Методическая статья

Мультиорганная коллекция из мышиных моделей для исследований старения

DOI:

10.3791/69128

⸱

12 декабря 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Biophysics, University of California, San Francisco

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предоставляет стандартизированный метод сбора органов у молодых и пожилых мышей с целью оценки возрастных анатомических и гистологических изменений в различных тканях, поддерживая как этичное, так и экономически эффективное проектирование экспериментов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Старение — это системный и многофакторный биологический процесс, который постепенно затрагивает почти все органы и ткани, приводя к структурным, клеточным и молекулярным изменениям. Этот протокол определяет стандартизированный и воспроизводимый подход к оценке возрастных анатомических и морфологических изменений у мышей посредством комплексного сбора органов для последующих гистологических и молекулярных анализов. Используя молодых мышей (2-3 месяца) и пожилых мышей (20-24 месяца), мы подробно описываем пошаговые процедуры по анатомической диссекции и систематическому извлечению основных органов для последующей секции, гистологического окрашивания и микроскопической оценки. Протокол позволяет собирать широкий спектр органов и тканей (включая мозг, глаза, пищевод, тимус, сердце, аорту, лёгкие, лимфатические узлы, печень, поджелудочную, желудок, тонкую кишку, кишечник, селезёнку, почки, мочевой пузырь, кожу, скелетные мышцы, кости и жировую ткань) одного животного. Максимизируя объём данных на каждого участника, этот рабочий процесс поддерживает этичное использование животных за счёт сокращения, повышает воспроизводимость между исследованиями и способствует интегративному анализу старения организмов.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Старение — это системный процесс, затрагивающий почти все органы, однако большинство экспериментальных исследований сосредоточены на одной ткани, что ограничивает представления о том, как возрастные изменения происходят совместно или взаимодействуют по всему телу. Старение проявляется как в тканевых и системных изменениях, включая иммунную дисфункцию, метаболические сдвиги, потерю регенеративной способности и структурнуюдегенерацию 1,2. Хотя органоспецифические исследования дали ценные сведения, необходим более широкий взгляд, чтобы понять, как старение клеток в разных системах способствует снижению численности всего организма. Многоорганный анализ в доклинических in vivo моделях, таких как мыши, необходим для выявления координированных структурных, клеточных и молекулярных изменений, способствующих возрастным заболеваниям и потере физиологическойустойчивости 3,4.

Лабораторная мышь остаётся важной и хорошо зарекомендовавшейся доклинической моделью для исследований старения благодаря своей генетической управляемости, короткой продолжительности жизни, консервативным путям старения и способности повторять ключевые признаки человеческого старения, включая иммунную дисфункцию, тканевой фиброз, метаболический спад и повышеннуюнеоплазию 5,6,7. Однако эффективные и стандартизированные протоколы рассечения нескольких органов используются нешироко. Такие протоколы необходимы для оптимизации гистологических сравнений, сокращения использования животных и интеграции омикс-наборов данных между тканями одного и того жесубъекта 8,9.

Здесь мы представляем воспроизводимый, эффективный по времени протокол для перфузии, диссекции и сохранения нескольких органов у мышей. Этот протокол предоставляет пошаговое руководство по анатомическому вскрытию и сбору основных органов у молодых мышей (2-3 месяца) и 20-24 месяца, включая мозг, глаза, тимус, сердце, лёгкие, аорту, паховые лимфатические узлы, желудочно-кишечный тракт (пищевод, желудок, тонкий кишечник, кишечник), печень, поджелудочную железу, селезёнку, почки, мочевой пузырь, жировую ткань, скелетные мышцы, кости и кожу. Включены подробные инструкции по сохранению тканей, совместимые с гистологическими, молекулярными и криосекционными процессами. Такой стандартизированный подход позволяет исследователям оценивать органоспецифические и системные признаки старения внутри одних и тех же экспериментальных испытуемых, поддерживая интегрированные высококачественные исследованиястарения 4,10,11,12.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мыши C57BL/6J содержались в Калифорнийском университете в Сан-Франциско. Все процедуры на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) и контролировались Центром ресурсов лабораторных животных. Мышей содержали в 12-часовом цикле светло-тёмно, при этом в клетке было менее пяти взрослых мышей. Эвтаназия проводилась в соответствии с Руководящими принципами Американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA) по эвтаназии животных13. Для этого протокола молодых мышей жертвовали в 3 месяца, а мышей — в 22 месяца. Перед тем как приступить к рассечению и сбору органов, распечатайте и заполните чек-лист подготовки (Таблица 1) и контрольный список по сбору тканей (Таблица 2). Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Шейный вывих

ПРИМЕЧАНИЕ: Шейный вывих должен выполняться обученным специалистом для минимизации чрезмерной травмы шейных структур.

