Методическая статья

Инновационный метод выделения эндосом из тканей сердца мышей и совместного культивирования с кардиомиоцитами

DOI:

10.3791/69146

⸱

10 октября 2025 г.

 ,  ,  , 
1Pharmacological and Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, University of Houston

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндосомы представляют собой совокупность внутриклеточных сортирующих органелл, входящих в транспортный путь эндоцитарной мембраны. Мы разработали новый метод выделения эндосом из сердечной ткани с помощью автоматической нанофильтрационной установки и исследовали клеточное поглощение эндосом путем их совместного культивирования с первичными кардиомиоцитами.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндосомы — это связанные с мембранами органеллы, играющие важную роль во внутриклеточном транспорте, передаче сигнала и рециркуляции мембран. Несмотря на то, что их функции в сердечно-сосудистой биологии получают признание, эффективное выделение эндосом из сердечной ткани остается серьезной технической проблемой. Мы разработали быстрый и высокоэффективный протокол для выделения эндосом из сердечной ткани мыши, сочетая субклеточное фракционирование со сверхбыстрой платформой выделения нанофильтрации. Этот метод включает в себя последовательное центрифугирование, нанофильтрацию и извлечение везикул на основе нанопористых мембран. Выделенные эндосомы характеризовались анализом вестерн-блоттинга, динамического рассеяния света (DLS) и нанопроточной цитометрии (NanoFCM). Для оценки биологической активности очищенные эндосомы культивировали совместно с первичными неонатальными кардиомиоцитами. Эндосомальные маркеры EEA1 и Rab7 были сильно обогащены в изолированных везикулах. Анализ DLS показал средний диаметр везикулы 187,30 ± 23,42 нм и дзета-потенциал -26,60 ± 5,79 мВ (n = 12). Количественное определение NanoFCM дало примерно 1,07 ± 0,31 × 1012 частиц/мл (n = 12) из 100 мг сердечной ткани. Функциональное поглощение эндосом кардиомиоцитами наблюдалось после совместного культивирования in vitro , что указывает на сохранение целостности и активности везикул. Эта интегрированная изоляционная платформа обеспечивает воспроизводимый и эффективный метод извлечения эндосом высокой чистоты из сердечных тканей. Протокол облегчает последующие биохимические и функциональные исследования, предлагая ценный инструмент для изучения роли эндосом в физиологии и заболеваниях сердечно-сосудистой системы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндосомы являются важными внутриклеточными органеллами, которые регулируют эндоцитоз, сортировку грузов и сигнальные пути 1,2. Активированные сигнальные рецепторы и другие подавленные белки первоначально сортируются во внутрипросветные везикулы (ILV) в ранних эндосомах (EE), которые затем созревают в мультивезикулярные тельца (MVB) или эндосомальные везикулы-носители (ECV). Эти везикулы впоследствии сливаются с поздними эндосомами (LE), которые служат вторичными сортировочными узлами для направления груза в сторону лизосомальной деградации или альтернативных путей. ILV также могут секретироваться в виде экзосом после слияния эндосом с плазматической мембраной 3,4. Параллельно путь аутофагии доставляет цитозольный материал к LE через аутофагосомы, которые приобретают деградационную способность при слиянии с поздними эндоцитарными компартментами. Эндосомы в настоящее время признаны важнейшими регуляторами рециркуляции рецепторов6, локализации ионных каналов7, биогенеза экзосом 8 и межклеточной коммуникации9 процессов, которые особенно актуальны в специализированных клетках, таких как нейроны и кардиомиоциты.

Новые данные подчеркивают ключевую роль эндосомальных путей в функционировании сердечно-сосудистой системы. Белок 3 домена гомологии Eps15 (EHD3) регулирует эндосомальную рециркуляцию ключевых сердечных ионных транспортеров, включая обменник Na+/Ca2+ и каналы Ca2+ L-типа. Дефицит EHD3 у мышей приводит к брадикардии, аномалиям проводимости и изменению обработкиCa2+ 10. Функциональный транспорт эндосом-лизосом в гладкомышечных клетках сосудов предотвращает индуцированную фосфатами медиальную кальцификацию, которая актуальна при хронической болезни почек и атеросклерозе11. Тем не менее, функциональная роль эндосом при сердечно-сосудистых заболеваниях и их потенциал в качестве терапевтических мишеней остаются не до конца изученными, что требует дальнейших исследований.

Многочисленные методы позволили биохимически выделить функционально интактные эндосомы. Марш и его коллеги впервые объединили центрифугирование с градиентом плотности с электрофорезом в свободном потоке для восстановления ранних и поздних эндосом, сохраняя их закисление и структурнуюцелостность. Современные методологии, такие как градиентный подход сахарозы, предлагают стандартизированный маршрут для разделения ранних и поздних эндосомальных популяций, что имеет важное значение для последующих протеомных и липидомных исследований13. Коммерческие комплекты на основе спин-колонн были разработаны для применения с высокой пропускной способностью.

