Оптимизированный анализ белков из ооцитов и эмбрионов Xenopus с помощью иммуноблоттинга

Краткое содержание

В данной статье описан протокол анализа белков из ооцитов и эмбрионов Xenopus методом иммуноблоттинга. Описаны этапы сбора, за которыми следуют этапы, соответствующие обработке образца, SDS-PAGE, переносу, окрашиванию антител и визуализации. В протоколе особое внимание уделяется изучению трансляционных регуляторных белковых комплексов с эндогенными антителами и антителами против белковых аффинных меток.

Аннотация

Анализ белков с помощью электрофореза в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида (SDS-PAGE) с последующим иммуноблоттингом (вестерн-блоттингом) является жизненно важной частью инструментария молекулярного биолога. Этот метод разделяет сложную белковую смесь по молекулярной массе, а затем анализирует наличие белков-мишеней с помощью специфических антител. Иммуноблоттинг имеет множество применений. Примеры включают использование в качестве целевого подхода для изучения белок-белковых взаимодействий или в качестве контроля для подтверждения экспрессии или истощения белковых мишеней. Однако успешное проведение иммуноблоттинга требует сложных, многоступенчатых экспериментов. Протоколы должны быть оптимизированы для каждого организма, целевого белка и области применения. Таким образом, существуют пробелы в знаниях об использовании иммуноблоттинга во многих моделях, включая модельную лягушку Xenopus laevis.

Благодаря своим большим размерам, обильному материалу для биохимических экспериментов и легкому обращению, ооциты и эмбрионы X. laevis были жизненно важны для изучения принципов трансляционного контроля. Тем не менее, у этого вида отсутствуют специальные протоколы для надежного и рутинного иммуноблоттинга. Здесь мы предлагаем подробный протокол вестерн-блоттинга, оптимизированный для образцов с нескольких стадий развития Xenopus . Затем мы анализируем трансляционные регуляторы в процессе разработки.

Введение

Понимание клеточных механизмов требует мониторинга конкретных видов белков. Общие вопросы включают в себя то, как они изменяются в экспрессии в пространстве и времени, с какими белками они взаимодействуют и модифицируются ли они в ответ на различные условия. Иммуноблоттинг, в просторечии известный как «вестерн-блоттинг», является ключевой методологией для решения этих проблем. Эксперимент с иммуноблоттингом отделяет белки от сложного образца, например, лизата цельных клеток, и идентифицирует их с помощью антител. В частности, белки денатурируют, а затем разделяют с помощью электрофореза в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида (SDS-PAGE) по размеру. Фракционированные по размеру белки переносят на твердую основу, такую как нитроцеллюлозная мембрана, и представляющий интерес белок идентифицируют с помощью реагентов антител. Иммуноблоттинг стал стандартной частью инструментария молекулярного биолога. Он обычно используется для мониторинга экспрессии белка в различных контекстах или в качестве конечной точки для таких экспериментов, как иммунопреципитационные анализы. Несмотря на эти преимущества, анализ стационарных уровней белка с помощью иммуноблоттинга оказывается сложной задачей, поскольку анализ должен быть оптимизирован для каждого этапа и экспериментального контекста (Рисунок 1).

Одним из сложных контекстов является анализ материала африканской когтистой лягушки Xenopus laevis. X. laevis является важным организмом для изучения РНК-белковых взаимодействий. Эта система имеет множество преимуществ, главное из которых заключается в том, что X. laevis производит сотни ооцитов и впоследствии синхронно развивает эмбрионы одновременно. Каждый ооцит содержит ~25 мкг нежелточного белка¹, что обеспечивает обильный материал для биохимических экспериментов. Большой размер (~1250 мкм)¹ ооцитов и эмбрионов также облегчает микроинъекцию мРНК для экзогенной экспрессии помеченных или мутировавших белков в масштабе². Эти качества позволяют проводить мощные эксперименты по анализу трансляционного контроля у X. laevis, такие как анализ привязанной функции, в котором влияние трансляционного регуляторного белка на мРНК может быть проанализировано независимо от способности этого белка связываться с РНК 3,4,5,6. Тем не менее, иммуноблоттинг в ооцитах и эмбрионах Xenopus сопряжен с трудностями, в том числе с вмешательством больших масс желточных тромбоцитов в этих^ранних клетках7, которые будут искажать результаты, если их не удалить.

В данной статье мы представляем оптимизированный протокол эффективного иммуноблоттинга у X. laevis с акцентом на обнаружение трансляционных регуляторных белков. Мы предоставляем инструкции по сбору и обработке ооцитов и эмбрионов для визуализации окончательного иммуноблоттинга. Также в комплект входят подробные инструкции по оптимальной загрузке белка и визуализации, а также предотвращению загрязнения образца желтком. Кроме того, мы обсуждаем возможные модификации протоколов и стратегии поиска антител, совместимых с белками Xenopus . Мы намерены предоставить исследователям рекомендации по проведению иммуноблоттинга без усилий в рамках их собственных экспериментов на этом недостаточно используемом модельном организме.

Рисунок 1: Рабочий процесс подготовки образцов Xenopus и последующего иммуноблоттинга. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Протокол

Вся работа с животными (X. laevis), представленными в этом протоколе, проводится в соответствии с Комитетом по уходу за животными и их использованию в учреждении Вашингтонского университета в Мэдисоне. Подробная информация об оборудовании, используемых реагентах и концентрациях антител приведена в Таблице материалов. Выбор оборудования можно посмотреть на рисунке 2 ниже.

Рисунок 2: Обработанный экстракт эмбриона и оборудование для иммуноблоттинга. (A) Центрифугированный экстракт ооцитов X. laevis стадии VI. Липиды и жирорастворимые белки поднимаются наверх, в то время как вителлогенин (желток) и пигментированный мусор образуют гранулу. (B) Оборудование для SDS-PAGE для разделения белков по молекулярной массе. (i) Источник питания, (ii) Вертикальный резервуар для электрофореза, (iii) Крышка резервуара для электрофореза, (iv) Электрод в сборе, (v) Буферная плотина, (vi) Сборный гель для электрофореза; Обратите внимание на зеленый гребень (вверху) и синюю наклейку (внизу), каждую из которых необходимо удалить. (C) Оборудование для мембранного переноса. Вертикальный бак для электрофореза и крышка повторно используются для переноса после тщательного промывки. (i) Валик для удаления пузырьков, (ii) Зажим для переноса, (iii) Маленькая полоса для перемешивания, (iv) Нитроцеллюлозная мембрана между двумя защитными синими листами бумаги, (v) Фильтровальная бумага для хроматографии целлюлозы, (vi) Подушки для переноса губки, (vii) Стеклянная форма для выпечки для сборки переноса, (viii) Пакет со льдом, (ix) Сердцевина для переноса. (D) Прочее оборудование. (i) Гелевый релизер (для обрезки предварительно переложенных гелевых лунок), (ii) Рычаг открытия гелевой кассеты, (iii) Щипцы (для обработки мембраны), (iv) Контейнер (для удерживающей мембраны), (v) Крышка контейнера. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

1. Сбор ооцитов и эмбрионов Xenopus

1. Подготовка ооцитов
   1. Получите дефолликулированные ооциты X. laevis у коммерческого поставщика (Ecocyte Bio Science, Остин, штат Техас) или изолируйте и дефолликулируйте в соответствии с описанием⁸.
   2. Культуру выделили ооциты в модифицированном растворе Барта (MBS; 88 мМ NaCl, 1 мМ KCl, 0,4 мМ CaCl₂, 0,33 мМ Ca(NO₃)₂, 0,8 мМ MgSO₄, 5 мМ Tris-HCl, 2,4 мМ NaHCO₃, pH 7,4) до использования.
2. Подготовка эмбрионов
   1. Изолировать яйца X. laevis и оплодотворить их, как описано ^9,10.
   2. Культивировали оплодотворенные эмбрионы в 0,25x Marc's Modified Ringer's solution¹¹ (MMR) (1x MMR: 0,1 M NaCl, 2,0 mM KCl, 1 mM MgSO₄, 2 mM CaCl₂, 5 mM HEPES).
   3. Приготовьте раствор 2% цистеина в 0,1x MMR с pH до 8,2 с использованием NaOH.
   4. Удалите 0,25x MMR из чашки, используемой для оплодотворения, и покройте эмбрионы раствором цистеина, чтобы удалить желейную оболочку¹². Осторожно перемешайте раствор, чтобы эмбрионы равномерно обнажились.
   5. Внимательно следите за эмбрионами с помощью стереомикроскопа с увеличением от 2x до 25x. После того, как желейная оболочка растворится (обычно через 3-5 минут), эмбрионы плотно упакуются. Следует избегать длительного воздействия цистеина.
   6. Удалите раствор цистеина и промойте эмбрионы несколько раз с 0,25x MMR.
   7. Культивируйте в 0,25x MMR до желаемой стадии роста.
3. Соберите желаемое количество эмбрионов или ооцитов (рекомендуется не менее пяти на образец) в пробирку объемом 1,5 мл.
4. Удалите излишки среды с помощью пипеттора, не повреждая клетки.
5. Используйте образцы немедленно или храните при температуре -80 °C до использования. Ооциты и эмбрионы могут храниться в течение нескольких лет.

2. Приготовление экстракта ксенопуса

1. Разморозьте образцы на льду, если они замерзли.
2. Добавьте 10 мкл охлажденного 10-кратного буфера для лизиса клеток, разбавленного в 1 раз двойной деионизированной водой (см. Таблицу материалов) на эмбрион/ооцит и гомогенизируйте образцы микропестиком на льду.
3. Отжим образцы при 5000 г при 4 °C в настольной центрифуге в течение 10 мин для удаления остатков гранул, включая желток и нерастворимые пигменты.
4. Удалите надосадочную жидкость в отдельную пробирку объемом 1,5 мл, стараясь избежать попадания гранул (рисунок 2A).
5. Добавьте равный объем 2x Laemmli sample buffer с добавлением 5% w/v 2-меркаптоэтанола в надосадочную жидкость и кипятите в течение 10 минут при 95-100 °C для денатурации образцовых белков.
6. Используйте образцы немедленно или храните при температуре -20 °C в течение нескольких месяцев или лет.

3. SDS-СТРАНИЦА

1. Приготовьте рабочий буфер SDS: 1x Tris-MOPS-SDS буфер (6,06 г трис-основания, 10,46 г 3-(N-морфолино)пропансульфоновой кислоты [MOPS], 1,0 г SDS, 0,3 г этилендиаминтетрауксусной кислоты [ЭДТА], дважды деионизированная вода до 1000 мл).
2. Извлеките из упаковки 4-12% сборный гель bis-tris SDS. Удалите наклейку в нижней части геля.
3. Вставьте гель в электродный узел напротив буферной прослойки. Поместите электрод в сборе в вертикальный резервуар для электрофореза (рис. 2B).
4. Заполните электродный узел и дно бака для электрофореза 1x Tris-MOPS-SDS рабочим буфером.
5. Аккуратно извлеките гелевую расческу из геля и запустите пипетку буфера в лунки для удаления пузырьков и уравновешивания буфера.
6. Осторожно загрузите 5 мкл предварительно окрашенных стандартов белка в первую лунку и по 10 мкл каждого образца в дополнительные лунки.
7. (НЕОБЯЗАТЕЛЬНО) Загрузите в оставшиеся лунки 10 мкл 1x буфера для проб Laemmli, чтобы гель тек более равномерно.
8. Закройте бак для электрофореза крышкой и подключите его к источнику питания. Приложите 200 В.
9. Остановите электрофорез, когда передний слой красителя буфера образца выйдет из геля.

4. Влажный перенос белков на мембрану

1. Во время электрофорирования образцов приготовьте 1 л буфера для переноса (3,0 г трис-основания, 4,08 г бицина, 900 мл дважды деионизированной воды, 100 мл метанола). Предварительно охладите буфер для переноса при 4 °C.
   ВНИМАНИЕ: Работайте с запасами концентрированного метанола в вытяжном шкафу и избегайте контакта с кожей. Метанол можно заменить этанолом.
2. Прежде чем электрофорез будет завершен, начните собирать трансферный «бутерброд» в трансферный зажим (рисунок 2C).
   1. Наполните стеклянную форму для выпечки охлажденным буфером для переноса. На последующих этапах сборки сэндвичей убедитесь, что материалы погружены в этот буфер.
   2. Поместите зажим для переноса в блюдо так, чтобы черная половина лежала на дне блюда, белая половина была открыта и направлена вверх, а зажим для переноса был открыт влево.
   3. Положите одну или две волокнистые губки плашмя на черную половину зажима для переноса.
   4. Отрежьте две целлюлозные бумаги для хроматографии толщиной 0,35 мм (фильтровальную бумагу) по размеру и положите одну поверх губок.
3. После завершения электрофореза извлеките гель из емкости для электрофореза.
4. Осторожно раздвиньте пластины геля с помощью рычага открытия гелевой кассеты, следя за тем, чтобы гель оставался прикрепленным к одной из пластин (Рисунок 2D). Обрежьте лунки сверху геля с помощью выпускателя геля.
5. Поместите гель, все еще прикрепленный к одной половине пластиковой кассеты, на фильтровальную бумагу. Снимите кассету наполовину, чтобы гель остался на фильтровальной бумаге.
6. Вырежьте квадрат из нитроцеллюлозной мембраны толщиной 0,45 мкм под размеры геля. Снимите мембрану с защитной бумаги, кратковременно намочите ее в буфере для переноса и поместите на гель.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно обращайтесь с мембраной за углы в перчатках или щипцах, чтобы избежать нежелательного загрязнения мембраны белком.
7. Положите вторую фильтровальную бумагу поверх нитроцеллюлозной мембраны. Аккуратно, но плотно удалите пузыри с помощью валика поверх фильтровальной бумаги.
8. Уложите еще одну-две волокнистые губки поверх фильтровальной бумаги.
9. Закройте кассету для переноса и плотно зафиксируйте ее, завершив «бутерброд».
10. Вставьте сэндвич для переноса в сердечник для переноса так, чтобы зажим был направлен вверх, а черная сторона зажима была обращена к черной стороне сердечника.
11. Поместите передаточный сердечник в резервуар для электрофореза. Добавьте в бак пакет со льдом и мешалку, чтобы мешалка могла свободно вращаться.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В дополнение к пакету со льдом или вместо него, перенос может быть выполнен в холодном помещении при температуре 4 °C на шаге 4.13.
12. Заполните бак охлажденным буфером для переноса. Плотно закрепите крышку сверху.
13. Подключите передающее устройство к источнику питания, убедившись, что цвета электродов совпадают. Запустите перенос в течение 1 ч, 100 В, при 4 °C, вращая мешалку.

5. Посттрансферная мембранная обработка

1. Приготовьте 10x Трис-буферный физиологический раствор (100 мМ трис-основание; 1,5 М NaCl). Отрегулируйте pH до 8 и простерилизуйте фильтром.
2. Приготовьте 1x Трис-буферный физиологический раствор с Tween-20 (TBSTw), разбавив 10x раствор TBS 1:10 в 500 мл дважды деионизированной воды и добавив 500 мкл Tween-20.
3. Приготовьте блокирующий буфер (500 мл TBSTw, 25 г сухого обезжиренного молока).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обезжиренное молоко можно заменить 2-5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в блокирующем буфере. BSA следует использовать, если экспериментальное применение включает визуализацию биотинилированных белков, так как молоко содержит биотин.
4. Как только перенос будет завершен, осторожно снимите и разберите бутерброд и удалите нитроцеллюлозную мембрану. Отметьте, какая сторона мембраны соприкасалась с гелем, и на последующих этапах держите эту сторону вверх.
5. Приготовьте 50 мл красителя Ponceau (0,5% Ponceau S, 1% уксусной кислоты), обратимый краситель для визуализации белка.
   ВНИМАНИЕ: Морилка Понсо вызывает коррозию. Избегайте попадания на кожу.
6. Поместите мембрану в небольшой контейнер (как показано на рисунке 2D) так, чтобы она лежала заподлицо с дном контейнера. Накройте мембрану морилкой Понсо до полного погружения и аккуратно покачивайте на коромысле в течение 5-10 минут.
7. Слейте пятно от Понсо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Морилку Ponceau можно использовать многократно.
8. Промывайте мембрану в повторных промывках дважды деионизированной водой до тех пор, пока избыток Понсо не будет удален и белковые полосы на дорожках не начнут рассасываться.
9. Подтвердите эффективность переноса наличием прямых, ровных полос с четко разрешенными полосами.
10. Слейте оставшуюся жидкость и погрузите блотку в блокирующий буфер, чтобы предотвратить связывание неспецифических антител с мембраной на последующих этапах.
11. Осторожно покачивайте на коромысле в течение 30-60 минут при комнатной температуре.

6. Инкубация антител

1. Разведите первичное антитело в 10 мл свежего блокирующего буфера до нужной концентрации.
   Примечание: Оптимальная концентрация должна быть определена опытным путем для каждого нового антитела. Типичная отправная точка — 1:1000, или следуйте рекомендациям производителя.
2. Удалите блокирующий буфер и замените его смесью антител. Инкубировать, осторожно покачивая, в течение ночи (~16 часов) при температуре 4 °C.
3. Слейте первичный раствор антитела и промойте мембрану с помощью TBSTw, погрузив ее в раствор и быстро вылив.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Большинство смесей антител можно сохранить и использовать повторно два-три раза. Это необходимо определить опытным путем для каждого антитела.
4. Промойте мембрану, погрузив ее в TBSTw и осторожно покачивая при комнатной температуре в течение 5 минут. Выполните три стирки по 5 минут.
5. Разведите вторичное антитело в 30 мл TBSTw до нужной концентрации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация должна быть определена эмпирически для каждого антитела. Обычно мы используем 1:30 000.
6. Слейте раствор для промывки TBSTw и замените его вторичной смесью антител. Инкубировать, осторожно покачивая, в течение 45 минут при комнатной температуре.
7. Быстро промойте мембрану один раз с помощью TBSTw, а затем три 5-минутных стирки TBSTw.

7. Визуализация мембраны на пленочном проявителе

1. В фотолаборатории включите проявитель пленки и дайте ей прогреться.
2. Отрежьте два квадрата полиэтиленовой пленки достаточно большими, чтобы охватить мембрану. С помощью щипцов поместите нитроцеллюлозную мембрану «лицевой стороной вверх» на первый квадрат полиэтиленовой пленки.
3. В пробирке объемом 1,5 мл смешайте равное количество реагентов Luminol с улучшенной хемилюминесценцией (ECL) и Enhancer. С помощью 1 мл смешанного раствора следует покрыть большинство мембран.
4. Нанесите реагент ECL пипеткой на мембрану и осторожно манипулируйте мембраной с помощью полиэтиленовой пленки, чтобы обеспечить полное покрытие. Инкубировать в течение 1 минуты.
5. Удалите излишки реагента ECL, обхватив мембрану щипцами и аккуратно стряхнув жидкость или отводя жидкость, прикоснувшись уголком мембраны к бумажному полотенцу.
6. Положите мембрану лицевой стороной вверх на второй квадрат полиэтиленовой пленки и заверните полиэтиленовую пленку поверх мембраны до тех пор, пока она не станет неплотно закрытой. Надежно заклейте обернутую мембрану скотчем в авторадиографическую кассету.
7. В фотолаборатории поместите пленку внутрь кассеты, накрыв ее скотчем. Плотно закройте кассету и приложите пленку к мембране на 1 минуту.
8. Аккуратно снимите пленку, стараясь не протащить экспонированную пленку по мембране. Подайте его в проявщик пленки.
9. Оценив проявленную пленку, отрегулируйте время экспозиции с последующими пленками до тех пор, пока не будет достигнута желаемая визуализация белка. Если визуализация белка дает слабый сигнал, повторите этап инкубации реагента ECL с более чувствительным реагентом ECL и повторите визуализацию.
10. Совместите проявленную пленку со светящимися в темноте маркерами и используйте этот эталон, чтобы отметить положение предварительно окрашенных белковых стандартов на мембране на пленке.
11. После завершения визуализации осторожно снимите мембрану с полиэтиленовой пленки и погрузите ее в TBSTw, чтобы смыть остатки реагента ECL.

8. (По желанию) Дополнительные инкубации антител

ПРИМЕЧАНИЕ: Стриппинг иммуноблоттинга относится к удалению исходных первичных и вторичных антител с помощью денатурирующего раствора (стриппинг-буфера), чтобы блот можно было повторно исследовать другим антителом. Повторное зондирование позволяет анализировать один и тот же иммуноблот на экспрессию различных белковых мишеней и сравнивать неизвестные белки с хорошо охарактеризованными белками, которые функционируют как стандарты. Зонд с антителом, которое сначала выдает сравнительно слабый сигнал. Это предотвращает появление артефактов, вызванных не полностью отрезанными антителами при последующих воздействиях, и сводит к минимуму влияние потери белка от повторного удаления блота.

1. Удалите связанные антитела, погрузив мембрану в буфер для снятия и осторожно покачивая в течение 5-10 минут.
2. Снимите мембрану с буфера для снятия изоляции и кратковременно промойте в TBSTw, чтобы удалить остатки раствора для зачистки.
3. Погрузите мембрану в блокирующий буфер и осторожно покачивайте на 30 минут.
4. Приготовьте новый раствор первичного антитела в блокирующем буфере с нужной концентрацией.
5. Добавьте новое первичное разведение антител в мембрану и осторожно инкубируйте в течение ночи при температуре 4 °C.
6. Далее, начиная с шага 6.3. Мембрана может быть снята и повторно исследована до трех дополнительных раз.

Результаты

Чтобы продемонстрировать эффективность нашего протокола иммуноблоттинга, мы проанализировали аффинно-меченые и эндогенные трансляционные контрольные белки в трех типах образцов X. laevis: ооциты VI стадии, эмбрионы 7 стадии (бластула) и эмбрионы стадии 10,5 (гаструла). Эти стадии были выбраны потому, что они охватывают переход средней бластулы (стадия 8.5), который знаменует собой начало устойчивой зиготической транскрипции^13,14. Поскольку развитие до перехода в середину бластулы происходит в отсутствие транскрипции, презиготические (т.е. контролируемые матерью) эмбрионы в значительной степени полагаются на механизмы трансляционного контроля для экспрессии белков клеточной судьбы с правильным временным и пространственным^{разрешением}. Таким образом, переход в середину бластулы является жизненно важным контекстом для изучения РНК-белковых взаимодействий.

Для анализа экспрессии белка с помощью иммуноблоттинга ооцитам и эмбрионам X. laevis вводили 500 пг мРНК, кодирующей С-концевую половину X. laevis Bicaudal-C (Bicc1), слитую с 3-кратным гемагглютинином (HA) аффинными метками. Мы решили проанализировать Bicc1 из-за его актуальности для биологии Xenopus и взаимодействия белка и РНК. Bicc1 является мРНК-связывающим белком и трансляционным репрессором, который управляет решениями о судьбе клеток на ранних стадиях развития эмбриона 16,17,18. На более поздних этапах развития он влияет на лево-правый паттерн ^19,20,21 и функцию органов, включая почки 22,23,24,25. Bicc1 содержит область, которая управляет доменами гомологии⁵ трансляционной репрессии 5 и hnRNP K (KH), которые опосредуют связывание со специфическими мРНК ^5,26,27,28.

Экстракты получали из пяти введенных HA-Bicc1 ооцитов или эмбрионов вместе с соответствующими неинъецированными образцами в качестве отрицательного контроля. Одну десятую часть каждого экстракта электрофорезировали на геле бис-трис с градиентом 4-12% и переносили на мембрану из нитроцеллюлозы. Окрашивание мембраны по Понсо для определения общего белка подтвердило успешный перенос (рис. 3A). В рамках наших исследований мы создали антитело у кроликов, которое распознает С-концевую половину человеческого белка Bicc1. Это антитело использовали для обнаружения эндогенного и экзогенного белка Xl-Bicc1 (рис. 3B). Предыдущая работа показала, что белок Bicc1 отсутствует в ооцитах X. laevis , но экспрессируется в эмбрионах до MBT, прежде чем зиготический геном становится активным¹⁶. Это говорит о том, что, хотя мРНК Bicc1 накапливается во время оогенеза, она трансляционно подавляется. В соответствии с этой предыдущей работой, эндогенный Bicc1 не был обнаружен в ооцитах. Напротив, антитело распознавало эндогенный Bicc1 (~MW 107 кДа) как на стадии 7, так и на стадии 10,5. В совокупности эти результаты подтверждают, что антитело распознает эндогенный белок Bicc1 (рисунок 3B, верхняя панель, красная стрелка). Антитело Bicc1 распознавало меньший белок примерно 70 кДа в экстрактах, приготовленных из образцов, введенных с помощью мРНК (рисунок 3B, верхняя панель, черная стрелка, сравните дорожки 2, 4 и 6 с дорожками 1, 3 и 5). В качестве контроля специфичности антитела Bicc1 мембрану снимали и повторно зондировали антителом против аффинной метки HA. Антитело к гиалуроновой кислоте идентифицировало белок 70 кДа во введенных образцах, но не распознало эндогенный Bicc1 (рисунок 3B, вторая панель, черная стрелка). Обнаружение С-термина HA-Bicc1 варьируется по интенсивности в зависимости от стадии из-за различий в экспрессии белка от введенной мРНК в различных типах клеток.

Затем мы расширили результаты, проверив экспрессию эндогенных трансляционных регуляторных белков, которые взаимодействуют с Bicc1. Во-первых, мы проанализировали экспрессию субъединицы транскрипционного комплекса Ccr4-Not 1 (Cnot1), большого белка каркаса и части комплекса Ccr4-Not деденилазы (CNOT). Мультисубъединичный комплекс CNOT является одной из основных эукариотических деаденилаз и в первую очередь известен тем, что обрезает поли(А)-хвост на конце матричных мРНК в качестве прелюдии к их деградации. Тем не менее, этот комплекс выполняет различные роли в управлении трансляцией, которые выходят за рамки деденилирования²⁹. Мы были заинтересованы в анализе экспрессии Cnot1 из-за важности комплекса CNOT для регуляции мРНК и предыдущих наблюдений о том, что Cnot1 взаимодействует с Bicc1^20,30. Для анализа экспрессии Cnot1 мы использовали антитело, которое распознает эндогенный белок Cnot1. Он идентифицировал два белка с концентрацией 250 кДа и 270 кДа в каждом образце, что соответствует прогнозируемому размеру Cnot1 (рис. 3B, третья панель). Таким образом, данный протокол позволяет нам легко идентифицировать критически важный компонент регуляторного комплекса. Кроме того, эти данные подтверждают способность протокола успешно идентифицировать высокомолекулярные белки.

Чтобы дополнительно проверить обобщаемость этих результатов, мы проанализировали образцы на наличие выдающейся геликазы DEAD-box, участвующей в трансляционной репрессии, геликазы DEAD-box 6 (Ddx6, ранее известная как xp54 у Xenopus и me31b у дрозофил). Ddx6 является важным компонентом гранул рибонуклеопротеина, участвует в хранении мРНК, взаимодействует с Bicc1 и Cnot1 ^6,31,32. Антитело, распознающее эндогенный Ddx6, идентифицировало белок около 54 кДа в каждом образце (рисунок 3B, четвертая панель). Экспрессия была снижена у скуловых эмбрионов (рис. 3B, сравните дорожки 5 и 6 с 1-4), как сообщалось ранее³³.

Наконец, чтобы убедиться, что различия, которые мы наблюдали между образцами, были связаны с различиями в экспрессии, мы сняли и повторно исследовали иммуноблот антителом, распознающим фермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (Gapdh). Gapdh служит вездесущим «контролем загрузки». Эквивалентные уровни экспрессии Gapdh подтверждают окрашивание по методу Понсо: в образцах анализируется равное количество общего белка (рис. 3B, пятая панель).

В совокупности эти результаты подтверждают эффективность данного метода иммуноблоттинга. Нам удалось идентифицировать экзогенный и эндогенный Bicc1 на нескольких стадиях развития X. laevis , имеющих отношение к изучению РНК-белковых взаимодействий: ооциты и эмбрионы до MBT, которые содержат только материнские депонированные мРНК, и эмбрионы после MBT, которые также включают зиготически транскрибируемые мРНК. Мы смогли обобщить эти результаты, проанализировав экспрессию нескольких трансляционных контрольных белков при различных молекулярных массах (Bicc1, Cnot1 и Ddx6) и контроле нагрузки (Gapdh). Мы также показываем, что этот протокол может быть использован для эмбрионов X. tropicalis с модификацией для увеличения количества используемого материала, чтобы объяснить их меньший размер (дополнительный рисунок 1).

Рисунок 3: Определение уровней трансляционных регуляторных белков с помощью иммуноблоттинга у X. laevis. (A) Окрашивание иммуноблоттинга по Понсо для идентификации общего белка из ооцитов X. laevis VI стадии, эмбрионов 7 стадии и эмбрионов стадии 10,5. Каждая дорожка представляет собой 10% белка, полученного из экстракта (0,5 ооцита или эмбриона). (B) Иммуноблоттинг-анализ выбранных трансляционных регуляторных белков X. laevis в ооцитах VI стадии, эмбрионах 7 стадии и эмбрионах 10,5 стадии. Дорожки 2, 4 и 6 соответствуют образцам, микроинъецированным мРНК HA-Bicc1 перед анализом, в то время как дорожки 1, 3 и 5 служат отрицательным (неинъецированным) контролем. Антитело α-Bicc1 использовали для анализа экспрессии эндогенного Bicc1 на разных стадиях (верхняя панель). Впоследствии блот удаляли и повторно исследовали с помощью антитела к аффинитной метке HA в качестве контроля специфичности антител α-Bicc1 (вторая панель). Блоттинг был удален и повторно исследован на наличие дополнительных регуляторных белков с использованием α-Cnot1 (третья панель) и α-Ddx6 (четвертая панель). α-Gapdh (нижняя панель) служил контролем для равномерной белковой нагрузки. Красными стрелками обозначено местоположение эндогенного Bicc1, в то время как черными стрелками обозначено местоположение экзогенно экспрессированного C-члена HA-Bicc1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1: Иммуноблоттинг-анализ белка Bicc1 у Xenopus laevis в сравнении с Xenopus tropicalis. Антитело α-Bicc1 использовали для анализа экспрессии эндогенного и экзогенного Bicc1 в различных количествах экстракта эмбриона X. laevis и X. tropicalis . Дорожка 1: 0,5 неинъекционного эмбриона X. laevis . Дорожка 2: 0,5 HA-Bicc1 введенный эмбрион X. laevis . Дорожка 3: 3 неинъекционных эмбриона X. tropicalis . Дорожка 4: 1 неинъекционный эмбрион X. tropicalis . Дорожка 5: 0,5 неинъекционного эмбриона X. tropicalis . Использовали два антитела, распознающие эндогенный Bicc1: одно, поднятое против человеческого Bicc1 (верхняя панель), и другое, поднятое против X. laevis Bicc1 (средняя панель). α-Gapdh (нижняя панель) использовался для контроля равной белковой нагрузки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Несмотря на простоту концепции, иммуноблоттинг сложен на практике из-за многоэтапности, охватывающей несколько дней. Таким образом, достижение стабильных и высококачественных результатов часто является сложной задачей. Тем не менее, иммуноблоттинг является жизненно важным и повсеместным компонентом современной биологии. Например, иммуноблоттинг имеет решающее значение для подтверждения успешной трансляции и экспрессии микроинъекционной мРНК в ооцитах и эмбрионах X. laevis , что подчеркивает его важность для исследований X. laevis . Кроме того, в экспериментах по иммунопреципитации используется иммуноблоттинг для анализа белок-белковых взаимодействий in vivo . Эффективное обнаружение конкретных белков во многом будет зависеть от их распространенности и качества реагентов для обнаружения антител. В этом исследовании расчетные концентрации эндогенного белка, который мы анализировали, варьировались почти в 500 раз в яйце Xenopus (Bicc1: 37,22 нМ, Cnot1: 115,08 нМ, Ddx6: 980,55 нМ, Gapdh: 17 907,26 нМ)³⁴, но все они были легко обнаружены. Ниже этого диапазона можно вносить изменения в рабочий процесс практически на каждом этапе иммуноблоттинга — от сбора образца до визуализации — для повышения точности и эффективности обнаружения, если это необходимо.

Какой тип геля и мембраны SDS-PAGE следует использовать, является основным фактором для любого эксперимента по иммуноблоттингу. По нашему опыту, сборные гели более просты и воспроизводимы, чем гели, произведенные на собственном производстве. Сборные гели имеют дополнительное преимущество, заключающееся в том, что они доступны в градиентных форматах, где концентрация полиакриламида в гелях постепенно увеличивается сверху вниз. Градиентные гели позволяют исследователям определять и анализировать широкий спектр белков с совершенно различной молекулярной массой. Это позволяет избежать типичного компромисса между выбором геля с низким процентом акриламида (<7%), который растворяет высокомолекулярные белки, и геля с высоким процентом (>12%), который лучше разрешает низкомолекулярные белки. Также важно учитывать, следует ли использовать мембрану из нитроцеллюлозы или поливинилиденфторида (PVDF) для переноса белка. Механизм и преимущества каждого типа мембран были подробно обсуждены^35,36. Короче говоря, PVDF обладает более высокой способностью связывания белка (и, следовательно, более высокой чувствительностью), чем нитроцеллюлозная мембрана, и более долговечен при многократном использовании. Однако PVDF требует дополнительной обработки в виде активации путем инкубации метанола и является более дорогостоящим. Несмотря на то, что мы считаем, что обе мембраны подходят для большинства областей применения, мы обычно используем нитроцеллюлозу из соображений стоимости.

Визуализация иммуноблоттинга является важнейшим компонентом протокола. На этом этапе исследователи должны проявить здравый смысл, чтобы получить изображение иммуноблота, которое передает всю необходимую информацию, но сводит фоновый шум к минимуму. Существует два основных метода визуализации стандартных HRP-конъюгированных антител: рентгеновская пленка или цифровые системы визуализации. По нашему опыту, съемка изображений с помощью рентгеновской пленки имеет много преимуществ. Рентгеновские пленки, как правило, гораздо более чувствительны, чем цифровые системы визуализации, что облегчает обнаружение белков с низким содержанием. Рентгеновские пленки также создают физическую запись эксперимента, которая может быть аннотирована и оцифрована с высоким разрешением. Тем не менее, цифровая система обработки изображений будет иметь гораздо больший линейный диапазон (соотношение между мощностью сигнала и интенсивностью изображения), чем проявка пленки. Из-за своей чувствительности рентгеновская пленка может быстро переэкспонироваться, теряя количественную информацию. Поэтому исследователь, стремящийся получить точную количественную оценку своих результатов, должен использовать цифровую систему визуализации или проявлять особую осторожность, чтобы не переэкспонировать развивающиеся иммуноблоттинги рентгеновской пленкой.

Если результаты иммуноблоттинга неудовлетворительны после следования описанному нами протоколу, например, при визуализации появляются слабые или «размытые» полосы, можно внести несколько корректировок для улучшения результата. Например, количество анализируемой белковой смеси Xenopus может быть скорректировано. Общий белок всего лишь из одной пятой эмбриона может дать хорошие результаты, хотя можно загрузить до двух эмбрионов или ооцитов на гелевую дорожку. Загрузка слишком большого количества белка может привести к образованию артефактов или ложных высоких фоновых сигналов во время визуализации. Кроме того, электрофорез при более низком напряжении (100 В) в течение более длительного времени работы обычно приводит к образованию более четких белковых полос. Аналогичным образом, выполнение переноса белка в течение ночи при 4°C при низком напряжении (30 В) вместо часа при 100 В может улучшить обнаружение белка, особенно для высокомолекулярных соединений. Наконец, некоторые инкубации первичных антител обнаруживают свои мишени более надежно, используя инкубацию в течение 1 часа при комнатной температуре, в отличие от 4 °C в течение ночи. Эта модификация протокола должна быть протестирована для каждого первичного антитела.

Идентификация антител для обнаружения эндогенных белков представляет собой серьезную проблему для иммуноблоттинга при Xenopus, поскольку относительно мало специфических для Xenopus антител коммерчески доступны. Исследователи могут извлечь пользу из некоммерческих источников антител Xenopus, таких как Xenbase³⁷ (https://www.xenbase.org/xenbase/), Банк гибридомов исследований развития (https://dshb.biology.uiowa.edu/) и Европейский ресурсный центр Xenopus (https://xenopusresource.org/). Альтернативно, антитела, полученные для распознавания человеческого или мышиного белка, могут быть полезны для детектирования гомологичных белков Xenopus, в зависимости от сохранности областей, используемых для производства антител. Например, антитело Bicc1, представленное в этом протоколе, было выращено против человеческого белка Bicc1. Для таких реагентов способность к перекрестной реакции с белками Xenopus должна быть определена опытным путем. Хотя точные эпитопы, которые компании используют для создания антител, как правило, являются собственностью, многие предоставляют диапазон аминокислот для эпитопа по запросу. Затем эта область может быть выровнена с соответствующей областью гомологичного белка Xenopus. Хотя успех не гарантирован, мы обычно добиваемся успеха, когда эпитоп, используемый для производства антител у целевого вида, демонстрирует сходство по меньшей мере 75% или выше с сопоставимым участком последовательности у Xenopus. Антитела, полученные против белков, отличных от Xenopus, должны быть валидированы перед широким использованием, поскольку неправильная верификация антител является основным фактором невоспроизводимых исследований^38,39. Это может быть сделано путем экспрессии меченого белка Xenopus, представляющего интерес у эмбрионов, посредством микроинъекции мРНК⁴⁰. Анализ одних и тех же образцов с антителом к аффинной метке затем используется для подтверждения того, что антитело к эндогенному белку и антитело к меченому белку распознают одно и то же вещество (как показано на рисунке 3B).

Анализ РНК-связывающих белков, особенно тех, которые обладают регуляторными функциями, таких как Bicc1, может оказаться сложным из-за нехватки реагентов и, как правило, низкой экспрессии мощных регуляторных молекул. Эта проблема становится более очевидной при иммуноблоттинге, где каждый реагент должен быть оптимизирован отдельно, и поиск антител достаточной специфичности и чувствительности может быть затруднен. Наша цель с помощью этого протокола состоит в том, чтобы устранить конкретные ограничения иммуноблоттинга в Xenopus и подробно рассказать о шагах, применимых к другим системам, чтобы исследователи могли преодолеть трудности анализа РНК-связывающих белков.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
100 кв. футов Heavy Duty Premium Wrap	Саран	2570000130
10-кратный буфер лизиса клеток	Технология клеточной сигнализации	#9803
2-меркаптоэтанол	Сигма-Олдрич	M3148
2-литровое продолговатое блюдо для выпечки/подачи	Пирекс	71160010116
2x Sample Buffer Laemmli	Био-Рад	#1610737
Антитела с высоким аффинизмом к ГК	Рош	11867423001	Приготовлено по указанию и использовано при разбавлении 1:10 000.
Антикроликовый IgG, антитела, связанные с HRP	Технология клеточной сигнализации	7074S	Используется при разбавлении 1:30 000.
Авторадиографическая кассета, 5 x 7 дюймов	Research Products International	420057	Не обязательно, если используется цифровая система визуализации.
Одноразовые пестики Bel-Art	Миллипор Сигма	BAF199230001
Bicaudal-C (человеческий) кроликовый антител	Envigo Bioproducts (ныне Inotiv)	Н/Д	Заказ на заказ. Используется при разбавлении 1:20 000.
Антитело кролика к бикаудальному C (Xenopus)	Envigo Bioproducts (ныне Inotiv)	Н/Д	Заказ на заказ. Используется при разбавлении 1:20 000. Ссылка Парк и др., 2016
Бычий сывороточный альбумин	Сигма-Олдрич	A3294	Замена обезжиренного молока в блокирующем буфере.
Центрифуга 5425	Эппендорф	13-864-456
Плёнка CL-XPosure	ThermoFisher Scientific	34091	Не обязательно, если используется цифровая система визуализации.
Моноклональное антитело CNOT1 (D5M1K) Rabbit Monoclonal	Технология клеточной сигнализации	#44613	Используется при разбавлении 1:2 000.
DDX6/RCK (D26C11) Моноклональное антитело кролика	Технология клеточной сигнализации	#8988	Используется при разбавлении 1:5 000.
E-Z Store and Pour Developer	MXR визуализация	103633	Не обязательно, если используется цифровая система визуализации.
E-Z Store and Pour Fixer	MXR визуализация	114511	Не обязательно, если используется цифровая система визуализации.
Моноклональное антитело GAPDH	ProteinTech	60004-1-Ig	Используется при разбавлении 1:40 000.
Гель-релизатор	Био-Рад	#1653320
Вторичный антител против мышей у коз (H+L), HRP	Инвитроген	A16066	Приготовлено по указанию и использовано при разбавлении 1:40 000.
Ледяной компресс, 8 унций, 5 x 3 x 1"	Улина	S-18256
L-Цистеин	Сигма-Олдрич	C7352
Медицинский пленочный процессор	Konica Minolta	SRX-101A	Не обязательно, если используется цифровая система визуализации.
Mini-PROTEAN  Рычаг открытия кассеты	Био-Рад	#4560000
Mini-PROTEAN  Вертикальная электрофорезная ячейка Tetra	Био-Рад	#1658004
Электрофорезный бак MSE PRO 700 мл Western Blot	MSE Supplies	BB2369
Мембрана нитроцеллюлозы, 0,45 и микро; m	Био-Рад	#1620115
Обезжиренное сухое молоко	Саналак	1570000180
Пероксидаза аффиниЧистый козий антикрысный IgG (H+L)	Jackson Immunoresearch	112-035-003	Приготовлено по указанию и использовано при разбавлении 1:100 000.
Полисорбат (подросток) 20	Биореагенты Fisher	BP337-500
Понсо С	VWR Life Science	K793-500ML	Можно сделать приближение с 0,5% Ponceau S, 1% уксусной кислоты
Базовый блок питания PowerPac	Био-Рад	1645050
PR1MA 2D рокер с переменной скоростью	MidSci	R2D-30
Лестница двухцветных стандартов Precision Plus Protein	Био-Рад	#1610374	Можно использовать любую выбранную белковую лестницу.
Фильтрующая бумага для чистой целлюлозной хроматографии, 0,35 мм	Fisher Scientific	05-714-4
Восстановить буфер для очистки Western Blot	ThermoFisher Scientific	#21059
Хлорид натрия	Фишер Кемикал	S640-10
Ящик для хранения 300 мл	Рости Мепал	RST46608	Для блокировки мембраны нитроцеллюлозы, инкубации антител и промывки
Субстрат максимальной чувствительности SuperSignal West Femto	ThermoFisher Scientific	#34094	Улучшенный хемилюминесцентный (ECL) субстрат, содержащий два компонента: люминол и энхансер. Этот реагент ECL обладает низкой чувствительностью к фемтограмме.
Хемилюминесцентная подложка SuperSignal West Pico PLUS	ThermoFisher Scientific	#34580	Улучшенный хемилюминесцентный (ECL) субстрат, содержащий два компонента: люминол и энхансер. Этот реагент ECL обладает чувствительностью к пикограмме к фемтограмме.
SurePAGE, Bis-Tris, 10 x 8, 4– 12%, 10-скважинные полиакриламидные гели	GenScript	M00652
Буферный порошок	GenScript	M00652
Tris Base Ultrapure	USBiological	77-86-1
Запускающий буферный порошок Tris-MOPS-SDS	GenScript	M00138