Методическая статья

Пространственная молекулярная визуализация гликома с помощью масс-спектрометрии

1.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69154

⸱

28 ноября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Advanced Spatial Biomolecule Research (CASBR), University of Florida, Gainesville, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Florida, Gainesville, 3Markey Cancer Center, University of Kentucky, 4Department of Pathology & Laboratory Medicine, University of Kentucky

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол подробно описывает ключевые шаги для обеспечения строгого и воспроизводимого измерения как гликогена, так и N-связанных гликанов с помощью масс-спектрометрической визуализации.

Аннотация

Пространственная организация гликома внутри тканей является ключом к молекулярной основе физиологической функции. Разнообразный и динамичный гликом критически важен для фундаментальных клеточных процессов, включая метаболизм, передачу сигналов и адгезию. Инновации в пространственной биологии открыли новые возможности для пространственной молекулярной визуализации различных классов гликомов. Здесь мы описываем оптимизированный протокол пространственной биомолекулярной визуализации гликома в свежезамороженной печени мыши. Рабочий процесс включает (1) быструю сборку и заморозку, (2) секционирование криостатом с оптимальной толщиной и положением, (3) подготовку тканей и переваривание ферментов на тканях с использованием ферментов, активных углеводов, (4) применение и сбор данных с помощью лазерной масс-спектрометрии с помощью масс-спектрометрии с помощью матрицы (MALDI-MSI), а также (5) обработку и визуализацию данных для размещения результатов в биологическом контексте. Использование этого подхода позволяет получить подробные пространственные карты N-связанных гликанов и гликогена, выявляя ключевые физиологические и клеточные особенности. Эти данные позволяют определить ключевую пространственную гликомную гетерогенность, связанную с функцией и дисфункцией печени. Этот рабочий процесс позволяет создавать высоковоспроизводимые и чувствительные пространственные гликомы печени мыши. Кроме того, он легко адаптируется к другим тканям или видам, что позволяет получить новые пространственные представления о биологии гликома в области здоровья и болезней.

Введение

Область пространственной биологии быстро расширяется, предоставляя критические представления о динамической пространственной биомолекулярной сложности живых организмов. Используются различные подходы для изучения различных биомолекул в биологическом контексте. Хотя некоторые из них являются высокоспециализированными методами, масс-спектрометрия (РС) стала важным универсальным методом для количественной оценки широкого спектра биомолекул в контексте клеток, тканей или организмов.

Масс-спектрометрия масс-спектрометрии с помощью матричного лазера с помощью лазерной десорбции/ионизации (MALDI-MSI) — одна из новых общих методов мультиомической пространственной биомолекулярной визуализации. Изначально он был создан для визуализации белков и пептидов в срезахтканей 1. С тех пор он был распространён на множество различных биологических образцов имолекул 2. Метод можно применить к клеточнымобразцам 3,органоидам 4, моделямживотных 5 и образцампациентов 6,7. Некоторые молекулярные классы можно напрямую измерять с помощью методов на основе MSI, включая множество метаболитов и липидов, в то время как другие более сложные биомолекулы, такие как белки и гликаны, требуют ферментативного или химического обработки, чтобы быть пригодными для обнаружения на основеMSI 2,8.

MALDI-MSI также применялся для пространственного анализа N-связанных гликанов и гликогена, используя рабочие процессы, требующие ферментативной обработки для получения фрагментов гликана, подходящих для обнаруженияMSI 9,10,11,12,13,14,15. N-гликаны отделяются от остатка аспарагина белков с помощью PNGase F, а глюкозные цепи гликогена расщепляются изоамилазой. Ключевые преимущества анализа гликогена MALDI заключаются в пространственном определении распределения гликогена в биологическом образце, относительной количественной оценке и информации о ветвлении глюкозных цепей. Поскольку рабочие процессы для N-гликанов и гликогена требуют ферментативной обработки образца для анализа MSI, они были объединены в интегрированный рабочий процесс для анализа гликома (рисунок 1A). Этот рабочий процесс требует тщательной подготовки биологических образцов и специальной обработки для проведения анализа гликома с помощью MS, а затем сбора и обработки данных. Хотя рабочий процесс требует серии специализированных этапов, он создаёт богатые, высококачественные пространственные гликомные данные, которые высоковоспроизводимы и могут быть адаптированы к различным типамобразцов 16. Кроме того, рабочий процесс является модульным, так что этапы обработки образцов могут выполняться независимыми исследовательскими лабораториями перед передачей образцов в специализированные учреждения, выполняющие последние этапы сбора и анализа данных MALDI-MSI.

Протокол

Это исследование проводилось в соответствии с руководящими принципами институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) Университета Флориды. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Сбор печени

  1. Эвтаназия и вскрытие животных
    1. Проведите вывих шейки матки и обезглавливание для эвтаназии мыши (согласно утверждённым институциональными протоколами).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого примера использовалась 6-месячная мышь дикого типа C57BL/6J. В этом возрасте вес мышей составляет ~25-33 г. Для такого анализа подходит широкий спектр возрастов, размеров и сортов.
    2. Немедленно положите животное на впитывающую подкладку и обнажите брюшную полость стерильным скальпелем.
    3. С помощью стерильных щипцов и ножниц изолировать печень с минимальными манипуляциями и повреждением тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Метаболические изменения происходят быстро. По возможности избегайте перфузии или седации и следите за тем, чтобы этапы вскрытия выполнялись как можнобыстрее 17.
  2. Быстро смойте и почистите салфетку.
    1. Аккуратно окуните печень в 1x физиологический раствор с фосфат-буфером (PBS), чтобы удалить всю кровь.
    2. Окуните ткань в деионизированную (DI) воду дважды.
    3. Промокните лишнюю воду, аккуратно коснувшись салфеткой чистого дворника.
      ПРИМЕЧАНИЕ: образцы, превышающие размер стандартного микроскопического стекла, следует разрезать на части перед заморозкой.
  3. Замораживание образцов
    1. Поместите очищенную печень прямо в предварительно охлаждённую одноразовую судно для полистирола, плавающую на жидком азоте.
    2. Когда ткань меняет цвет на блестящий, непрозрачный, примерно 3 минуты, затем положите ткань в готовые и подписанные пакеты из алюминиевой фольги на сухом льду.
    3. Поместите пакеты с алюминиевой фольгой с образцами в морозильник при температуре -80 °C для хранения. Образцы можно хранить длительное время при -80 °C.