Для выделения экзосом с помощью автоматической системы сверхбыстрой изоляции используется инновационная технология ультразвуковой нанофильтрации, которая включает в себя двухмембранную систему нанофильтрации, интегрированную с периодическими колебаниями отрицательного давления и двухсвязанными гармоническими колебаниями, что позволяет выделять экзосомы высокой чистоты из биожидкостей14. Здесь мы объединили субклеточное фракционирование с выделением эндосом с использованием автоматической системы сверхбыстрой изоляции для достижения нового метода быстрой изоляции эндосом с высоким выходом и высокой чистотой из сердечной ткани мыши.

Кроме того, мы совместно культивировали экстрагированные эндосомы с первичными кардиомиоцитами (КМ) in vitro и обнаружили, что экзогенные эндосомы успешно проникли в КМ. Используя эндосомный репортер, в котором локализованный в эндосоме белок Numb был слит с красным флуоресцентным белком mCherry15,16, мы наблюдали флуоресценцию mCherry, локализованную внутри КМ с пунктирным рисунком.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Рекомендациями Национальных институтов здравоохранения по использованию лабораторных животных и с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию в Университете Хьюстона.

ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом процедуры изоляции важно убедиться, что все необходимые буферы были свежеприготовлены и охлаждены до 4 °C. Стерилизованные инструменты, планшеты для культивирования тканей и соответствующие пробирки должны быть размещены на специально отведенных рабочих местах, при этом все материалы должны храниться на льду или при температуре 4 °C, если не указано иное. Центрифуги и роторы должны быть предварительно отбалансированы до 4 °C в течение как минимум 2-3 часов перед использованием. Фракционирующий буфер должен быть приготовлен до дня эксперимента и храниться при температуре 4 °C, а также храниться на льду во время эксперимента до тех пор, пока он не понадобится. Если не указано иное, все этапы инкубации и центрифугирования должны проводиться при температуре 4 °C.

1. Приготовление лизата сердца

  1. Продезинфицируйте операционную область с помощью 70% этанола с последующим размещением стерильной абсорбирующей прокладки на рабочей поверхности, на которой располагаются стерилизованные хирургические инструменты.
  2. Усыпляйте мышей (самцы C57BL/6, 8-12 недель, 20-25 г, и самцы mCherry: NumbKi, 8-12 недель, 20-25 г) с помощью ингаляции CO2 (10-30%CO2 в течение 3-5 минут) или альтернативным методом, одобренным соответствующим комитетом по уходу и использованию животных.
    ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, работайте на открытом пространстве и следите за тем, чтобы баллон сCO2 закрывался вовремя, чтобы предотвратить утечку. Во время эвтаназии за мышами следует наблюдать, чтобы подтвердить потерю сознания и надлежащую процедуру. Когда вы потеряете сознание, используйте вторичный метод, такой как вывих шейки матки, торакотомия или обескровливание, чтобы обеспечить смерть.
  3. Расположите мышь в положении лежа на спине и очистите грудную область 70% этанолом.
    1. Быстро откройте грудную полость, чтобы извлечь сердце, и переведите сердце в ледяной сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) в 60-миллиметровую посуду, помещенную на лед.
    2. Аккуратно удалите остатки крови из камер сердца с помощью пинцета и очень хорошо промойте сердце до тех пор, пока в камерах не останется крови. Держите сердце на льду на протяжении всей обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните 50-100 мг сердечной ткани для анализа вестерн-блоттинга (WB) в качестве положительного контроля. Сердце можно замораживать в жидком азоте и хранить при температуре -80 °C до 6 месяцев.
  4. Добавьте 8 мл фракционирующего буфера (Таблица 1) в 50 мл пробирки со льдом. Перелейте 100-120 мг свежей или замороженной сердечной ткани мыши в пробирку, содержащую фракционирующий буфер.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Любая часть сердечной ткани мыши может быть использована для извлечения эндосом. Требуется минимум 100 мг сердечной ткани для получения достаточного количества эндосом для последующих анализов. Чтобы обеспечить единообразие в экспериментальных группах, ткань должна быть точно взвешена перед добавлением в буфер для фракционирования.
    ВНИМАНИЕ: При работе с фракционирующим буфером надевайте соответствующие СИЗ, чтобы избежать прямого контакта с телом.
  5. Измельчите ткань примерно на1 мм 3 кусочка с помощью микрохирургических ножниц в буфере для фракционирования на льду все время.
  6. Гомогенизация с помощью электрического гомогенизатора на средних оборотах, за 40 с работы 30 с цикл остановки. Гомогенизация в течение 5-7 циклов (Рисунок 1А).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательный процесс гомогенизации имеет важное значение и поможет увеличить конечную концентрацию эндосом.
  7. Ультразвуком обрабатывайте гомогенизированный лизат сердца в течение 10 мин в ледяной водяной бане с ультразвуковой ванной (рис. 1А).