  1. Удержите мышь, крепко схватив основание хвоста одной рукой.
  2. Положите большой и указательный пальцы противоположной руки у основания черепа.
  3. Примените сильное и быстрое давление, чтобы вывихнуть шейный позвонк. Прощупайте шею, чтобы подтвердить разделение между черепом и соседними позвонками.
  4. Подтвердить успешную эвтаназию (согласно утверждённым институциональными протоколами), обеспечив остановку дыхания и отсутствие реакций на вредные стимулы перед началом процедуры.
  5. Запишите вес тела мыши перед перфузией и сбором тканей.

2. Торакотомия и перфузия

ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия необязательна. Выполняйте все процедуры, связанные с параформальдегидом (PFA) в сертифицированном капюшоне для химических выпаров, при этом надевая соответствующие средства индивидуальной защиты (PPE), включая лабораторный халат, нитриловые перчатки и защитные очки. Утилизировать растворы PFA в соответствии с институциональными рекомендациями по химической безопасности. Соберите все отходы PFA и загрязнённые материалы (например, перчатки, салфетки, контейнеры) в чётко маркированный контейнер и утилизируйте их через офис по охране окружающей среды и безопасности учреждения, соблюдая протоколы, соответствующие местным, штатным и федеральным нормам.

ВНИМАНИЕ: Если вы используете параформальдегид (PFA) для фиксации, выполните все этапы под вытяжкой, чтобы избежать воздействия паров формальдегида.

  1. Поставьте крышку из пенопласта, покрытую впитывающим материалом для сбора жидкости из перфузии, в лоток для сбора средств. Положите мышь на эту поверхность вскрытия в положении на спине и закрепите конечности булавками для стабилизации тела: передние конечности расположены боково, чтобы открыть грудную полость, а задние — хвостово, создавая мягкое напряжение через брюшную стенку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Такое позиционирование улучшает видимость, минимизирует обструкцию и максимизирует рабочее пространство для сбора органов.
  2. Нанесите 70% этанола в область груди.
  3. Используйте острые ножницы, чтобы сделать поперечный разрез на уровне диафрагмы, за которым следует два V-образных разреза, чтобы открыть грудную клетку (рисунок 1A).
  4. С помощью тупых щипцов аккуратно поднимите кожу и аккуратно разрежьте оставшиеся крепления, чтобы полностью обнажать грудную область.
  5. Сделайте два V-образных разреза длиной примерно 2 см по обеим сторонам грудной клетки, чтобы открыть грудную полость.
  6. Подтяните грудину вверх и прикрепите её через плечо мыши рядом с головой.
  7. С помощью тупых щипцов аккуратно обнажайте сердце. Удалите застрявшие пузырьки воздуха с линии перфузии, затем введите иголку или канюлю в кончик левого желудочка на глубину примерно 3-4 мм. Сделайте разрез длиной примерно 5 мм в правом предсердии, чтобы обеспечить выход перфусата (рисунок 1B).
  8. Начните перфузию с физиологическим раствором без кальция и магния (например, PBS, физиологический раствор или HBSS) для очистки кровеносной системы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия может выполняться с помощью шприца объёмом 20 мл, насоса или системы питания под действием гравитации. В среднем на мышь требуется 15-20 мл раствора перфузии для полного очищения крови из сосудистых органов. Хорошая перфузия характеризуется быстрым очищением (бланшированием) печени и лёгких, а также бледным видом области рта и языка. Полная перфузия приведёт к чистому, безкровенному оттоку из сердца.
  9. При желании инициируйте перфузию PFA, переключив перфузионную линию с физиологического раствора без кальция и магния (используемого для предварительного промыва и удаления крови) на шприц объемом 50 мл с 4% параформальдегида (PFA), при этом сохраняя иглу на месте. Будьте осторожны, чтобы не попадать в трубу пузырьки. Продолжайте перфузию с 4% PFA, пока желаемая степень фиксации не будет оценена по постепенному ужесточению тела. Примерно 30 мл фиксатива достаточно для одной мыши.

3. Сбор органов и тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность сбора органов имеет решающее значение при сравнении молодых и пожилых мышей. Органы у пожилых животных обычно хрупкие и подвержены аутолизу или механическим повреждениям, поэтому необходимо быстрое и стабильное обращение с тканями. Стандартизация порядка сбора минимизирует вариабельность после смерти, уменьшает обращение с артефактами и обеспечивает равномерное качество фиксации у животных14,15. Согласованность жизненно важна для выявления тонких возрастных морфологических изменений, поскольку задержка или несогласованность выборки может привести к смещению. Если перфузия PFA не проводилась, органы должны быть извлечены быстро. Поджелудочная железа, желудок, лёгкие и мозг особенно подвержены быстрому аутолизу и гистологическому разрушению, если не обрабатывать их сразу. Поскольку у пожилых мышей часто развиваются неопластические поражения, внимательно осматривайте селезёнку, печень, лимфатические узлы, лёгкие и тимус на предмет асимметрии, увеличения, узлов или изменения цвета. Зафиксируйте эти результаты как часть общей нагрузки на болезнь (см. таблицу 2).

  1. Начните с того, что животное находится в положении на спине после перфузии или шейного вивиха, чтобы собрать основные органы грудной и брюшной полости (рисунок 1C).
  2. Аккуратно наносите 70% этанола с помощью марли или пульверизатора после закрепления — это минимизирует загрязнение шерсти и поддерживает увлажнение тканей в чувствительных областях. Этот метод доказал свою эффективность в наших руках для уменьшения количества шерстящих остатков и улучшения видимости во время вскрытия, при этом избегая недостатков полного погружения.
  3. С помощью ножниц и щипцов с тупым концом аккуратно откройте брюшную полость, сделав средний разрез от диафрагмы к тазу, затем два боковых разреза, как показано красными линиями на рисунке 1A. Поднимите кожу и брюшную стенку, чтобы полностью обнажить внутренние органы.
  4. Желудок, тонкий кишечник и кишечник: отсоедините желудок в пищеводном соединении, оставляя пилорический конец непрерывным с тонкой кишкой. Аккуратно освободите желудочно-кишечный тракт, перерезав поддерживающие связки, затем удалите тракт, включая тонкую кишку и кишечник. Разрез дистально в области прямой кишки.
    1. Чтобы очистить содержимое света, перерезайте тонкий кишечник проксимально в области дуоденоэюнального изгиба и дистально в илеоцекальном соединении. Для толстой кишки разрежьте проксикуль у слепой кишки. Промите тонкую кишку и кишку примерно 20 мл физиологического раствора с помощью шприца с иглой для кормления, аккуратно закрепляя ткань тонким щипцом, чтобы избежать повреждений.
  5. Пищевод: Изолировать пищевод от шейного до желудочного соединения.
  6. Селезёнка и поджелудочная железа: Изолируйте селезёнку и поджелудочную железу от окружающих тканей с помощью тонкого вскрытия, минимизируя механические повреждения. Аккуратно отсоедините поджелудочную железу от селезёнки. Немедленно расчлените и обрежьте поджелудочную железу на мелкие кусочки (≤5 мм) и погрузите их в фиксационное вещество в течение 5 минут после эвтаназии, чтобы минимизировать аутолиз и сохранить оптимальную морфологию тканей. Осмотрите селезёнку, отмечая размер, цвет, форму и наличие видимых аномалий.
  7. Печень: С помощью тонких щипцов захватите центральную соединительную ткань между долями печени и аккуратно подтяните вверх, чтобы создать натяжение. С помощью ножниц для вскрытия аккуратно разрежьте все прикрепления между печенью и соседними органами. Осмотрите печень на цвет, консистенцию и наличие узлов или других аномалий.
  8. Висцеральный жир: Собирайте образцы висцеральных жировых депо.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Молодые животные обычно имеют минимальное количество висцерального жира, тогда как пожилые животные часто демонстрируют повышенное накопление жира, особенно вокруг кишечника, почек и гонадных областей.
  9. Почки и мочевой пузырь: удалите обе почки вместе с прикреплёнными мочеточниками и мочевым пузырём. Аккуратно отдельте почки от окружающей жировой ткани и соединительных структур с помощью тонких ножниц или тупых щипцов. Следуйте за мочеточниками дистально к мочевому пузыру, вырезая оставшиеся прикрепления, чтобы изолировать весь мочевыводящий путь. Осмотрите почки и мочевой пузырь на предмет размера, цвета и аномалий перед дальнейшей обработкой.
  10. Лимфатические узлы: Отведите кожу от брюшины, чтобы обнажить паховую область. Определите лимфатические узлы внутри жировой подушки молочной железы вдоль лимфатических сосудов. Изолируйте и удаляйте узлы тонким щипцем, минимизируя повреждение окружающей жировой и соединительной ткани.
  11. Сердце: Аккуратно удалите сердце, перерезав основные сосуды.
  12. Тимус: аккуратно вырезать тимус, чтобы сохранить его структуру. Имейте в виду, что тимус подвергается инволюции с возрастом, и у пожилых мышей может присутствовать лишь минимальная или вовсе отсутствующая тимуса.
  13. Лёгкие: С помощью острых ножниц и тонких щипцов аккуратно удалите лёгкие вместе с прикреплённой трахеей целым и целым.
  14. Аорта: Вставьте закрытые щипцы между аортой и позвоночником и аккуратно сдвиньте аорту, разделяя её вдоль дорсальной стороны. Будьте осторожны, чтобы не порвать сосуд. С помощью тонких щипцов аккуратно удаляйте окружающую жировую и соединительную ткань из аорты под диссекцияционным микроскопом.
  15. Скелетная мышца: Резецировать кожу над задними конечностями, чтобы обнажить бедренную кость и окружающую мышцу. С помощью тонких ножниц аккуратно изолируйте мышцы, прикреплённые к бедренной кости, отсоединяя их от окружающей соединительной ткани и перерезая в местах прикрепления сухожилий, чтобы сохранить целостность волокон.
  16. Кость (большеберцовая кость): с помощью ножниц для вскрытия резекции поверхностной кожи и мышцы, чтобы обнажить большеберцовую кость. С помощью ножниц для вскрытия и тупых щипцов аккуратно отделите большеберцовую кость в коленном и голеностопном суставах. Удалять оставшуюся мягкую ткань, не повреждая кость.
  17. Глаза: С помощью больших ножниц для вскрытия обезглавить мышь. Аккуратно удалите глаза, используя щипцы с тонким концем.
  18. Мозг: Резецировать кожу головы, чтобы обнажить переднюю часть черепа. Используя острые ножницы или скальпелем, следите за швами черепа и отнимите костные сегменты, чтобы открыть мозг (рисунок 1D). Отрежьте обонятельные лампы и вентральные насадки. Аккуратно извлеките мозг из полости черепа. Немедленно обрабатывайте ткань для поддержания морфологии.
  19. Кожа: Если для последующих процедур требуется удаление волос, удаляйте волосы с помощью электрического триммера. Защипните часть кожи зазади тупыми щипцами, вырезьте ножницами и соберите ткань для дальнейшей обработки.
  20. После удаления всех интересующих органов поместите всю тушу мыши в контейнер объёмом 450 мл, предварительно наполненный 4% PFA, чтобы сохранить на случай неожиданных находок или ответить на вопросы рецензентов, которые могут потребовать возврата в влажную фиксированную ткань.

4. Сохранение и обработка тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы сохранить целостность тканей, минимизируйте время между вскрытием и сохранением. Задержки могут ухудшать морфологию тканей и качество молекул; дополнительные сведения о критическом времени сбора и сохранения тканей приведены в таблице 2.

ВНИМАНИЕ: Если вы используете параформальдегид (PFA) для фиксации, выполните все этапы внутри вытяжки, чтобы избежать воздействия паров формальдегида.

  1. Обрабатывайте ткани сразу после вскрытия, выбирая соответствующий протокол (шаги 4.1, 4.2 или 4.3) в соответствии с предполагаемым следующим применением.
    1. Фиксация параформальдегидом (PFA): поместить ткани, предназначенные для гистологического анализа, в 4% PFA при 4 °C в течение 12-24 часов. После фиксации тщательно промыйте салфетки с помощью фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS), чтобы удалить остаточный фиксатор, затем переведите их на 70% этанол для хранения до момента внедрения парафина и секционирования.
  2. Вложение соединения при оптимальной температуре резки (OCT): встраивайте свежие ткани в состав ОКТ. Поместите ткани в встраивающие формы, заполненные ОКТ-соединением, устраняя воздушные пузырьки, инкубировать 5 минут при комнатной температуре, затем заморозить в паровой фазе жидкого азота. Герметизируйте алюминиевой фольгой и храните блоки OCT при −80 °C до секционирования.
  3. Мгновенное замораживание в фазе жидкого азота: Ткани быстрого заморажения, предназначенные для анализа РНК, белков или метаболитов в паровой фазе жидкого азота, чтобы минимизировать образование кристаллов льда. Поместите ткани в маркированные криотрубки и подвесьте их над жидким азотом для быстрого заморажения. После полного заморозки перемещайте образцы в хранилище −80 °C.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время вскрытия у пожилых мышей часто проявляются неопластические поражения и требуется тщательное исследование для подтверждения патологическихнаходок 13, 14, 16, 17, 18. На рисунке 2A показан 22-месячный самец мыши C57BL/6 в положении на спине после перфузии. Полное бланширование лёгких подтверждает эффективную перфузию, тогда как печень демонстрирует лишь частичное бланширование. Более тщательный осмотр печени выявил множество злокачественных узлов (рисунок 2B), сопровождаемые увеличенными семенной пузырьками (рисунок 2A) и спленомегалией (рисунок 2C). Эти результаты часто встречаются у пожилых мышей и должны быть зафиксированы как часть общего бремениболезни 18.

На рисунке 3 показаны макроскопически нормальные органы, собранные после вскрытия и перфузии, что позволяет оценить анатомическую целостность и эффективность перфузии. Желудочно-кишечный тракт был промыт физиологическим раствором для удаления переваренного содержимого, что привело к чистому, полупрозрачному виду желудка, толстой кишки и тонкого кишечника (рисунок 3A). Дополнительные структуры, включая пищевод, поджелудочную железу, селезёнку, висцеральные жировые депо, почки с мочевым пузырём, лимфатические узлы, сердце и тимус, были хорошо идентифицируемы и могли быть выделены целыми для дальнейших анализов (рисунок 3B, C, E-I).

Качество перфузии оценивалось путём изучения бланширования в сильно васкуляризированных тканях. Как показано на рисунках 3D и3J, печень и лёгкие демонстрировали явные различия между состояниями без перфузии, хорошо перфузионированными и частично перфузионными. Полное бланширование подтвердило успешную перфузию, тогда как неполное бланширование указывало на техническую изменчивость или скрытые аномалии. Другие ткани, включая аорту, скелетную мышцу, большеберцовую мышцу, мозг, глаз и кожу, были выделены с сохраненной морфологией, подходящими для дальнейших гистологических, молекулярных или визуализационных приложений (рисунок 3K-P). Эта стандартизированная процедура вскрытия обеспечивает стабильное восстановление целых, хорошо сохранившихся тканей и органов, а также позволяет провести анатомическую оценку для поддержки различных последующих анализов. Вскрытие и сбор органов занимали примерно 40–60 минут на животное, в зависимости от опыта оператора и наличия патологических находок.

На рисунке 4 показаны примеры изменений, связанных со старением, в собранных органах после вложения, сечения парафина и окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). В срезах кожи у пожилых мышей наблюдалось истончение эпителия и выпадение волосяных фолликулов по сравнению с молодыми контролями (рисунок 4A). Срезы почек выявили увеличение капсул Боумана с фиброзными и некротическими изменениями, а также области, характерные для лимфом (рисунок 4B). В срезах поджелудочной железы наблюдалось увеличение числа апоптотических тел19 и лимфоматозных областей у пожилых животных, что свидетельствует о нарушении целостности тканей с возрастом (рисунок 4C). Срезы селезёнки показывали амилоидные отложения и области лимфомы у пожилых животных, что отражает дополнительные признаки возрастной патологии (рисунок 4D).

Эти результаты выделяет репрезентативные гистопатологические особенности старения в различных тканях, демонстрируя полезность этого протокола для выявления структурных признаков возрастного снижения.