2: Подготовка биологического образца

  1. Подготовка к криосекции
    1. Убедитесь, что криостат включён и уравновешен до температуры, подходящей для ткани, от -16 °C до -20 °C. Точная температура зависит от типа ткани. Печень следует секционировать при немного более высокой температуре, примерно при -16 °C до -17 °C, чтобы предотвратить разрывы тканей, а другие ткани — при -20 °C.
    2. Убедитесь, что в криостате есть как минимум два патрона, две тонкие кисточки, пара тонких пинцетов и стеклянная вставка диаметром 70 мм при температуре криостата. Кроме того, перед тем, как поместить их в криостат, наклейте клейки карандашом для акклиматизации.
    3. Перенесите ткани из морозильника при температуре -80 °C в криостат на сухом льду.
    4. Дайте тканям привыкнуть к температуре криостата не менее 30 минут.
    5. Убедитесь, что край стеклянной вставки не повреждён и что он гладкий в месте соприкосновения ткани с направляющим стабилизатором, проведя перчаткой пальцем по краю.
    6. Вставьте стеклянную вставку в направляющую стабилизатора крена.
    7. Возьмите низкопрофильное лезвие, аккуратно вставьте его в открытый держатель лезвий и закройте его. Положите красную защиту лезвия поверх лезвия до разрезания.
    8. Закрепите салфетку на патроне с помощью монтажного материала M1, который совместим с MS. Поместите монтажное средство M1 комнатной температуры на патрон внутри криостата, закрывая не менее двух кольц, чтобы ткань была закреплена на месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При криосекции часто используется соединение с оптимальной температурой резки (OCT); однако она вызывает подавление ионов в приложениях MS и должна избегаться. Если необходимо использовать OCT, то следует использовать дополнительный многоступенчатый протокол для минимизации или удаления OCT. Кроме того, некоторые ресурсные центры MS не анализируют образцы, встроенные в OCT.
    9. Возьмите охлаждённый пинцет и удалите ткань из алюминиевой фольги. С помощью пинцета разместите ткань на патроне в нужном положении.
    10. Поставьте патрон в криостат, чтобы крепящий материал замёрз примерно на 2 минуты. После заморозки он затвердеет и будет выглядеть непрозрачным.
  2. Криосецирование ткани печени
    1. Положите патрон с крепленной тканью в держатель патрона. Расположите патрон так, чтобы ткань резала под углом 90° к лезвию.
    2. Втяните держатель патрона, пока ткань не перестанет контактировать с лезвием. Медленно вводите патрон, пока ткань не окажется непосредственно рядом с лезвием, чтобы начать секционирование.
    3. Начните секцию с разрезом толщиной 30 мкм, чтобы удалить нежелательные ткани.
    4. Убедитесь, что глубина прокатной пластины создаёт гладкий участок, и ткань не накатывается поверх пластины. Если это так, то немного ослабьте прокатную пластину. Если ткань сдвинет пластину и ударит по ней во второй раз при сбросе вращения, слегка затяните пластину для прокатки.
    5. По мере приближения желаемого участка уменьшайте предполагаемую толщину среза до 10 мкм или другой желаемой толщины для конкретного применения.
    6. Сделайте 10 оборотов, чтобы патрон был нужной толщины, чтобы избежать задержки и неровных участков.
    7. Используйте охлаждённую кисть, чтобы очистить сцену в подготовке к разделке на секции. Закройте роликовую пластину над лезвием и медленно возьмите участок ткани.
    8. Поднимите рулонную пластину и используйте две охлаждённые тонкие кисти, чтобы аккуратно отодвинуть участок от лезвия. Отодвините секцию в сторону сцены для удобства установки на горку.
    9. Возьмите охлаждённый слайд из переноски в криостате и положите указательный палец на противоположную сторону затвора, где ткань будет находиться на 10 секунд.
    10. Аккуратно опустите слайд на ткань и поднимите её обратно. Не давите сильно, так как это может порвать ткань. Ткань должна плавиться на стекле и стать полупрозрачной.
    11. Быстро перенесите затворы в сушитель для сушки. Сушите затвор в десикаторе на 1 час.
    12. После высыхания стекли могут быть непосредственно обработаны для MS или вакуумно запечатаны и хранятся при -80 °C.