2. Субклеточное фракционирование

  1. Поместите клеточный фильтр 40 μм над центрифужной трубкой объемом 50 мл и отфильтруйте гомогенизированный лизат сердца через фильтр (рисунок 1A).
  2. Для ядерной таблетки: центрифугировать лизат сердца при 1000 × г в течение 5 минут при 4 °C. Перенесите надосадочную жидкость и поместите ее в свежую пробирку с этикеткой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Соберите гранулу, которая является ядерной фракцией, и повторно суспендируйте ядерную гранулу в буфере для лизиса WB объемом 200 μL, если ядерная фракция необходима для WB. Аккуратно пипетируйте ядерную таблетку радиоиммуноципитацией (RIPA), буферизуйте вверх и вниз 20 раз и обрабатывайте ультразвуком в течение 10 минут. Центрифугируйте ядерный лизат при 14 000 × г в течение 10 минут. Соберите надосадочную жидкость и храните ее при температуре -80 °C для дальнейшего использования. Шаг 2.2 не является обязательным; Его можно пропустить, если требуются только везикулы.
  3. Для митохондриальной фракции: снова центрифугируйте надосадочную жидкость при 10 000 × г в течение 10 мин при 4 °C. Гранула содержит митохондриальную фракцию. Перенесите надосадочную жидкость и поместите ее в свежую ультрацентрифугированную пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если для WB требуется митохондриальная фракция, сохраните гранулу на этапе 2.2, как описано в предыдущем ПРИМЕЧАНИЕ.
  4. Тщательно отбалансируйте трубки. Взвесьте каждую пробирку и добавьте дополнительный буфер для холодного фракционирования в более легкую пробирку, чтобы обеспечить одинаковый вес. Предварительно охладите ротор и адаптеры ультрацентрифуги в течение 2-3 часов при 4 °C. Ультрацентрифугирование надосадочной жидкости при 160 000 × г в течение 30 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе ультрацентрифугирования крайне важно убедиться, что все ультрацентрифужные пробирки правильно сбалансированы и заполнены буфером примерно на 0,5-1 см ниже края. Недостаточное наполнение может привести к деформации или разрушению трубки из-за приложенных высоких центробежных сил.
  5. Удалите надосадочную жидкость в свежую трубку. Надосадочная жидкость содержит эндосомы. Установите шприц объемом 10 мл, прикрепленный к шприцевому фильтру 0,45 мкм, на вершине центрифугирующей пробирки объемом 50 мл и отфильтруйте надосадочную жидкость в пробирку. Добавьте 5 мл стерилизованного PBS буфера, чтобы разбавить раствор и избежать засорения фильтра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этап фильтрации гарантирует, что все эндосомы в надосадочной жидкости находятся на дне <450 нм на начальном этапе выделения.
  6. Повторно суспендируйте гранулу с 5 мл стерилизованного буфера PBS с шага 2.4 и пипеткой вверх и вниз не менее 20 раз, чтобы хорошо перемешать гранулу. В грануле содержатся и другие внутриклеточные пузырьки. Установите шприц объемом 10 мл, прикрепленный к шприцевому фильтру 0,45 мкм на вершине центрифугирующей трубки объемом 50 мл, и отфильтруйте раствор гранул в пробирку. Добавьте еще 5 мл стерилизованного буфера PBS, чтобы разбавить раствор и избежать засорения фильтра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этап фильтрации гарантирует, что все везикулы из гранулы находятся на <450 нм при запуске этапов изоляции.

3. Процесс выделения эндосом и других внутриклеточных везикул

  1. Отфильтрованный надосадочный жидкость на стадии 2.5 и отфильтрованный раствор гранул на стадии 2.6 стерилизованным буфером PBS до конечного объема 30 мл в пробирках объемом 50 мл соответственно. Храните образцы при температуре 4 °C (рис. 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы можно хранить при температуре 4 °C в течение 24 часов. Если у вас недостаточно времени для выполнения следующих действий в тот же день, их можно хранить в холодильнике при температуре 4 °C, а затем дождаться следующего дня для продолжения эксперимента.
  2. Включите прибор и начните ежедневную программу очистки, которая обычно занимает 20 минут.
  3. Для изоляции выберите изолирующее устройство Medium EXODUS (M EID). Установите адаптер для пробирки на 50 мл и поместите пробирку на 50 мл с образцом в положение для образца. Нажмите EID на экране и загрузите M EID.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средний EID предназначен для образца объемом 20-50 мл, рекомендуется 30 мл.
  4. Настройте программу:
    1. Введите имя образца и объем образца.
    2. Выберите тип образца: Плазма.
    3. Выберите программу: Плазма. Стронг-МА. А03.
    4. Выберите пробирку для центрифуги: 50 мл.
    5. Включите режим высокой чистоты.
    6. Выберите опцию программы 3000.
    7. Нажмите OK , чтобы начать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Весь процесс изоляции занимает 1-2 часа. При более высокой концентрации образцов потребуется больше времени.
  5. Восстанавливают эндосомы и другие внутриклеточные везикулы:
    1. Извлеките EID и поднесите его к капоту, чтобы выполнить следующие действия.
    2. Перенесите 200 мкл стерилизованного PBS-буфера в EID с помощью пипетки объемом 200 мкл. Промойте нанопористую мембрану с обеих сторон по 20 раз соответственно.
    3. Соберите эндосомы или другие внутриклеточные везикулы, ресуспендируйте по 200 мкл в пробирке объемом 1,5 мл. Хранить при температуре 4 °C при использовании 24-48 ч, или при -80 °C при длительном хранении.
      Примечание: Элюат содержит эндосомы или другие внутриклеточные везикулы и используется для дальнейшего анализа и совместного культивирования с кардиомиоцитами. Образец эндосом стабилен при хранении при температуре -80 °C в течение 5 месяцев, исходя из полученных данных.
  6. Элюирующие эндосомы и другие внутриклеточные везикулы при ВБ:
    1. Получите идентификатор EID. Перенесите 80 мкл буфера для лизиса WB в EID. Промойте нанопористую мембрану с обеих сторон по 20 раз соответственно.
    2. Инкубируйте EID на льду в течение 30 минут, чтобы обеспечить полную растворимость, буфер для пипеток внутри EID каждые 10 минут. Соберите эндосомы или лизат других внутриклеточных пузырьков в пробирки объемом 1,5 мл. Центрифуга в течение 10 минут при 14 000 × г при 4°C. Соберите и храните надосадочную жидкость при температуре -80 °С для длительного хранения. Выбросьте гранулу, если в трубке осталась гранула.