figure-results-1
Рисунок 1: Схематический обзор процедур диссекции мыши и экспозиции органов. (A) Места разрезов для открытия грудной и брюшной полости (красные линии), включая поперечный разрез на уровне диафрагмы, затем V-образные разрезы по обеим сторонам грудной клетки для открытия грудной полости, а также средний разрез от диафрагмы до таза с двусторонними разрезами для полного открытия брюшной полости. (B) Установка перфузии, показывающая введение иглы бабочки в левый желудочек и разрез правого предсердия для эффективного отвода крови. (C) Анатомическое расположение основных грудных и брюшных органов после обнажения полости. (D) Этапы вскрытия головы, включая удаление кожи головы и открытие черепа вдоль черепных швов для обнажения мозга. Красные линии указывают на места разреза. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Идентификация опологических поражений у пожилых мышей. (A) Представительный 22-месячный самец мыши C57BL/6 в положении на спине после перфузии с 4% PFA. Полное бланширование лёгких (розовый наконечник стрелы) подтверждает эффективную перфузию, тогда как печень (зелёный наконечник стрелы) демонстрирует лишь частичное бланширование. Синие наконечники стрел обозначают увеличенные семенные пузырьки. (B) Детальный обзор печени, обнажающий множество злокачественных узлов (чёрных наконечников стрелок). (C) Увеличенная селезёнка у пожилой мыши C57BL/6 (правая сторона) по сравнению с нормальной селезёнкой молодого животного (левая сторона). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Обзор основных органов мышей и их целостности после вскрытия и перфузии. (A) Желудок, тонкий кишечник и толстой кишки до и после промывания физиологическим раствором для удаления переваренного содержимого. (B) Пищевод. (C) Поджелудочная железа с прилегающей селезёнкой. (D) Печень без перфузии, с полным бланшированием после эффективной перфузии и частичным бланшированием, указывающим на неполную перфузию или патологию. (E) Висцеральная жировая ткань. (F) Почки с прикреплённым мочевым пузырём. (G) Паховые лимфатические узлы. (H) Сердце. (I) Тимус. (J) Легкие без перфузии, с полным бланшированием после эффективной перфузии и с частичным бланшированием. (К) Аорта. (L) Скелетная мышца, изолированная от задней конечности. (M) Большеберцовая кость с сохранившейся костной структурой. (N) Мозг. (О) Глаз. (P) Кожа. Масштабные планки: 5 мм в A, C, D, E, F, J, L, N, P; 1 мм во всех остальных панелях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Гистологический анализ основных органов с использованием окрашивания гематоксилином и эозином (H&E). (A) Срезы кожи у 3-месячных (молодых) и 22-месячных (пожилых) мышей. Срезы пожилых животных показывают истончение эпителия и выпадение волосяных фолликулов. (B) Почечные срезы, подчеркивающие капсулы Боумана. Срезы пожилых животных показывают увеличение капсулы, фиброзные и некротические изменения, а также лимфомы (оранжевые наконечники стрел). (C) Срезы поджелудочной железы у молодых и пожилых животных, при этом у пожилых животных наблюдаются увеличенные апоптотические тела (синие наконечники стрел) и области лимфомы (оранжевые наконечники стрел). (D) Срезы селезёнки у 3-месячных (молодых) и 22-месячных (пожилых) мышей. Срезы пожилых животных показывают амилоидные отложения (известковато-зелёные наконечники стрел) и области лимфомы. Шкала (A-C) 100 мкм. Шкала (D) 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Чек-лист подготовки. Пошаговый список необходимых препаратов для диссекция и консервации мышиной ткани, включая маркировку трубок и формы, подготовку буфера и фиксации, установку для крио-вложения, стерилизацию инструментов для вскрытия, организацию рабочих мест и планирование документации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Контрольный список для сбора тканей. Используйте таблицу для фиксации собранных тканей. Добавьте время сбора и заметки о состоянии или аномалиях. Отдайте приоритет тканям, критически важным для вашего исследования; Соберите наиболее подходящие органы в рекомендованный срок, чтобы избежать аутолиза/деградации тканей.*Обратите внимание на любые аномалии (включая изменение цвета органов, узлы, злокачественный рост, аномальный размер органа). **Рассмотрите возможность документирования метода сохранения (включая фиксацию PFA, OCT embedding или snap freeze). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол обеспечивает воспроизводимую стратегию систематического сбора множественных органов у молодых и пожилых мышей, позволяя проводить анатомические, гистологические и молекулярные анализы. Ряд технических факторов может повлиять на качество результатов и решить ограничения описанного метода. Во-первых, вариабельность качества перфузии — важный фактор, который стоит учитывать. Неполная перфузия может оставить остаточную кровь, что нарушает гистологию, иммуногистохимию и молекулярные анализы. Перфузия после вывиха шейки матки может вызвать травму шейных тканей и привести к заражению лёгких кровью. Поэтому вывих шейки матки должен выполняться только обученным персоналом. Для достижения оптимального результата перфузия должна проводиться под терминальной анестезией, как описано в другихстатьях 20,21 в соответствии с рекомендациями IACUC иAVMA 13. Во-вторых, фиксация является ключевым фактором целостности ткани. Хотя 4% параформальдегид (PFA) широко применяется, он может недостаточно проникать в крупные или плотные органы, что приводит к плохому гистологическому и антигенному сохранению. Это ограничение можно уменьшить, используя 10% нейтральный буферный формалин (NBF) или разрезание тканей на срезы ≤5 мм для улучшенияпроникновения 22. В-третьих, некоторые ткани, особенно поджелудочная, желудок и мозг, проходят быстрый аутолиз, требующий фиксации или замораживания в течение 5-10 минут после эвтаназии и использования инструментов предварительно охлаждённоговскрытия 23. У пожилых мышей неоплазия может дополнительно искажать анатомию и усложнять вскрытие. Дополнительные артефакты могут возникать из-за недостатка фиксационного объёма или замерзания, что приводит к усадке и эффектам краёв; их можно минимизировать, поддерживая соотношение фиксатив к тканям не менее 10:1, избегая переполнения и предварительно охлаждая формы ОКТ перед встраиванием. Наконец, использование PFA и формалина вызывает вопросы безопасности и утилизации; Фиксативные средства на основе глиоксала предлагают менее токсичные альтернативы. Стандартизированное обращение, оптимизированная фиксация и тщательное время необходимы для максимизации воспроизводимости, качества тканей и надёжности анализов на последующихэтапах 24.

Извлекая ткани из более чем 15 органов одного животного, этот процесс максимизирует биологический урожай на каждого участника и соответствует этическим требованиям по снижению использования животных. Систематический процесс можно легко масштабировать до среднепроизводительных исследований, изучающих возрастное физиологическое снижение и органоспецифическиепатологии 25.

Оперативная обработка тканей, подверженных аутолизу, необходима для сохранения гистологической целостности. Использование физиологических растворов без кальция и магния, а затем 4% PFA, надёжно сохраняет структуру органов и минимизирует аутолиз чувствительных тканей, таких как поджелудочная железа и пищеварительная система. В отличие от протоколов, ориентированных на отдельные органы или модели заболеваний, этот подход позволяет быстро и стабильно собирать несколько органов, снижая вариабельность и повышая пропускную способность. Вся диссекция — от перфузии до окончательного удаления ткани — может быть завершена за 60 минут на животное, что делает его подходящим для крупномасштабных или чувствительных по времениисследований 3,11,26. Соблюдение точной последовательности перфузии-фиксации минимизирует артефакты и позволяет получать воспроизводимые результаты.