3. Подготовка слайда для MSI гликомики

  1. Подготовка ферментов
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лиофилизированный PNGase F с низким содержанием соли можно приобрести и использовать напрямую.
    1. Изоамилаза требует диализа для удаления избыточной соли при применении при рассеянном склерозе. Подготовьте одну или несколько диализаторов, поместив их в воду с ВЭЖХ на 15 минут.
    2. Диализировать 200 мкл стандартной изоамилазы с помощью диализа 500 мкл в 14,3 мл воды ВЭЖХ в течение 2 часов при 4 °C, не перемешивая. Замените 14,3 мл воды для HPLC на свежую воду HPLC и проведите диализ ещё 16 часов (ночью) при 4 °C. Замените 14,3 мл воды для ВЭЖХ на свежую воду для HPLC и проведите диализ ещё 8 часов при 4 °C.
    3. Аккуратно вынимите изоамилазу из чашки пипеткой и поместите её в микроцентрифугную трубку на 1,5 дюйма. Измерьте общий объём раствора изоамилазы после диализа (в мкл). Исходя из начальной активности запаса, обычно 200 единиц/мл, и итогового объёма рассчитывается общий объём, необходимый для 3 единиц изоамилазы.
    4. Пипетные аликвоты 3 единиц изоамилазы помещаются в тонкостенные ПЦР-трубки. Зажимать заморозочные трубки в жидком азоте. Храните при -80 °C. Для каждого протокола распыления можно использовать одну трубку раствора диализированной изоамилазы, чего хватает для четырёх слайдов. Избегайте циклов замораживания и оттаивания, чтобы поддерживать активность ферментов.
  2. Фиксация и промывка тканей
    1. Поместите слайды в держатель для затвора и погрузите в стеклянную ёмкость, наполненную 10% нейтрально буферированным формалином (NBF) на 1 час.
    2. Снимите слайды с NBF. Погружать шлаги в 70% этанола на 2 часа.
    3. Приготовьте четыре банки Coplin с этанолом 70%, 80%, 90% и 100%. Чётко маркируйте каждую банку, чтобы избежать путаницы при последовательной стирке.
    4. Последовательно переносите слайды следующим образом: 70% этанол в течение 5 минут, 80% этанол в течение 5 минут, 90% этанол в течение 5 минут, 100% этанол в течение 5 минут.
    5. Перенесите слайды в стеклянную чашку Петри, наполненную свежим 100% ксилолом. Убедитесь, что слайды полностью погружены под воду. Инкубировать слайды на шейкере со скоростью 70 об/мин в течение 1 часа, в зависимости от содержания липидов в ткани. Повторяйте этот шаг ещё два раза, используя свежий ксилол для каждой мойки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол разработан для обеспечения максимальной делипиды, поскольку известно, что липиды приводят к подавлению ионов и, следовательно, к максимальной воспроизводимости. Однако это приводит к делокализации сигналов, тем самым снижая возможное разрешение. Сокращение этапов мытья, ограничение времени обработки и тщательный контроль влажности могут снизить делокализацию и, следовательно, улучшить разрешение данных.
    6. Поместите слайды в сушитель на ночь, чтобы они высохли.
    7. Поставьте стекли с 70% этанола на 1 минуту для восстановления воды. Поместите слайды в воду DI на 3 минуты. Повторите промывку DI-водой свежей DI-водой.
    8. Сушите стекли в десикаторе 10 минут или пока полностью не высохнут.
  3. Подготовка слайдов для нанесения ферментов
    1. Подготовьте камеру влажности HTX к инкубации, положив под металлическую стойку бумажное полотенце, пропитанное водой DI. Поместите камеру в инкубатор при температуре 37 °C.
    2. Приготовьте пароварку, наполнив резервуар сверху водопроводной водой. Установите таймер на 60 минут, чтобы включить устройство.
    3. Подготовьте цитракониновый буфер, добавив 50 мл воды ВЭЖХ, 25 мкл цитраконианангида и 2 мкл 12 м HCl в трубку Falcon объёмом 50 мл. Используйте раствор в вихрь на 10 секунд, чтобы тщательно перемешать. Каждая 50 мл центрифугной трубки цитракона-буфера достаточно для четырёх слайдов. Убедитесь, что pH раствора — 3,0 (допустимый диапазон: 2,5-3,5).
    4. Заполните каждую почту подготовленным цитраконическим буфером. Разместите стекло так, чтобы ткань была обращена внутрь, чтобы предотвратить соприкосновение тканей с боками и обеспечить эффективное извлечение антигена. На каждый лист можно использовать по два слайда, используя оба положения краёв, при этом обе стекли имеют ткани, обращённые внутрь.
    5. Проверьте, что пар выделяет пар. Положите рассылки в пароварку и инкубуйте 30 минут.
    6. Перенесите рассылки в водяную ванну DI на 5 минут. Замените половину цитракониевого буфера в рамейлере на DI-воду и дайте постоять ещё 5 минут. Повторите это разбавление ещё два раза.
    7. Удалите весь растворитель и помойте стеклы, добавив 100% DI-воду в рассылку, а затем уберите DI-воду. С помощью лабораторной салфетки просушите пятна вокруг мест, где ткани отсутствуют.
    8. Нарисуйте круг и треугольник на обратной стороне каждого слайда, чтобы обозначить внутренние стандартные места. Нанесите 1 мкл 1 мг/мл пероксидазы хрена (HRP; круг) и 1 мкл 10 мг/мл гликогена (треугольник) кросличьего печени (треугольник) на переднюю часть затвора.
    9. Поставьте слайды в сушитель на 15 минут, чтобы полностью высохли.
  4. Распыление ферментами и пищеварение
    1. Удалите одну трубку с лиофилизированной PNGазой F с концентрацией 100 мкг и одну трубку изоамилазы 3 единиц и дайте разморозить 10 минут. Спин-трубки при ~2000 x г в течение 5 секунд в микроцентрифужной трубке. Этого фермента достаточно, чтобы распылять 4 слайда.
    2. Пипетте 50 мкл DI воды в каждую лиофилизированную трубку PNGase F, плавно вихрь в течение 10 секунд и вращение в микрофуге при ~2000 x г в течение 5 секунд. Пипетировать раствор 50 мкл PNGase F непосредственно в изоамилазную трубку. Добавьте воду из ВЭЖХ в итоговый объём 1 мл.
    3. Вихрь микроцентрифугу с двойным ферментом в течение 10 секунд и вращение вниз при ~2000 x g в течение 5 секунд.
    4. Включите распылитель HTX M5 и откройте программное обеспечение HTX M5. Убедитесь, что тип лотка установлен на Ambient во вкладке System .
