Ось Mettl3/Nrf2 подавляет прогрессирование болезни Паркинсона за счет ингибирования NLRP3-индуцированного пироптоза в серотониновых нейронах

Болезнь Паркинсона (БП) занимает второе место среди наиболее распространенных нейродегенеративных расстройств среди пожилых людей, затрагивая около 2-3% людей в возрасте 65 лет и старше, что создает значительную нагрузку как для семей, так^{и для общества}. Несмотря на то, что точные механизмы БП остаются частично изученными, накапливающиеся данные указывают на связь между развитием БП и проблемами в передаче нейронов, а также нейровоспалением, вызванным микроглиальными клетками, что является общей чертой, наблюдаемой при старении мозга и различных нейродегенеративных заболеваниях, включая БП 2,3,4,5 . Микроглия служит клетками врожденного иммунитета в центральной нервной системе (ЦНС) и жизненно важна для поддержания гомеостаза мозга⁶. Тем не менее, стойкая гиперактивация этих микроглий может вызвать хронические нейровоспалительные реакции, что в конечном итоге способствует прогрессированию нейродегенеративного заболевания.

Как центральные, так и периферические воспалительные процессы существенно влияют на патологию БП ^7,8. Активация клеток микроглии вызывает воспалительные реакции, которые влияют на выживаемость нейронов⁹, при этом новые данные подчеркивают его праймирование убиквитиновыми лигазами¹⁰. Среди различных воспалительных путей активация инфламмасомы, содержащей NOD-, LRR и пирин-домен белка 3 (NLRP3), служит основным фактором микроглиальной воспалительной регуляции¹¹. Активация приводит к экспрессии NLRP3 и последующей сборке инфламмасомного комплекса, состоящего из адаптерного белка домена активации и рекрутирования каспазы (CARD) и про-каспазы-1, что приводит к расщеплению белка и высвобождению цитокинов¹². Повышенная активация NLRP3 наблюдалась у пациентов с болезнью Паркинсона и на различных животных моделях заболевания, что приводило к гибели нейронов. Примечательно, что ингибирование NLRP3 продемонстрировало защитные эффекты против патологии БП на мышиных моделях, что подчеркивает решающую роль инфламмасомы NLRP3 в возникновении БП^13,14.

Передача сигналов серотонина (5-НТ) является важным механизмом нервной регуляции, влияющим на многочисленные виды поведения и физиологические функции посредством взаимодействия по меньшей мере с 14 подтипами постсинаптических рецепторов^15,16, включая роль в патологии ЦНС, как подробно описано в комплексных обзорах¹⁷. Обширное нейромодулирующее влияние системы 5-HT регулируется примерно 26 000 нейронов в мозге грызунов^. В то время как значительная часть литературы связывает БП преимущественно с потерей дофаминергических нейронов, связь между нейронами 5-HT и БП изучается менее тщательно.

Модификация N6-метиладенозина (m6A), наиболее распространенная модификация мРНК в эукариотических клетках, является ключом к регуляции сплайсинга, стабильности и экспорта мРНК, тем самым влияя на различные клеточные^{активности.} Уровни m6A модулируются метилтрансферазами и деметилазами. Повышенные модификации m6A в мозге были связаны с развитием нервной системы, при этом ее дисрегуляция тесно связана с нейродегенеративными состояниями^20,21, включая измененную экспрессию METTL3 в моделях болезни Альцгеймера²². Например, накопление метилтрансферазы-подобного 3 (METTL3) в нерастворимой фракции посмертных тканей мозга у пациентов с болезнью Альцгеймера положительно коррелирует с уровнями нерастворимого тау-белка²³. Кроме того, значительное снижение уровня m6A в стриатуме может привести к значительному снижению уровня дофаминовых нейротрансмиттеров²⁴. Примечательно, что двенадцать однонуклеотидных полиморфизмов, связанных с m6A, показали значительную связь с восприимчивостью к БП²⁵. Этот протокол устанавливает всесторонние методологии для исследования того, как METTL3-опосредованные модификации m6A регулируют микроглиальный пироптоз через ось Nrf2/NLRP3, в конечном итоге влияя на выживаемость серотониновых нейронов в моделях БП. Модель острой МФТП in vivo и модель ЛПС in vitro были выбраны из-за их надежной индукции нейровоспалительных реакций, хотя хронические парадигмы могут дополнить будущие исследования, как обсуждается ниже.

Все эксперименты на животных проводились с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию Народной больницы Фэйчэн (номер одобрения IACUC-2024-118) и проводились в строгом соответствии с институциональными руководящими принципами и установленными этическими принципами для исследований на лабораторных животных. Протоколы исследования обеспечивали гуманный уход и обращение со всеми животными, уделяя особое внимание минимизации страданий и стресса, при этом соблюдая как институциональные стандарты, так и руководящие принципы ARRIVE, касающиеся ответственной практики исследований на животных.