Согласованность в сборе, обрезании и вложении тканей крайне важна для точной гистопатологической оценки, особенно в лонгитюдных или многоцентровых исследованиях. Вариабельность в обращении с тканями может привести к появлению артефактов, неясным патологическим находкам или неправильному толкованию бремени болезни. Пересмотренные руководства по отбору и обрезанию органов у крыс и мышей, такие как руководства по подрезке RENI, содержат подробные, стандартизированные протоколы для минимизации такихнесоответствий 22. Внедрение этих гармонизированных методов улучшает сопоставимость данных между исследованиями и учреждениями, усиливает воспроизводимость и повышает целостность патологических результатов в исследованияхстарения 4,9.

Сбор множества органов особенно важен в исследованиях старения, где понимание взаимодействия органов крайне важно для выявления процессов, вызывающих физиологический упадок всего тела с возрастом. Хотя этот подход может быть полезен и для различных других исследовательских вопросов, основное внимание протокола направлено на поддержку исследований старения, где возрастные изменения могут одновременно затрагивать несколько органов. Однако его также можно применять к исследованиям, посвящённым фиброзу, регенерации и старению, особенно к тем, которые интегрируют транскриптомику или открытие мультитканевыхбиомаркеров 9,27,28.

Гистологические оценки выявили характерные возрастные изменения в нескольких тканях (рисунок 4). В коже у пожилых животных наблюдалось истончение эпителия и выпадение волосяных фолликулов. В почках срезы пожилых мышей показали увеличение капсулы Боумана вместе с фиброзными, некротическими и лимфоматическими изменениями. Ткань поджелудочной железы у пожилых животных показала накопление апоптотических тел и лимфом, а сечения селезёнки — амилоидные отложения и дополнительные области лимфомы. Эти наблюдения соответствуют установленным фенотипам старения мышей и демонстрируют полезность этого протокола для выявления репрезентативных гистопатологических маркеров старения 1,18,19,27,29,30,31,32,33,34.

В заключение, этот протокол предлагает надёжную и масштабируемую основу для сбора и сохранения тканей в доклинических моделях старения. Её можно применять как в исследовательских, так и в гипотетических исследованиях для выявления тканеспецифических и системных механизмов старения, дегенерации и устойчивости.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Фонда Ларри Л. Хиллблома, грантом AFAR и Гленна для младших преподавателей, премией Фонда младших исследователей Фонда Эдварда Маллинкродта-младшего и премией Программы прорывных биомедицинских исследований (PBBR) для Ханны Мартенс. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Абсорбантная площадка
Мыши в возрасте C57BL/6J и bbsp;Лаборатория Джексона  #000664
Лотки для сбора 
Беспроводной триммерBravMini+ CLP-41590Для удаления волос
Этаноловый спрей 70%Fisher Scientific50-163-3592
Дополнительные щипцы 5 INOXДюмонF6521-1EAОчень тонкие щипцы для лимфатических узлов
ЩипцыMilliporeSigmaXX6200006PТупые концевые щипцы
Щипцы 5 INOXДюмонF6521-1EAЩипцы с тонким кончиком
Сбалансированный сольный раствор Хэнка (HBSS) 1x 500 млGibco14025092
Микрорассекающие ножницы (прямые, острые/резкие, 25 мм)Roboz SurgicalRS-5668Стандартные микроножницы, нержавеющая сталь, лезвие 25 мм (M-37)
Ножницы для микропрепарирования (прямые, острые/острые, тонкие лезвия)Roboz SurgicalRS-5918Тонкие ножницы для препарирования, длина 4,5" (H-327)
NBFSigma HT501128Для фиксации
Обычный физиологический растворЦитива76081-514
Оптимальная температура резки (OCT)Fisher Scientific23730571
Параформальдегид (PFA) 4%Науки об электронной микроскопии15710Для фиксации
Чашки Петри размером 100 мл x 15 млMilliporeSigmaP5856-500EA
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Gibco10010023
КеглиEisco LabsDISPINS1Чтобы обезопасить мышь во время вскрытия
Пластиковый шприц 20 мл, люер-замокFisherBrand302830Для перфузии
Коробка Seal'N Freeze (Крио-контейнер)Ted Pella, Inc.20956
Криотрей Seal'N FreezeTed Pella, Inc.20956-1Для размещения образцов в криоконтейнере
Игла-бабочка Sol-Vet с адаптеромSol-Millenium Medical110301070003для перфузии
Крышка из пенопласта
Tissue-Tek Cyromold (биопсия)Сакура25608-922
Молодые мыши C57BL/6JЛаборатория Джексона  #000664

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lopez-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. Hallmarks of aging: An expanding universe. Cell. 186 (2), 243-278 (2023).
  2. Schafer, M. J., et al. The senescence-associated secretome as an indicator of age and medical risk. JCI Insight. 5 (12), e133668(2020).
  3. Sladitschek-Martens, H. L., et al. Yap/taz activity in stromal cells prevents aging by controlling cGAS-STING. Nature. 607 (7920), 790-798 (2022).
  4. Tabula Muris, C. A single-cell transcriptomic atlas characterizes aging tissues in the mouse. Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).
  5. Farooqi, I. S., Xu, Y. Translational potential of mouse models of human metabolic disease. Cell. 187 (16), 4129-4143 (2024).
  6. Marttala, J., Andrews, J. P., Rosenbloom, J., Uitto, J. Keloids: Animal models and pathologic equivalents to study tissue fibrosis. Matrix Biol. 51, 47-54 (2016).
  7. Yuan, R., Peters, L. L., Paigen, B. Mice as a mammalian model for research on the genetics of aging. ILAR J. 52 (1), 4-15 (2011).
  8. Wang, Q., et al. The mouse multi-organ proteome from infancy to adulthood. Nat Commun. 15 (1), 5752(2024).
  9. Zhuang, J., et al. Comparison of multi-tissue aging between human and mouse. Sci Rep. 9 (1), 6220(2019).
  10. Basisty, N., et al. A proteomic atlas of senescence-associated secretomes for aging biomarker development. PLoS Biol. 18 (1), e3000599(2020).
  11. Wu, C., et al. Spatially resolved transcriptome of the aging mouse brain. Aging Cell. 23 (5), e14109(2024).
  12. Yousefzadeh, M. J., et al. Tissue specificity of senescent cell accumulation during physiologic and accelerated aging of mice. Aging Cell. 19 (3), e13094(2020).
  13. Treuting, P. M., Snyder, J. M. Mouse necropsy. Curr Protoc Mouse Biol. 5 (3), 223-233 (2015).
  14. Antal, C., et al. Tissue collection for systematic phenotyping in the mouse. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 29 (Unit 29A), 24(2007).
  15. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Mouse tissue fixation. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), pdb.prot073403(2014).
  16. Brayton, C., Justice, M., Montgomery, C. A. Evaluating mutant mice: Anatomic pathology. Vet Pathol. 38 (1), 1-19 (2001).
  17. Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Limited mouse necropsy. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), pdb.prot073395(2014).
  18. Pettan-Brewer, C., Treuting, P. M. Practical pathology of aging mice. Pathobiol Aging Age Relat Dis. 1, (2011).
  19. Xiong, Y., et al. Arginase-II promotes tumor necrosis factor-alpha release from pancreatic acinar cells causing beta-cell apoptosis in aging. Diabetes. 66 (6), 1636-1649 (2017).
  20. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. 65, e3564(2012).
  21. Navarro, K. L., et al. Mouse anesthesia: The art and science. ILAR J. 62 (1-2), 238-273 (2021).
  22. Morawietz, G., et al. Revised guides for organ sampling and trimming in rats and mice--part 3. A joint publication of the Rita and NACAD groups. Exp Toxicol Pathol. 55 (6), 433-449 (2004).
  23. Zhao, H., et al. Identifying specific functional roles for senescence across cell types. Cell. 187 (25), 7314-7334 (2024).
  24. Aversa, Z., et al. Biomarkers of cellular senescence in idiopathic pulmonary fibrosis. Respir Res. 24 (1), 101(2023).
  25. Aghali, A., Koloko Ngassie, M. L., Pabelick, C. M., Prakash, Y. S. Cellular senescence in aging lungs and diseases. Cells. 11 (11), 1781(2022).
  26. Travaglini, K. J., et al. A molecular cell atlas of the human lung from single-cell RNA sequencing. Nature. 587 (7835), 619-625 (2020).
  27. Chen, S., et al. Integration of spatial and single-cell data across modalities with weakly linked features. Nat Biotechnol. 42 (7), 1096-1106 (2024).
  28. Wu, J., et al. Transcardiac perfusion of the mouse for brain tissue dissection and fixation. Bio Protoc. 11 (5), e3988(2021).
  29. Hoj, K., et al. Age-related decline in pancreas regeneration is associated with an increased proinflammatory response to injury. Gastro Hep Adv. 3 (7), 973-985 (2024).
  30. Roeder, S. S., et al. Changes in glomerular parietal epithelial cells in mouse kidneys with advanced age. Am J Physiol Renal Physiol. 309 (2), F164-F178 (2015).
  31. Russell-Goldman, E., Murphy, G. F. The pathobiology of skin aging: New insights into an old dilemma. Am J Pathol. 190 (7), 1356-1369 (2020).
  32. Sparks, J., et al. Presence of systemic amyloidosis in mice with partial deficiency in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) in aging. App Sci. 11 (16), 7373(2021).
  33. Sun, P., Juskevicius, R. Histological and immunohistochemical features of the spleen in persistent polyclonal B-cell lymphocytosis closely mimic splenic B-cell lymphoma. Diagn Pathol. 7, 107(2012).
  34. Vannan, A., et al. Spatial transcriptomics identifies molecular niche dysregulation associated with distal lung remodeling in pulmonary fibrosis. Nat Genet. 57 (3), 647-658 (2025).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи