neurosci. 23 (2), 70-85 (2022).
  21. Svientek, S. R., Ursu, D. C., Cederna, P. S., Kemp, S. W. P. Fabrication of the composite regenerative peripheral nerve interface (C-RPNI) in the adult rat. J Vis Exp. (156), e60841(2020).
  22. Zepeda, J. L., Mraz, G., Roth, E., Weihrauch, D., Hoben, G. Rat hindlimb amputation model shows analgesia and sexually dimorphic cold hypersensitivity with immediate targeted muscle reinnervation. J Pain. 33, 105460(2025).
  23. Roth, E., et al. Targeted muscle reinnervation prevents and reverses rat pain behaviors after nerve transection. Pain. 164 (2), 316-324 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Видео скоро будет доступно

Похожие статьи