1. Модель клеточной культуры и активации микроглии

1. Подготовка и обслуживание ячеек BV2
   1. Быстро разморозьте замороженные запасы микроглиальных клеток BV2 на водяной бане при температуре 37 °C в течение 2 минут, обеспечивая мягкое вращение для предотвращения теплового удара.
   2. Центрифугируйте размороженную клеточную суспензию при 300 × г в течение 5 мин при комнатной температуре (ОТ) для удаления криопротектора.
   3. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте клеточную гранулу в 10 мл полной среды DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицина и 2 мМ L-глутамина.
   4. Оценку жизнеспособности клеток проводят методом исключения трипанового синего (смешайте 10 мкл клеточной суспензии с 10 мкл 0,4% трипанового синего, подсчитайте с помощью гемоцитометра), убедившись в жизнеспособности >95%, прежде чем продолжить.
   5. Пластинчатые клетки в культуральных колбах Т75 при плотности от 1 ×^{10 до 6} клеток в колбе и выдерживают в увлажненном инкубаторе для клеточных культур при температуре 37°С с 5% СО2.
   6. Пассаж клеток каждые 48 ч при достижении 80-85% конфлюенции с использованием стандартных процедур трипсинизации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте постоянное количество пассажей (пассажи 3-8) для обеспечения воспроизводимых воспалительных реакций. Все эксперименты с клеточными культурами независимо друг от друга повторялись не менее трех раз, с тремя техническими повторениями в каждом условии для минимизации вариабельности.
2. ЛПС-индуцированная активация микроглии
   1. Посев BV2 клеток в 6-луночные планшеты по 2 ×^{10 5} клеток в лунку в 2 мл полной среды за 24 ч до обработки.
   2. Готовить исходный раствор ЛПС в концентрации 1 мг/мл в стерильном PBS, фильтровать-стерилизовать через фильтр 0,22 мкм и хранить в одноразовых аликвотах при -20 °С.
   3. Валидация активности ЛПС с помощью анализа лизата амебоцитов Limulus (LAL) для подтверждения концентрации эндотоксина перед каждым экспериментом²⁶.
   4. Развести бульонные массы ЛПС до рабочей концентрации 1 мкг/мл в бессывороточном DMEM непосредственно перед применением.
   5. Извлеките питательную среду из лунок и дважды промойте клетки стерильным ПБС.
   6. Добавьте 2 мл среды, содержащей ЛПС (конечная концентрация 1 мкг/мл) в очистные скважины и бессывороточный DMEM для контрольных лунок.
   7. Инкубируйте клетки в течение 24 ч при 37 °C с 5%_CO2 для активации воспаления.
   8. Для подтверждения воспалительной реакции включайте положительные контрольные лунки, обработанные фактором некроза опухоли (TNF)-α с концентрацией 100 нг/мл, и отрицательные контрольные лунки только с носителем (PBS).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Готовьте свежий раствор ЛПС для каждого эксперимента, чтобы поддерживать постоянную биологическую активность. Если воспалительная реакция слабая (например, <2-кратное увеличение цитокинов), проверьте стабильность реагента или продлите инкубацию до 48 часов.
3. Сверхэкспрессия и нокдаун Mettl3
   1. Проектирование и синтез последовательностей малых интерферирующих РНК (миРНК), нацеленных на Mettl3 и скремблированные контрольные последовательности, с использованием стандартных протоколов синтеза олигонуклеотидов. Выберите последовательности-мишени из кодирующей области мРНК Mettl3 (образец GenBank: NM_019721) с длиной 19-21 нуклеотид, обеспечивая содержание GC 40-60%²⁷.
   2. Валидация последовательностей миРНК с помощью анализа BLAST для подтверждения специфичности и предотвращения побочных эффектов (обеспечение гомологии <70% с нецелевыми генами).
   3. Получить векторы сверхэкспрессии, содержащие полноразмерную кДНК Mettl3, клонированную в вектор pcDNA3.1, с использованием сайтов рестрикции EcoRI и XhoI.
   4. Трансфектируйте клетки при 70-80% конфлюенции с помощью катионного липидного реагента для трансфекции:
      1. Смешайте 2 мкл реагента для трансфекции катионных липидов с 50 пмоль миРНК или 2 мкг плазмидной ДНК в 100 мкл среды Opti-MEM.
      2. Инкубировать смесь в течение 15 минут при RT.
      3. Трансфекционный комплекс добавляют по каплям в клетки и инкубируют в течение 4-6 часов, прежде чем превратить в свежую полноценную среду.
   5. Инкубируйте трансфицированные клетки в течение 48 ч перед лечением ЛПС, чтобы обеспечить адекватные изменения экспрессии белка.
   6. Подтвердите эффективность трансфекции с помощью котрансфекции флуоресцентного репортера (100 нг pEGFP-C1 на лунку) с целью достижения эффективности >70% с помощью флуоресцентной микроскопии, прежде чем продолжить.

2. Разработка животных моделей и планирование экспериментов

1. Подготовка животных и рандомизация
   1. Получите мышей C57BL/6J из лаборатории Vital River, обеспечив равное соотношение самцов и самок, в возрасте 8 недель и весом 19-26 г.
   2. Домашние животные в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF) с циклом «свет-темнота» 12:12 ч, контролируемой температурой (22 ± 2°C) и влажностью (50-60%).
   3. Предусмотрите 7-дневный период акклиматизации с ограниченным доступом к стандартному корму и воде.
   4. Проведение исходных поведенческих оценок во время акклиматизации: Проведение комплексных поведенческих оценок, включая тест на размещение передних конечностей (10 попыток с каждой стороны), ускорение ротародной оценки (4-40 об/мин в течение 5 минут) и анализ локомоторной активности в открытом поле (10-минутные сеансы на аппарате 50 см × 50 см × 50 см)28,29,30.
   5. Случайным образом распределите животных по экспериментальным группам (n = 6 в группе) с помощью компьютеризированной рандомизации для минимизации систематической ошибки: smock, Model, Model+Nrf2-KD, Model+oe-Nrf2.
   6. Внедрите слепой экспериментальный дизайн, в котором исследователи, проводящие поведенческие оценки, не знают о групповых заданиях.
2. Модель болезни Паркинсона, индуцированной 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридином (МФТП)
   1. Готовят раствор МФТП в дозе 30 мг/кг в стерильном физрастворе непосредственно перед инъекцией, растворяя 15 мг МФТП гидрохлорида в 5 мл стерильного физиологического раствора и корректируя объем в зависимости от массы животного.
      ВНИМАНИЕ: МФТП обладает высокой нейротоксичностью. Обращайтесь в вытяжном шкафчике с химическими веществами с соответствующими средствами индивидуальной защиты, включая двойные перчатки и лабораторный халат.
   2. Вводите МФТП путем внутрибрюшинной инъекции в дозе 30 мг/кг массы тела (объем инъекции 10 мл/кг) в течение трех дней подряд в одно и то же время каждый день (09:00 ± 30 минут).
   3. Вводите животным фиктивной группы эквивалентные объемы стерильного физиологического раствора, следуя идентичной схеме инъекций.
   4. Ежедневно наблюдайте за животными на предмет признаков дистресса, потери веса (>15% считается конечной точкой) или побочных реакций ежедневно в течение периода введения MPTP с использованием стандартизированных таблиц оценки.
   5. Сохраняйте животных в течение 8 дней после последней инъекции, чтобы дать возможность развиться нейродегенерации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этот период животные могут содержаться в обычном режиме при постоянном контроле.
3. Стереотаксическая вирусная инъекция
   1. Получить вирусные векторы AAV9 путем тройной трансфекции HEK293T клеток с использованием полиэтиленимина (ПЭИ; соотношение ДНК:ПЭИ 1:3), собрать через 72 ч после трансфекции, очистить с помощью градиентного ультрацентрифугирования йодиксанолом (177 000 × г в течение 2 ч) и сконцентрировать с помощью центробежных фильтрующих устройств для получения 1 × 10–¹² копий генома/мл.
   2. Валидация титра вируса с помощью количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием праймеров, нацеленных на области ITR, при этом титры достигают 1 × 10¹² копий генома/мл с помощью стандартного анализа кривых.
   3. Валидация титра вируса с помощью количественной ПЦР на основе SYBR Green с ITR-специфичными праймерами, выполнение серийных разведений известных стандартов и расчет копий генома с помощью анализа стандартных кривых. Подтвердите отсутствие репликационно-компетентной вирусной контаминации с помощью p24 ELISA.
   4. Обезболивайте мышей изофлураном (3% индукции, 1,5-2% поддержания), доставляемым со скоростью 0,8-1,0 л/мин потока кислорода через носовой конус, контролируя частоту дыхания (60-100 вдохов/мин) и рефлекс защемления пальцев ног на протяжении всей процедуры. Закрепите мышь в стереотаксической рамке и нанесите офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
   5. Закрепите мышь в стереотаксической рамке и нанесите офтальмологическую мазь, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
   6. Сделайте разрез кожи головы по средней линии 1,5 см с помощью стерильного лезвия скальпеля и определите ориентир брегмы по стереотаксическим координатам с точностью до 0,1 мм.
   7. Рассчитать координаты инъекции стриатума: передне-задний -0,5 мм, медиально-латеральный ±2,0 мм, дорсально-вентральный -3,0 мм от брегмы.
   8. Перед экспериментальными инъекциями проведите пилотные инъекции с флуоресцентным индикатором (например, зеленым флуоресцентным белком [GFP]) для проверки точности нацеливания, подтвердив >80% колокализацию с микроглиальными маркерами (Iba1) с помощью иммуногистохимии.
   9. Опустите иглу для инъекций (33-G) на целевую глубину со скоростью 1 мм/мин и введите 2 мкл вирусной суспензии со скоростью 0,2 мкл/мин с помощью микрошприцевого насоса с автоматическим контроллером. Опустите иглу для инъекций на целевую глубину и введите 2 мкл вирусной суспензии со скоростью 0,2 мкл/мин с помощью микрошприцевого насоса.
   10. Сохраняйте положение иглы в течение 5 минут после инъекции, чтобы предотвратить обратный поток.
   11. Медленно извлеките иглу со скоростью 0,5 мм/мин, закройте разрез шелковыми швами 4-0 по прерывистой схеме и дайте возможность восстановиться после анестезии на подогретой салфетке для восстановления.
   12. Проводить послеоперационное обезболивание (карпрофен 5 мг/кг подкожно один раз в сутки в течение 3 дней) и контролировать восстановление в течение 24 ч с помощью подробных протоколов наблюдения.

3. Методы молекулярной биологии и валидация

1. Экстракция РНК и контроль качества
   1. Забор образцов клеток или тканей мозга полосатого тела сразу после экспериментальных конечных точек путем гуманной эвтаназии животных с помощью ингаляции CO₂ с последующим вывихом шейки матки; Рассеките ткань на льду, мелко измельчите и ферментативно диссоциируйте с 0,25% трипсином в течение 10 минут при 37 °C при сборе клеток.
   2. Выделить общую РНК с помощью реагента ТРИзол (1 мл на 1,^{10, 6} клеток или 100 мг ткани) с механической гомогенизацией (20-25 ходов в гомогенизаторе с подачкой) и разделением фаз хлороформа (0,2 мл хлороформа на 1 мл ТРИЗОЛА).
   3. Оценка качества РНК с помощью спектрофотометрии (соотношение A260/A280 1,8-2,0) и гель-электрофореза (1% агарозы) для подтверждения 28S и 18S рибосомных полос.
   4. Количественное определение концентрации РНК с помощью спектрофотометра.
   5. Хранить образцы РНК при -80 °C в воде без нуклеаз при -80 °C с добавлением ингибитора РНКазы (40 ед/мкл) до анализа.
2. Ядерно-цитоплазматическое фракционирование
   1. Соберите клетки (2 × 10^{6 минимум} ) и дважды промойте ледяным PBS (5 мл на промывку, 5 мин центрифугирование при 300 × г).
   2. Используйте коммерческий набор для фракционирования клеток по следующему протоколу.
      1. Ресуспендируйте клеточную таблетку в 200 мкл цитоплазматического экстракционного буфера с ингибиторами протеазы.
      2. Выдерживать на льду в течение 10 мин с вортексированием каждые 3 мин.
      3. Центрифугировать при 16 000 × г в течение 5 мин при 4 °C и собрать надосадочную жидкость (цитоплазматическую фракцию).
      4. Дважды промойте гранулу цитоплазматическим экстракционным буфером.
      5. Ресуспендируйте гранулу в 100 мкл ядерного буфера для извлечения.
      6. Выдерживать на льду в течение 40 мин с фортексированием каждые 10 мин.
      7. Центрифугируйте при 16 000 × г в течение 10 мин при 4 °C и соберите надосадочную жидкость (ядерную фракцию)
   3. Проверка эффективности фракционирования путем анализа распределения ядерных маркеров (U6) и цитоплазматических маркеров (GAPDH) с помощью вестерн-блоттинга.
   4. Извлекают РНК из ядерной и цитоплазматической фракций отдельно.
   5. Анализируйте уровни мРНК Nrf2 в каждой фракции с помощью ОТ-кПЦР с референсными генами, специфичными для фракции.
3. Количественная ПЦР в реальном времени (ОТ-кПЦР)
   1. Синтезировать кДНК из 1 мкг общей РНК с помощью набора реагентов для обратной транскрипции со случайными праймерами.
   2. Проведите кПЦР с помощью набора Premix Ex Taq II с ген-специфичными праймерами на системе ПЦР в реальном времени.
   3. Подтвердите специфичность праймера с помощью анализа кривой расплава и подтвердите одиночный ампликон с помощью гель-электрофореза.
   4. Используйте следующие условия термоциклирования: начальная денатурация при 95 °C в течение 10 минут, затем 40 циклов при 95 °C в течение 15 с, 60 °C в течение 30 с и 72 °C в течение 30 с.
   5. Расчет относительных уровней экспрессии мРНК с использованием метода ^2-ΔΔCt с β-актином в качестве внутреннего эталона.
   6. Включите контрольные элементы без шаблонов и проверьте стабильность референсных генов в экспериментальных условиях с помощью анализа geNorm (значение стабильности M < 0,5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Показатели воспроизводимости: коэффициент вариации (CV) внутри анализа <10% по трем независимым прогонам.
4. MeRIP-qPCR для анализа модификации m6A
   1. Извлечь общую РНК (минимум 20 мкг) и фрагментировать до 100-200 нуклеотидов с помощью реагента для фрагментации РНК (10 мМ ZnCl₂, 10 мМ Tris-HCl, pH 7,0) при 70 °C в течение 5 мин.
   2. Иммунопреципитацию проводят с использованием m6A-специфического антитела (2 мкг на 20 мкг РНК) в течение ночи при 4 °C с вращением (10 об/мин) в буфере для иммунопреципитации (50 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 750 мМ NaCl, 0,5% NP-40).
   3. Валидация специфичности антител с использованием известных m6A-модифицированных и немодифицированных РНК контрольных показателей.
   4. Иммунопреципитированные комплексы промыть пять раз промывающим буфером.
   5. Элюируйте связанную РНК и выполните обратную транскрибацию с помощью случайных праймеров.
   6. Обратная транскрибация элюированной РНК с использованием случайных праймеров и выполнение количественного ПЦР-анализа с использованием Nrf2-специфичных праймеров, охватывающих потенциальные сайты m6A.
   7. Выполните анализ количественной ПЦР с использованием специфичных для Nrf2 праймеров и рассчитайте обогащение относительно входной РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если обнаружение непостоянное, оптимизируйте время фрагментации (4-6 минут) для улучшения воспроизводимости; количественный контроль: отношение сигнал/шум >15:1 по сравнению с контролем IgG.

4. Анализ и валидация белка

1. Экстракция и количественное определение белка
   1. Лизируют клетки (1 × 10,⁶ клеток) или гомогенизируют образцы тканей (100 мг ткани стриарного тела) в 200 мкл буфера радиоиммунопреципитационного анализа (RIPA), содержащего ингибиторы протеазы (1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF), 1 мкг/мл лейпептина, 1 мкг/мл пепстатина А) и ингибиторы фосфатазы (1 мМ ортованадат натрия, 5 мМ фторида натрия).
   2. Лизаты инкубировать на льду в течение 30 мин с периодическим вортексированием (каждые 10 мин в течение 10 с).
   3. Центрифугируйте при 12 000 × г в течение 15 мин при 4 °C для удаления клеточного мусора и сбора надосадочной жидкости.
   4. Количественное определение концентрации белка с помощью анализа бицинхониловой кислоты (БЦА) со стандартами бычьего сывороточного альбумина (0, 25, 125, 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000 мкг/мл) в трех измерениях.
   5. Проверьте целостность белка путем анализа уровней бытовых белков (GAPDH, ожидаемая MW: 36 кДа) во всех образцах с помощью вестерн-блоттинга.
2. Вестерн-блоттинг
   1. Подготовить образцы белка с равной нагрузкой (30-50 мкг) в загрузочном буфере для электрофореза додецилсульфата натрия-полиакриламида (SDS-PAGE) (конечные концентрации: 62,5 мМ Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% глицерина, 5% β-меркаптоэтанола, 0,003% бромфенолового синего) и денатурировать при 95 °C в течение 5 мин.
   2. Разделите белки с помощью SDS-PAGE с использованием 10% полиакриламидных гелей при напряжении 80 В в течение 30 мин, а затем при напряжении 120 В в течение 90 мин в буфере Tris-glycine-SDS.
   3. Перенос белков на мембраны из поливинилиденфторида (PVDF) с помощью полусухой системы переноса (400 мА в течение 90 мин) в буфере для переноса (25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 20% метанола).
   4. Подтвердите эффективность переноса с помощью обратимого окрашивания белка (Ponceau S: 0,1% в 5% уксусной кислоте в течение 5 мин) перед началом инкубации антител.
   5. Заблокируйте мембраны с 5% обезжиренным молоком в TBST (TBS + 0,1% Tween-20) на 1 ч при RT с легким перемешиванием.
   6. Инкубировать с первичными антителами, разведенными в соотношении 1:1000 в блокирующем буфере в течение ночи при температуре 4 °C, с легким перемешиванием.
   7. Мембраны трижды промыть TBST (по 10 мин каждая) и инкубировать с HRP-конъюгированными вторичными антителами (разведение 1:5000) в течение 1 ч в режиме РТ.
   8. Обнаружение белковых полос с помощью усиленной хемилюминесценции и количественное определение с помощью денситометрии.
   9. Нормализуйте экспрессию белка-мишени до контроля нагрузки (GAPDH) и подтвердите специфичность антител с использованием соответствующих контролей (пептидная блокировка первичных антител, вторичный контроль).

5. Поведенческая оценка и функциональный анализ

1. Тест на размещение передних конечностей
   1. Дайте мыши акклиматизироваться к условиям тестирования (тихая комната, 22 °C, приглушенное освещение) в течение 30 минут перед оценкой.
   2. Осторожно возьмитесь за спинную поверхность мыши, подвешивая все четыре конечности примерно на 0,5 см над краем стола, при этом следя за тем, чтобы мышь не видела поверхность стола.
   3. Прижмите вибриссы с каждой стороны к краю стола, чтобы вызвать рефлекс размещения и зафиксировать успешную постановку передних конечностей в течение 2 секунд.
   4. Выполните 10 попыток с каждой стороны с 30-секундными интервалами между попытками, чередуя левую и правую стороны.
   5. Проводите тестирование в постоянных условиях освещения (50-100 люкс) и времени суток (13:00-17:00), чтобы свести к минимуму циркадное влияние.
   6. Рассчитайте коэффициент успеха в процентах от числа успешных размещений: (количество успешных размещений/общее количество испытаний) × 100.
2. Ускорение испытания ротарод
   1. Установите вращательный аппарат на начальную скорость 4 об/мин с линейным ускорением до 40 об/мин в течение 5 минут.
   2. Обучайте мышей работе на ротароде в течение 3 дней подряд (3 испытания в день с 15-минутными интервалами) перед тестированием, чтобы свести к минимуму эффект обучения.
   3. Стандартизируйте условия тестирования, включая RT (22 ± 2 °C), освещение (100 люкс) и уровень фонового шума (<50 дБ).
   4. Поместите мышь на вращающийся стержень лицом вперед и немедленно начните протокол ускорения.
   5. Запишите задержку до падения (время от начала до падения мыши или завершения 5-минутного испытания) для каждого испытания, тестируя 5 раз на животное с 15-минутными интервалами отдыха.
   6. Рассчитайте среднюю задержку по трем самым длительным испытаниям, чтобы свести к минимуму вариативность из-за мотивационных факторов.
3. Испытание в открытом поле
   1. Используйте аппарат для открытого поля (50 см × 50 см × прозрачный акриловый бокс 50 см) с системой видеонаблюдения, расположенный на высоте 1 м над ареной.
   2. Очистите аппарат с 70% этанолом между животными (распылите и протрите, высушите на воздухе 5 минут) для устранения запахов.
   3. Поместите мышь в центр устройства и записывайте активность в течение 10 минут при постоянном освещении (200 люкс) с видеосъемкой со скоростью 30 кадров в секунду.
   4. Анализируйте несколько параметров с помощью программного обеспечения для автоматического отслеживания:
      Общее пройденное расстояние (см)
      Время в центральной зоне (определяется как 10 см от стен, указывается в s)
      Скорость движения (см/с)
      Время, проведенное в периферийных и центральных зонах
4. Определите центральную зону как 10 см от стен и количественно оцените затраченное время и пройденное расстояние в центре по сравнению с периферийными зонами.

6. Передовая микроскопия и визуализация

1. Окрашивание DHE для обнаружения АФК
   1. Готовьте свежий раствор дигидроэтидия (ДГЭ) в концентрации 10 мкМ в PBS непосредственно перед применением (беречь от света).
   2. Проводите совместное иммунофлуоресцентное окрашивание в сочетании DHE с антителами к триптофангидроксилазе 2 (TPH2) (разведение 1:500) для специфической идентификации серотониновых нейронов.
      Примечание: Этот подход с двойной маркировкой позволяет отличить продукцию АФК в телах TPH2-положительных нейрональных клеток от окислительного стресса в окружающих глиальных клетках, основываясь на принципе, что ДГЭ при окислении супероксидом образует непроницаемые для мембраны флуоресцентные продукты, которые остаются локализованными в исходной клетке.
   3. Срезы тканей (толщиной 20 мкм) инкубировать с раствором DHE в течение 30 мин при 37 °C в темноте в увлажненной камере.
   4. Включите отрицательный контроль (без ДГЭ) и положительный контроль (100 мкМ Н₂О₂ в течение 30 мин) для подтверждения специфичности обнаружения АФК.
   5. Трижды вымойте секции с помощью PBS и установите с помощью монтажной среды, предотвращающей выцветание.
   6. Изображение получено с помощью флуоресцентной микроскопии (DHE: возбуждение 518 нм/излучение 605 нм, TPH2: возбуждение 488 нм/излучение 525 нм) с постоянными настройками экспозиции (200 мс) для всех образцов; Еженедельная калибровка систем визуализации проводилась с использованием стандартных флуоресцентных шариков (отношение сигнал/шум > 20:1).
   7. Количественно оценивайте интенсивность флуоресценции в TPH2-положительных клетках только с помощью программного обеспечения ImageJ со стандартизированными протоколами анализа (порог: 50-255, размер частиц: 10-∞ пикселей²). Установление границ ROI на основе иммунореактивности TPH2 для обеспечения измерения окислительного стресса в серотонинергических нейронах при одновременном исключении сигнала от соседних микроглий, астроцитов или других типов клеток. Для каждого животного проанализируйте минимум 50 TPH2-положительных нейронов на нескольких срезах ткани.
2. Иммуногистохимия
   1. Зафиксируйте срезы тканей в 4% параформальдегиде в PBS в течение 24 ч при 4 °C с легким перемешиванием.
   2. Обезвоживайте с помощью сортированного этанола (70%, 80%, 90%, 95%, 100% × 2, 1 ч каждый) и засыпайте в парафин с помощью автоматизированного процессора.
   3. Вырежьте секции 5 мкм с помощью микротома и закрепите на предметных стеклах с заряженным стеклом, обеспечив 3-4 секции на предметное стекло.
   4. Депарафинизируйте секции с помощью ксилола (2 × 10 минут) и регидратируйте через градуированный этанол в воду.
   5. Выполните забор антигена с помощью цитратного буфера (10 мМ цитрата натрия, pH 6,0) в микроволновой печи (750 Вт в течение 10 мин с интервалом охлаждения 2 мин).
   6. Подтвердите специфичность антител с использованием соответствующего отрицательного контроля (без первичного антитела) и положительных контрольных тканей (участки мозга, которые, как известно, экспрессируют белки-мишени).
   7. Блокировать активность эндогенной пероксидазы 3% перекисью водорода в метаноле в течение 10 мин при РТ.
   8. Внесите первичные антитела на ночь при температуре 4 °C во увлажненной камере.
   9. Детектирование с помощью HRP-конъюгированных вторичных антител (разведение 1:500, 1 ч при ЛТ) и DAB-хромогена (инкубировать до появления коричневого цвета, обычно 2-5 мин).
   10. Контрокрашивание гематоксилином (30 с), обезвоживание, очистка и монтаж с постоянной монтажной средой.
   11. Количественное определение положительных клеток с помощью стереологических методов с систематической случайной выборкой (каждый 5-й срез, 3 подсчета кадров на срез, 40× увеличение).

7. Статистический анализ и проверка данных

1. Статистическое проектирование и анализ
   1. Выполните анализ мощности для определения размеров выборки, достаточных для обнаружения биологически значимых различий (размер эффекта ≥ 0,8, мощность ≥ 0,80, α = 0,05) с помощью программного обеспечения G*Power 3.1.9.7.
   2. Проверьте нормальность данных с помощью теста Шапиро-Уилка и оцените однородность дисперсии с помощью теста Левена перед параметрическим анализом.
   3. Анализируйте данные с помощью статистического программного обеспечения с соответствующими статистическими тестами, основанными на планировании эксперимента и распределении данных.
   4. Применяйте односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) для однофакторных сравнений и двухфакторный ANOVA для факторных дизайнов (например, обработки × временных взаимодействий).
   5. Используйте апостериорный тест Тьюки для множественных сравнений, когда ANOVA показывает значимость (p < 0,05), применяя поправку Бонферрони, когда это уместно.
   6. Установите порог статистической значимости на уровне p < 0,05 для всех анализов с дополнительными обозначениями для p < 0,01 и p < 0,001.
   7. Сообщите о размерах эффекта (d Коэна или η²) и 95% доверительных интервалах вместе с p-значениями, чтобы обеспечить всестороннюю статистическую интерпретацию.
   8. Представьте данные в виде среднего значения ± SEM как минимум из трех независимых экспериментов, при этом отдельные точки данных отображаются при n ≤ 10.
      Примечание: Все эксперименты на клеточных культурах должны повторяться независимо друг от друга не менее трех раз, причем каждый эксперимент включает соответствующий контроль и множественные технические повторы, а наблюдаемая вариабельность (например, CV <15% для поведенческих данных) была сведена к минимуму за счет ослепления и стандартизированного времени.

Протокол успешно демонстрирует, что экспрессия Mettl3 снижается в микроглиальных клетках, обработанных ЛПС (рис. 1), о чем свидетельствует снижение уровня мРНК и белка по сравнению с контрольными группами (рис. 1B, C). Анализ методом ИФА подтверждает успешную ЛПС-опосредованную активацию воспаления за счет повышенных уровней IL-6 и TNF-α в супернатантах культуры (рис. 1A).

Анализ MeRIP-qPCR показывает, что сверхэкспрессия Mettl3 усиливает метилирование мРНК Nrf2 m6A, что парадоксальным образом увеличивает стабильность и экспрессию белка, а не способствует его деградации, что согласуется с новыми данными о том, что модификации m6A могут повысить эффективность трансляции в определенных клеточных контекстах (рис. 2A, B). Эксперименты по ядерно-цитоплазматическому фракционированию показывают, что в то время как распределение мРНК Nrf2 остается неизменным в клеточных компартментах, уровни белка в значительной степени модулируются статусом экспрессии Mettl3 (рис. 2C, D).

Эксперименты in vivo с использованием MPTP-индуцированных моделей БП показывают, что поведенческий дефицит коррелирует с молекулярными изменениями по оси Mettl3/Nrf2. Все образцы тканей были получены из полосатой области (координаты: от +0,5 до -0,5 мм от брегмы, ±от 1,5 до ±2,5 мм латерально, от -2,5 до -3,5 мм вентрально). Мыши в модельной группе демонстрировали снижение точности размещения передних конечностей, снижение производительности ротарода и снижение активности в открытом поле по сравнению с фиктивной контрольной группой (рис. 3A). Нокдаун Nrf2 усугубляет эти дефициты, в то время как сверхэкспрессия Nrf2 обеспечивает частичную защиту. Иммуногистохимический анализ выявляет снижение популяций микроглии (Iba1-положительных клеток) в полосатых областях моделей БП, при этом модуляция Nrf2 соответственно влияет на выживаемость микроглии (рис. 3B).

Уровни провоспалительных цитокинов (IL-1β, IL-18, TNF-α) значительно увеличиваются в моделях заболевания, как и ожидалось, при этом в модельной группе наблюдаются повышенные уровни по сравнению с контрольной группой Sham, а сверхэкспрессия Nrf2 обеспечивает противовоспалительные эффекты (рис. 3C). Молекулярный анализ демонстрирует повышенный уровень маркеров пироптоза, включая GSDMD-N, расщепленную каспазу-1 и NLRP3 у животных, получавших MPTP, при этом скорректированные результаты вестерн-блоттинга показывают надлежащие маркеры молекулярной массы (рис. 3D). Сканирующая электронная микроскопия подтверждает повышенное образование пироптотических тел у больных животных, при этом модуляция Nrf2 влияет на степень гибели пироптотических клеток (рис. 3E).

Окрашивание DHE в сочетании с иммунофлуоресценцией TPH2 выявляет повышенные уровни АФК, в частности, в серотониновых нейронах моделей БП (рис. 4A). Ко-локализация продуктов окисления DHE в телах TPH2-положительных клеток указывает на эндогенную генерацию супероксида в этих нейронах, что согласуется с вызванной воспалительными цитокинами митохондриальной дисфункцией и нарушением антиоксидантной защиты. Пространственное распределение сигнала DHE соответствует морфологии нейронов, а не диффузному окислению тканей, поддерживая окислительный стресс, специфичный для клеточного типа. Иммуногистохимический анализ показывает снижение экспрессии маркеров серотониновых нейронов TPH2 и SLC6A4 в группах Model и Model+Nrf2-KD, при этом защитные эффекты наблюдаются в группе Model+oe-Nrf2 (рис. 4B). Эти результаты указывают на то, что микроглиальный пироптоз приводит к окислительному стрессу и последующему повреждению серотониновых нейронов.

Общий механистический путь обобщен на рисунке 5, который иллюстрирует, как Mettl3-опосредованная m6A модификация Nrf2 подавляет микроглиальный пироптоз и защищает серотониновые нейроны.

Успешные эксперименты обычно показывают четкую зависимость «доза-ответ» между уровнями экспрессии Mettl3/Nrf2 и нисходящими маркерами воспаления. Неоптимальные результаты могут быть получены из-за неполной вирусной трансдукции, недостаточной активации ЛПС или технических проблем во время обработки тканей. Контрольные эксперименты неизменно демонстрируют надлежащую специфичность антител и отсутствие неспецифического связывания в иммуногистохимических анализах. Эффективность вирусной инфекции в стриатуме была подтверждена за счет колокализации с маркерами Iba1 и NeuN, что подтвердило преобладающее микроглиальное нацеливание.

Рисунок 1: Недостаточная экспрессия Mettl3 в ЛПС-индуцированных микроглиальных клетках. (A) Измерение уровней IL-6 и TNF-α методом ИФА в микроглиальных клетках, обработанных ЛПС. (B) Измерение уровня мРНК Mettl3 в микроглиальных клетках, обработанных ЛПС, ОТ-кПЦР. (C) Вестерн-блоттинг для измерения уровней белка Mettl3 в микроглиальных клетках, обработанных ЛПС, показывает Mettl3 на уровне 64 кДа и GAPDH на уровне 36 кДа. **Данные представляют собой среднее значение ± SEM, n = 6 на группу. *p < 0,05, p < 0,01 против контрольной группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Mettl3 влияет на трансляцию Nrf2 через модификацию m6A в ЛПС-индуцированных микроглиальных клетках. (A) Измерение уровней мРНК Nrf2 методом ОТ-кПЦР в группах oe-NC и oe-Mettl3. (B) Измерение MeRIP-qPCR уровней метилирования Nrf2 в группах oe-NC и oe-Mettl3. (C) Измерение уровней мРНК Nrf2 в ядре и цитоплазме экспериментальных групп методом ОТ-кПЦР. (D) Вестерн-блоттинг уровней белка Nrf2 в экспериментальных группах, показывающий Nrf2 на уровне 110 кДа и GAPDH на уровне 36 кДа. **Данные представляют собой среднее значение ± SEM, n = 6 на группу. *p < 0,05, p < 0,01 против контрольной группы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Демонстрация in vivo того, как ось Mettl3/Nrf2 запускает микроглиальный пироптоз через инфламмасому NLRP3. (A) Поведенческие оценки, включая размещение передних конечностей, ротарод и открытые полевые тесты. (B) Иммуногистохимическое обнаружение экспрессии белка Iba в тканях головного мозга (масштабная линейка = 50 мкм). (C) Обнаружение воспалительных цитокинов в ткани головного мозга методом иммуноферментного анализа с ожидаемым повышением в модельных группах со снижением гиперэкспрессии Nrf2. (D) Вестерн-блоттинг маркеров пироптоза с аннотациями молекулярной массы: NLRP3 при 110 кДа, clud-Casspase-1 при 22 кДа, GSDMD-N при 31 кДа и GAPDH при 36 кДа. (E) Обнаружение пироптотических тел с помощью сканирующей электронной микроскопии (обозначено белыми стрелками, показывающими характерные мембранные везикулы размером 1-5 мкм). Количественная оценка на основе 5 полей на секцию, n = 6 животных на группу. **Данные представляют собой среднее значение ± SEM, n = 6 на группу. *p < 0,05, p < 0,01 против группы Sham. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Микроглиальный пироптоз вызывает повреждение митохондрий и способствует апоптозу 5-HT нейронов. (A) Окрашивание DHE в сочетании с иммунофлюоресценцией TPH2 для обнаружения АФК в нейронах 5-HT (масштабная линейка = 50 мкм). Подход к колокализации позволяет отличать окислительный стресс в телах TPH2-положительных нейрональных клеток от окружающих глиальных клеток. (B) Иммуногистохимическое обнаружение экспрессии белков TPH2 и SLC6A4 в нейронах 5-HT (масштабная линейка = 50 мкм). **Данные представляют собой среднее значение ± SEM, n = 6 на группу. *p < 0,05, p < 0,01 против группы Sham. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Схематическое изображение Mettl3-опосредованного подавления прогрессирования болезни Паркинсона через m6A-модификацию Nrf2 и ингибирование гибели 5-HT нейронов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов или конфликтов интересов, связанных с этой работой. Ни один автор не имеет никаких финансовых отношений с компаниями, продукция которых упоминается в этой статье.