    5. Выключите насос Кнауэра, нажав кнопку стопа на передней правой стороне. Включите внешний шприцовый насос с помощью переключателя на задней панели.
    6. В программном обеспечении HTX, во вкладке «Методы », выберите подходящий метод для двойного ферментного распыления. Параметры должны быть установлены: температура сопла 45 °C, 15 проходов, расход 0,025 мл/мин, скорость 1200 мм/мин, расстояние между путями 3 мм, схема CC, давление 10 psi, расход газа 3 л/мин и высота сопла 40 мм.
    7. Перейдите к вкладке «Температура » и установите температуру сопла на 45 °C. Используйте ключ, чтобы переместить трубку распылителя к верхнему разъёму.
    8. Откройте сверхчистый азотный газовый клапан и убедитесь, что давление распылителя составляет 10 psi. На шприцовом насосе установите расход на 95 мкл/мин.
    9. Используя свежий шприц и иглу, наполните водой для HPLC объемом 4 мл. Удалите все пузырьки. Пропустите 2 мл воды через участок линии распылителя толщиной ~6 дюймов в стекал для отходов.
    10. Подключите шприц к линии распылителя и пропустите воду через шприцовый насос, запустив и запустив при 95 мкл/мин в течение 5 минут.
    11. Во время промывки насоса шприца приклейте стекли к нижнему левому углу нагреваемого лотка с помощью металлической направляющей для выравнивания, чтобы ткань находилась в области распыления. Во вкладке «Образцы » определите параметры X и Y для области распыления, что позволит небольшое перераспыление и обеспечить полное покрытие затвора.
    12. Через 5 минут поставьте насос на паузу, отсоедините шприц, втяните в него воздух, а затем пропустите воздух через трубку распылителя, чтобы очистить остатки воды. Повторяйте по необходимости.
    13. Загрузите раствор с двойным ферментом в новый шприц и подключите к насосу, убедитесь, что пузырьки не остаются.
    14. Подключите шприц к линии распылителя. На шприцовом насосе отрегулировать расход до 25 мкл/мин.
    15. Когда распылительное сопло достигнет 45 °C, нажмите «Старт » под вкладкой «Цикл ». Нажмите «Нет » при включении насоса Кнауэра. Нажмите «Старт » на шприцовом насосе, чтобы начать распылять.
    16. Поставьте пустой затвор под насадку для распылителя, чтобы убедиться в видимом осадке ферментного распыления. После наблюдения нажмите на «Продолжить » в программе, наденьте стеклянную крышку на распылитель и следите за равномерным нанесением, что подтверждается равномерным смачиванием.
    17. Когда цикл распыления завершится, нажмите стоп на насосе, выключите азотный газ и нажмите «Подтвердить нагрузку клапана». Очистите линию и ступень распылителя и выключите его, убедитесь, что насос Knauer снова включён.
    18. Инкубировать затворы в камере влажности HTX при 37 °C в течение 2 часов, размещая затворы вверх. Когда всё будет готово, поместите слайды в сушитель на 15 минут. Слайды могут оставаться в десикаторе на ночь, или протокол можно продолжить.
  5. Подготовка и применение матрицы MALDI
    1. Перед матричным применением зафиксируйте оптическое изображение слайда с помощью сканера.
    2. Взвесьте 40 мг твёрдого CHCA в конической трубке объёмом 15 мл. Растворить порошок CHCA в растворе 0,1% трифторуксусной кислоты и 50% ацетонитрила (ACN) в концентрации 7 мг/мл.
    3. Соник матричного раствора в течение 10 минут с циклами 90 секунд включён и 30 секунд выключен. Повторите эти шаги 5 раз, чтобы обеспечить полное растворение и однородность.
    4. Включите распылитель HTX M5 и откройте программное обеспечение HTX M5. Откройте клапан азотного газа и установите давление в системе на 10 psi.
    5. В программном обеспечении HTX, во вкладке «Методы », выберите подходящий метод для матричного распыления CHCA. Параметры установлены: температура сопла 79 °C, 10 проходов, расход 0,1 мл/мин, скорость 1300 мм/мин, расстояние между путями 3 мм, схема CC, давление 10 psi, расход газа 3 л/мин, высота сопла 40 мм.
    6. Перейдите на вкладку «Температура », установите температуру сопла на 79 °C. В вкладке «Насос » установите расход на 100 мкл/мин.
    7. Прикрепите затворы к нижнему левому углу нагреваемого лотка с помощью металлической направляющей для правильного выравнивания в области распыления. Во вкладке «Образцы » определите параметры X и Y для области распыления, что позволит небольшое перераспыление и обеспечить полное покрытие затвора.
    8. Используйте одноразовый шприц и иглу, чтобы взять 5,5 мл 50% ACN (удалить пузырьки).
    9. Установите распылитель в режим ЗАГРУЗКИ . Введите шприц ACN и введите ACN. Снимите шприц ACN и немедленно замените его на новый шприц с 5,5 мл фильтрованного раствора CHCA, введите инъекцию, чтобы избежать пузырей. Установите распылитель в режим РАСПЫЛЕНИЯ .
    10. Когда насадка достигнет 79 °C, нажмите Start под вкладкой Cycle . Нажмите на «Да » при запросе.
    11. Используйте пустой тестовый затвор и поставьте его под сопло распылителя. Для подтверждения видимого матричного распыления на слайде будет обнаружена жёлтая матричная осадка. После наблюдения нажмите «Продолжить», поставьте стеклянную крышку на прибор и следите за равномерностью распыления. Регулярное распыление создаёт скольжение с равномерной непрозрачностью.
    12. Когда цикл распыления завершится, уведомите распылитель в режим LOAD и нажмите на Valve load confirm (Valve load confirm).
    13. Очистите распылитель, установив насос на 300 psi и снизив температуру до 30 °C. Вдохнуть и протолкнуть через линию 5 мл 50% ацетонитрила дважды и 5 мл 50% метанола дважды. Протрите сцену 100% метанолом. Когда температура достигнет 30 °C, переключитесь на LOAD, выключите газ, выключите распылитель и убедитесь, что насос Кнауэра снова включён.
    14. Поместите затворы в сушитель на 15 минут, пока матрица полностью не высохнет. Стекли следует запускать как можно скорее после распыления, максимум в течение 14 дней, чтобы обеспечить надёжный сбор данных с соответствующим соотношением сигнал-шум.

4. Сбор данных по гликомике MALDI-MSI

  1. Подготовка к сбору данных
    1. Закрепите затвор в держателе для сэмплов инструмента MALDI с помощью адаптера затвора. Вставьте держатель для образца в MS и убедитесь, что он правильно установлен для съёмки.
    2. Откройте программное обеспечение flexImaging и импортируйте ранее записанное оптическое изображение слайда, см. шаг 3.4.1. При необходимости калибруйте выравнивание изображения с инструментальной стадией так, чтобы тканевые срезы и стандартные участки были правильно расположены для выбора региона.
    3. Определите области визуализации для срезов тканей, стандарт HRP, стандарт гликогена и квадрат контрольной матрицы в программном обеспечении. Определите каждый регион отдельно.
    4. Установите размер растрового шага на 50 мкм, получив разрешение пикселей 50 × 50 мкм.
    5. В программном обеспечении управления приборами выберите положительно-ионный MS режим и установите диапазон сканирования на m/z 500–4000 с низкой массовой пороговой скоростью 700,00 м/з.
    6. Загрузите заранее оптимизированный параметр настройки изображения MALDI в программное обеспечение управления приборами (или введите значения вручную, если нужно). Проверьте, что напряжения источника и ионной оптики установлены на заданных значениях: смещение пластин MALDI 50.0 V; Отклонение 1 Delta 70.0 V; Труба 1 RF 500.0 Vpp; Труба 2 RF 500.0 Vpp; Многополюсный RF 500.0 Vpp; Ионная энергия 5,0 эВ. Подтвердите настройки тайминга столкновения и TOF: Энергия столкновения 10,0 эВ; Коллизионный RF 4000.0 Vpp; Время передачи — 180,0 мкс; Предимпульсное хранилище 25,0 мкс.
    7. Проверьте настройки лазера во вкладке «Лазер». Выберите Imaging 50 μm в качестве приложения по умолчанию.
    8. Калибруйте масс-спектрометр с помощью внешней смеси калибра, например, tune mix. Введите калибр и запустите калибровку прибора. Отрегулируйте калибровку так, чтобы ошибка массовой точности была в пределах 0,001%, а балл точности калибровки — 100%.
    9. Установите запись на серию из 320 лазерных выстрелов на частоте 10 000 Гц. Ослабление лазера следует отрегулировать до 37%, чтобы поддерживать интенсивность сигнала в оптимальном динамическом диапазоне. Регулируйте лазерные выстрелы и ослабление по мере необходимости.
    10. Используйте автоматическую функцию выравнивания луча, регулировки профиля мишени и фокусировки прибора, чтобы лазер правильно сфокусировался на образце. В области вне ткани выполните Auto Beam Adjustment под вкладкой Laser в программном обеспечении управления, чтобы выровнять лазер с ионной оптикой. Это обеспечит регулировку лазера и ступени для оптимального сбора данных. Наконец, выполните генерацию профиля цели и настройки фокуса во вкладке носителей образца.
    11. Убедитесь, что внутренние стандартные пятна обеспечивают ожидаемые пики ионов, что указывает на готовность к сбору данных. HRP должен иметь заметный пик гликана на уровне 1211,42. Гликоген должен был регулярно размещать заметные пики, с наибольшими по интенсивности пиками на 1013,32, 1175,37 и 1337,43.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если выявлены проблемы с интенсивностью, пересмотрите конфигурацию лазера. Если выявлены проблемы с точностью массы, пересмотрите калибровку.
  2. Сбор данных MALDI-MSI
    1. Начните получение изображений MALDI-MS для определённых областей, нажав кнопку Start в программном обеспечении визуализации. Прибор автоматически растерирует лазер по каждой определённой области с интервалом в 50 мкм, получая положительный ионный спектр MS1 (m/z 500-4000) на каждом пикселе. Типичное время сбора данных для среза печени при таком разрешении составляет 135 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После запуска инструмент автоматически сохраняет спектры для каждого получаемого пикселя, создавая папку .d с исходными данными.

5. Анализ данных MALDI-MSI

  1. Импорт и экспорт данных
    1. Импортируйте набор данных в SCiLS Lab или аналогичное программное обеспечение для анализа MSI, чтобы визуализировать карты интенсивности ионов гликома на сечениях ткани.
    2. Открыть лабораторию SCiLS. Выберите «Новое». Выберите файл .mis из запуска MALDI.
    3. Когда файл .mis откроется в SCiLS, нажмите Next. Выберите автоматический диапазон для m/z диапазона. Выберите автоматическую ось для параметров оси. Выберите абсолютный размер контейнера. Нажмите на «Далее », а затем на «Импорт». Выберите папку, в которой будет сохранен файл.
    4. После завершения импорта откройте новый .slx-файл.
    5. Нажмите на файл, Импорт и выберите список функций из опции «Файл». Импортируйте аннотации glycome и создайте ионные изображения, перейдя в панель списка функций, выбирая правильный список и нажимая кнопку создания ионных изображений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Доступны надёжные списки признаков для N-гликанов16, 18, 19 игликогена 13.
    6. Нормализуйте данные, если это необходимо. Общее количество ионов (TIC) — наиболее часто используемая нормализация.
    7. После загрузки ионных изображений пройдитесь по списку функций и убедитесь, что правильная интеграция пиков, вручную подстраивая для тех признаков, где пик не полностью интегрирован. Для настройки нажмите левой кнопкой мыши по пику, удерживая Shift. После интеграции пика нажмите Control и пробел на клавиатуре. Это создаст новое ионное изображение для скорректированного пика.
    8. После повторения для остальной части списка функций в панели ионного изображения выберите список функций Сохранение , назначите список и нажмите Сохранить.
    9. Перейдите в файл, таблицу функций и откройте только что сохранённую таблицу списка функций. Сортируйте по m/z. Скорректированные признаки будут отображаться с пустой ячейкой в столбце с именем. Переименуйте скорректированные пики, скопировав и вставив имя, а оригинальный пик удалите, выбрав кнопку удаления выбранной строки из списка признаков, расположенной в верхней середине таблицы признаков.
    10. После корректировки всех имён получается окончательный аннотированный пиковый список. Нажмите кнопку добавления интенсивности , расположенную рядом с кнопкой удаления. Отсюда выберите интересующие образцы, чтобы экспортировать среднюю интенсивность для аннотированных признаков для каждого изображенного региона.
    11. Обязательно выберите режим обработки интервалов пиковой зоны и общий уровень ионов для нормализации. Нажмите на OK. Появятся новые столбцы с соответствующими данными. Для экспорта данных выберите стрелку, указывающую наружу, и сохраните как .csv.

Результаты

Тщательная обработка печени мыши дикого типа, включая вырезание полного поперечного сечения (рисунок 1A), позволила определить гликома с помощью MALDI-MSI, используя различные олигосахариды, полученные из гликогена, и N-связанные гликаны в диапазоне m/z (рисунок 1B). Гликоген был в целом локализован по всему печеночному гепатоциту и отсутствовал в сосудах и соединительной ткани в портальных путях, как и ожидалось (рисунок 1C,D). Важно отметить, что данные MALDI-MSI позволили измерять как пространственное распределение гликогена, так и распределение длины цепи — ключевую особенность гликогена в нормальном метаболизме и состоянии заболеваний (рисунок 1D). Кроме того, разнообразные N-связанные гликаны демонстрируют разнообразные структуры. Наблюдаемое пространственное распределение варьируется от широкого распределения в гепатоцитах (рисунок 1E) до региональных очаг, что соответствует синусоидальной организации печени (рисунок 1F), до специфического маркировки элементов портального тракта (рисунок 1G-I).

figure-results-1
Рисунок 1: MALDI-MSI гликом-анализ печени мышей. (A) Схема критически важных методов подготовки образцов, сбора данных и анализа. (B) Выборка масс-спектров, полученных при подходе. Стрелки красного цвета демонстрируют равномерно расположенные олигосахариды, полученные из гликогена, отличающиеся на один моносахарид глюкозы. Стрелки синего цвета обозначают N-гликаны, которые распределяются по всему спектру. В печени пики гликогена обычно более выражены, особенно при более высоких значениях m/z. (C) Пространственное распределение мальтогексаозы (DP6), получаемого из гликогена в печени. (D) Распределение длин цепей гликогена в печени. (E-G) Пространственное распределение различных видов N-связанных гликанов в печени. (H) Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) для сфокусированной центральной области, а также анатомические аннотации. (I) Соответствующее сфокусированное вставление, показывающее пространственную локализацию дополнительного N-связанного гликана (Hex5dHex1HexNAc5) в элементах портального тракта. Масштабные полосы: 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

MALDI-MSI — это новый инструмент для пространственной биологии гликома. Важно, что, хотя этот протокол ориентирован на сбор данных с использованием конкретного оборудования, его легко адаптировать к платформам MALDI-MSI от несколькихпоставщиков 13. Обработка образцов остаётся идентичной до 4-го метода, хотя некоторые производители могут потребовать использование специализированных слайдов. Модификации сбора данных с использованием параметров, специфичных для платформы MALDI-MSI, позволяют быстро адаптировать этот протокол. Специализированное программное обеспечение для обработки данных может использоваться, как подробно описано на шаге 5, или, альтернативно, использовать платформы для строгой и воспроизводимой обработки данныхMALDI-MSI 19.

MALDI-MSI — особенно полезный инструмент для понимания биологии, поскольку разные органы, ткани и клетки имеют разные паттерны для гликома. Печень хорошо подходит для анализа гликома, так как содержит высокий уровень гликогена и разнообразные N-связанныегликаны. Другие органы имеют более высокий уровень и разнообразие N-связанных гликанов и более низкий уровеньгликоген-13. Важно, что гликом варьируется в разных органах в зависимости от метаболического и болезненного состояния организма, поэтому гликом предоставляет богатый источник биологической информации 5,14,15,20. Продолжающаяся разработка уникальных ферментов-активных углеводов для анализа MALDI-MSI обещает расширить анализ гликома на дополнительные ортогональные биомолекулы гликома в гликоме.

Несмотря на множество преимуществ, MALDI-MSI в настоящее время ограничен по разрешению по сравнению с другими инструментами, используемыми в пространственной биологии. Этот протокол использовал сбор данных с разрешением 50 мкм. Хотя данные с одноклеточным разрешением отлично подходят для физиологического анализа, они значительно продвинут область21. В частности, делокализация может стать значительным препятствием для повышения разрешения в методах, использующих распыление ферментами и последующую инкубацию во влажных условиях. Недавние достижения в аппаратном обеспечении обработки образцов, методологиях обработки образцов, аппаратном обеспечении для сбора данных, использовании селективной маркировки и обработке данных позволяют собирать данные MALDI-MSI достигать клеточного разрешения22,23. Однако существуют компромиссы между разрешением и соотношением сигнал/шум, а также внутренние ограничения, основанные на текущих методах подготовки проб для MALDI, которые необходимо учитывать. Очень специфические приложения уже достигают цели одноклеточного разрешения MALDI-MSI, используя инновации как в обработкевыборок 24, так и в новых алгоритмах, что свидетельствует о том, что общие решения этих задач находятсяв пределах досягаемости 25,26,27.

После сбора данных слайд может быть окрашен с помощью H&E для целей гистологической аннотации. Однако с сбором данных MALDI-MSI связаны повреждения клеток и тканей, поэтому эта стратегия ограничивает степень клеточной аннотации. Альтернативно, для H&E можно использовать последовательные срезы ткани. Эта стратегия обеспечивает высококачественные данные, но требует выравнивания и интеграции отдельных разрезов выборок.

Стоит отметить, что формалин-фиксированные парафин-вложенные ткани (FFPE) очень хорошо подходят для анализа гликома с помощью MALDI-MSI с небольшими изменениями в протоколе подготовкиобразцов 13. Однако ткань FFPE нельзя эффективно использовать для метаболомики и других подобных анализов, поэтому для мультиомических подходов предпочтительнее использовать свежезамороженные образцы,описанные здесь. Подготовка образцов является критически важным компонентом любого трубопровода MSI для лабильных биомолекул, что требует особых подходов к сбору и обработкеобразцов 17, 29 и 30.

Методы расширения общего и широкого применения подходов на базе MALDI-MSI стремительно развиваются благодаря значительным улучшениям аппаратного и программногообеспечения 19. Кроме того, современные подходымультиомик 28 имультимодаль 21 в сочетании с машинным обучением и искусственным интеллектом особенно перспективны для работы с этими чрезвычайно сложными наборами данных31.

Раскрытие информации

R.C.S., M.S.G. и C.W.V.K. являются содиректорами Центра передовых исследований пространственных биомолекул (CASBR) при Университете Флориды и соучредителями Sugar3 LLC. R.C.S. получает исследовательскую поддержку и/или консультационные гонорары от Maze Therapeutics. M.S.G. получил исследовательскую поддержку, сборы за исследовательские соединения или консультационные услуги от Maze Therapeutics, Valerion Therapeutics, Ionis Pharmaceuticals, PTC Therapeutics и Aro Biotherapeutics. M.S.G. является членом научного консультативного совета Chelsea's Hope, Фонда синдрома глют1-дефицита и Фонда заболеваний тела с полиглюкозаном у взрослых.

Благодарности

Мы благодарим членов лабораторий Вандер Куи, Сан и Джентри за плодотворные обсуждения. Это исследование было поддержано грантами Национальных институтов здравоохранения (NIH) для Центра совместных ресурсов по получению биообразцов и трансляционной патологии Онкологического центра имени Марки Университета Кентукки, P30CA177558 D.B.A., R01AG066653, R01CA266004, R01AG078702, R01CA288696, RM1NS133593 R.C.S., R35NS116824 M.S.G., R01DC019054 C.W.V.K., а также Медицинского колледжа Университета Флориды.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Впитывающая подкладкаDenville ScientificB1623
Ацетонитрил (ACN)Сигма-Олдрич34851-4X4L
Алюминиевая фольгаFisher Scientific 15078292
Цитракониновый ангидридСигма-Олдрич125318
Коническая трубка (15 мл)Alkali ScientificCW5600
Банки КоплинаDWK Life Sciences900570
Cryostat LeicaCM1860
Cryostat chuckLeica14041926491
ДесикаторBel ArtF424004131
Чашка для диализаТермо Фишер88400
ЭтанолFisher Scientific 22032601
Пароварка для едыRival CKRVSTLM21   
Стеклянная вставка (70 мм)Компания GelLGI50
ГликогенСигма-ОлдричG8876Стандарт
Пероксидаза хрена (HRP)Сигма-ОлдричP8125Стандарт
Вода с ВЭЖХСигма-Олдрич270733-4X4L
HTX распылительHTX TechnologiesM5
Соляная кислотаFisher Scientific A144-500
ИзоамилазаMegazymeE-ISAMY
Насос КнауэраКнауэрСтр. 4.1 С
Лопасть с низким профилемНауки об электронной микроскопии63059-01
Монтажные носители M1Эпредия1310
Масс-спектрометрBruker DaltonicstimsTOF fleX
Микрофужная трубка (1,5 мл)Alkali ScientificCN3016
ИглаBD305109
Нейтральный буферизованный формалин NBFМиллипорная сигмаHT501128-4L
Азотный газAirgasNIUHP300
PBSFisher Scientific SH30256. FS
ПЦР-трубкиПартнеры MedSupply62-1091-1
PNGase F PRIME-LY ULTRA Биография БульдогаNZPULT10LY
SCiLS LabBruker Daltonics1889000
ШейкерThermo Scientific88882007
Slide   Электронные микроскопические науки71873-02
Слайд-рассылкаПродукты RPI212620A
Соникатер (Биоруптор Пико)ДиагенодыB01080010
Стерильные щипцыDR InstrumentsS08098
Стерильный скальпельWPIWPI-500240
Стерильные ножницыТонкие научные инструменты14084-08
Шприц   Грейнджер19G342
Шприцовый насосНовая эраNE-300
ЗаписьFisher Scientific 15-901-R
Тонкая кистьАнезус#00
Трифторуксусная кислотаСигма-ОлдричT6508-1L
Tune Mix, ESI с низкой концентрациейAgilentG1969-85000
Весовые лодкиСигма-ОлдричHS120882
КсилолСигма-Олдрич534056
&альфа;-циано-4-гидроксициннамовая кислота (CHCA)Cayman Chemical Company15254

Ссылки

  1. Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular imaging of biological samples: Localization of peptides and proteins using MALDI-TOF MS. Anal Chem. 69 (23), 4751-4760 (1997).
  2. Buchberger, A. R., Delaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass spectrometry imaging: A review of emerging advancements and future insights. Anal Chem. 90 (1), 240-265 (2018).
  3. Ouedraogo, R., Daumas, A., Capo, C., Mege, J. L., Textoris, J. Whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry is an accurate and rapid method to analyze different modes of macrophage activation. J Vis Exp. 82, e50926(2013).
  4. Khalil, S. M., Cappuccio, G., Li, F., Maletic-Savatic, M. Molecular imaging of human brain organoids using mass spectrometry. J Vis Exp. 211, e66997(2024).
  5. Sun, R. C., et al. Brain glycogen serves as a critical glucosamine cache required for protein glycosylation. Cell Metab. 33 (7), 1404-1417 (2021).
  6. Aichler, M., Walch, A. Maldi imaging mass spectrometry: Current frontiers and perspectives in pathology research and practice. Lab Invest. 95 (4), 422-431 (2015).
  7. Conroy, L. R., et al. High-dimensionality reduction clustering of complex carbohydrates to study lung cancer metabolic heterogeneity. Adv Cancer Res. 154, 227-251 (2022).
  8. Seeley, E. H., Caprioli, R. M. Molecular imaging of proteins in tissues by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18126-18131 (2008).
  9. Powers, T. W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization imaging mass spectrometry workflow for spatial profiling analysis of N-linked glycan expression in tissues. Anal Chem. 85 (20), 9799-9806 (2013).
  10. Drake, R. R., Powers, T. W., Norris-Caneda, K., Mehta, A. S., Angel, P. M. In situ imaging of N-glycans by MALDI imaging mass spectrometry of fresh or formalin-fixed paraffin-embedded tissue. Curr Protoc Protein Sci. 94 (1), e68(2018).
  11. Stanback, A. E., et al. Regional n-glycan and lipid analysis from tissues using MALDI-MS imaging. STAR Protoc. 2 (1), 100304(2021).
  12. Hawkinson, T. R., Sun, R. C. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry imaging of glycogen in situ. Methods Mol Biol. 2437, 215-228 (2022).
  13. Young, L. E. A., et al. In situ mass spectrometry imaging reveals heterogeneous glycogen stores in human normal and cancerous tissues. EMBO Mol Med. 14 (11), e16029(2022).
  14. Conroy, L. R., et al. Spatial metabolomics reveals glycogen as an actionable target for pulmonary fibrosis. Nat Commun. 14 (1), 2759(2023).
  15. Clarke, H. A., et al. Glycogen drives tumor initiation and progression in lung adenocarcinoma. Nat Metab. 7 (5), 952-965 (2025).
  16. Wallace, E. N., et al. An N-glycome tissue atlas of 15 human normal and cancer tissue types determined by MALDI imaging mass spectrometry. Sci Rep. 14 (1), 489(2024).
  17. Veerasammy, K., et al. Sample preparation for metabolic profiling using MALDI mass spectrometry imaging. J Vis Exp. 166, e62008(2020).
  18. Mcdowell, C. T., et al. Imaging mass spectrometry and lectin analysis of N-linked glycans in carbohydrate antigen-defined pancreatic cancer tissues. Mol Cell Proteomics. 20, 100012(2021).
  19. Palmer, A., et al. FDR-controlled metabolite annotation for high-resolution imaging mass spectrometry. Nat Methods. 14 (1), 57-60 (2017).
  20. Colpaert, M., et al. Neurological glycogen storage diseases and emerging therapeutics. Neurotherapeutics. 21 (5), e00446(2024).
  21. Taylor, M. J., Lukowski, J. K., Anderton, C. R. Spatially resolved mass spectrometry at the single cell: Recent innovations in proteomics and metabolomics. J Am Soc Mass Spectrom. 32 (4), 872-894 (2021).
  22. Chan, Y. H., et al. Gel-assisted mass spectrometry imaging enables sub-micrometer spatial lipidomics. Nat Commun. 15 (1), 5036(2024).
  23. Lim, M. J., et al. Maldi Hiplex-IC: Multiomic and multimodal imaging of targeted intact proteins in tissues. Front Chem. 11, 1182404(2023).
  24. Hankin, J. A., Barkley, R. M., Murphy, R. C. Sublimation as a method of matrix application for mass spectrometric imaging. J Am Soc Mass Spectrom. 18 (9), 1646-1652 (2007).
  25. Rappez, L., et al. Spacem reveals metabolic states of single cells. Nat Methods. 18 (7), 799-805 (2021).
  26. Grgic, A., Cuypers, E., Dubois, L. J., Ellis, S. R., Heeren, R. M. A. Maldi MSI protocol for spatial bottom-up proteomics at single-cell resolution. J Proteome Res. 23 (12), 5372-5379 (2024).
  27. Dressman, J. W., Bayram, M. F., Angel, P. M., Drake, R. R., Mehta, A. S. Single-cell multiomic MALDI-MSI analysis of lipids and N-glycans through affinity array capture. Anal Chem. 97 (24), 12493-12502 (2025).
  28. Clarke, H. A., et al. Spatial mapping of the brain metabolome, lipidome, and glycome. Nat Commun. 16 (1), 4373(2025).
  29. Juras, J. A., et al. In situ microwave fixation provides an instantaneous snapshot of the brain metabolome. Cell Rep Methods. 3 (4), 100455(2023).
  30. Cantrell, A. R., et al. Protocol for high-power, brain-focused microwave fixation to define rodent metabolism. STAR Protoc. 6 (2), 103794(2025).
  31. Ma, X., et al. An AI-driven framework to map the brain metabolome in three dimensions. Nat Metab. 7 (4), 842-853 (2025).

Перепечатки и разрешения

Теги

Картирование гликомамасс-спектрометрическая визуализацияMALDI MSIN-связанные гликанылокализация гликогенаферментативное расщепление тканейгликомика печени мышиуглевод-активные ферментыпространственная гликомная гетерогенность
Пространственная молекулярная визуализация гликома с помощью масс-спектрометрии
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.