4. Количественное определение белка эндосомы и характеристика везикул

  1. Вестерн-блоттинг
    1. Сэкономьте 5 мкл из каждого образца для количественного определения концентрации белка с помощью анализа бицинхониновой кислоты (BCA).
    2. Разведите образцы в буфере для образцов 4× Laemmli и тщательно перемешайте путем вортексирования. Нагрейте образцы до 95 °C в течение 10 минут, чтобы денатурировать белки.
    3. Центрифугируйте денатурированные образцы при 14 000 × г в течение 10 мин при 4 °C и соберите полученную надосадочную жидкость для анализа.
    4. Соберите полиакриламидные гели в аппарате для электрофореза и заполните камеру рабочим буфером додецилсульфата натрия (SDS).
    5. Загрузите маркер молекулярной массы и подготовленные образцы белка в гель, выбрав подходящий процент акриламида на основе молекулярной массы целевых белков.
      Примечание: Как правило, 20 г белка загружается в лунку как для лизатов сердечной ткани, так и для лизатов эндосом.
    6. Прогоняйте гель при напряжении 6 В в течение примерно 120 минут или до тех пор, пока фронт красителя не достигнет дна геля.
    7. Переносите белки из геля на мембрану из поливинилиденфторида (PVDF) с помощью системы переноса вестерн-блоттинга.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Метод влажного переноса также хорошо работает.
    8. Кратковременно промойте мембрану PVDF трис-буферным физиологическим раствором, содержащим 0,05% Tween-20 (TBST).
    9. Блокировать мембрану с помощью TBST с добавлением 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) на 1 ч при комнатной температуре.
    10. Инкубируйте мембрану в течение ночи при температуре 4 °C с первичным антителом (Таблица материалов), специфичным для выбранного эндосомального маркера, используя мягкое покачивание.
    11. На следующий день промойте мембрану три раза с помощью TBST, каждая стирка длится 10 минут при комнатной температуре на коромысле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Правильная стирка необходима для уменьшения неспецифического фона; Убедитесь, что мембрана остается полностью увлажненной на протяжении всего процесса.
    12. Инкубируйте мембрану с соответствующим вторичным антителом (Таблица материалов) в течение 1 ч при комнатной температуре.
    13. Промойте мембрану три раза с TBST, каждая стирка длится 10 минут на коромысле при комнатной температуре.
    14. Нанесите хемилюминесцентный субстрат на мембрану для обнаружения белков, связанных с антителами.
    15. Использование системы визуализации геля для экспонирования мембраны и получения изображений белков.
  2. Анализ динамического рассеяния света (DLS)
    1. Размер частиц и дзета-потенциал эндосом измеряют с помощью метода динамического рассеяния света (DLS)17. с помощью Litesizer 500 (Anton Paar) с программным обеспечением Kalliope версии 2.10.4. Измерения DLS выполняются в трех экземплярах с помощью лазера с длиной волны 658 нм и углом обнаружения 90° при 25 °C.
    2. Сделайте разведение «стандартных по размеру наносфер» в ультрачистой воде, добавьте 1 мл объема в одноразовую кювету и поместите ее в камеру.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стандартные наносферы (маленькие или большие) в соответствии с ожидаемым размером неизвестного образца.
    3. Откройте программное обеспечение DLS и перейдите на новую вкладку измерений . Выберите размер частиц в режиме измерения. Назовите файл в поле Без названия и введите входные параметры (растворитель, температура и т.д.), и нажмите на кнопку Пуск. После определения размера стандартных частиц выньте кювету из камеры.
    4. Разбавьте «эталонный материал дзета-потенциала» в ультрачистой воде, поместите его в кювету с дзета-потенциалом омега и поместите в камеру кюветы. Нажмите на вкладку «Новое измерение » в программном обеспечении. Выберите дзета-потенциал в режиме измерения. Назовите файл в поле Без названия и введите входные параметры (растворитель, температура и т.д.), и нажмите на кнопку Пуск.
    5. Для определения размера частиц и дзета-потенциала эндосом разведите образец эндосомы в ультрачистой воде, поместите его в соответствующие кюветы и поместите их в кюветную камеру. Проводите измерения таким же образом, как описано в стандартах.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Произведите разбавление неизвестных образцов в соответствии с концентрацией образцов в ультрачистой воде.
  3. Анализ NanoFCM
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации частиц в эндосомах определяются с помощью NanoFCM Flow NanoAnalyzer с программным обеспечением Professional Suite V2.318. Сбор сигнала частиц осуществляется в течение 2 мин с помощью синего лазера с длиной волны 488 нм, установленного на 20 мВт с затуханием SS на 0,2% и/или красного лазера с длиной волны 638 нм, установленного на 8 мВт с распадом SS на 10%, при давлении дискретизации 1,0 кПа, модулированном и поддерживаемом модулем давления на воздушной основе. Образец фокусируется на длине волны 1,4 мкм с использованием ультрафиолетовой воды в качестве жидкости оболочки с помощью гравитационной подачи. Оптимальная юстировка лазера проверяется и калибруется с помощью гранул контроля качества наносферы кремнезема (S16M-Exo). Калибровочные измерения размеров проводятся перед анализом с использованием стандартных гранул размера S16M-Exo (коктейль наночастиц кремнезема, содержащий диаметры частиц 68, 91, 113 и 155 нм с известной концентрацией 2,17 × 10)10/мл).
    1. Получение стандарта концентрации:
      1. Запуск и инициализация флюидики nanoFCM. Разбавьте шарики QC (1:100) в ультрачистой воде, отфильтрованной мембраной 0,22 мкм, добавьте в пробирку объемом 0,5 мл и поместите в загрузочную площадку. Выберите QC FL SiNPs в раскрывающемся меню Sample Inf и введите коэффициент разбавления образца шариков QC.
      2. В раскрывающемся меню Sample Flow (Поток пробы ) выберите Boosting, чтобы ввести пробу контроля качества с высокой скоростью и удалить чистящий раствор из системы на 45 секунд. Во время усиления установите мощность лазера на 20/50 мВ для синего лазера с длиной волны 488 нм и 20/100 мВт для красного лазера с длиной волны 638 нм, с распадом SS на 0,2%.
      3. Выберите выборку в раскрывающемся меню «Поток выборки » и выполните настройку пороговых значений для большого сигнала. Во время отбора проб отрегулируйте юстировку конденсационной линзы сигнала вручную и юстировку линзы лазерной фокусировки из программного обеспечения, если это необходимо. Автоматическая регулировка порога для большого сигнала должна оставаться в диапазоне от 50 до 120 для бокового канала рассеяния и менее 75 для обоих каналов флуоресценции.
      4. Нажмите кнопку Время для записи, чтобы получить данные за 120 с. При получении данных убедитесь, что интересующая область (ROI) находится в диапазоне 1500–15000. Сохраните файл результата во всплывающей папке с расширением "nfa" и выгрузите пробирку с образцом.
        ПРИМЕЧАНИЕ: После каждого прогона используйте чистящий раствор (1x) для удаления обработанного образца из трубки, повышая ее давление в течение 45 секунд. Затем окуните наконечник капилляра в сверхчистую воду, чтобы удалить остатки чистящего раствора с внешней стороны капилляра перед загрузкой следующего образца.
    2. Стандартный размер комплектации:
      1. Разбавьте «бусины стандартного размера» (1:100) в воде, отфильтрованной мембраной, 0,22 мкм и поместите в погрузочную площадку. Выберите 68-155 S16M-Exo из выпадающего меню Образец Inf и введите коэффициент разбавления стандартного размера образца шариков.
      2. В раскрывающемся меню «Поток образца » выберите «Форсирование», чтобы ввести валики стандартного размера и удалить чистящий раствор из системы на время 45 с. Во время усиления установите мощность лазера на 8/50 мВ для синего лазера с длиной волны 488 нм и 20/100 мВт для красного лазера с длиной волны 638 нм, с 10% распадом SS.
      3. Выберите «Дискретизация » в раскрывающемся меню «Поток выборки » и выполните настройку пороговых значений для небольшого сигнала. В окне должны быть видны четыре четко выраженных пика (68 нм, 91 нм, 113 нм, 155 нм). Нажмите кнопку Время для записи , чтобы получить данные за 120 с. Сохраните файл результата во всплывающей папке с расширением "nfa" и выгрузите пробирку с образцом.
    3. Заготовка стандартного комплектования:
      1. Используйте сверхчистую воду или (буфер/разбавитель образца) для проведения измерения в том же процессе, что и описанный выше, сохраните файл с именем "blank" в папке с расширением "nfa" и выгрузите пробирку с образцом.
    4. Определение концентрации частиц в эндосомах
      1. Разведите образец эндосомы в сверхчистой воде и поместите его в загрузочную площадку.
      2. После повышения давления и отбора проб нажмите «Время записи », чтобы начать измерения. Если пороговое значение не находится в диапазоне 50-120 для бокового канала рассеяния, или ROI больше 15 000, то рассмотрите возможность разбавления выборки.
    5. Анализ данных:
      1. Переключитесь с вкладки «Получение » на вкладку «Анализ » в программном обеспечении и откройте сохраненные файлы «nfa». Установите стандарт концентрации, открыв сохраненный файл результатов контроля качества date__QC FL SnNPs.nfa, установите порог для большого сигнала, нажав на инструмент установки порога.
      2. Выберите концентрацию частиц с помощью инструмента стробирования по кругу. Нажмите Подсчитать STD и проверьте концентрацию шариков контроля качества (2,17 ×10 10/мл) перед закрытием окна.
      3. Чтобы установить стандарт размера, откройте файл date_68-155 S16M-Exo.nfa. Нажмите на инструмент Размер , чтобы открыть окно создания стандартной кривой, и установите порог для малого сигнала, нажав на инструмент установки порога.
      4. Выберите S16 exo 68-155 nm в раскрывающемся меню «Определено пользователем». Щелкните Найти пики, чтобы определить пиковые интенсивности SS четырехразмерных популяций.
      5. Выберите пустой файл и нажмите « Установить пустой », чтобы определить количество ложных срабатываний для удаления образца. Чтобы проанализировать концентрацию эндосом, сначала выберите образец и установите порог для небольшого сигнала, нажав на инструмент установки порога. Представьте количественные данные в виде отчета о размере (нм) и концентрации (частицы/мл).

5. Посев первичных кардиомиоцитов

ПРИМЕЧАНИЕ: Изолируйте кардиомиоциты с помощью набора для выделения первичных кардиомиоцитов, который обеспечивает достаточное количество реагентов для выделения кардиомиоцитов из 50 неонатальных сердец мышей или крыс. В набор также входят компоненты, которые подходят для поддержки первичной культуры кардиомиоцитов. Все среды и буферы следует удалять с осторожностью, чтобы не повредить клетки. Рекомендуется ручное пипетирование с помощью наконечника для дозатора объемом 1000 мкл, следует избегать вакуумной аспирации. Сбалансированный солевой раствор Хэнка (HBSS) должен быть предварительно охлажден до 4 °C перед началом процедуры.

  1. Восстановите фермент выделения кардиомиоцитов 1 (содержащий папаин), доступный в наборе, добавив 2. мл охлажденного HBSS на один флакон. Аккуратно перемешивайте в течение примерно 5 минут или до полного растворения фермента. Держите ферментный раствор на льду на протяжении всей процедуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Одного флакона восстановленного фермента 1 достаточно для выделения кардиомиоцитов из 10 неонатальных сердец. Он может храниться при температуре -20 °C до 6 месяцев и стабилен в течение двух циклов замораживания-оттаивания. При хранении при температуре 4 °C раствор следует использовать в течение 1 недели для обеспечения ферментативной активности.
  2. Поместите только что рассеченные неонатальные сердца в индивидуальные стерильные 1. mL микроцентрифужных пробирок и немедленно добавить 500 μL ледяного HBSS в каждую пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется обрабатывать одно сердце на трубку для максимального выхода и воспроизводимости.
  3. Измельчите сердечную ткань на фрагменты размером 1 мм³ с помощью стерильных ножниц для вскрытия. Дважды промойте каждый образец 500 мкл ледяного HBSS, чтобы удалить остаточную кровь.
  4. В каждую пробирку добавьте 200 мкл восстановленного фермента выделения кардиомиоцитов 1 (папаин) и 10 мкл фермента 2 для выделения кардиомиоцитов (содержащего термолизин), доступного в наборе. Аккуратно перемешайте и инкубируйте пробирки при температуре 37 °C в течение 30-35 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фермент выделения кардиомиоцитов 2 поставляется в виде суспензии в HBSS и должен быть разморожен на льду перед использованием. Гомогенизируйте фермент путем пипетирования вверх и вниз, чтобы обеспечить однородную суспензию перед добавлением в образцы.
  5. После ферментативного разложения тщательно отсадите ферментный раствор и дважды промойте каждый образец 500 μL ледяного HBSS.
  6. Добавьте мл полного DMEM для выделения первичных клеток в каждую пробирку. Аккуратно растирайте ткань, пипетируя вверх и вниз 25–30 раз с помощью стерильного наконечника для дозатора объемом 1,0 мл. Сведите к минимуму образование пузырьков воздуха во время этого этапа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разрушение тканей путем пипетирования повышает выход клеток. Однако чрезмерное пипетирование может привести к повреждению клеток.
  7. Центрифугировать надосадочную жидкость при 300 × г в течение 5 мин.
  8. Осторожно извлеките Complete DMEM с помощью пипетки. Добавьте 1 мл свежего Complete DMEM в пробирку и проведите пипеткой вверх и вниз 25–30 раз с помощью стерильного наконечника для дозатора объемом 1,0 мл. Избегайте образования пузырьков воздуха при пипетировании.
  9. После того как ткань представляет собой преимущественно одноклеточную суспензию, добавьте 0,5 мл Complete DMEM для выделения первичных клеток в каждую пробирку, чтобы довести общий объем до 1,5 мл. Комбинируйте отдельные клеточные суспензии для определения концентрации и жизнеспособности клеток.

6. Совместное культивирование эндосомы с кардиомиоцитами

  1. Высадите кардиомиоциты в чашку диаметром 60 мм и добавьте Complete DMEM к общему объему.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Предполагается, что каждое неонатальное сердце мыши будет засеяно в одну чашку, а общий объем каждой лунки должен составлять 5 мл (Рисунок 1B).
  2. Инкубируйте чашку диаметром 60 мм при температуре 37 °C в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 в течение 24 часов. Через 24 ч замените среду эквивалентным объемом свежего полного DMEM для выделения первичных клеток, содержащего добавку для роста кардиомиоцитов, разведенную в 1000 раз.
  3. Переведите полученный на этапе 3 элюат эндосомы с -80 °C до -20 °C на 1 ч. Затем положите эндосомы на лед и постепенно размораживайте их.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Постепенное оттаивание на льду может сделать мембрану эндосом более интактной и уменьшить деградацию.
  4. Через 48 ч смешайте каждые 100 мкл элюата эндосомы с 5 мл свежего полного DMEM и замените старую среду в каждой чашке. Совместное культивирование эндосом с кардиомиоцитами в течение 24 ч.
  5. Промойте кардиомиоциты 2 мл холодного стерильного PBS. Добавьте ледяной буфер для лизиса в каждую чашку с буфером для лизиса 80-100 мкл. Соскребите клетки с помощью холодного пластикового скребка для клеток и соберите их в пробирки объемом 1,5 мл.
  6. Выполните протокол WB, описанный в шаге 4.1.
  7. Для иммуноокрашивания (ЕСЛИ) выполните описанные ниже действия.
    1. Затравите кардиомиоциты в 8-луночную камеру предметного стекла. Одноклеточную суспензию разбавляют готовой DMEM от 1,5 мл до 3 мл.
    2. Засейте по 300 мкл суспензии в каждую камеру. Повторите шаги 6.2-6.4.
    3. Зафиксируйте кардиомиоциты с 200 мкл 4% параформальдегида (PFA) на 20 мин при комнатной температуре и трижды промойте 200 μL стерильного PBS. Затвор с 8-луночной камерой готов к ИФ.
      ВНИМАНИЕ: При работе с 4% PFA, пожалуйста, надевайте соответствующие СИЗ. Пожалуйста, выбросьте 4% PFA в надлежащий контейнер после использования.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы изучили уровни экспрессии маркеров ранних эндосом, поздних эндосом, лизосом и аутофагосом в пяти группах: лизат сердечной ткани, ядерная фракция, митохондриальная фракция, другие внутриклеточные везикулы с этапа 2.6 и этапа 3.6 и эндосомы с этапа 2.5 и этапа 3.6. Результаты вестерн-блоттинга показали, что EEA1 (ранний эндосомный антиген 1) имеет самый высокий уровень экспрессии в эндосомах и почти не экспрессируется в других группах (рис. 2A, B). Rab7 также экспрессировал...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании мы представляем быстрый и воспроизводимый метод выделения эндосом высокой чистоты из сердечных тканей мышей путем сочетания субклеточного фракционирования со сверхбыстрой изоляционной платформой14. Традиционные подходы к выделению эндосом, такие как центрифугирование с градиентом плотности12 или иммунная изоляция, часто являются трудоемкими и требуют большого количества тканей или специализированных антител. Интегриров...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана следующими грантами: грант Национального института сердца, легких и крови 2R01HL121700-06A1 и R01HL172834-01 M.W., грант Американской кардиологической ассоциации 24TPA1303770 и грант 25EIA1422015 M.W. US EPA84045701 X.L.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
&микро;-Горка 8 Хорошо высокаяТам же80806-90
Мерная микроцентрифужная пробирка объемом 1,5 млСША Сайентифик1615-5500
10x Трис/Глицин БуферБио Рад1610734
4x Буфер для образцов LaemmliБио Рад1610747
Настольная центрифугаЭппендорфЦентрифуга Eppendorf 5810R
Бычий сывороточный альбумин СигмаА9418
Сетчатый фильтр для ячеекКорнингCLS431750Размер пор 40  μ м, стерильный
Чашки для культивирования тканей CELLSTARВВР82050-546Полистирол, стерильный, 60 мм и острый; 15 мм
Система визуализации ChemiDocБио РадChemiDoc XRS+
Чистящий растворНаноФСМ17159
DMEM для Pierce Наборы для выделения первичных клетокНаучный центр ФишераPI88287
ДТТНаучный центр ФишераБП172
Дульбекко s фосфатно-солевой буфер (PBS)Термо Сайентиал10010023
Реагент для детектирования вестерн-блоттинга ECLБио Рад1705061
ЭДТАСигмаЕ4884
ЕЭА1Клеточная сигнализация3288СWB (1:1000)
ЭГТАСигмаЕ-4378-25
ИДИСХОДMA03 EID
ЭРп72Клеточная сигнализация5033СWB (1:1000)
ЭтанолИсследовательский магазин UH200 пруф, 5 галлонов
ИСХОДУС Н-600ИСХОДН-600
ГАПДХПротеинтек10494-1-АПWB (1:5000)
Хэнк s сбалансированный солевой раствор (HBSS)Термо Сайентиал14175095
ХЕПЕССигмаН3375
ГомогенизаторНаучный центр Фишера15340167
KClСигмаП3911
Лампа1АбкамАБ320851ВБ (1:2000)
ЛК3Клеточная сигнализация2775СWB (1:1000)
Лайтсайзер 500 Антон ПаарЛайтсайзер 500Другое оборудование, такое как Zetasizer (Malvern) или DLS  (Wyatt) можно использовать
mCherryБиорбыторб66657WB (1:500)
MgCl2Научный центр ФишераБП214-500
NaClСигмаС7653
НаноФСМНаноФСМНаноанализатор расхода
Стандарты размеров наносферТермо Сайентиал3020А
Конфокальный микроскоп Nikon AXRКомпания NikonАХР
Раствор параформальдегида 4% в PBSСанта Крус БиотехнологииСК-281692
Зонды для мечения фаллоидинаИнвитрогенА22284ЕСЛИ (1:500)
Наборы для анализа белка Pierce BCAТермо Сайентиал23227
Набор для выделения первичных кардиомиоцитов PierceТермо Сайентиал88028
Полиэфирсульфоновый шприцевой фильтрМногородностьSLHPR33RSРазмер пор 0.45  μ м, стерильный
Сборные протеиновые гелиБио Рад4561093
Бусины для контроля качестваНаноФСМQS2503
Раб7Клеточная сигнализация9367СWB (1:1000)
Буфер для лизиса и экстракции RIPAТермо Сайентиал89900
Рош ФосСТОП (Коктейль ПИ)Рош4906837001
Наносферы диоксида кремнияНаноФСМС16М-Экзо
СахарозаСигма84097
Ротор с качающимся ковшомБекман КоултерСВ55Ти
Trans-Blot Turbo Transfer System RTA Transfer KitБио Рад1704270
Подросток 20Био Рад1662404
УльтрацентрифугаБекман КоултерОптима ХЕ-90
Ультрацентрифужные пробирки Бекман Коултер326819
Ультразвуковая чистящая ваннаБрэнсон УльтразвукCPX952238R
VWR Tube Cent 50 млВВР89039-656
Центрифуга для трубок VWR 15 млВВР89039-666
Справочный материал по дзета-потенциалуАнтон Паар175108

