Методическая статья

In vitro Дифференцировка CD8 Т-клеток с резидентной памятью с использованием системы кокультуры эпителиальной органоидно-Т-клеточной клетки

DOI:

10.3791/69120

⸱

3 февраля 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology and Immunology, Brown University, 2Pathobiology Graduate Program, Brown University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для изучения дифференцировки CD8 Т-клеток и функции in vitro CD8 Т-клетки можно выделить из мыши для длительного совместного культивирования с уже сформированными инфицированными мышиными вагинальными эпителиальными органоидами. Здесь мы описываем этот процесс и оцениваем получение местных Т-клеточных маркеров памяти при совместном выращивании.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Барьерные слизистые ткани играют важную роль в дифференциации и функции резидентных Т-клеток. Среди разнообразных популяций клеток в этих тканях эпителиальные клетки являются ключевыми факторами дифференцировки Т-клеток. Однако наше понимание эпителиальных сигналов, формирующих биологию Т-клеток в слизистых средах, остаётся ограниченным, в значительной степени из-за отсутствия конкретных инструментов и сложности доступных моделей. Здесь мы описываем мышиную вагинальную эпителиальную систему кокультуры органоидных Т-клеток CD8, которая моделирует динамические взаимодействия между инфицированным эпителием и вирусоспецифическими Т-клетками CD8. Этот протокол позволяет проводить фенотипический и функциональный анализ ответов Т-клеток в физиологически релевантной трёхмерной эпителиальной микросреде. Используя эту систему, мы демонстрируем дифференцировку эффекторных Т-клеток CD8 в Т-клетки памяти, проживающие в тканях (TRM). Эта универсальная система культуры in vitro предоставляет редукционистские возможности для изучения молекулярных деталей эпителиальных сигналов, лежащих в основе дифференцировки Т-клеток CD8, которые регулируют защитный иммунитет и иммунопатологию в барьерных органах.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Резидентные Т-клетки памяти CD8 (TRM) представляют собой уникальную популяцию CD8 Т-клеток памяти, которые постоянно сохраняются в периферических тканях без регулярного циркуляции через кровь и лимфоидные ткани. Эти клетки TRM стратегически расположены в барьерных органах, включая кожу, лёгкие, кишечник и репродуктивный тракт, где они выступают в роли стражей против патогенов и зарождающихсяопухолей 1,2. После обнаружения патогена клетки CD8 TRM быстро высвобождают цитотоксические гранулы для прямого уничтожения инфицированных клеток, одновременно выделяя воспалительные цитокины, которые предупреждают окружающие тканевые клетки и привлекают циркулирующие иммунные эффекторы для сдерживания распространенияпатогена 3,4. Эффективность CD8 TRM в антипатогенном иммунитете, а также в иммунотерапии рака, ужепродемонстрирована 5,6. Соответственно, размещение большого количества функционально компетентного CD8 TRM в барьерных слизистых тканях является ключевой целью для вакцин и иммунотерапевтических стратегий.

Формирование и поддержание CD8 TRM в периферических органах критически зависят от локального тканевого программирования. Эти локальные экологические сигналы включают уникальные тканевые цитокины и метаболические агенты, а также межклеточные взаимодействия, которые в совокупности поддерживают тканево-специфическую идентичность TRM 7,8,9. Это программирование тканей позволяет TRM адаптироваться к специфическим для тканей требованиям при выполнении их обязанностей по иммунному надзору. Однако наше понимание природы этих взаимодействий неполно из-за отсутствия надёжных моделей, которые точно отражают эти процессы. Модели мелких животных, хотя и очень информативны, часто страдают от тесно взаимосвязанной и сложной сети взаимодействий, которые мешают быстрым и производительным исследованиям.

Здесь мы описываем in vitro альтернативу мышиной модели, которая позволит исследовать молекулярные детали эпителиальных клеток, лежащих в основе дифференцировки TRM CD8. Совместно культивируя преформированные вагинальные эпителиальные органоиды (VEO) с активированными CD8 T-клетками, мы получили CD8 TRM in vitro. Подробное описание процесса активации и совместного культивирования Т-клеток CD8 позволит более широкому внедрению этого процесса в тканях, что приведёт к лучшему пониманию клеточных взаимодействий, формирующих память CD8 T-клеток в тканях передовой линии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры, связанные с животными, были рассмотрены и утверждены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Брауна (номер протокола 22-10-0001).

1. Основная установка и подготовка активационной пластины

  1. За день до начала эксперимента подготовьте необработанную тканевую культурную пластину для посева наивными Т-клетками CD8. Приготовьте раствор активирующих антител в стерильной dPBS с конечной концентрацией 1 мкг/мл для анти-CD3ε (2C11) и 0,167 мкг/мл для B7-1 Fc. Для пластины с 24 лунками наносите 600 мкл этого раствора на каждую скважину. Инкубировать на ночь при 4 °C до готовности к использованию.
  2. Подготовьте буфер для обогащения лимфоцитов в стерильном dPBS, добавив 2% FBS с угольным покрытием и 1 mM EDTA к стерильному dPBS. Храните при 4 °C до готовности к использованию.
  3. Подготовьте буфер лиза эритроцитов аммония-хлорида и калия (ACK эритроциты) вddH 2O, добавив 10 мМ бикарбоната калия, 155 мМ хлорида аммония и 0,1 мМ ЭДТА. Фильтруйте, стерилизуйте и храните при комнатной температуре.
  4. Подготовьте соответствующее количество материала для урожая в RPMI, добавив 5% FBS с угольной очисткой. Храните при 4 °C до готовности к использованию. Для каждой мыши рекомендуется 50 мл материала.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пенициллин/стрептомицин и амфотерицин B необязательны, но конечная концентрация 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,2 мкг/мл амфотерицина B может помочь предотвратить бактериальное и грибковое загрязнение культуры Т-клеток во время выделения тканей, если это вызывает проблему.
  5. Подготовьте Т-клеточную среду в RPMI, добавив 10% FBS, очищенного углём, 2 мМ L-глутамина, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1x незаменительных аминокислот и 1 мМ пирувата натрия. Для пластины с 24 лунками используйте 2 мл Т-клеточной среды на одну скважину и 50 мл Т-клеточной среды для полной пластины. Храните при 4 °C до готовности к использованию.
  6. Подготовьте инструменты для вскрытия (0,4 мм микродисектирующие ножницы и 0,8 мм тонко изогнутые зубчатые щипцы) путём автоклава в стерилизационном мешочке или замачивания в 70% этаноле.

2. Сбор и диссоциация вторичных лимфоидных органов взрослой мыши

  1. Быстрое охлаждение центрифуги до 4 °C с помощью соответствующих адаптеров для размещения конических трубок объёмом 15 мл.
  2. Подготовьте лёд для транспортировки тканей и лимфоцитов во время сбора и инкубации.
  3. Подготовьте стерильную коническую трубку объёмом 15 мл с не менее 5 мл материала для каждой мыши для вскрытия.
  4. Анестезия и эвтаназия взрослой трансгенной мыши CD8 T-клеток (~8 недель) согласно институциональному протоколу в ламинарном капюшоне.
  5. Прикрепите конечности мыши к чистой поверхности из пенополистирола с помощью игл любого размера и распылите торс 70% этанола, чтобы мех не закрывал разрез и не прилипал к инструментам.
  6. С помощью чистых микродисекционных ножниц и щипцов сделайте вертикальный разрез на брюшной полости и отдельте кожу от тонкого слоя соединительной ткани под ней. Приколоть кожу к поверхности пенополистирола с помощью игл любого размера и разрезать оставшуюся соединительную ткань, чтобы обнажить органы внутри туловища.
  7. Аккуратно найдите и удалите селезёнку, удаляя лишний жир с помощью изогнутых щипцов, и переместите его в коническую трубку объемом 15 мл с материалом для убора. Оставьте селезёнку на льду и изолируйте как можно больше лимфатических узлов (например, подвздошную и паховую части), чтобы соединить их с селезёнкой в одной конической трубке на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подвздошные лимфатические узлы расположены по обе стороны от каудальной полой вены в нижней области живота под желудочно-кишечным трактом, а паховые лимфатические узлы расположены рядом с ветвением поверхностной эпигастральной вены по обе стороны нижней части кожи туловища. Изолировать больше лимфатических узлов для повышения выхода CD8 Т-клеток после обогащения; однако выделение одной селезёнки обычно достаточно для получения нескольких миллионов CD8 Т-клеток.
  8. Перенесите селезёнку и лимфатические узлы в надрезанную чашу диаметром 60 мм и, используя плоский конец шприцового поршена объемом 3 мл, механически диссоциируйте селезёнку и лимфатические узлы, измельчая ткань, пока не останется крупных фрагментов.
  9. Собирайте суспензию, пропуская её через стерильный сито 70 мкм в свежую стерильную коническую трубку объёмом 15 мл. Промыйте чашу диаметром 60 мм 5 мл материала для полного перемещения отделённых клеток и фильтруйте в ту же 15 мл конической трубки.
  10. Центрифугуйте подвеску при 584 × г в течение 5 минут при 4 °C. Сбросьте супернатант и установите трубку, быстро и сильно проведя по сетке держателя центрифугной трубки, чтобы ослабить гранулу.
  11. Лизайте эритроциты, ресуспензируя расхлабченную гранулу в 2 мл буфера лизиса эритроцитов ACK. Вихрь и инкубация при комнатной температуре в течение 2 минут.
  12. Через 2 минуты нейтрализируйте буфер лизиса, добавив 2 мл среды для уборки. Аспирируйте суспензию с помощью 5-мл серологической пипетки и фильтруйте через стерильный фильтр 70 мкм обратно в ту же коническую трубку объёмом 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта фильтрация важна для удаления всех комков.
  13. Центрифугуйте подвеску при 584 × г в течение 5 минут при 4 °C. Сбросьте супернатант и ресуспензируйте гранулу в 950 мкл буфера обогащения лимфоцитов.

3. Обогащение и активация Т-клеток CD8

  1. Переходите к обогащению наивных Т-клеток CD8 из лимфоцитов с помощью коммерчески доступного изоляционного набора. Следуйте протоколу производителя.
  2. После обогащения Т-клеток CD8 переместите обогащённую суспензию в новую стерильную коническую трубку объёмом 15 мл и заполните объём до 10 мл средой для уборки.
  3. Считайте с помощью гемоцитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Из одной взрослой мыши можно выделить как минимум 5-10 миллионов наивных CD8 Т-клеток с чистотой >95%.
  4. Проложить не менее 500 000 клеток в 2 мл Т-клеточной среды на одну скважину пластины с 24 лунками. Тщательно смешайте Т-клетки перед нанесением пластины, чтобы обеспечить однородную суспензию в одной клеточке. Дополняйте среду Т-клеток конечной концентрацией 100 единиц/мл IL-2, 2,5 нг/мл IL-12 и 55 мкм бета-меркаптоэтанола.
  5. Извлеките ранее покрытую антителами пластину для культуры тканей с температуры 4 °C и аккуратно аспирируйте раствор покрытия, не касаясь дна колодцев.
  6. Немедленно поставьте Т-клетки. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 дней.

4. Удаление активационных сигналов и покой активированных Т-клеток CD8

  1. Наблюдайте активированные колодцы под световым микроскопом. После двух дней активации ищите небольшие скопления Т-клеток по всей комнате. Более крупные скопления свидетельствуют о большей активации. Если скоплений нет или мало, инкубировать пластину при 37 °C с 5%CO2 ещё один день перед отдыхом.
  2. Подготовьте лёд для хранения суспензии Т-клеток в инкубационные периоды и когда она не используется.
  3. Повторно суспензируйте Т-клетки с помощью пипетки P1000, несколько раз поднимая и опускаясь в каждом углу скважины. Когда Т-клетки подняты, переместите содержимое колодца в стерильную коническую трубку объёмом 50 мл и пересчитайте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Промывка каждой скважины 1 мл dPBS является опциональной, но объединение промывки dPBS с Т-элементной суспензией может увеличить выход Т-элементов.
  4. Перепластинируйте Т-клетки в той же концентрации, что и в шаге 3.4 — 250 000 клеток/мл при 2 мл на колодцу. Приготовьте соответствующее количество Т-клеточной среды с добавлением 100 единиц/мл IL-2 и 55 мкм бета-меркаптоэтанола.
  5. Центрифугуйте суспензию при температуре 584 × г в течение 5 минут при 4 °C, сбросьте супернатант и снова суспензуйте гранулу в соответствующем объёме Т-клеточной среды, подготовленной на предыдущем этапе для количества скважин, которые должны быть покрыты. Тщательно перемешайте для получения однородной суспензии с одной ячейкой.
  6. Пластинка 2 мл суспензии Т-клеток (500 000 клеток/скважины) в новой необработанной пластине для культуры тканей без покрытия антителами. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 в течение 2 дней.

5. Заражение вирусом заранее сформированных мышиных вагинальных эпителиальных органоидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Для проведения вирусной инфекции органоидов использовали как вирус симплекс-2 (HSV-2), так и вирус лимфоцитарного хориоменингита (LCMV). Оба являются агентами уровня биобезопасности 2 (BSL-2). Проводите все процедуры, связанные с инфекционными агентами, внутри сертифицированного биобезопасного шкафа BSL-2. Очистить рабочие площадки с содержанием 70% этанола как до, так и после использования, и убрать все материалы в соответствии с институциональными рекомендациями по биобезопасности. Для этого протокола мы установили VEO из вагинальных эпителиальных клеток, взятых из вагинального эпителия самок мышей C57BL/6, как было описано до10.

  1. Пластины VEO имеют плотность 10 000 клеток в 20 мкл экстракта базальной мембраны (BME) на одну скважину 24-луночной пластины за 7–10 дней до инфекции.
  2. За день до совместного выращивания выделите один источник VEO для трипсинизации и подсчёта для получения точного множества инфекции (MOI). Предварительно разогрейте 0,25% трипсина-EDTA в водяной бане при температуре 37 °C в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 0,25% трипсина-ЭДТА не будет использоваться во время инфекции; он необходим только для диссоциации VEO во время расчётов MOI. Покрытие пластиковой посуды (например, наконечников пипеток, конических трубок) 2,5% BSA в dPBS на этом этапе опционально, но может помочь снизить потери органоидов и клеток для более точного подсчёта.
  3. Аспирируйте клеточную культуру из назначенной скважины и промывайте с помощью dPBS.
  4. Впустите 600 мкл предварительно подогретого трипсина-ЭДТА 0,25% в скважину и тщательно повторно суспензируйте пипеткой P1000 с BSA, чтобы механически нарушить работу BME. Перенесите содержимое скважины в стерильную коническую трубку объемом 15 мл с покрытием BSA.
  5. Инкубировать в водяной бане при температуре 37 °C в течение 5 минут. Через 5 минут добавьте 10 мл 10% FBS в RPMI, чтобы уменьшить трипсинизацию.
  6. Центрифугуйте подвеску при 500 x g на 5 минут при 4 °C. Сбросьте супернатант и повторно суспензуйте с помощью наконечника пипетки, покрытой BSA, в 100-300 мкл среды для культуры Т-органоидных клеток или обычной DMEM/F12.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объём зависит от размера гранулы. Если шарик едва заметен, подвесьте в меньшом объёме.
  7. Считайте с помощью гемоцитометра. Рассчитайте соответствующее количество вируса, необходимое для достижения 0,1 MOI, используя известный вирусный титр и плотность клеток на одну яму VEO согласно следующему уравнению:
    figure-protocol-1
  8. Аспирировать клеточную культуру из колодцев VEO для заражения и промыть 500 мкл предварительно подогреного (37 °C) dPBS. Инкубировать скважины с dPBS в течение 5 минут при 37 °C.
  9. Через 5 минут сбросьте dPBS и добавьте 500 мкл органоидной среды в каждую яму, содержащее достаточно вирусных частиц для достижения MOI 0,1. Инкубировать при 37 °C с 5%CO2 в течение 1 часа с мягким ручным поворотом пластины для культуры тканей каждые 20-30 минут.
  10. После 1 часа инкубации аспирировать вирусную органоидную среду и промыть 500 мкл предварительно подогретого (37 °C) dPBS. Аспирируйте dPBS и замените на свежие органоидные среды.

6. Совместное сокультурирование Т-клеток CD8 с вирусно-инфицированными, готово сформированными мышиными вагинальными эпителиальными органоидами

  1. Перед совместным выращиванием (желательно за 4-24 часа вперёд) переведите BME с -80 °C на 4 °C для размораживания. Прогнозируйте соответствующее количество BME для оттаивания на основе экспериментального дизайна ко-культуры: планируйте покрыть 8 мкл BME на одну скважину пластины с 96 лунками и 20 мкл BME на скважину пластины с 24 лунками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: BME вязкий, и более длительный период оттаивания при 4 °C снижает вязкость и улучшает манёвренность.
  2. Подготовьте 2,5% BSA в dPBS и стерилизуйте фильтром. Используйте это решение BSA, чтобы покрыть каждую пластиковую поверхность, соприкасающуюся с VEO (например, наконечники пипеток, конические трубки).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это покрытие предотвращает прилипывание VEO к пластиковой поверхности и их потерю при обращении.
  3. Проверьте VEO под световым микроскопом по размеру и общему состоянию. Подтвердите, что VEO проходят через 7-10 дней после посева и в среднем диаметр ~100 микрон. Здоровые VEO имеют мало или вообще не имеют отдельных клеток и имеют однородную, круглую морфологию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перепластинируйте VEO в соотношении 1:1 в кокультуре, если выращиваются в пластине на 24 лунки и реплируют в пластине на 24 лунки (то есть одна колодица VEO пересеивает одну колодцу Т-клеточных органоидных кокультур). Если реплировать в пластине с 96 лунками из пластины с 24 лунками, перепластинируйте VEO в соотношении 1:2 (то есть одна яма VEO пересеет две колодцы кокультуры Т-клеток и органоидов).
  4. Разместить необходимое количество стерильных пластин для культуры тканей на 96 или 24 лунки для совместной культуры в инкубаторе при температуре 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Нагревая пластина ускорит адгезию и затвердевание BME.
  5. Подготовьте Т-клеточно-органоидную культурную среду в DMEM/F12, добавив 2% добавки B-27, 2 мМ L-глутамина, 100 единиц/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1x незаменительных аминокислот, 1 мМ пирувата натрия и 0,2 мкг/мл амфотерицина B. Храните при 4 °C до готовности к использованию.
  6. Аспирировать клеточную культуру из скважин VEO и промыть каждую скважину 500 мкл холодного (2-8 °C) стерильного dPBS.
  7. Аспирируйте dPBS и добавьте 200-500 мкл холодного (2-8 °C) раствора для забора органоидов (не менее 10-кратного объёма органоидной капли BME). Пипетты вверх и вниз с пипеткой P200 с покрытием BSA, чтобы механически нарушить работу BME.
  8. Инкубировать пластину с лёгким встряхиванием (~100 об/мин) на орбитальном шейкере при 4 °C в течение 20 минут. Если холодный орбитальный шейкер недоступен, инкубировать пластину на льду с ручным встряхиванием каждые 5 минут. Если BME не деполимеризовался через 20 минут, удлините время инкубации по мере необходимости.
  9. Переместите содержимое скважин с помощью наконечника пипетки с покрытием BSA в стерильную трубку объемом 15 мл или 50 мл на льду. Центрифугуйте подвеску при 500 × г в течение 5 минут при 4 °C.
  10. Выбросьте супернатант и промите VEO 5-10 мл холодного (2-8 °C) dPBS (не менее 10-кратного объёма комбинированных органоидных капель BME). Центрифугуйте подвеску при 500 × г в течение 5 минут при 4 °C.
  11. Сбросьте dPBS и повторно суспензуйте гранулу в 1 мл среды для культуры Т-клеток, используя наконечник пипетки P1000, покрытый BSA. Оставьте VEO-суспензию на льду, пока Т-клетки не будут готовы к совместной культуре.
  12. Начните собирать Т-клетки для совместной культуры. Проверьте Т-клетки в покое под световым микроскопом на размер и общее состояние. Без активации сигналов Т-клетки замедляют свою пролиферацию, но всё равно должны были образовать некоторые кластеры. Убедитесь, что отсутствует обломок или фрагментов клеток, а морфология Т-клеток увеличена. Суспензируйте Т-клетки с помощью пипетки P1000, несколько раз вверх и вниз в каждом углу ямы и подсчитайте общее количество живых Т-ячеек CD8.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На каждую скважину пластины на 96 лунок посевайте по 100 000 Т-клеток на каждую совместную культуру в 8 мкл БМЭ. На одну скважину пластины с 24 лунками сеять 200 000 Т-клеток для каждой кокультуры в 20 мкл БМЭ.
  13. Центрифугуйте подвеску при 584 × г в течение 5 минут при 4 °C. Сбросьте супернатант и снова суспензуйте гранулу в 10 мл среды Т-органоидной культуры. Комбинируйте Т-клетки с ВЭО, перенося соответствующее количество Т-клеток для покрытия колодцев в коническую трубку с ВЭО.
  14. Центрифуга при 584 × г в течение 5 минут при 4 °C. Отбросьте супернатант и ресуспензируйте VEO и T-клетки в нужном пропорции BME. Тщательно перемешайте с помощью наконечника пипетки, покрытой BSA, и поставьте на предварительно подогреную пластину для культуры тканей: 20 мкл на колодец пластины с 24 лунками или 8 мкл на одну пластину с 96 луками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите BME на льду или в охлаждающем блоке при 4 °C во время накладки. Размещение наконечников пипеток в холодильнике при температуре 4 °C на 30 минут перед погружением может помочь предотвратить преждевременное затвердевание БМЭ.
  15. Поставьте пластину вверх дном в инкубатор при температуре 37 °C и подождите 30 минут до полной адгезии и затвердевания BME.
  16. В течение этого инкубационного периода подготовьте полную T-клеточно-органоидную культурную среду, добавив 100 нг/мл мышиного EGF, 55 мкм бета-меркаптоэтанола и 10 единиц/мл мышиного IL-2 в готовую Т-клеточно-органоидную культурную среду.
  17. После инкубационного периода аккуратно добавляйте 500 мкл полного Т-клеточно-органоидного культурного материала на каждую скважину пластины с 24 лунками или 250 мкл полной среды Т-клеточных органоидных культур на каждую скважину пластины с 96 луками. Наносите материал по стенам скважины, чтобы не нарушать каплю BME. Меняйте среду каждые 2 дня до сбора для анализа.

7. Сбор совместно культивируемых Т-клеток CD8 для анализа потоковой цитометрии

  1. Когда кокультуры достигнут как минимум 7-го дня в культуре, собирайте урожай для анализа. Если Т-клетки не экспрессируют маркеры, похожие на TRM, в совместной культуре к 7-му дню, оптимизируйте дату сбора между 7-м и 14-м днём, в зависимости от фенотипического приобретения и жизнеспособности ВЭО и Т-клеток.
  2. Подготовьте буфер для сортировки флуоресцентных клеток (FACS) для окрашивания и анализа потоковой цитометрии, добавив 0,2% с в/в бычий сывороточный альбумин и 0,1% w/v натрия азида к dPBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Азид натрия — это остротоксичное химическое вещество. Следовать институциональным рекомендациям по обращению и утилизации всех отходов в соответствии с институциональными нормами биобезопасности.
  3. Приготовьте коктейль с флуоресцентными антителами в буфере FACS для поверхностного окрашивания, в зависимости от того, какие маркеры желаются для анализа. На каждую скважину учитывайте не менее 50 мкл коктейля антител.
  4. Подготовьте краску для флуоресцентной жизнеспособности в dPBS. Для каждой скважины учитывайте не менее 50 мкл красителя с жизнеспособностью.
  5. Аккуратно удаляйте среду из каждой скважины и тщательно повторно суспензируйте в холодном (2-8 °C) буфере FACS, поднимая и опуская 10-20 раз, чтобы механически нарушить работу BME. Переместите содержимое каждой скважины на маркированную пластину с круглым дном на 96 лунок.
  6. Центрифуга при 859 × г в течение 2 минут при 4 °C. Снижайте уровень замедления на всех этапах центрифуга, чтобы предотвратить потерю образца из-за пересмешивания гранул.
  7. Удалите супернатант, перевернув пластину и выпустив жидкость одним твёрдым вниз движением. Повторно суспензировать в 50 мкл коктейля антител. Пипетки вверх и вниз не менее 5 раз с помощью многоканальной пипетки для обеспечения полноценного восстановления ячеточной гранулы.
  8. Инкубировать 30 минут при 4 °C или комнатной температуре при необходимости, защищая от света. В конце инкубационного периода добавьте в каждую скважину 150 мкл dPBS с помощью многоканальной пипетки и центрифуги при 859 × г в течение 2 минут при 4 °C.
  9. Декантуйте супернатант, переворачивая пластину вверх дном и опуская её вниз один раз в непрерывном движении. Повторно суспензировать в 50 мкл красителя с жизнеспособностью. Пипетки вверх и вниз не менее 5 раз с помощью многоканальной пипетки для обеспечения полноценного восстановления ячеточной гранулы.
  10. Инкубировать 15 минут при комнатной температуре, защищая от света. В конце инкубационного периода добавьте 150 мкл буфера FACS в каждую скважину с помощью многоканальной пипетки и центрифуги при 859 × г в течение 2 минут при 4 °C.
  11. Декантировать супернатант как раньше и повторно суспензировать в 150 мкл буфера FACS, если образцы будут запускаться на потокном цитометре, или фиксировать 150 мкл параформальдегида 0,5% и оставлять при 4 °C. Пипетки вверх и вниз не менее 5 раз с помощью многоканальной пипетки для обеспечения полноценного восстановления ячеточной гранулы. Фильтруйте фиксированные образцы для предотвращения засоров приборов и запускайте на проточном цитометре в течение 12-36 часов, чтобы предотвратить потерю флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Параформальдегид считается опасным химическим веществом. Соблюдайте институциональные нормы биобезопасности при обращении и утилизации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроскопическая визуализация кокультуры органоидов, инфицированных Т-клетками CD8
Готово сформированные мышиные VEO были инфицированы LCMV и совместно культивированы с специфическими CD8 T-клетками LCMV. Мы также проводили совместные культуры с моделью заражения HSV-2, чтобы определить универсальность протокола, но при этом показываем микроскопические данные для модели LCMV и включили данные дифференцировки Т-клеток в модель HSV-2 ниже. LCMV экспрессирует жёлтый флуо...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

CD8 TRM зависят от местных окружающих сигналов для различия и поддержания. Эти сигналы вводят тканино-специфическое программирование, позволяющее CD8 TRM адаптироваться к окружающей среде и выполнять функции иммунного надзора по мере необходимости. К сожалению, TRM не выжили in vitro после извлечения из ткани, что ограничило их детальныйанализ 12,13. В этом протоколе мы предложили метод, с помощью которого CD8 Т-клетки м...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конкурирующих интересов, которые можно было бы заявить.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Национального института здоровья R01AI177704-01A1, R21AI183017-01, грантом Университета Брауна (L.K.B.) и грантом F31AI186444 (для Y.L.). Мы хотели бы поблагодарить доктора Дориана Б. МакГаверна (NINDS, NIH) за предоставление вируса лимфоцитарного хориоменингита, экспрессирующего YFP. Мы благодарим доктора Санхён Ли и его лабораторию за помощь с визуализацией Cytation-5 и ядром проточной цитометрии Университета Брауна для проведения анализов на основе потока.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
16% параформальдегидный водный растворНауки об электронной микроскопии15710-С
24-колодящие, необработанные полистироловые плиты Tissuce культурыVWR International10861-558
2-меркаптоэтанолGibco21985023
Стерильные шприцы объемом 3 млFisher Scientific14-955-457
5 мл,  Snap Cap,  Стерильные пробирки из полистирола с круглым дномFalcon352058
Чашки Петри диаметром 60 ммFisher ScientificFB0875713A 
70 μ m Стерильные клеточные ситаFisher Scientific22-363-548
96-колодцевые необработанные полистиролные микропластины с круглым дномGreiner Bio-One650101
96-скважинные полистироловые необработанные многоскважинные тканевые культивные пластиныVWR International10861-562
Альбумин/дробная V крупная рогатая ротаThermo Scientific ChemicalsJ6465518
Хлорид аммонияFisher ScientificA661-500
Амфотерицин B Сигма-ОлдричA9528-100MG
Дополнение к B-27Gibco17504044
Многомодовый считыватель ioTek Cytation 5 Cell Imaging
DMEM/F12 1:1 MediumЦитиваSH30271. FS
Раствор соли, буферированный фосфатом Dulbecco, 1xКорнинг21031CV
Этилендиаминтетрауксусная кислота (раствор 0,5 м/pH 8,0)Fisher ScientificBP2482-500
Сверхтонкие микроразборочные ножницыКомпания по хирургическим инструментам Roboz.RS-5882
Сыворотка для плода — обработана углём/декстраномR& D SystemsS11650
Программное обеспечение Flowjo v10Бектон, Дикинсон и компанияFlowJo (RRID:SCR_008520)
Щипцы ГрефеКомпания по хирургическим инструментам Roboz.RS-5135
Решение HEPESЦитиваSH30237.01
L-глутамин (200 мМ)GibcoA2916801
Магнит 5 млБиолегенда480019
Mouse CD8 Naï Набор для изоляции Т-клетокБиолегенда480044
Рекомбинантный белок EGF мышиGibco315091MG
Раствор незаменительных аминокислот (100x)Gibco11140050
Раствор пенициллина-стрептомицинаЦитиваSV30010
Бикарбонат калияMP Biomedicals0215255780
Очищенный противомышиный препарат CD3 и эпсилон; АнтителаБиолегенда100360
Рекомбинантная мышь B7.1 (CD80)-Fc Chimera (без несущего)Биолегенда555406
Рекомбинантный Mouse IL-12 (p70) (без несущей связи)Биолегенда577004
Рекомбинантная мышь IL-2 (без носителей)Биолегенда575406
Экстракт базальной мембраны с пониженным фактором ростаR& D SystemsBME001-10
RPMI 1640 MediaЦитиваSH30027.LS
Натрий АзидFisher ScientificS227I-25
Пируват натрия (100 мм)Gibco11360070
Трипсин 0,25% протеазы с свиньей трипсиномЦитиваSH30042.02
Краситель жизнеспособности (Red 780)Cytek Biosciences13-0865-T100

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rosato, P. C., Beura, L. K., Masopust, D. Tissue resident memory T cells and viral immunity. Curr Opin Virol. 22, 44-50 (2017).
  2. Park, C. O., Kupper, T. S. The emerging role of resident memory T cells in protective immunity and inflammatory disease. Nat Med. 21, 688-697 (2015).
  3. Schenkel, J. M., et al. Resident memory CD8 T cells trigger protective innate and adaptive immune responses. Science. 346 (6205), 98-101 (2014).
  4. Ariotti, S., et al. Skin-resident memory CD8 + T cells trigger a state of tissue-wide pathogen alert. Science. 346 (6205), 101-105 (2014).
  5. Christo, S. N., Park, S. L., Mueller, S. N., Mackay, L. K. The Multifaceted Role of Tissue-Resident Memory T Cells. Annu Rev Immunol. 42 (1), 317-345 (2024).
  6. Gavil, N. V., Cheng, K., Masopust, D. Resident memory T cells and cancer. Immunity. 57 (8), 1734-1751 (2024).
  7. Christo, S. N., et al. Discrete tissue microenvironments instruct diversity in resident memory T cell function and plasticity. Nat Immunol. 22 (9), 1140-1151 (2021).
  8. Pan, Y., et al. Survival of tissue-resident memory T cells requires exogenous lipid uptake and metabolism. Nature. 543, 252-256 (2017).
  9. Hasan, M. H., Beura, L. K. Cellular interactions in resident memory T cell establishment and function. Curr Opin Immunol. 74, 68-75 (2022).
  10. Ulibarri, M. R., et al. Epithelial organoid supports resident memory CD8 T cell differentiation. Cell Rep. 43 (8), 114621(2024).
  11. Evrard, M., et al. Single-cell protein expression profiling resolves circulating and resident memory T cell diversity across tissues and infection contexts. Immunity. 56 (7), 1664-1680.e9 (2023).
  12. Borges da Silva, H., Wang, H., Qian, L. J., Hogquist, K. A., Jameson, S. C. ARTC2.2/P2RX7 Signaling during Cell Isolation Distorts Function and Quantification of Tissue-Resident CD8+ T Cell and Invariant NKT Subsets. J Immunol. 202 (7), 2153-2163 (2019).
  13. Künzli, M., et al. Long-lived T follicular helper cells retain plasticity and help sustain humoral immunity. Sci Immunol. 5 (45), eaay5552(2020).
  14. Kang, J. S., et al. Generation of induced alveolar assembloids with functional alveolar-like macrophages. Nat Commun. 16, 3346(2025).
  15. Lin, M., et al. Establishment of gastrointestinal assembloids to study the interplay between epithelial crypts and their mesenchymal niche. Nat Commun. 14, 3025(2023).
  16. Park, S. E., Georgescu, A., Huh, D. Organoids-on-a-chip. Science. 364 (6444), 960-965 (2019).
  17. Quintard, C., et al. A microfluidic platform integrating functional vascularized organoids-on-chip. Nat Commun. 15, 1452(2024).
  18. Vincenti, I., et al. Tissue-resident memory CD8+ T cells cooperate with CD4+ T cells to drive compartmentalized immunopathology in the CNS. Sci Transl Med. 14 (640), eabl6058(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

CD8

Похожие статьи