Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ось Mettl3/Nrf2 подавляет прогрессирование болезни Паркинсона за счет ингибирования NLRP3-индуцированного пироптоза в серотониновых нейронах

594 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69124

⸱

7 ноября 2025 г.

 ,  , 
1Department of Neurosurgery, Feicheng People's Hospital, 2Department of Neurology, Yantai Yantaishan Hospital

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье мы представляем протокол для исследования того, как Mettl3 регулирует Nrf2 через модификацию m6A, тем самым подавляя микроглиальный пироптоз и защищая серотониновые нейроны в моделях болезни Паркинсона, с применением в исследованиях эпитранскриптомного нейровоспаления.

Аннотация

Точные механизмы, лежащие в основе патогенеза болезни Паркинсона (БП), остаются до конца неизученными, особенно в отношении роли микроглиального воспаления и выживаемости серотониновых нейронов. Этот протокол очерчивает всестороннюю основу для выяснения того, как метилтрансфераза-подобный 3 (Mettl3) модулирует ядерный фактор эритроид-2-связанный фактор 2 (Nrf2) через N6-метиладенозин (m6A), тем самым ослабляя микроглиальный пироптоз и сохраняя серотониновые нейроны как в моделях БП in vitro , так и in vivo . Основная цель состоит в том, чтобы предоставить исследователям воспроизводимые методологии для анализа эпитранскриптомной регуляции нейровоспалительных путей, начиная с индуцированной липополисахаридом (ЛПС) активации микроглии в клетках BV2 для моделирования воспалительных каскадов с последующей количественной иммунопреципитацией метилированной РНК (MeRIP-qPCR) для анализа m6A. In vivo мы подробно описываем создание MPTP-индуцированной модели мыши, дополненной стереотаксической доставкой векторов аденоассоциированного вируса серотипа 9 (AAV9) для целевой модуляции Nrf2 в стриатуме. Поведенческие оценки включают в себя размещение передних конечностей, ускорение ротарода и открытые полевые тесты для количественной оценки двигательного дефицита, в то время как молекулярные анализы включают вестерн-блоттинг на маркеры пироптоза (например, NLRP3, clud-caspase-1), иммуноферментный анализ (ИФА) на цитокины и окрашивание дигидроэтидия (DHE) на обнаружение активных форм кислорода (АФК) в серотониновых нейронах. Передовые методы микроскопии, такие как иммуногистохимия для Iba1 и TPH2, позволяют визуализировать динамику микроглии и серотонинергическую целостность. Полученные результаты подтверждают, что дефицит Mettl3 усугубляет подавление Nrf2, гиперактивацию инфламмасомы NLRP3, гибель пироптотических клеток и последующую дегенерацию серотониновых нейронов. Этот метод не только обеспечивает надежную экспериментальную основу для исследования m6A-опосредованной нейропротекции, но и выявляет потенциальные терапевтические возможности для смягчения прогрессирования БП за счет целенаправленной модуляции оси Mettl3/Nrf2 в нейродегенеративных контекстах.

Введение

Болезнь Паркинсона (БП) занимает второе место среди наиболее распространенных нейродегенеративных расстройств среди пожилых людей, затрагивая около 2-3% людей в возрасте 65 лет и старше, что создает значительную нагрузку как для семей, таки для общества. Несмотря на то, что точные механизмы БП остаются частично изученными, накапливающиеся данные указывают на связь между развитием БП и проблемами в передаче нейронов, а также нейровоспалением, вызванным микроглиальными клетками, что является общей чертой, наблюдаемой при старении мозга и различных нейродегенеративных заболеваниях, включая БП 2,3,4,5 . Микроглия служит клетками врожденного иммунитета в центральной нервной системе (ЦНС) и жизненно важна для поддержания гомеостаза мозга6. Тем не менее, стойкая гиперактивация этих микроглий может вызвать хронические нейровоспалительные реакции, что в конечном итоге способствует прогрессированию нейродегенеративного заболевания.

Как центральные, так и периферические воспалительные процессы существенно влияют на патологию БП 7,8. Активация клеток микроглии вызывает воспалительные реакции, которые влияют на выживаемость нейронов9, при этом новые данные подчеркивают его праймирование убиквитиновыми лигазами10. Среди различных воспалительных путей активация инфламмасомы, содержащей NOD-, LRR и пирин-домен белка 3 (NLRP3), служит основным фактором микроглиальной воспалительной регуляции11. Активация приводит к экспрессии NLRP3 и последующей сборке инфламмасомного комплекса, состоящего из адаптерного белка домена активации и рекрутирования каспазы (CARD) и про-каспазы-1, что приводит к расщеплению белка и высвобождению цитокинов12. Повышенная активация NLRP3 наблюдалась у пациентов с болезнью Паркинсона и на различных животных моделях заболевания, что приводило к гибели нейронов. Примечательно, что ингибирование NLRP3 продемонстрировало защитные эффекты против патологии БП на мышиных моделях, что подчеркивает решающую роль инфламмасомы NLRP3 в возникновении БП13,14.

Передача сигналов серотонина (5-НТ) является важным механизмом нервной регуляции, влияющим на многочисленные виды поведения и физиологические функции посредством взаимодействия по меньшей мере с 14 подтипами постсинаптических рецепторов15,16, включая роль в патологии ЦНС, как подробно описано в комплексных обзорах17. Обширное нейромодулирующее влияние системы 5-HT регулируется примерно 26 000 нейронов в мозге грызунов. В то время как значительная часть литературы связывает БП преимущественно с потерей дофаминергических нейронов, связь между нейронами 5-HT и БП изучается менее тщательно.

Модификация N6-метиладенозина (m6A), наиболее распространенная модификация мРНК в эукариотических клетках, является ключом к регуляции сплайсинга, стабильности и экспорта мРНК, тем самым влияя на различные клеточныеактивности. Уровни m6A модулируются метилтрансферазами и деметилазами. Повышенные модификации m6A в мозге были связаны с развитием нервной системы, при этом ее дисрегуляция тесно связана с нейродегенеративными состояниями20,21, включая измененную экспрессию METTL3 в моделях болезни Альцгеймера22. Например, накопление метилтрансферазы-подобного 3 (METTL3) в нерастворимой фракции посмертных тканей мозга у пациентов с болезнью Альцгеймера положительно коррелирует с уровнями нерастворимого тау-белка23. Кроме того, значительное снижение уровня m6A в стриатуме может привести к значительному снижению уровня дофаминовых нейротрансмиттеров24. Примечательно, что двенадцать однонуклеотидных полиморфизмов, связанных с m6A, показали значительную связь с восприимчивостью к БП25. Этот протокол устанавливает всесторонние методологии для исследования того, как METTL3-опосредованные модификации m6A регулируют микроглиальный пироптоз через ось Nrf2/NLRP3, в конечном итоге влияя на выживаемость серотониновых нейронов в моделях БП. Модель острой МФТП in vivo и модель ЛПС in vitro были выбраны из-за их надежной индукции нейровоспалительных реакций, хотя хронические парадигмы могут дополнить будущие исследования, как обсуждается ниже.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Народной больницы Фэйчэн (номер одобрения IACUC-2024-118) и проводились в строгом соответствии с институциональными руководящими принципами и установленными этическими принципами для исследований на лабораторных животных. Протоколы исследования обеспечивали гуманный уход и обращение со всеми животными, уделяя особое внимание минимизации страданий и стресса, при этом соблюдая как институциональные стандарты, так и руководящие принципы ARRIVE, касающиеся ответственной практики исследований на животных.

1. Модель клеточной культуры и активации микроглии

  1. Подготовка и обслуживание ячеек BV2
    1. Быстро разморозьте замороженные запасы микроглиальных клеток BV2 на водяной бане при температуре 37 °C в течение 2 минут, обеспечивая мягкое вращение для предотвращения теплового удара.
    2. Центрифугируйте размороженную клеточную суспензию при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре (ОТ) для удаления криопротектора.
    3. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 мл полной среды DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицина и 2 мМ L-глутамина.
    4. Оценку жизнеспособности клеток проводят методом исключения трипанового синего (смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл 0,4% трипанового синего, подсчитайте с помощью гемоцитометра), убедившись в жизнеспособности >95%, прежде чем продолжить.
    5. Пластинчатые клетки в культуральных колбах Т75 при плотности от 1 ×10 до 6 клеток в колбе и выдерживают в увлажненном инкубаторе для клеточных культур при температуре 37°С с 5% СО2.
    6. Пассаж клеток каждые 48 ч при достижении 80-85% конфлюенции с использованием стандартных процедур трипсинизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте постоянное количество пассажей (пассажи 3-8) для обеспечения воспроизводимых воспалительных реакций. Все эксперименты с клеточными культурами независимо друг от друга повторялись не менее трех раз, с тремя техническими повторениями в каждом условии для минимизации вариабельности.
  2. ЛПС-индуцированная активация микроглии
    1. Посев BV2 клеток в 6-луночные планшеты по 2 ×10 5 клеток в лунку в 2 мл полной среды за 24 ч до обработки.
    2. Готовить исходный раствор ЛПС в концентрации 1 мг/мл в стерильном PBS, фильтровать-стерилизовать через фильтр 0,22 мкм и хранить в одноразовых аликвотах при -20 °С.
    3. Валидация активности ЛПС с помощью анализа лизата амебоцитов Limulus (LAL) для подтверждения концентрации эндотоксина перед каждым экспериментом26.
    4. Развести бульонные массы ЛПС до рабочей концентрации 1 мкг/мл в бессывороточном DMEM непосредственно перед применением.
    5. Извлеките питательную среду из лунок и дважды промойте клетки стерильным ПБС.
    6. Добавьте 2 мл среды, содержащей ЛПС (конечная концентрация 1 мкг/мл) в очистные скважины и бессывороточный DMEM для контрольных лунок.
    7. Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 °C с 5%CO2 для активации воспаления.
    8. Для подтверждения воспалительной реакции включайте положительные контрольные лунки, обработанные фактором некроза опухоли (TNF)-α с концентрацией 100 нг/мл, и отрицательные контрольные лунки только с носителем (PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте свежий раствор ЛПС для каждого эксперимента, чтобы поддерживать постоянную биологическую активность. Если воспалительная реакция слабая (например, <2-кратное увеличение цитокинов), проверьте стабильность реагента или продлите инкубацию до 48 часов.
  3. Сверхэкспрессия и нокдаун Mettl3
    1. Проектирование и синтез последовательностей малых интерферирующих РНК (миРНК), нацеленных на Mettl3 и скремблированные контрольные последовательности, с использованием стандартных протоколов синтеза олигонуклеотидов. Выберите последовательности-мишени из кодирующей области мРНК Mettl3 (образец GenBank: NM_019721) с длиной 19-21 нуклеотид, обеспечивая содержание GC 40-60%27.
    2. Валидация последовательностей миРНК с помощью анализа BLAST для подтверждения специфичности и предотвращения побочных эффектов (обеспечение гомологии <70% с нецелевыми генами).
    3. Получить векторы сверхэкспрессии, содержащие полноразмерную кДНК Mettl3, клонированную в вектор pcDNA3.1, с использованием сайтов рестрикции EcoRI и XhoI.
    4. Трансфектируйте клетки при 70-80% конфлюенции с помощью катионного липидного реагента для трансфекции:
      1. Смешайте 2 мкл реагента для трансфекции катионных липидов с 50 пмоль миРНК или 2 мкг плазмидной ДНК в 100 мкл среды Opti-MEM.
      2. Инкубировать смесь в течение 15 минут при RT.
      3. Трансфекционный комплекс добавляют по каплям в клетки и инкубируют в течение 4-6 часов, прежде чем превратить в свежую полноценную среду.
    5. Инкубируйте трансфицированные клетки в течение 48 ч перед лечением ЛПС, чтобы обеспечить адекватные изменения экспрессии белка.
    6. Подтвердите эффективность трансфекции с помощью котрансфекции флуоресцентного репортера (100 нг pEGFP-C1 на лунку) с целью достижения эффективности >70% с помощью флуоресцентной микроскопии, прежде чем продолжить.

2. Разработка животных моделей и планирование экспериментов

  1. Подготовка животных и рандомизация
    1. Получите мышей C57BL/6J из лаборатории Vital River, обеспечив равное соотношение самцов и самок, в возрасте 8 недель и весом 19-26 г.
    2. Домашние животные в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF) с циклом «свет-темнота» 12:12 ч, контролируемой температурой (22 ± 2°C) и влажностью (50-60%).
    3. Предусмотрите 7-дневный период акклиматизации с ограниченным доступом к стандартному корму и воде.
    4. Проведение исходных поведенческих оценок во время акклиматизации: Проведение комплексных поведенческих оценок, включая тест на размещение передних конечностей (10 попыток с каждой стороны), ускорение ротародной оценки (4-40 об/мин в течение 5 минут) и анализ локомоторной активности в открытом поле (10-минутные сеансы на аппарате 50 см × 50 см × 50 см)28,29,30.
    5. Случайным образом распределите животных по экспериментальным группам (n = 6 в группе) с помощью компьютеризированной рандомизации для минимизации систематической ошибки: smock, Model, Model+Nrf2-KD, Model+oe-Nrf2.
    6. Внедрите слепой экспериментальный дизайн, в котором исследователи, проводящие поведенческие оценки, не знают о групповых заданиях.
  2. Модель болезни Паркинсона, индуцированной 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином (МФТП)
    1. Готовят раствор МФТП в дозе 30 мг/кг в стерильном физрастворе непосредственно перед инъекцией, растворяя 15 мг МФТП гидрохлорида в 5 мл стерильного физиологического раствора и корректируя объем в зависимости от массы животного.
      ВНИМАНИЕ: МФТП обладает высокой нейротоксичностью. Обращайтесь в вытяжном шкафчике с химическими веществами с соответствующими средствами индивидуальной защиты, включая двойные перчатки и лабораторный халат.
    2. Вводите МФТП путем внутрибрюшинной инъекции в дозе 30 мг/кг массы тела (объем инъекции 10 мл/кг) в течение трех дней подряд в одно и то же время каждый день (09:00 ± 30 минут).
    3. Вводите животным фиктивной группы эквивалентные объемы стерильного физиологического раствора, следуя идентичной схеме инъекций.
    4. Ежедневно наблюдайте за животными на предмет признаков дистресса, потери веса (>15% считается конечной точкой) или побочных реакций ежедневно в течение периода введения MPTP с использованием стандартизированных таблиц оценки.
    5. Сохраняйте животных в течение 8 дней после последней инъекции, чтобы дать возможность развиться нейродегенерации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этот период животные могут содержаться в обычном режиме при постоянном контроле.
  3. Стереотаксическая вирусная инъекция
    1. Получить вирусные векторы AAV9 путем тройной трансфекции HEK293T клеток с использованием полиэтиленимина (ПЭИ; соотношение ДНК:ПЭИ 1:3), собрать через 72 ч после трансфекции, очистить с помощью градиентного ультрацентрифугирования йодиксанолом (177 000 × г в течение 2 ч) и сконцентрировать с помощью центробежных фильтрующих устройств для получения 1 × 10–12 копий генома/мл.
    2. Валидация титра вируса с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, нацеленных на области ITR, при этом титры достигают 1 × 10¹² копий генома/мл с помощью стандартного анализа кривых.
    3. Валидация титра вируса с помощью количественной ПЦР на основе SYBR Green с ITR-специфичными праймерами, выполнение серийных разведений известных стандартов и расчет копий генома с помощью анализа стандартных кривых. Подтвердите отсутствие репликационно-компетентной вирусной контаминации с помощью p24 ELISA.
    4. Обезболивайте мышей изофлураном (3% индукции, 1,5-2% поддержания), доставляемым со скоростью 0,8-1,0 л/мин потока кислорода через носовой конус, контролируя частоту дыхания (60-100 вдохов/мин) и рефлекс защемления пальцев ног на протяжении всей процедуры. Закрепите мышь в стереотаксической рамке и нанесите офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
    5. Закрепите мышь в стереотаксической рамке и нанесите офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
    6. Сделайте разрез кожи головы по средней линии 1,5 см с помощью стерильного лезвия скальпеля и определите ориентир брегмы по стереотаксическим координатам с точностью до 0,1 мм.
    7. Рассчитать координаты инъекции стриатума: передне-задний -0,5 мм, медиально-латеральный ±2,0 мм, дорсально-вентральный -3,0 мм от брегмы.
    8. Перед экспериментальными инъекциями проведите пилотные инъекции с флуоресцентным индикатором (например, зеленым флуоресцентным белком [GFP]) для проверки точности нацеливания, подтвердив >80% колокализацию с микроглиальными маркерами (Iba1) с помощью иммуногистохимии.
    9. Опустите иглу для инъекций (33-G) на целевую глубину со скоростью 1 мм/мин и введите 2 мкл вирусной суспензии со скоростью 0,2 мкл/мин с помощью микрошприцевого насоса с автоматическим контроллером. Опустите иглу для инъекций на целевую глубину и введите 2 мкл вирусной суспензии со скоростью 0,2 мкл/мин с помощью микрошприцевого насоса.
    10. Сохраняйте положение иглы в течение 5 минут после инъекции, чтобы предотвратить обратный поток.
    11. Медленно извлеките иглу со скоростью 0,5 мм/мин, закройте разрез шелковыми швами 4-0 по прерывистой схеме и дайте возможность восстановиться после анестезии на подогретой салфетке для восстановления.
    12. Проводить послеоперационное обезболивание (карпрофен 5 мг/кг подкожно один раз в сутки в течение 3 дней) и контролировать восстановление в течение 24 ч с помощью подробных протоколов наблюдения.

3. Методы молекулярной биологии и валидация

  1. Экстракция РНК и контроль качества
    1. Забор образцов клеток или тканей мозга полосатого тела сразу после экспериментальных конечных точек путем гуманной эвтаназии животных с помощью ингаляции CO2 с последующим вывихом шейки матки; Рассеките ткань на льду, мелко измельчите и ферментативно диссоциируйте с 0,25% трипсином в течение 10 минут при 37 °C при сборе клеток.
    2. Выделить общую РНК с помощью реагента ТРИзол (1 мл на 1,10, 6 клеток или 100 мг ткани) с механической гомогенизацией (20-25 ходов в гомогенизаторе с подачкой) и разделением фаз хлороформа (0,2 мл хлороформа на 1 мл ТРИЗОЛА).
    3. Оценка качества РНК с помощью спектрофотометрии (соотношение A260/A280 1,8-2,0) и гель-электрофореза (1% агарозы) для подтверждения 28S и 18S рибосомных полос.
    4. Количественное определение концентрации РНК с помощью спектрофотометра.
    5. Хранить образцы РНК при -80 °C в воде без нуклеаз при -80 °C с добавлением ингибитора РНКазы (40 ед/мкл) до анализа.
  2. Ядерно-цитоплазматическое фракционирование
    1. Соберите клетки (2 × 106 минимум ) и дважды промойте ледяным PBS (5 мл на промывку, 5 мин центрифугирование при 300 × г).
    2. Используйте коммерческий набор для фракционирования клеток по следующему протоколу.
      1. Ресуспендируйте клеточную таблетку в 200 мкл цитоплазматического экстракционного буфера с ингибиторами протеазы.
      2. Выдерживать на льду в течение 10 мин с вортексированием каждые 3 мин.
      3. Центрифугировать при 16 000 × г в течение 5 мин при 4 °C и собрать надосадочную жидкость (цитоплазматическую фракцию).
      4. Дважды промойте гранулу цитоплазматическим экстракционным буфером.
      5. Ресуспендируйте гранулу в 100 мкл ядерного буфера для извлечения.
      6. Выдерживать на льду в течение 40 мин с фортексированием каждые 10 мин.
      7. Центрифугируйте при 16 000 × г в течение 10 мин при 4 °C и соберите надосадочную жидкость (ядерную фракцию)
    3. Проверка эффективности фракционирования путем анализа распределения ядерных маркеров (U6) и цитоплазматических маркеров (GAPDH) с помощью вестерн-блоттинга.
    4. Извлекают РНК из ядерной и цитоплазматической фракций отдельно.
    5. Анализируйте уровни мРНК Nrf2 в каждой фракции с помощью ОТ-кПЦР с референсными генами, специфичными для фракции.
  3. Количественная ПЦР в реальном времени (ОТ-кПЦР)
    1. Синтезировать кДНК из 1 мкг общей РНК с помощью набора реагентов для обратной транскрипции со случайными праймерами.
    2. Проведите кПЦР с помощью набора Premix Ex Taq II с ген-специфичными праймерами на системе ПЦР в реальном времени.
    3. Подтвердите специфичность праймера с помощью анализа кривой расплава и подтвердите одиночный ампликон с помощью гель-электрофореза.
    4. Используйте следующие условия термоциклирования: начальная денатурация при 95 °C в течение 10 минут, затем 40 циклов при 95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с.
    5. Расчет относительных уровней экспрессии мРНК с использованием метода 2-ΔΔCt с β-актином в качестве внутреннего эталона.
    6. Включите контрольные элементы без шаблонов и проверьте стабильность референсных генов в экспериментальных условиях с помощью анализа geNorm (значение стабильности M < 0,5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Показатели воспроизводимости: коэффициент вариации (CV) внутри анализа <10% по трем независимым прогонам.
  4. MeRIP-qPCR для анализа модификации m6A
    1. Извлечь общую РНК (минимум 20 мкг) и фрагментировать до 100-200 нуклеотидов с помощью реагента для фрагментации РНК (10 мМ ZnCl2, 10 мМ Tris-HCl, pH 7,0) при 70 °C в течение 5 мин.
    2. Иммунопреципитацию проводят с использованием m6A-специфического антитела (2 мкг на 20 мкг РНК) в течение ночи при 4 °C с вращением (10 об/мин) в буфере для иммунопреципитации (50 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 750 мМ NaCl, 0,5% NP-40).
    3. Валидация специфичности антител с использованием известных m6A-модифицированных и немодифицированных РНК контрольных показателей.
    4. Иммунопреципитированные комплексы промыть пять раз промывающим буфером.
    5. Элюируйте связанную РНК и выполните обратную транскрибацию с помощью случайных праймеров.
    6. Обратная транскрибация элюированной РНК с использованием случайных праймеров и выполнение количественного ПЦР-анализа с использованием Nrf2-специфичных праймеров, охватывающих потенциальные сайты m6A.
    7. Выполните анализ количественной ПЦР с использованием специфичных для Nrf2 праймеров и рассчитайте обогащение относительно входной РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если обнаружение непостоянное, оптимизируйте время фрагментации (4-6 минут) для улучшения воспроизводимости; количественный контроль: отношение сигнал/шум >15:1 по сравнению с контролем IgG.

4. Анализ и валидация белка

  1. Экстракция и количественное определение белка
    1. Лизируют клетки (1 × 10,6 клеток) или гомогенизируют образцы тканей (100 мг ткани стриарного тела) в 200 мкл буфера радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA), содержащего ингибиторы протеазы (1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 1 мкг/мл лейпептина, 1 мкг/мл пепстатина А) и ингибиторы фосфатазы (1 мМ ортованадат натрия, 5 мМ фторида натрия).
    2. Лизаты инкубировать на льду в течение 30 мин с периодическим вортексированием (каждые 10 мин в течение 10 с).
    3. Центрифугируйте при 12 000 × г в течение 15 мин при 4 °C для удаления клеточного мусора и сбора надосадочной жидкости.
    4. Количественное определение концентрации белка с помощью анализа бицинхониловой кислоты (БЦА) со стандартами бычьего сывороточного альбумина (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 мкг/мл) в трех измерениях.
    5. Проверьте целостность белка путем анализа уровней бытовых белков (GAPDH, ожидаемая MW: 36 кДа) во всех образцах с помощью вестерн-блоттинга.
  2. Вестерн-блоттинг
    1. Подготовить образцы белка с равной нагрузкой (30-50 мкг) в загрузочном буфере для электрофореза додецилсульфата натрия-полиакриламида (SDS-PAGE) (конечные концентрации: 62,5 мМ Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% глицерина, 5% β-меркаптоэтанола, 0,003% бромфенолового синего) и денатурировать при 95 °C в течение 5 мин.
    2. Разделите белки с помощью SDS-PAGE с использованием 10% полиакриламидных гелей при напряжении 80 В в течение 30 мин, а затем при напряжении 120 В в течение 90 мин в буфере Tris-glycine-SDS.
    3. Перенос белков на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) с помощью полусухой системы переноса (400 мА в течение 90 мин) в буфере для переноса (25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 20% метанола).
    4. Подтвердите эффективность переноса с помощью обратимого окрашивания белка (Ponceau S: 0,1% в 5% уксусной кислоте в течение 5 мин) перед началом инкубации антител.
    5. Заблокируйте мембраны с 5% обезжиренным молоком в TBST (TBS + 0,1% Tween-20) на 1 ч при RT с легким перемешиванием.
    6. Инкубировать с первичными антителами, разведенными в соотношении 1:1000 в блокирующем буфере в течение ночи при температуре 4 °C, с легким перемешиванием.
    7. Мембраны трижды промыть TBST (по 10 мин каждая) и инкубировать с HRP-конъюгированными вторичными антителами (разведение 1:5000) в течение 1 ч в режиме РТ.
    8. Обнаружение белковых полос с помощью усиленной хемилюминесценции и количественное определение с помощью денситометрии.
    9. Нормализуйте экспрессию белка-мишени до контроля нагрузки (GAPDH) и подтвердите специфичность антител с использованием соответствующих контролей (пептидная блокировка первичных антител, вторичный контроль).

5. Поведенческая оценка и функциональный анализ

  1. Тест на размещение передних конечностей
    1. Дайте мыши акклиматизироваться к условиям тестирования (тихая комната, 22 °C, приглушенное освещение) в течение 30 минут перед оценкой.
    2. Осторожно возьмитесь за спинную поверхность мыши, подвешивая все четыре конечности примерно на 0,5 см над краем стола, при этом следя за тем, чтобы мышь не видела поверхность стола.
    3. Прижмите вибриссы с каждой стороны к краю стола, чтобы вызвать рефлекс размещения и зафиксировать успешную постановку передних конечностей в течение 2 секунд.
    4. Выполните 10 попыток с каждой стороны с 30-секундными интервалами между попытками, чередуя левую и правую стороны.
    5. Проводите тестирование в постоянных условиях освещения (50-100 люкс) и времени суток (13:00-17:00), чтобы свести к минимуму циркадное влияние.
    6. Рассчитайте коэффициент успеха в процентах от числа успешных размещений: (количество успешных размещений/общее количество испытаний) × 100.
  2. Ускорение испытания ротарод
    1. Установите вращательный аппарат на начальную скорость 4 об/мин с линейным ускорением до 40 об/мин в течение 5 минут.
    2. Обучайте мышей работе на ротароде в течение 3 дней подряд (3 испытания в день с 15-минутными интервалами) перед тестированием, чтобы свести к минимуму эффект обучения.
    3. Стандартизируйте условия тестирования, включая RT (22 ± 2 °C), освещение (100 люкс) и уровень фонового шума (<50 дБ).
    4. Поместите мышь на вращающийся стержень лицом вперед и немедленно начните протокол ускорения.
    5. Запишите задержку до падения (время от начала до падения мыши или завершения 5-минутного испытания) для каждого испытания, тестируя 5 раз на животное с 15-минутными интервалами отдыха.
    6. Рассчитайте среднюю задержку по трем самым длительным испытаниям, чтобы свести к минимуму вариативность из-за мотивационных факторов.
  3. Испытание в открытом поле
    1. Используйте аппарат для открытого поля (50 см × 50 см × прозрачный акриловый бокс 50 см) с системой видеонаблюдения, расположенный на высоте 1 м над ареной.
    2. Очистите аппарат с 70% этанолом между животными (распылите и протрите, высушите на воздухе 5 минут) для устранения запахов.
    3. Поместите мышь в центр устройства и записывайте активность в течение 10 минут при постоянном освещении (200 люкс) с видеосъемкой со скоростью 30 кадров в секунду.
    4. Анализируйте несколько параметров с помощью программного обеспечения для автоматического отслеживания:
      Общее пройденное расстояние (см)
      Время в центральной зоне (определяется как 10 см от стен, указывается в s)
      Скорость движения (см/с)
      Время, проведенное в периферийных и центральных зонах
  4. Определите центральную зону как 10 см от стен и количественно оцените затраченное время и пройденное расстояние в центре по сравнению с периферийными зонами.

6. Передовая микроскопия и визуализация

  1. Окрашивание DHE для обнаружения АФК
    1. Готовьте свежий раствор дигидроэтидия (ДГЭ) в концентрации 10 мкМ в PBS непосредственно перед применением (беречь от света).
    2. Проводите совместное иммунофлуоресцентное окрашивание в сочетании DHE с антителами к триптофангидроксилазе 2 (TPH2) (разведение 1:500) для специфической идентификации серотониновых нейронов.
      Примечание: Этот подход с двойной маркировкой позволяет отличить продукцию АФК в телах TPH2-положительных нейрональных клеток от окислительного стресса в окружающих глиальных клетках, основываясь на принципе, что ДГЭ при окислении супероксидом образует непроницаемые для мембраны флуоресцентные продукты, которые остаются локализованными в исходной клетке.
    3. Срезы тканей (толщиной 20 мкм) инкубировать с раствором DHE в течение 30 мин при 37 °C в темноте в увлажненной камере.
    4. Включите отрицательный контроль (без ДГЭ) и положительный контроль (100 мкМ Н2О2 в течение 30 мин) для подтверждения специфичности обнаружения АФК.
    5. Трижды вымойте секции с помощью PBS и установите с помощью монтажной среды, предотвращающей выцветание.
    6. Изображение получено с помощью флуоресцентной микроскопии (DHE: возбуждение 518 нм/излучение 605 нм, TPH2: возбуждение 488 нм/излучение 525 нм) с постоянными настройками экспозиции (200 мс) для всех образцов; Еженедельная калибровка систем визуализации проводилась с использованием стандартных флуоресцентных шариков (отношение сигнал/шум > 20:1).
    7. Количественно оценивайте интенсивность флуоресценции в TPH2-положительных клетках только с помощью программного обеспечения ImageJ со стандартизированными протоколами анализа (порог: 50-255, размер частиц: 10-∞ пикселей2). Установление границ ROI на основе иммунореактивности TPH2 для обеспечения измерения окислительного стресса в серотонинергических нейронах при одновременном исключении сигнала от соседних микроглий, астроцитов или других типов клеток. Для каждого животного проанализируйте минимум 50 TPH2-положительных нейронов на нескольких срезах ткани.
  2. Иммуногистохимия
    1. Зафиксируйте срезы тканей в 4% параформальдегиде в PBS в течение 24 ч при 4 °C с легким перемешиванием.
    2. Обезвоживайте с помощью сортированного этанола (70%, 80%, 90%, 95%, 100% × 2, 1 ч каждый) и засыпайте в парафин с помощью автоматизированного процессора.
    3. Вырежьте секции 5 мкм с помощью микротома и закрепите на предметных стеклах с заряженным стеклом, обеспечив 3-4 секции на предметное стекло.
    4. Депарафинизируйте секции с помощью ксилола (2 × 10 минут) и регидратируйте через градуированный этанол в воду.
    5. Выполните забор антигена с помощью цитратного буфера (10 мМ цитрата натрия, pH 6,0) в микроволновой печи (750 Вт в течение 10 мин с интервалом охлаждения 2 мин).
    6. Подтвердите специфичность антител с использованием соответствующего отрицательного контроля (без первичного антитела) и положительных контрольных тканей (участки мозга, которые, как известно, экспрессируют белки-мишени).
    7. Блокировать активность эндогенной пероксидазы 3% перекисью водорода в метаноле в течение 10 мин при РТ.
    8. Внесите первичные антитела на ночь при температуре 4 °C во увлажненной камере.
    9. Детектирование с помощью HRP-конъюгированных вторичных антител (разведение 1:500, 1 ч при ЛТ) и DAB-хромогена (инкубировать до появления коричневого цвета, обычно 2-5 мин).
    10. Контрокрашивание гематоксилином (30 с), обезвоживание, очистка и монтаж с постоянной монтажной средой.
    11. Количественное определение положительных клеток с помощью стереологических методов с систематической случайной выборкой (каждый 5-й срез, 3 подсчета кадров на срез, 40× увеличение).

7. Статистический анализ и проверка данных

  1. Статистическое проектирование и анализ
    1. Выполните анализ мощности для определения размеров выборки, достаточных для обнаружения биологически значимых различий (размер эффекта ≥ 0,8, мощность ≥ 0,80, α = 0,05) с помощью программного обеспечения G*Power 3.1.9.7.
    2. Проверьте нормальность данных с помощью теста Шапиро-Уилка и оцените однородность дисперсии с помощью теста Левена перед параметрическим анализом.
    3. Анализируйте данные с помощью статистического программного обеспечения с соответствующими статистическими тестами, основанными на планировании эксперимента и распределении данных.
    4. Применяйте односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) для однофакторных сравнений и двухфакторный ANOVA для факторных дизайнов (например, обработки × временных взаимодействий).
    5. Используйте апостериорный тест Тьюки для множественных сравнений, когда ANOVA показывает значимость (p < 0,05), применяя поправку Бонферрони, когда это уместно.
    6. Установите порог статистической значимости на уровне p < 0,05 для всех анализов с дополнительными обозначениями для p < 0,01 и p < 0,001.
    7. Сообщите о размерах эффекта (d Коэна или η2) и 95% доверительных интервалах вместе с p-значениями, чтобы обеспечить всестороннюю статистическую интерпретацию.
    8. Представьте данные в виде среднего значения ± SEM как минимум из трех независимых экспериментов, при этом отдельные точки данных отображаются при n ≤ 10.
      Примечание: Все эксперименты на клеточных культурах должны повторяться независимо друг от друга не менее трех раз, причем каждый эксперимент включает соответствующий контроль и множественные технические повторы, а наблюдаемая вариабельность (например, CV <15% для поведенческих данных) была сведена к минимуму за счет ослепления и стандартизированного времени.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Протокол успешно демонстрирует, что экспрессия Mettl3 снижается в микроглиальных клетках, обработанных ЛПС (рис. 1), о чем свидетельствует снижение уровня мРНК и белка по сравнению с контрольными группами (рис. 1B, C). Анализ методом ИФА подтверждает успешную ЛПС-опосредованную активацию воспаления за счет повышенных уровней IL-6 и TNF-α в супернатантах культуры (рис. 1A).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Существует несколько критических шагов, которые требуют тщательного внимания для обеспечения воспроизводимых результатов. Время активации ЛПС имеет решающее значение - воспалительные реакции достигают пика через 24 ч после лечения, и мы настоятельно рекомендуем готовить свежий раствор ЛПС для каждого эксперимента, так как накопленные растворы могут терять биологическую активность19,20. Для анализа MeRIP-qPCR качество антител имее...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов или конфликтов интересов, связанных с этой работой. Ни один автор не имеет никаких финансовых отношений с компаниями, продукция которых упоминается в этой статье.

Благодарности

Авторы благодарят технический персонал Народной больницы Фэйчэн и больницы Яньтай Яньтайшань за помощь в проведении экспериментальных процедур и уходе за животными.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Вирусные векторы AAV9Векторный ядроОбычайСодержащие конструкции Nrf2
Ускоряющийся ротародУго Базиле47600Для поведенческого тестирования
Антиантитела к GAPDHТехнология клеточной сигнализации5174Первичное антитело, 1:5000
Антитела к GSDMDAbcamAB219800Первичное антитело, 1:1000
Антитела к Iba1Вако019-19741Первичный антител — 1:500
Антитела к NLRP3AdipoGenAG-20B-0014Первичное антитело, 1:1000
Анти-NRF2 антителаAbcamab62352Первичное антитело, 1:1000
Антитела к SLC6A4Novus BiologicalsNBP1-85726Первичный антител — 1:500
Антитела к TPH2МиллипорMAB847Первичный антител — 1:500
Набор для анализа белков BCAПрокалывать23225Для количественной оценки белков
Микроглиальные клетки BV2Шэнгэнская биологияSG-BV2Микроглиальная клеточная линия мыши
Мыши C57BL/6JЛаборатория Витал Ривер2138 недель, 19-26 г
Набор для фракционирования клетокТехнология клеточной сигнализации9038Ядерно-цитоплазматическое отделение
Полный ДМЭМ с высоким уровнем глюкозыGibco11965092Среда для культивирования клеток
DAB хромогенVector LaboratoriesSK-4100Для иммуногистохимии
Стоматологическая дрельТонкие научные инструменты18000-17Для бурения жернова
DHE (дигидроэтидий)Молекулярные зондыD11347Обнаружение ROS
ELISA Kit (IL-1 и бета;)R& D SystemsMLB00CMouse IL-1β обнаружение
ЭЛИЗА Кит (IL-18)R& D Systems7625Обнаружение мыши ИЛ-18
ЭЛИЗА Кит (IL-6)R& D SystemsM6000BОбнаружение мыши IL-6
ELISA Kit (TNF-α)R& D SystemsMTA00BМыши TNF-и альфа; обнаружение
Сыворотка плода для быкаGibco16000044Добавка для культуры клеток
Вторичные антитела, конъюгированные с HRPJackson ImmunoResearch111-035-003Анти-кролик, 1:10000
ИзофлуранRWD Life ScienceR510-22Анестетик
LAL Assay KitЛонза50-647UВалидация активности LPS
Реагент для трансфекции липофектаминовИнвитроген11668019Для трансфекции клеток
LPS (липополисахарид)Сигма-ОлдричL2630Из E. coli — 1 мг/мл запаса
Антитела к m6AСинаптические системы202003Для MeRIP, 1:200
Микрошприцовый насосАппаратура Гарварда70-3007Для стереотаксической инъекции
MPTPСигма-ОлдричM0896Нейротоксин, 30 мг/кг
Оборудование для открытого поляANY-mazeОбычай50 см и остро; 50 см и остро; 50 см
ПараформальдегидСигма-ОлдричP61484% в PBS
pcDNA3.1 векторИнвитрогенV79020Вектор экспрессии
Пенициллин-стрептомицинGibco15140122Антибиотиковый раствор
Premix Ex Taq II KitТакараRR820AДля qPCR
PrimeScript RT KitТакараRR037AОбратная транскрипция
Мембрана PVDFМиллипорIPVH00010Для Western Blot
Буфер RIPAТехнология клеточной сигнализации9806Экстракция белка
siRNA (Mettl3)RiboBioОбычайВалидация целевой последовательности
Стереотактический кадрRWD Life Science68001Для операции на мозге
Реагент ТризолИнвитроген15596026Экстракция РНК
Трипан-синийСигма-ОлдричT8154Окрашивание жизнеспособности клетки

Ссылки

  1. Poewe, W. Parkinson disease primer-a true team effort. Nat Rev Dis Primers. 6 (1), 31(2020).
  2. Badanjak, K., Fixemer, S., Smajić, S., Skupin, A., Grünewald, A. The contribution of microglia to neuroinflammation in Parkinson's disease. Int J Mol Sci. 22 (9), 4676(2021).
  3. Glass, C. K., Saijo, K., Winner, B., Marchetto, M. C., Gage, F. H. Mechanisms underlying inflammation in neurodegeneration. Cell. 140 (6), 918-934 (2010).
  4. Lee, Y., Lee, S., Chang, S. -C., Lee, J. Significant roles of neuroinflammation in Parkinson's disease:therapeutic targets for PD prevention. Arch Pharm Res. 42 (5), 416-425 (2019).
  5. Yao, L., et al. Translational evaluation of metabolic risk factors impacting DBS efficacy for PD-related sleep and depressive disorders:preclinical, prospective and cohort studies. Int J Surg. 111 (1), 543-566 (2025).
  6. Rodríguez-Gómez, J. A., et al. Microglia:agents of the CNS pro-inflammatory response. Cells. 9 (7), 1717(2020).
  7. Nguyen, M., Palm, N. W. Gut instincts in neuroimmunity from the eighteenth to twenty-first centuries. Semin Immunopathol. 44 (5), 569-579 (2022).
  8. Pajares, M., Rojo, A. I., Manda, G., Boscá, L., Cuadrado, A. Inflammation in Parkinson's disease:mechanisms and therapeutic implications. Cells. 9 (7), 1687(2020).
  9. Sampson, T. R., et al. Gut microbiota regulate motor deficits and neuroinflammation in a model of Parkinson's disease. Cell. 167 (6), 1469-1480.e12 (2016).
  10. Yao, L., et al. LRRK2 Gly2019Ser mutation promotes ER stress via interacting with THBS1/TGF-β1 in Parkinson's disease. Adv Sci. 10 (30), e2303711(2023).
  11. Haque, M. E., et al. Targeting the microglial NLRP3 inflammasome and its role in Parkinson's disease. Mov Disord. 35 (1), 20-33 (2019).
  12. Huang, Y., Xu, W., Zhou, R. NLRP3 inflammasome activation and cell death. Cell Mol Immunol. 18 (9), 2114-2127 (2021).
  13. Lee, E., et al. MPTP-driven NLRP3 inflammasome activation in microglia plays a central role in dopaminergic neurodegeneration. Cell Death Differ. 26 (2), 213-228 (2018).
  14. Humphries, F., et al. The E3 ubiquitin ligase Pellino2 mediates priming of the NLRP3 inflammasome. Nat Commun. 9 (1), 1560(2018).
  15. Berger, M., Gray, J. A., Roth, B. L. The expanded biology of serotonin. Annu Rev Med. 60 (1), 355-366 (2009).
  16. Filip, M., Bader, M. Overview on 5-HT receptors and their role in physiology and pathology of the central nervous system. Pharmacol Rep. 61 (5), 761-777 (2009).
  17. Yao, L., et al. MicroRNA-124 regulates the expression of MEKK3 in the inflammatory pathogenesis of Parkinson's disease. J Neuroinflammation. 15 (1), 13(2018).
  18. Fyodorov, D., Nelson, T., Deneris, E. Pet-1, a novel ETS domain factor that can activate neuronal nAchR gene transcription. J Neurobiol. 34 (2), 151-163 (1998).
  19. Deng, J., Chen, X., Chen, A., Zheng, X. m6A RNA methylation in brain injury and neurodegenerative disease. Front Neurol. 13, 995747(2022).
  20. Livneh, I., Moshitch-Moshkovitz, S., Amariglio, N., Rechavi, G., Dominissini, D. The m6A epitranscriptome:transcriptome plasticity in brain development and function. Nat Rev Neurosci. 21 (1), 36-51 (2019).
  21. Jiang, L., Li, X., Wang, S., Yuan, Z., Cheng, J. The role and regulatory mechanism of m6A methylation in the nervous system. Front Genet. 13, 962774(2022).
  22. Yao, L., et al. MicroRNA-124 regulates the expression of p62/p38 and promotes autophagy in the inflammatory pathogenesis of Parkinson's disease. FASEB J. 33 (7), 8648-8665 (2019).
  23. Huang, H., Camats-Perna, J., Medeiros, R., Anggono, V., Widagdo, J. Altered expression of the m6A methyltransferase METTL3 in Alzheimer's disease. eNeuro. 7 (5), (2020).
  24. Mathoux, J., Henshall, D. C., Brennan, G. P. Regulatory mechanisms of the RNA modification m6A and significance in brain function in health and disease. Front Cell Neurosci. 15, 671932(2021).
  25. Guo, F., et al. Genome-wide identification of m6A-associated single nucleotide polymorphisms in complex diseases of nervous system. Neurosci Lett. 817, 137513(2023).
  26. Romaschin, A. D., Klein, D. J., Marshall, J. C. Bench-to-bedside review:clinical experience with the endotoxin activity assay. Crit Care. 16 (6), 248(2012).
  27. Zhong, L., et al. METTL3 induces AAA development and progression by modulating N6-methyladenosine-dependent primary miR34a processing. Mol Ther Nucleic Acids. 21, 394-411 (2020).
  28. Justice, J. N., et al. Battery of behavioral tests in mice that models age-associated changes in human motor function. Age (Dordr). 36 (2), 583-592 (2014).
  29. Seibenhener, M. L., Wooten, M. C. Use of the Open Field Maze to measure locomotor and anxiety-like behavior in mice. J Vis Exp. (96), e52434(2015).
  30. Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785(2014).
  31. Roundtree, I. A., Evans, M. E., Pan, T., He, C. Dynamic RNA modifications in gene expression regulation. Cell. 169 (7), 1187-1200 (2017).
  32. Song, M. -Y., Lee, D. -Y., Chun, K. -S., Kim, E. -H. The role of NRF2/KEAP1 signaling pathway in cancer metabolism. Int J Mol Sci. 22 (9), 4376(2021).
  33. He, F., Ru, X., Wen, T. NRF2, a transcription factor for stress response and beyond. Int J Mol Sci. 21 (13), 4777(2020).
  34. Schöller, E., et al. Interactions, localization, and phosphorylation of the m6A generating METTL3-METTL14-WTAP complex. RNA. 24 (4), 499-512 (2018).
  35. Li, G., et al. METTL3 plays a crucial function in multiple biological processes. Acta Histochem. 124 (6), 151916(2022).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Пироптоз NLRP3воспаление микроглиимодификация m6AMeRIP-qPCRмышиная модель MPTPвестерн-блоттингиммуногистохимия
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.