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cullen, P. J., Steinberg, F. To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling. Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 679-696 (2018).
  2. Gould, G. W., Lippincott-Schwartz, J. New roles for endosomes: from vesicular carriers to multi-purpose platforms. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (4), 287-292 (2009).
  3. Bissig, C., Gruenberg, J. Lipid sorting and multivesicular endosome biogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (10), a016816(2013).
  4. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
  5. Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. The autophagosome: origins unknown, biogenesis complex. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 759-774 (2013).
  6. Singh, J., et al. Endosome transcriptomics reveal trafficking of Cajal bodies into multivesicular bodies. bioRxiv. , (2025).
  7. Scott, C. C., Gruenberg, J. Ion flux and the function of endosomes and lysosomes: pH is just the start: the flux of ions across endosomal membranes influences endosome function not only through regulation of the luminal pH. Bioessays. 33 (2), 103-110 (2011).
  8. Lopez-Verrilli, M. A. Exosomes: mediators of communication in eukaryotes. Biol Res. 46 (1), 5-11 (2013).
  9. Corbeil, D., et al. Uptake and fate of extracellular membrane vesicles: nucleoplasmic reticulum-associated late endosomes as a new gate to intercellular communication. Cells. 9 (9), 1931(1931).
  10. Curran, J., et al. EHD3-dependent endosome pathway regulates cardiac membrane excitability and physiology. Circ Res. 115 (1), 68-78 (2014).
  11. Kapustin, A. N., et al. Vascular smooth muscle cell calcification is mediated by regulated exosome secretion. Circ Res. 116 (8), 1312-1323 (2015).
  12. Marsh, M., et al. Rapid analytical and preparative isolation of functional endosomes by free flow electrophoresis. J Cell Biol. 104 (4), 875-886 (1987).
  13. de Araújo, M. E., Lamberti, G., Huber, L. A. Isolation of early and late endosomes by density gradient centrifugation. Cold Spring Harb Protoc. 2015 (11), 1013-1016 (2015).
  14. Chen, Y., et al. Exosome detection via the ultrafast-isolation system: EXODUS. Nat Methods. 18 (2), 212-218 (2021).
  15. Miao, L., et al. Cardiomyocyte orientation modulated by the Numb family proteins-N-cadherin axis is essential for ventricular wall morphogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (31), 15560-15569 (2019).
  16. Miao, L., et al. The spatiotemporal expression of Notch1 and Numb and their functional interaction during cardiac morphogenesis. Cells. 10 (9), 2192(2021).
  17. Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-what they are and what they are not. J Control Release. 235, 337-351 (2016).
  18. Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Rev Rep. 18 (3), 1067-1077 (2022).
  19. Wilson, J. M., et al. EEA1, a tethering protein of the early sorting endosome, shows a polarized distribution in hippocampal neurons, epithelial cells, and fibroblasts. Mol Biol Cell. 11 (8), 2657-2671 (2000).
  20. Dumas, J. J., et al. Multivalent endosome targeting by homodimeric EEA1. Mol Cell. 8 (5), 947-958 (2001).
  21. Bucci, C., et al. Rab7: a key to lysosome biogenesis. Mol Biol Cell. 11 (2), 467-480 (2000).
  22. Langemeyer, L., Fröhlich, F., Ungermann, C. Rab GTPase function in endosome and lysosome biogenesis. Trends Cell Biol. 28 (11), 957-970 (2018).
  23. Wang, C., et al. Investigation of endosome and lysosome biology by ultra pH-sensitive nanoprobes. Adv Drug Deliv Rev. 113, 87-96 (2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи