Методическая статья

Методы динамического зажима для исследования нарушенной возбудимости нейронов, связанной с аутизмом

1.1K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69155

⸱

17 октября 2025 г.

 , 
1Department of Biology, Miami University

В этой статье

Краткое содержание

Динамическая электрофизиология зажима может установить причинно-следственные связи между дефицитом возбуждения нейронов и дисфункцией ионных каналов. Мы описываем методы и протоколы динамического зажима в нейронах мозжечка Пуркинье у мышей, отмечая полезные ресурсы и технические соображения. В репрезентативном исследовании мы добавляем смоделированную натриевую проводимость к нейронам Tsc1-/- Пуркинье для спасения повторяющегося возбуждения.

Аннотация

Расстройство аутистического спектра (РАС) возникает из-за широкого спектра генетических факторов и факторов окружающей среды. В то время как многочисленные мутации, связанные с аутизмом, нарушают развитие синапсов или пластичность, было показано, что все большее число из них изменяют экспрессию и функционирование потенциал-зависимых ионных каналов, что приводит к дефициту внутренней возбудимости нейронов. Записи напряжения всей клетки могут быть использованы для характеристики того, как мутации, связанные с РАС, влияют на функцию ионных каналов. Тем не менее, эти эксперименты не позволяют напрямую оценить, как измененная ионная проводимость влияет на возбуждение потенциала нейронного действия. Динамическая электрофизиология зажима устраняет этот пробел, позволяя в режиме реального времени вводить определяемые пользователем ионные проводимости в живые нейроны. Это позволяет провести причинно-следственную проверку того, как изменения свойств ионных каналов влияют на электрическую активность данного типа клеток. В данной статье мы описываем, как реализовать динамическую электрофизиологию зажима на нейронах Пуркинье у взрослых мышей, записанных в физиологических условиях в остро подготовленных срезах мозга мозжечка. Нейроны Пуркинье являются особенно актуальной моделью для этой работы, поскольку они обладают внутренней способностью возбуждать повторяющиеся высокочастотные (20-100 Гц) потенциалы действия и последовательно участвуют в дисфункции мозжечкового контура, связанной с РАС. Мы сосредоточились на Tsc1, гене, мутации которого с потерей функции являются одними из наиболее распространенных моногенных причин РАС. В нейронах Пуркинье мыши делеция Tsc1 также была связана со снижением экспрессии потенциал-зависимых натриевых каналов (Nav). Мы используем модели кинетического состояния Маркова для моделирования и воспроизведения свойств проводимости Nav нейрона Пуркинье, а также продолжаем использовать динамический зажим для непосредственной оценки того, как изменения проводимости Nav влияют на внутреннюю активацию интактных нейронов Пуркинье в мозжечке. Мы предоставляем инструкции и ресурсы для модификации и настройки моделей ионной проводимости. Интегрируя моделирование ионной проводимости, динамический зажим и традиционные методы патч-clamp, этот подход обеспечивает мощную и гибкую основу для связи генетических нарушений с физиологическими исходами в нейронах, имеющих отношение к РАС.

Введение

В предыдущих исследованиях молекулярных и клеточных факторов расстройства аутистического спектра (РАС) часто подчеркивалось, что синаптическая дисфункция занимает центральное место в патофизиологии расстройства. Многочисленные исследования продемонстрировали повышенную возбуждающую плотность синапсов 2,3,4, нарушение обрезки синапсов5 и изменения в белках постсинаптической плотности 6,7 в моделях РАС. Тем не менее, недавние исследования показали, что изменения внутренней возбудимости нейронов также являются факторами патологии РАС. Например, трансгенные мышиные модели с РАС и клеточные линии, полученные от пациентов, выявили нарушение генерации потенциала действия в мозжечковом Пуркинье 8,9,10 и корковых пирамидальных нейронах11, а также ослабленную дендритную возбудимость и синаптическую интеграцию в подклассах корковых пирамидальных нейронов12. Каналопатии, включающие мутации с потерей функции в SCN2A, кодирующем потенциал-зависимый натриевый (Nav) канал Nav1.2, образующую поры α субъединице, в настоящее время являются хорошо известной моногенной причиной РАС13 и, как было показано, вызывают дефицит внутренней возбудимости различных классов центральных нейронов 14,15,16,17. По мере продвижения этих типов исследований важно установить причинно-следственные связи между патогенными изменениями ионной проводимости и влиянием этих изменений на функцию нейронов и цепей. Электрофизиология динамического зажима обеспечивает эффективный подход к решению этой задачи. Sharp et al. (1992 и 1993)18,19, вместе с Робинсоном и Каваи (1993)20 первоначально описали методы динамического зажима, в которых моделируемая нелинейная ионная проводимость, с потенциал-зависимыми свойствами или без них, вводится/добавляется в живые нейроны, что позволяет исследователям оценивать в режиме реального времени, как свойства или предполагаемые изменения потенциал-зависимой ионной проводимости влияют на возбуждение нейронов 21. 22.

Реализация экспериментов с динамическими зажимами была облегчена несколькими свободно доступными программными системами, такими как RTXI23, QuB24,25 и StdpC26; Тем не менее, последние достижения упростили реализацию динамических зажимов с помощью коммерческих систем plug-and-play, которые позволяют разрабатывать, изменять и применять проводимость модели на одном компьютере и в рамках одного программного пакета. В данной работе мы предоставляем протоколы для выполнения динамического зажима с использованием системы Sutter dPatch27 и проводим исследование образца, в котором мы проверяем, как целенаправленная делеция туберозного склероза 1 (Tsc1)9, который является распространенным локусом мутаций для РАС28, влияет на внутреннюю активацию нейронов мозжечка Пуркинье в результате изменений в экспрессии потенциал-зависимой натриевой проводимости8.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными руководящими принципами Комитета по уходу за животными и их использованию Университета Майами (протокол #1044). В экспериментах использовались самцы и самки мышей дикого типа C57BL/6J и трансгенные линии с фоном штамма C57BL/6J. Для электрофизиологических экспериментов животных проводили в возрасте 6-7 недель. Все записи были взяты из нейронов Пуркинье в дольках 5, 6 или 7 в черве мозжечка.

1. Настройка и подготовка тканей к экспериментам с патч-зажимом на нейроне Пуркинье

  1. Приготовьте 1 л искусственной спинномозговой жидкости (АКЦБ), содержащей: 125 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ2PO4, 25 мМ NaHCO3, 2 мМ CaCl2, 1 мМ MgCl2 и 25 мМ декстрозы при pH 7,4 (~300 мОсМ/л). Также приготовьте 250 мл «режущего раствора», содержащего: 240 мМ сахарозы, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ2PO4, 0,5 мМ CaCl2 и 7 мМ MgCl2. Отсыпьте (пузырьковые) ACSF и режущие растворы с карбогеном (95 % O2 / 5 % CO2) в течение не менее 20 минут перед использованием и непрерывно в течение всех экспериментов.
  2. Подготовьте камеру для хранения срезов мозга, заполненную ACSF, для последующего использования. Убедитесь, что срезы мозжечка (после добавления в камеру для срезов) погружены в воду с обеих сторон срезов мозжечка, подверженных воздействию ACSF. Для этого поместите погруженные ломтики на плотно натянутую нейлоновую сетку, которая также погружена в воду.
  3. Подготовьте операционную станцию. Готовы четыре куска скотча, которыми будет прикалываться обезболенное животное. В наполненное льдом ведро или сковороду со льдом поместите нижнюю половину чашки Петри в лед стенками вниз, а чашку Петри — дном вверх. Положите на дно чашки Петри фильтровальную бумагу (≥ 3 см2 см) и пропитайте 2-3 мл режущего раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для описанных экспериментов используется компрессомный вибратом для разрезания парасагиттальных срезов мозжечка размером 350 мкМ. С помощью компресстома ткань для нарезки приклеивается к пластиковой трубке для образца, которая проходит через окружающую тонкую металлическую трубку. Во время нарезки трубка для образца проталкивается через металлическую трубу, которая остается неподвижной. После того, как ткань приклеена к пробирке для образца, ткань погружается в разогретую 2% агарозу. Лезвие компрессома наклеивается на неподвижный держатель, который крепится к руке вибратома. Другие типы вибратом не требуют встраивания ткани в разогретую агарозу, но должны одинаково хорошо работать для описанных экспериментов.
  4. Также в лед положите лезвие бритвы с одним лезвием и небольшой (10 мл) стакан, наполненный раствором для резки. Держите при себе охлаждающий блок, который используется для быстрого охлаждения нагретой агарозы после ее добавления в пробирку для образцов, а также шприц объемом 30 мл, наполненный режущим раствором, охлажденным на льду. Убедитесь, что шприц объемом 30 мл подключен к участку 30-60 см внутривенной (IV) трубки (через наружный конус замка Люэра), который соединен (на конечном конце) с иглой (≥ 26 G) с внутренней базой замка Люэра.
  5. Поместите оставшийся раствор для резки в морозильную камеру при температуре -80 °C. Как только этот раствор для резки станет консистенцией слякотного льда (20-25 минут), достаньте из морозильной камеры при температуре -80 °C и положите на лед.
  6. Обезболите взрослую мышь в возрасте 5-8 недель с помощью внутрибрюшинной инъекции 1 мл/кг животного веса коктейля кетамина (10 мг/мл)/ксилазина (0,25 мг/мл).
  7. Приготовьте 2% раствор агарозы, растворив 0,5 г агарозы в 25 мл режущего раствора. После того, как животное будет обезболено (не реагирует на защемление пальцев ног), нагрейте 2% раствор агарозы (~30 с в микроволновке) и перенесите подогретый раствор агарозы на водяную баню при температуре 40 °С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги под номерами 1.8-1.18 должны быть выполнены в срочном порядке и до того, как нагретая агароза застынет.
  8. Приколите конечности животного к операционному столу с помощью скотча. С помощью ножниц вскройте грудную полость животного, следя за тем, чтобы легкие и органы брюшной полости не были разрезаны. Используйте стопорные щипцы или гемостатики, чтобы удерживать грудную клетку в открытом состоянии, обнажая сердце. Для этого зафиксируйте щипцы на грудине и осторожно положите их к передней части животного (с отверстиями для пальцев инструмента рядом с головой животного).
  9. Введите иглу, соединенную со шприцем объемом 30 мл, в левый желудочек и с помощью щипцов сжимайте ткань вокруг иглы, удерживая иглу в пределах левой внутрижелудочковой камеры. С помощью хирургических ножниц сделайте небольшой надрез в правом предсердии и быстро проденьте животному 25 мл охлажденного режущего раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что перфузат поступает в левый желудочек и выходит из правого предсердия, очищая кровь от кровеносной системы животного.
  10. Когда перфузия будет завершена, быстро обезглавьте животное и разрежьте скальп по средней линии головы по направлению к брегме, чтобы обнажить поверхность черепа.
  11. С помощью ножниц удалите соединительную ткань с задней стороны черепа, а также удалите лишнюю ткань спинного мозга, следя за тем, чтобы спинной мозг не выступал из большого затылочного отверстия.
  12. Поместите одно лезвие ножниц в большое затылочное отверстие и разрежьте по окружности черепа с обеих височных сторон по направлению к брегме, оставив немного ткани черепа на месте в брегме.
  13. Поместите лезвие ножниц или половину тонких щипцов в большое затылочное отверстие и поднимите его сверху, отделив череп от мозга. Будьте осторожны, чтобы не протолкнуть лезвие ножницы или щипцы в мозг во время подъема черепа.
  14. Используйте хирургический инструмент шпателем, чтобы зачерпнуть под мозг (спереди) и осторожно удалите мозг в стакан объемом 10 мл с охлажденным раствором для резки, стараясь защитить мозжечок при переносе мозга. На этом этапе переоденьтесь в чистые перчатки.
  15. Осторожно извлеките мозг из стакана (с помощью шпателя) и положите его на фильтровальную бумагу (на чашку Петри). Используйте однолезвийное лезвие, чтобы резать вдоль парасагиттальной оси в нескольких миллиметрах от средней линии. Откажитесь от более мелкой парасагиттальной ткани. Сделайте второй корональный разрез посередине переднего мозга (спереди от мозжечка). Отбросьте коронально разрезанную ткань, которая находится перед мозжечком.
  16. Проденьте однолезвиечное лезвие под переднюю часть переднего мозга и поднимите, чтобы повернуть оставшуюся ткань так, чтобы сторона первоначального парасагиттального разреза была обращена вниз (на фильтровальной бумаге), а неразрезанное полушарие мозжечка было обращено вверх.
  17. Поместите трубку с образцами вертикально на лед и нанесите тонкий слой суперклея (цианоакрилатного клея) на поверхность трубки. С помощью шпателя с изгибом на 90° осторожно перенесите мозговую ткань с фильтровальной бумаги на поверхность пробирки для образца, сохраняя ориентацию тканей. Следите за тем, чтобы неразрезанное полушарие мозжечка продолжало быть обращено вверх. После того, как ткань будет размещена/приклеена к трубке для образца, сдвиньте металлическую трубку вверх, чтобы она окружала ткань мозга.
  18. С помощью моторизованной пипетки объемом 10 мл заполните пробирку с подогретой агарозой (встраивая ткани мозга). Быстро охладите ткань (теперь встроенную в нагретую агарозу), зажав охлаждающий блок вокруг металлической трубки на ~30 с.
  19. Поместите трубку с образцами в камеру вибратомной ванны и заполните ванну смазанным раствором для резки. Непрерывно разбрызгивайте режущий раствор во время разреза тканей мозга, но не подвергайте срезы мозжечка воздействию пузырьков газа.
  20. Нарежьте 300-350 μм парасагиттальные ломтики, немедленно перенося каждый ломтик в камеру для хранения ломтиков, наполненную паргированным ACSF комнатной температуры. Когда все ломтики окажутся в камере для нарезки, инкубируйте камеру для ломтиков на водяной бане при температуре 33 °C в течение 25 минут.
  21. После 25 минут на водяной бане поместите камеру для срезов (снова) при комнатной температуре, подождая еще не менее 35 минут, прежде чем пытаться записывать патчи с любого из срезов мозжечка.

2. Настройка марковской модели проводимости в динамическом зажиме

ПРИМЕЧАНИЕ: Динамический зажим — это приложение смоделированной проводимости к живой клетке в режиме реального времени. Напряжение мембраны регистрируется/дискретизируется с помощью острого или патч-электрода, а оцифрованный сигнал отправляется в программное обеспечение динамических клещей, которое рассчитывает, используя применяемую модель (модели) ионной проводимости, соответствующую инжекцию тока динамического зажима для дискретизируемого напряжения. Рассчитанный сигнал динамического тока клещи подается на усилитель и головной стол для ввода (через электрод) в ячейку. Для того чтобы смоделированная проводимость была надлежащим образом добавлена к ячейке, которая возбуждает потенциалы действия, которые приводят к быстрым переходным изменениям напряжения мембранного напряжения, частота дискретизации напряжения должна быть достаточно высокой, а задержка между образцом напряжения и инжекцией тока динамического клеща (иногда называемая задержкой) должна быть минимальной и инвариантной.

  1. Перед началом любого эксперимента с динамическим зажимом разработайте или получите математическую модель ионной проводимости, которая будет использоваться в эксперименте с динамическим зажимом. Эти модели могут быть в виде марковской модели кинетического состояния, модели Ходжкина-Хаксли (HH) или пассивной (линейной) проводимости. Убедитесь, что выбранная модель проводимости точно воспроизводит кинетические и зависящие от напряжения свойства предполагаемой ионной проводимости.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспериментаторы могут подтвердить свойства моделируемой ионной проводимости перед использованием в экспериментах с динамическими зажимами, проверив смоделированную проводимость (in silico) в исследованиях по моделированию электрических зажимов. Важные свойства и соображения марковских моделей кинетического состояния и проводимости HH описаны в разделе «Обсуждение». Ниже приведены инструкции по настройке марковской модели проводимости в программном обеспечении для динамических зажимов.
  2. Создание или получение марковской диаграммы переходов состояний для модели проводимости, которая будет использоваться в экспериментах с динамическим зажимом. Используйте эту диаграмму для точной сборки марковской модели проводимости в программном обеспечении для динамических зажимов (описанном ниже).
    ПРИМЕЧАНИЕ: SutterPatch - это программное обеспечение для сбора данных усилителя dPatch. Эксперименты с динамическими зажимами могут быть выполнены в программном обеспечении, которое позволяет собирать и применять смоделированные проводимости за счет инжекции тока во время протоколов тока-зажима. Марковская диаграмма перехода состояний для моделируемой потенциал-зависимой натриевой проводимости, основанная на измерениях тока Nav от нейронов Пуркинье мыши, показана на рисунке 1A. Эта модель была разработана Ransdell et al., 202230 и использовалась для исследования роли стойких и возрождающихся компонентов натриевого тока в возбуждении31 нейрона Пуркинье. Стробирующие состояния (C, IC, IF, IS и O) связаны между собой константами скорости перехода, обозначаемыми переменными (т.е. S0, S3, S1, S4). Эта модель используется в репрезентативных экспериментах с динамическими зажимами и доступна для скачивания на GitHub: https://github.com/morenomdphd/Resurgent_INa.
  3. В программном обеспечении для сбора данных откройте окно Dynamic Clamp Editor на вкладке SutterPatch > Dynamic Clamp Editor или щелкнув соответствующий значок в окне Dashboard . Части окна редактора динамических зажимов показаны на рисунке 1B.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окно редактора динамических зажимов содержит все необходимые настройки для применения моделируемой проводимости во время протокола записи токовых клещей. Интерфейс Conductance Pool (рис. 1B, вверху слева) позволяет пользователям организовывать и одновременно загружать группы проводимостей моделей.
  4. В интерфейсе Conductorance Pool (рисунок 1B, вверху слева) создайте пул, нажав кнопку New и присвоив ему желаемое имя. После выбора пула проводимости в правой части окна в интерфейсе выбора Headstage (рис. 1B, внизу слева) выберите тип модели для соответствующего пула проводимости (модель Маркова, Ходжкина-Хаксли, переменная проводимость и т. д.) и время применения модели проводимости, например, во время процедуры/протокола (активный режим). Интерфейс выбора Headstage также позволяет выбрать частоту обновления динамического зажима (в кГц) и источник сигнала напряжения (см. рис. 1B справа). В поле Источник сигнала напряжения выберите головной блок, который записывает сигнал напряжения.
  5. На панели выбора Headstage (Headstage) для примера марковской модели проводимости навигации (рис. 1A) выберите Markov Model (Марковская модель) для модели, During Sweeps (Развертка) для Active Mode (Активный режим), 200 kHz (200 кГц) для Update Rate (Частота обновления) и Headstage 1 (Headstage 1) для источника сигнала напряжения. Установите флажок Apply and Command Signal to AuxOUT1, чтобы начать расчеты модели в ответ на сигнал напряжения и добавить динамическую инжекцию тока клещи в любые протоколы токовых клещей соответственно (рис. 1B, слева внизу).
  6. Под основными панелями Dynamic Clamp Editor находится матрица состояний (Рисунок 1C, внизу). Чтобы отредактировать матрицу состояний, сначала нажмите кнопку «Редактировать параметры модели » в интерфейсе выбора Headstage (рисунок 1B, слева внизу). Рядом с редактором появится новое окно под названием «Параметры модели Маркова динамического зажима». На этой панели введите уравнения матрицы состояния, представляющие проводимость марковской модели.
  7. На панели настроек канала (рисунок 1B, вверху справа) выберите, какие сохраненные модели проводимости должны быть применены (в динамическом зажиме). Либо выберите пустой канал и начните создание новой модели проводимости. В правой части этой панели введите V-образный реверсал (смоделированный потенциал обращения ионов проводимости). Для нашего исследования с использованием натриевой проводимости введите 55,0 мВ, чтобы отразить реверсивный потенциал натрия на основе ACSF и внутреннего раствора патч-электрода.
  8. Также на панели настроек канала укажите количество кинетических состояний выбранной проводимости (см. рисунок 1B, вверху справа, красное поле). Здесь введите 9, чтобы отразить 9 кинетических состояний моделируемой проводимости (см. рисунок 1A).
  9. Под панелью настроек канала находится панель «Уравнения состояния ». Поместите уравнения константы скорости перехода состояний в матрицу состояний стробирования , чтобы отразить топологическое расположение марковской модели. Введите уравнения на панель «Уравнения состояния» и укажите идентификатор, начиная с «S0» (рисунок 1B, посередине).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Порядок, с которым вводятся эти уравнения, не имеет значения, если эти переменные надлежащим образом заполнены в матрице состояния стробирования в соответствии с топологией модели Маркова.
  10. Чтобы заполнить матрицу состояний стробирования теперь определенными переменными константы скорости, нажмите кнопку «Редактировать матрицу состояний » в правой части панели « Уравнения состояния» (рисунок 1B, посередине). Каждому кинетическому состоянию присваивается число, начинающееся с 0. Например, для двухкинетической модели состояний, содержащей состояния X и Y, эти состояния будут называться «0» и «1» и будут включать две константы скорости перехода a1 и b1, где a1 переходит от 0 к 1, а b1 переходит от 1 к 0.
  11. Чтобы правильно соединить эти уравнения с помощью редактора матрицы состояний (рисунок 1B, внизу), введите константы скорости в таблицу, содержащую пронумерованные строки и столбцы, оба из которых начинаются с 0 (см. пример на рисунке 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Переход из одного состояния в другое определяется их положением в этой таблице в виде "строка в столбец". Например, в примере с моделью с двумя состояниями на шаге 2.1 переход от состояния 0 к состоянию 1 зависит от константы скорости "a1", которая затем помещается в строку 0 столбца 1. Константа скорости перехода "b1" управляет переходами из состояния 1 в состояние 0, поэтому константа скорости должна быть помещена в строку 1, столбец 0. На рисунке 1C пример матрицы состояний стробирования содержит константы скорости, которые отражают топологию модели проводимости Nav, показанной на рисунке 1A. Например, "S0" — это константа скорости, определяющая переходы из IC1 в кинетическое состояние IC2; таким образом, "S0" помещается в строку 0, столбец 1 матрицы состояния стробирования (рисунок 1C). Уравнения константы перехода, определяющие переменную каждой константы скорости, затем заполняют заполненную матрицу состояний (рис. 1C, ниже).
  12. Поскольку уравнения константы скорости соединяются через панель редактора матрицы состояний, соединения (соответствующая строка и столбец) будут заполнять панель «Соединения » рядом с уравнением (рисунок 1B, средний справа). Обратите внимание на состояние «Открытое/проводящее» в репрезентативной модели натриевой проводимости (рисунок 1A), добавленное в строку и столбец 7 рисунка 1C (вверху, красные прямоугольники), что важно для следующего шага.
  13. На рисунке 1B (внизу справа) используйте панель «Уравнения проводимости» (nS) для определения амплитуды модельной проводимости, которая будет приложена во время динамического зажима. Выберите разомкнутые/проводящие состояния в марковской модели и укажите значение проводимости (рисунок 1B, внизу, красное поле).
  14. Для этого эксперимента введите «400 нС» в поле «G7», в котором будут добавлены значения пикового тока Nav, аналогичные пиковым токам Nav, измеренным в исследованиях с помощью напряжения на нейронах Пуркинье мыши.
  15. После выполнения описанных выше шагов нажмите кнопку Загрузить , чтобы подготовить модель к применению динамических клещей после запуска процедуры обработки токовых клещей.
  16. Используйте аналогичный процесс для компоновки моделей HH; однако добавьте уравнения для определения независимых состояний стробирования (в уравнениях вентиля) и проводимости при максимуме G.
  17. Чтобы применить динамическую проводимость зажима, сначала создайте подпрограмму с токовым зажимом с помощью редактора подпрограмм (перейдите на вкладку SutterPatch > редакторе подпрограмм) (рис. 1D). Чтобы создать подпрограмму токовых зажимов, выберите родительский выходной канал (в данном примере им является StimOut1). Откроется панель, которая позволит пользователю определить вывод текущей команды во время процедуры. Убедитесь, что для параметра Режим записи установлено значение CC_Mode в редакторе подпрограмм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В репрезентативных экспериментах, поскольку этот протокол работает со спонтанно возбуждающимися клетками, используется процедура/протокол без зазоров с инжекцией тока с нулевой инжекцией тока.
  18. В окне Входные каналы редактора Routine Editor (рисунок 1D, вверху справа) определите входные сигналы, которые во время экспериментов будут заполнять записанные окна области видимости. Эти входы должны включать сигнал напряжения, а также инжекцию тока команды подпрограммы, а также динамическую инжекцию тока клещей, называемую Current1 и AuxIN1 соответственно (рис. 1D, нижний левый угол).
  19. Для процедур токовых зажимов, включающих команды ввода положительного и/или отрицательного тока, сигнал ввода тока команды будет автоматически объединен с сигналом тока динамического зажима. Создайте виртуальное окно области видимости для вычитания сигнала тока команды так, чтобы была запись об инжекции тока изолированного динамического зажима. Чтобы создать новое окно виртуальной области, сначала выберите дополнительный канал ввода, установив флажок Virtual1.
  20. В редакторе подпрограмм в разделе Математический тип выберите Уравнение и выберите (в разделе Исходный канал) входной сигнал команды подпрограммы с токовым зажимом, который в данном примере имеет значение Current1. Введите уравнение в открытое поле, чтобы вычесть командный сигнал тока-клеща из сигнала динамической инжекции тока клещи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом примере эксперимента это делается с помощью уравнения t[3]-t[2]. В окне осциллографа Virtual1 теперь отображается динамическая инжекция тока клеща (изолированная от сигнала текущей команды). Пользователи имеют возможность настроить метки входных или выходных каналов, дважды щелкнув в разделе Метка.

3. Получение записей токового зажима от нейронов Пуркинье мыши в парасагиттальных срезах мозжечка

  1. Оснастите электрофизиологическую установку камерой для среза тканей, которая (под действием силы) перфузируется ACSF, нагретым до температуры, близкой к физиологической (34-36 °C). Осторожно поместите парасагиттальный срез мозжечка в камеру среза и с помощью срезной армы удерживайте срез мозжечка в погруженном и фиксированном положении. Убедитесь, что хлоридированный заземляющий электрод и температурный зонд также погружены и стабильны в камере для среза мозжечка.
  2. Найдите слой нейронов Пуркинье с помощью объектива с 40-кратным погружением. Нейроны Пуркинье большие и каплевидной формы. Плазматическая мембрана здоровых клеток Пуркинье обычно выглядит гладкой, а ядро не видно.
  3. После того, как здоровый нейрон Пуркинье идентифицирован и нацелен на запись с помощью патч-зажима, отрегулируйте линзу объектива микроскопа вверх. Расположите и сфокусируйтесь на кончике стеклянного микроэлектрода, прикрепленного к держателю электрода и головному столу. Управляйте сценой/микроэлектродом с помощью 3-осевого роботизированного микроманипулятора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих экспериментов убедитесь, что микроэлектроды имеют значения сопротивления 2-4 МОм и заполнены соответствующим внутренним раствором с токоизмерительными клещами. Внутренний раствор, используемый в репрезентативных экспериментах, содержит: 144 мМ K-глюконата, 0,2 мМ EGTA, 3 мМ MgCl2, 10 мМ HEPES, 8 мМ NaCl, 4 мМ Mg-АТФ и 0,5 мМ Na-ГТФ.
  4. Перед приближением к целевому нейрону Пуркинье добавьте 2-3 мл положительного давления воздуха в напорное отверстие держателя электрода.
  5. Переключитесь в режим VC на панели управления усилителем и примените функции компенсации электродов и смещения напряжения электрода. В приведенном ниже примере это можно сделать, нажав кнопку «Авто » рядом с параметрами компенсации электродов и смещения напряжения.
  6. Начните непрерывное тестирование мембранного уплотнения (нажмите «Испытание мембраны»). Установите параметры испытания мембраны на уровне (или близком) к скорости развертки 5 мВ с шагом 5 мВ или 10 мВ. Установите удерживающий потенциал (V-holding) равным 0 мВ.
  7. Переместите микроэлектрод к целевой клетке, регулируя фокальную плоскость так, чтобы фокус оставался на кончике электрода или немного ниже него. Расположите электрод немного выше плазматической мембраны целевой клетки. С помощью микроманипулятора и положительного давления кончика электрода оттолкните внеклеточный мусор от сомы клетки-мишени, «очищая» поверхностную мембрану.
  8. После того, как клетка-мишень будет очищена от внеклеточного мусора, медленно расположите электрод у поверхности мембраны на широком конце сомы нейрона Пуркинье, от которого аксон отходит от тела клетки. Когда кончик электрода опускается к мембране, на поверхности мембраны, скорее всего, станет видна ямочка (из-за положительного давления электрода). На этом этапе ослабьте положительное давление и используйте всасывание ртом, чтобы оказать небольшое отрицательное давление.
  9. На панели управления усилителем измените потенциал удержания напряжения на -80 мВ (с 0 мВ). Контролируя испытание на герметичность мембраны, когда сопротивление пипетки достигает ≥ 1 ГОм, увеличьте отрицательное давление и нажмите функцию Zap на панели Membrane Seal Test , чтобы разорвать мембрану и получить конфигурацию патч-зажима для всей ячейки.
  10. Используйте краткий протокол удержания напряжения для измерения пассивных свойств мембраны (значения емкости и входного сопротивления) перед переключением через панель управления усилителя в режим токового зажима.
  11. После переключения в режим токоизмерительных клещей примените компенсацию баланса моста до ≥ 70%.
  12. Перед применением динамического зажима проводимости с помощью патч-электрода следует скорректировать погрешность потенциала перехода (которая рассчитывается на основе состава внутреннего электрода и растворов ACSF). Для решений в репрезентативных экспериментах примените коррекцию потенциала перехода 17,5 мВ. В исследованиях динамических клещей точная коррекция потенциала перехода имеет решающее значение, чтобы точный сигнал напряжения использовался моделью (моделями) проводимости для расчета динамических инжекторов тока.

4. Применение динамической проводимости зажима

  1. Поскольку нейроны Пуркинье спонтанно активируют повторяющиеся потенциалы действия, они регистрируют свойства возбуждения перед добавлением (или вычитанием) смоделированной ионной проводимости для проверки здоровья клеток и измерения базовых свойств возбудимости мембраны. Примените смоделированную проводимость, нажав кнопку "Нагрузить " в окне настроек динамического зажима . Теперь на контроллере dPatch будет видна маленькая метка DynC , накладывающаяся на CC (см. Рисунок 1D, красные прямоугольники).
  2. После включения/загрузки динамического зажима проводимость динамического зажима применяется автоматически, пока активна процедура/протокол токовых зажимов. Просмотр динамической инжекции тока клещи в окне осциллографа, соответствующем выбранному входному сигналу AuxIN1 .
    Примечание: Чередование записей спонтанного возбуждения с применением и без применения динамических проводимостей, опосредованных зажимами, важно для определения того, как проводимость применяемой модели влияет на возбудимость, а также для определения того, являются ли исходные уровни возбудимости стабильными/постоянными на протяжении всего эксперимента.

Результаты

В представленных экспериментах мы применяем с помощью динамического зажима смоделированную потенциал-зависимую натриевую (Nav) проводимость к взрослым (6-7 недельным) нейронам мозжечка Пуркинье у взрослых (6-7 недель) мышей, которые остро выделены в препарате парасагиттального среза мозжечка. Исследования проведены на мышах дикого типа (контрольных) и трансгенных мышах, у которых используется рекомбинация Cre-loxP для селективного удаления туберозного склероза 1 (Tsc1) из нейронов мозжечка Пуркинье. Комплекс туберозного склероза (ТСК) — это мультисистемное расстройство, вызванное мутациями с потерей функции в TSC1 или TSC2 32,28,33. У людей с ТСК обычно диагностируют эпилептические расстройства, когнитивные нарушения и расстройства аутистического спектра34,35. Мыши с нейрон-специфичной делецией Tsc1 Пуркинье, обозначенной здесь как Tsc1mut/mut, демонстрируют несколько поведенческих фенотипов, связанных с РАС, включая нарушения моторной функции, поведения социального взаимодействия и вокализаций, а также преувеличенное повторяющееся поведение 9,36. Tsc1мут/мут Также было показано, что нейроны Пуркинье имеют ослабленное возбуждение потенциала действия (рис. 2A, B), что связано со значительным снижением амплитуды тока Nav (рис. 2C) и экспрессии канала Nav на начальных сегментах аксонов Tsc1mut/mut нейронов Пуркинье8. Навигационные токи в нейронахПуркинье Tsc1mut/mut обладают теми же кинетическими и потенциал-зависимыми свойствами, что и нейроны Пуркинье дикого типа8. В этой трансгенной мышиной модели Tsc1mut/mut мы использовали динамический зажим, чтобы проверить, может ли добавление проводимости Nav к нейронам Tsc1mut/mut Пуркинье спасти повторяющееся возбуждение. Далее мы проверяем, вызывает ли вычитание проводимости Nav в нейронах Пуркинье дикого типа аналогичное затухание в возбуждении нейронов Пуркинье, измеренное в нейронах Tsc1mut/mut Пуркинье (рис. 2B). Чтобы вычесть изначально выраженную проводимость Nav, мы применили проводимость Nav с помощью динамического зажима; Однако полярность проводимости обратная.

Марковская модель кинетического состояния (рис. 1A), используемая для моделирования проводимости нейронов Пуркинье, содержит девять кинетических состояний, восемь из которых являются непроводящими, которые помечены как замкнутые (C1, C2 и C3), инактивированно-закрытые (IC1 и IC2), быстро инактивированные (IF1 и IF2) и медленно инактивированные (IS). Существует одно открытое/проводящее (O) кинетическое состояние30,31. Константы скорости перехода, показанные между помеченными кинетическими состояниями (рис. 1A), определяют долю моделируемых каналов/проводимости, занимающих каждое кинетическое состояние. Напряжение мембраны влияет на каждую из констант скорости модели. Смоделированные навигационные токи, производимые этой моделью (in silico) в смоделированных экспериментах с потенциальными клещами, показаны (красным цветом) справа от навигационных токов, измеренных от остро изолированных нейронов Пуркинье, которые показаны черным цветом (рис. 1A, внизу). Команда напряжения, вызывающая эти симулированные (красный) и нейроны Пуркинье (черный) навигационные токи, представлена над трассами тока черным цветом. Обратите внимание, что в команде voltage, начальная ступень деполяризации (до 0 мВ) приводит к быстрому переходному внутреннему току натрия, который в моделируемой трассировке отражает каналы, переходящие из непроводящих замкнутых состояний в открытое кинетическое состояние, обеспечивая кратковременный внутренний ток до того, как открытые каналы накапливаются в быстро инактивированных (IF1 и IF2) кинетических состояниях. Этот шаг деполяризующего напряжения является коротким (5 мс), и затем мембранный потенциал повышается до промежуточного реполяризованного напряжения -45 мВ, при котором потенциал удерживается в течение 80 мс (рис. 1A, ниже). Примечательно, что во время этой ступени напряжения реполяризации происходит возрождение внутреннего натриевого тока, составляющей тока, называемой возрождающимся натриевым током (INaR). Во время этого шага в 80 мс до -45 мВ INaR демонстрирует медленное (по сравнению с INaT) затухание амплитуды, в конечном итоге достигая устойчивого состояния внутреннего тока, который является постоянной составляющей навигационного тока (INaP). Активация моделируемого INaR (рис. 1A, внизу, красный) во время реполяризации мембраны отражает восстановление смоделированных каналов из быстро инактивированных (IF1 + IF2) кинетических состояний в открытое/проводящее состояние. С течением времени (при напряжении -45 мВ) часть моделируемых каналов, занятых в открытом состоянии, накапливается в поглощающем медленно-инактивированном (IS) кинетическом состоянии, которое отражается при распаде INaR, а часть этих каналов остается в открытом/проводящем состоянии, отражаясь в виде установившегося в стационарном состоянии токовой составляющей30,31 INaP.

В репрезентативных экспериментах/результатах модель проводимости Нава Маркова (рис. 1A) была добавлена к взрослым нейронам Пуркинье в остро изолированных срезах мозжечка. Карикатурное изображение этой экспериментальной установки представлено на рисунке 3А. Для применения смоделированной проводимости Nav с помощью динамической инжекции тока зажима мы использовали усилительную систему dPatch (показанную на рисунке 3B), которая имеет полностью интегрированное аналого-цифровое (A/D) и цифро-аналоговое (D/A) преобразование. Эта система также обрабатывает преобразование сигналов с помощью интегрированных процессоров ядра ARM (внешних по отношению к ПК) и имеет встроенную схему FPGA (программируемая в полевых условиях) схему, которая обеспечивает почти мгновенную обработку входных сигналов и обратную связь (отправку выходных сигналов) на электрод27, вводящий ток. Эксперименты здесь включали применение (в динамическом зажиме) сложной марковской модели проводимости, которую нам удалось применить с текущей скоростью обновления инжекции до 500 кГц.

Добавление смоделированной проводимости Nav (400 нГц) к нейронам Tsc1mut/mut Пуркинье во время записи токового зажима без зазоров привело к явному увеличению частот повторяющегося возбуждения клеток (рис. 3C1, D1), что указывает на то, что добавление проводимости Nav в этих клетках может быть достаточным для устранения дефицита возбудимости нейрона Tsc1mut/mut Пуркинье, хотя мы не изучали полный репертуар дефицитов, зарегистрированных в Tsc1mut/mut Возбудимость нейронов Пуркинье8. Как видно из репрезентативных следов, показанных на рисунке 3C2 (вверху), нейроны Пуркинье дикого типа обладают внутренней способностью запускать повторяющиеся потенциалы действия на высоких частотах. Используя динамический зажим, мы вычли смоделированную проводимость Nav из нейронов Пуркинье дикого типа, применив смоделированную проводимость Nav с обратной (отрицательной) полярностью (-400 нС). Вычитание смоделированной проводимости Nav привело к немедленному и очевидному уменьшению повторяющегося возбуждения (рисунок 3C2, ниже), что также согласуется с гипотезой о том, что уменьшение токов Nav, измеренное в нейронах Tsc1mut/mut Пуркинье, способствует ослаблению свойств возбуждения, измеренных в этих клетках8. На нескольких нейронах Tsc1mut/mut или Пуркинье дикого типа эти эксперименты с динамическим зажимом, в которых проводимость Nav добавлялась или вычиталась соответственно, привели к последовательному влиянию на частоту возбуждения. Добавление проводимости Nav значительно (P = 0,029) увеличивало частоту возбуждения нейрона Пуркинье Tsc1mut/mut (рис. 3D1), а в нейронах Пуркинье дикого типа вычитание проводимости Nav значительно (P = 0,031) снижало частоту возбуждения (рис. 3D2) (парный t-критерий Стьюдента).

figure-results-1
Рисунок 1: Настройка марковской модели в программном обеспечении для динамических зажимов. (A) Показана диаграмма перехода состояний Маркова для модели, которая воспроизводит свойства проводимости Nav, измеренные в нейронах мозжечкаПуркинье 30 мыши. Эта модель включает в себя девять кинетических состояний. Из них 8 являются непроводящими состояниями: три закрытых (C), два инактивированно-закрытых (IC), два быстро инактивированных (IF) и одно медленно инактивированное (IS). Модель включает в себя одно открытое (O) кинетическое состояние, которое является проводящим. Между смежными кинетическими состояниями переходы между соединениями/занятостью состояний с течением времени определяются константами скорости перехода, отображаемыми как S0-S15. Обратите внимание, что каждому кинетическому состоянию также присваивается числовое значение (красный), что позволяет пользователям определять марковскую модель и ее топологию кинетического состояния в матрице стробируемого состояния (показана на панели C, описанной ниже). (B) Представлены панели/графические интерфейсы, с которыми пользователи работают в редакторе динамических зажимов SutterPatch. Обратите внимание, что расположение этих панелей Dynamic Clamp Editor не соответствует расположению в программном обеспечении Dynamic Clamp. Кроме того, отображаются не все панели, связанные с редактором динамических зажимов. (C) (верхняя панель) Показан пример матрицы состояний стробирования с введенными переменными, которые соответствуют топологии диаграммы перехода состояний, показанной на панели A. Красными прямоугольниками на матрице состояний стробирования выделена строка и столбец 7, которые соответствуют кинетическому состоянию модели с открытым (O). В столбце 7 перечислены все константы скорости, определяющие переходы в открытое (O) кинетическое состояние, а в строке 7 перечислены все константы скорости, определяющие переходы, выходящие из открытого (O) кинетического состояния. При такой организации матрица состояний стробирования описывает количество кинетических состояний, переменные константы скорости и топологию (взаимосвязи между кинетическими состояниями) модели. На рисунке (D) показаны панели/пользовательские интерфейсы SutterPatch, связанные с моделями динамической проводимости зажима при нагрузке, а также интерфейсы, участвующие в создании текущих подпрограмм зажимов. Взаимодействие пользователя с этими моделями описано в шагах протокола 2.17-2.20. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Нейроны Tsc1mut/mut Пуркинье имеют ослабленную возбудимость мембраны по сравнению с контрольной группой дикого типа. (A) Записи токового зажима всей клетки от нейронов дикого типа (верхний, черный) и Tsc1mut/mut (нижний, синий) показывают ослабленное возбуждение в мутантной клетке Tsc1 . (B) Сниженная частота возбуждения в нейронах Tsc1mut/mut Пуркинье, по сравнению с контрольной группой дикого типа, является последовательной для всех клеток. Средняя (±± SEM) частота спонтанного возбуждения Tsc1mut/mutнейронов Пуркинье значительно ниже (P < 0,0001) по сравнению с клетками дикого типа (непарный t-критерий Уэлча; контрольный N = 13, n = 32; Tsc1mut/mut N = 6, n = 21). (C) Измерения напряжения токов Nav во взрослых нейронах Пуркинье показывают, что средний (±± SEM) пик быстро переходящего тока Nav (INaT) значительно снижен в клетках Tsc1mut/mut по сравнению с контрольной группой дикого типа. (P = 0.007, RM двусторонний ANOVA; управление диким типом: N = 6, n = 22, черный; Tsc1mut/mut: N = 6, n = 16, синие квадраты). Примеры записейI NaT , вызванные ступенью деполяризации -35 мВ, показаны в виде вставной панели справа от панели C. Данные ранее опубликованы в Brown et al.8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Использование динамического зажима для определения влияния ионной проводимости на возбудимость нейронов Пуркинье. Динамический зажим включает в себя выборку напряжения мембраны (через записывающий электрод) и вычисление на основе дискретизированного напряжения выходного тока модельной проводимости. Затем рассчитанный ток подается на биологическую клетку с помощью электрода, вводящего ток. На панели (А) изображена эта экспериментальная схема. Если выборка напряжения выполняется с достаточной частотой и существует минимальная задержка (задержка) между выборкой напряжения и подачей вычисленного тока, этот метод может быть использован для оценки того, как добавление или вычитание моделируемой проводимости влияет на возбуждение нейронов и возбудимость мембраны. (B) В репрезентативных экспериментах динамические записи с зажимами были получены с помощью программного обеспечения SutterPatch и усилительной системы dPatch. dPatch представляет собой усилитель с зажимами, который имеет внешние сигнальные процессоры и полностью интегрированный дигитайзер, что делает его хорошо подходящим для динамических записей с зажимами (см. Обсуждение). (C) Репрезентативные записи токовых зажимов спонтанного возбуждения нейронов Пуркинье до и после использования динамического зажима для сложения или вычитания 400 нС моделируемой проводимости Nav (представлены на рисунке 1A). В C1 (слева) записи получены от нейрона Пуркинье Tsc1mut/mut с ослабленным возбуждением. Добавление проводимости 400 нS Nav приводит к явному увеличению частоты срабатывания этой ячейки. В качестве альтернативы, в C2 записи поступают от нейрона Пуркинье дикого типа. В этом эксперименте смоделированная проводимость Nav применяется с обратной полярностью (-400 нГс), что приводит к вычитанию проводимости Nav и явному снижению частоты повторяющихся срабатываний. Записи о динамическом токе клещи, показанные серым цветом, представлены под записями о потенциале возбуждения (напряжении), показанными черным цветом. (D) Результаты этих экспериментов с динамическим зажимом, представленные как изменения частоты спонтанного возбуждения после добавления проводимости Nav к нейронам Tsc1mut/mut Purkinje (D1, n = 3) или вычитания проводимости Nav из нейронов Пуркинье дикого типа (D2, n = 3), обнаруживают последовательные и значимые эффекты добавления или вычитания этой проводимости по Tsc1mut/mut (P = 0,029) и дикому типу (P = 0,029) и дикому типу (P = 0,031) ячеек, соответственно (парный t-критерий Стьюдента). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Обсуждение

Мозжечковые цепи функционируют в проприоцепции и моторном контроле37,38, но также имеют решающее значение для сложных форм поведения, таких как социальные взаимодействия и эмоциональная обработка 39,40,41. Патология структуры и функции мозжечка часто связана с РАС 42,43,44,45,46. Простая архитектура мозжечковых контуров47 и очевидная роль мозжечка в патологии РАС делают его привлекательной областью мозга для исследования молекулярных и клеточных драйверов поведенческого дефицита РАС, а также потенциальных терапевтических средств. Электрофизиология динамического зажима является важным инструментом для этих исследований, позволяя исследователям напрямую проверять причинно-следственные связи между связанными с РАС изменениями свойств ионных каналов/ионной проводимости и возбуждением нейронов мозжечка. В то время как методы динамического зажима особенно подходят для исследований изменений возбудимости нейронов, связанных с РАС, этот метод актуален для исследования ряда патологических механизмов, влияющих на клетки с возбудимыми мембранами. Кроме того, динамический зажим остается отличным инструментом для анализа сложных процессов, с помощью которых нейроны и мышечные клетки регулируют и поддерживают возбуждение потенциала соответствующего действия.

Точное выполнение экспериментов с динамическим зажимом требует тщательного контроля технических параметров. В частности, экспериментаторы должны знать и понимать последствия потенциальной изменчивости задержки между дискретизацией напряжения и инжекцией тока, часто называемой джиттером29, а также пассивные свойства электродов, ограничения пространственных зажимов и физиологическую точность исследуемого экспериментального препарата. Bettencourt et al. (2008)48 и Butera et al. (2001)29 ранее показали, что достижение высоких частот дискретизации не менее 50 кГц имеет решающее значение для точного захвата быстрых ионных проводимостей, при этом задержка обратной связи в идеале поддерживается ниже 25% (≤ 5 мкс) интервала дискретизации. Номинальная частота дискретизации, сообщаемая коммерческими системами, особенно платформами на базе Windows, может вводить в заблуждение; следовательно, часто необходима независимая проверка работоспособности, которая более подробно обсуждается в работах Milescu et al. (2008)25 и Clausen et al. (2012)49. Также необходимо учитывать ограничения пространственного зажима, особенно при работе с интактными нейронами, которые имеют сложную морфологию и неизопотенциальные свойства мембраны. Например, попытка применить (или вычесть) проводимость с помощью электрода, расположенного дистальнее интегрирующего сайта, такого как AIS, приведет к неточному изображению эффектов приложенной проводимости. Плохое (высокое) сопротивление электродов, недостаточная компенсация емкости и/или неспособность исправить ошибку потенциала перехода также могут привести к искажению измерений напряжения (входного сигнала) и, следовательно, к неправильному применению смоделированных ионных проводимостей50,51.

Тысячи моделей Маркова и HH находятся в свободном доступе для исследователей в онлайн-базах данных, таких как ModelDB52 и Channelpedia53, поддерживаемых проектом «Человеческий мозг» и Лабораторией нейронных микросхем соответственно. Эти базы данных включают модели синаптической проводимости, проводимости ионных каналов и модели нейронов на основе проводимости, которые в основном написаны на NEURON, MATLAB или Python. Файлы базы данных обычно содержат необходимые уравнения модели, а также любую различную информацию о типе (типах) клеток и экспериментах, которые легли в основу модели.

Обе модели проводимости Маркова и HH содержат проводящие (имитирующие открытые/активированные каналы) и непроводящие (имитируемые закрытые каналы) стробирующие состояния/переменные. Тем не менее, эти типы моделей различаются по способу расчета значения проводимости при каждом дискретизируемом напряжении, при этом марковские модели требуют большей вычислительной мощности, но обеспечивают большую детализацию стробирующих свойств моделируемых каналов. Например, в моделях HH проводящее и непроводящее состояния являются независимыми переменными, каждая из которых определяется кинетикой входного напряжения и стробирования соответствующего состояния54,55. В отличие от марковских моделей, модели HH не моделируют и не ограничивают переходы между стробируемыми состояниями, такие как переход моделируемых каналов из активированного/открытого кинетического состояния непосредственно в быстро инактивированное кинетическое состояние в потенциал-зависимой модели натриевой проводимости25. Это делает модели HH менее сложными в вычислительном отношении54,55 и позволяет исследователям добавлять несколько моделей HH с высокой проводимостью одновременно, сохраняя при этом высокую частоту выборки и обновления.

Марковские модели кинетических состояний состоят из дискретных кинетических состояний, которые могут быть проводящими или непроводящими, и эти состояния связаны между собой в фиксированной топологии. В моделях Маркова проводимость рассчитывается при каждом измеренном напряжении на основе доли моделируемых каналов, занимающих проводящие кинетические состояния. Доля моделируемых каналов, занимающих каждое кинетическое состояние (с течением времени), определяется константами скорости, которые являются параметрами, определяющими скорость, с которой занятость состояния переходит из одного кинетического состояния в другое. Константы скорости имеют единицы обратной секунды (с-1), представляющие вероятность перехода в единицу времени. В зависимости от модели значения константы скорости могут зависеть от динамических факторов, таких как напряжение или температура.

В моделях Маркова обыкновенные дифференциальные уравнения используются для описания зависимости от времени занятости каждого кинетического состояния. Эти уравнения определяют, как вероятность нахождения в каждом состоянии изменяется с течением времени, основываясь на константах скорости перехода. Она представлена матрицей скоростей Q:figure-discussion-156. Как обсуждалось выше, на константы скорости перехода (r), определяющие движение между состояниями, могут влиять входное напряжение (В) и параметры α и β, которые отражают кинетику проводимости по напряжениям. Эти уравнения могут быть описаны как: figure-discussion-2, и могут быть представлены визуально в виде графиков, включающих связи (константы скорости перехода) в каждое кинетическое состояние модели 56,57,58 и из него. Полезную дискуссию о развитии марковских моделей и их топологии можно найти в Schoening and Silva (2024)56.

С момента появления динамического зажима в его нынешней форме, в котором нелинейная ионная проводимость моделируется и применяется (с помощью электрода, инжектирующего ток) к живым клеткам в режиме реального времени19,59, методы и ресурсы для этого метода эволюционировали и становятся все более доступными и экономически эффективными благодаря таким инновациям, как недорогие системы на основе микроконтроллеров60 и бесплатное программное обеспечение с открытым исходным кодом23. 25,26. Коммерческие системы, такие как dPatch от Sutter Instrument или Cybercyte от Cytocybernetics, еще больше облегчают быстрое проведение экспериментов с динамическим зажимом благодаря интегрированным аппаратным и программным решениям27,61.

Универсальность динамического зажима позволяет использовать его в различных областях, включая создание виртуальных химических и электрических синапсов, встраивание реальных нейронов в искусственные сети (или наоборот) и добавление виртуальных ионных каналов62. Важно отметить, что зависимость от напряжения, кинетические свойства и амплитуды приложенной проводимости могут быть быстро отрегулированы, что позволяет исследователям непосредственно проверить, как масштабирование одного или нескольких параметров влияет на потенциальное возбуждение ивозбудимость мембраны. Современные системы обеспечивают высокую частоту дискретизации, что позволяет точно применять быстрые переходные проводимости и могут быть легко интегрированы с обычным электрофизиологическим оборудованием 60,63, что делает динамический зажим идеальным методом для углубления нашего понимания функции и дисфункции нейронов.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Телли Галиацатоса и Джоша Стэнфорда из Sutter Instrument за их помощь в технических запросах. Мы также выражаем признательность и благодарность Яну Дольцеру за помощь в инициировании исследований динамических зажимов dPatch.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
CaCl2Фишер КемикалC79-500 Реагент
Капиллярная стеклянная трубка, боросциликированная стандартная стена, OD 1,5 мм, ID 0,86 мм, длина 10 смWarner Instruments64-0793Оборудование
CleanBenchTMC63-9090EОборудование
Компрессионный вибратом VF-500-Z Предсцисионные инструментыhttps://precisionary.com/product-category/compresstome-parts/parts-by-model/vf-500-0z/Оборудование
Dell OptiPlex 7080Лощинаhttps://www.dell.com/en-us/shop/desktop-computers/optiplex-7080-tower-and-small-form-factor/spd/optiplex-7080-desktop/s005o7080sffusОборудование
ГлюкозаФишер КемикалD16-500 Реагент
Система усилителя dPatchИнструмент СаттераFG-DPATCHОборудование
EGTAEMD Миллипор324626-25GMРеагент
HEPESФишер Кемикал7365-45-9Реагент
Встроенный нагревательWarner Instruments64-0102Оборудование
KClФишер КемикалP330-500 Реагент
КетаминDechra Veterinary Products193.40620.3 Реагент
K-глюконатTCI ChemicalsG0040Реагент
Программное обеспечение LinLabScientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-linlab-2Оборудование
Водяная ванна LSE 6LКорнинг6783Оборудование
Mg-ATPСигма-Олдрич74804-12-9Реагент
MgCl2Фишер Кемикал012288.A9Реагент
Модель P-1000 Pipette pullerИнструмент СаттераFG-P1000Оборудование
NaClФишер КемикалS271-500 Реагент
Na-GTPMP Biomedicals56001-37-7Реагент
2PO4Дж.Т. Бейкер02-004-220 Реагент
NaHCO3Фишер КемикалS233-500 Реагент
Офтальмологическое программное обеспечениеDigital Optics Limitedhttps://www.scientifica.uk.com/products/qimaging-ocular-softwareОборудование
ЛезвиеPersonna60-0139-CTNОборудование
Слайс-арфаWarner Instruments64-0255Оборудование
SliceScope Pro 3000Scientificahttps://www.scientifica.uk.com/products/slicescope-pro-3000Оборудование
СуперклейЛоктайт8040-00-142-9193Оборудование
Программное обеспечение SutterPatchИнструмент Саттераhttps://www.sutter.com/amplifiers/sutterpatchОборудование
Регулятор температурыWarner Instruments64-2400Оборудование
КсилазинMP Biomedicals158307Реагент

Ссылки

  1. Zoghbi, H. Y., Bear, M. F. Synaptic dysfunction in neurodevelopmental disorders associated with autism and intellectual disabilities. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (3), a009886-a009886 (2012).
  2. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nat Commun. 5 (1), 4742(2014).
  3. Connor, S. A., et al. Altered cortical dynamics and cognitive function upon haploinsufficiency of the autism-linked excitatory synaptic suppressor MDGA2. Neuron. 91 (5), 1052-1068 (2016).
  4. Pagani, M., et al. mTOR-related synaptic pathology causes autism spectrum disorder-associated functional hyperconnectivity. Nat Commun. 12 (1), 6084(2021).
  5. Tang, G., et al. Loss of mTOR-dependent macroautophagy causes autistic-like synaptic pruning deficits. Neuron. 83 (5), 1131-1143 (2014).
  6. Fatemi, S. H., Eschenlauer, A., Aman, J., Folsom, T. D., Chekouo, T. Quantitative proteomics of dorsolateral prefrontal cortex reveals an early pattern of synaptic dysmaturation in children with idiopathic autism. Cereb Cortex. 34 (13), 161-171 (2024).
  7. Deneault, E., et al. Complete disruption of autism-susceptibility genes by gene editing predominantly reduces functional connectivity of isogenic human neurons. Stem Cell Rep. 11 (5), 1211-1225 (2018).
  8. Brown, S. P., Jena, A. K., Osko, J. J., Ransdell, J. L. Tsc1 deletion in Purkinje neurons disrupts the axon initial segment, impairing excitability and cerebellar function. Neurobiol Dis. 207, 106856(2025).
  9. Tsai, P. T., et al. Autistic-like behaviour and cerebellar dysfunction in Purkinje cell Tsc1 mutant mice. Nature. 488, 647-651 (2012).
  10. Sundberg, M., et al. Purkinje cells derived from TSC patients display hypoexcitability and synaptic deficits associated with reduced FMRP levels and reversed by rapamycin. Mol Psychiatry. 23, 2167-2183 (2018).
  11. Brumback, A., Sohal, V. Intrinsic excitability defects in specific subtypes of medial prefrontal cortex pyramidal neurons in a mouse model of autism. Neurology. 82 (10), I4-1.010(2014).
  12. Mitchell, D. E., Miranda-Rottmann, S., Blanchard, M., Araya, R. Altered integration of excitatory inputs onto the basal dendrites of layer 5 pyramidal neurons in a mouse model of Fragile X syndrome. Proc Natl Acad Sci U S A. 120 (2), e2208963120(2023).
  13. Sanders, S. J., et al. De novo mutations revealed by whole-exome sequencing are strongly associated with autism. Nature. 485, 237-241 (2012).
  14. Ben-Shalom, R., Keeshen, C. M., Berrios, K. N., An, J. Y., Sanders, S. J., Bender, K. J. Opposing effects on NaV1.2 function underlie differences between SCN2A variants observed in individuals with autism spectrum disorder or infantile seizures. Biol Psychiatry. 82 (3), 224-232 (2017).
  15. Spratt, P. W. E., et al. The autism-associated gene Scn2a contributes to dendritic excitability and synaptic function in the prefrontal cortex. Neuron. 103 (4), 673-685.e5 (2019).
  16. Nelson, A. D., et al. Physical and functional convergence of the autism risk genes Scn2a and Ank2 in neocortical pyramidal cell dendrites. Neuron. 112 (7), 1133-1149.e6 (2024).
  17. Zhang, J., et al. Severe deficiency of the voltage-gated sodium channel NaV1.2 elevates neuronal excitability in adult mice. Cell Rep. 36 (5), 100858(2021).
  18. Sharp, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. Artificial electrical synapses in oscillatory networks. J Neurophysiol. 67 (6), 1691-1694 (1992).
  19. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends Neurosci. 16 (10), 389-394 (1993).
  20. Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. J Neurosci Methods. 49 (3), 157-165 (1993).
  21. Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends Neurosci. 27 (4), 218-224 (2004).
  22. Muñiz, C., Arganda, S., Rodríguez, F. B., De Polavieja, G. G. Realistic stimulation through advanced dynamic-clamp protocols. Computational Methods in Neural Modeling. Mira, J., Álvarez, J. R. , Springer. Berlin. 95-105 (2005).
  23. Ortega, F. A., Butera, R. J., Christini, D. J., White, J. A., Dorval, A. D. Dynamic clamp in cardiac and neuronal systems using RTXI. Methods Mol Biol. 1183, 327-354 (2014).
  24. Milescu, L. S., Tabak, J. Dynamic clamp on a Windows PC. Methods Mol Biol. 2188, 157-177 (2021).
  25. Milescu, L. S., Yamanishi, T., Ptak, K., Mogri, M. Z., Smith, J. C. Real-time kinetic modeling of voltage-gated ion channels using dynamic clamp. Biophys J. 95 (1), 66-87 (2008).
  26. Kemenes, I., et al. Dynamic clamp with StdpC software. Nat Protoc. 6 (3), 405-417 (2011).
  27. Dolzer, J. Patch clamp technology in the twenty-first century. Methods Mol Biol. 2188, 21-49 (2021).
  28. Crino, P. B., Henske, E. P. New developments in the neurobiology of the tuberous sclerosis complex. Neurology. 53 (7), 1384-1390 (1999).
  29. Butera, R. J., Wilson, C. G., DelNegro, C. A., Smith, J. C. A methodology for achieving high-speed rates for artificial conductance injection in electrically excitable biological cells. IEEE Trans Biomed Eng. 48 (12), 1460-1470 (2001).
  30. Ransdell, J. L., Moreno, J. D., Bhagavan, D., Silva, J. R., Nerbonne, J. M. Intrinsic mechanisms in the gating of resurgent Na+ currents. eLife. 11, e70173(2022).
  31. Brown, S. P., Lawson, R. J., Moreno, J. D., Ransdell, J. L. A reinterpretation of the relationship between persistent and resurgent sodium currents. J Neurosci. 44 (29), e2396232024(2024).
  32. European Chromosome 16 Tuberous Sclerosis Consortium. Identification and characterization of the tuberous sclerosis gene on chromosome 16. Cell. 75 (7), 1305-1315 (1993).
  33. Henske, E. P., Jóźwiak, S., Kingswood, J. C., Sampson, J. R., Thiele, E. A. Tuberous sclerosis complex. Nat Rev Dis Primers. 2 (1), 16036(2016).
  34. Wiznitzer, M. Autism and tuberous sclerosis. J Child Neurol. 19 (9), 675-679 (2004).
  35. Jeste, S. S., Sahin, M., Bolton, P., Ploubidis, G. B., Humphrey, A. Characterization of autism in young children with tuberous sclerosis complex. J Child Neurol. 23 (5), 520-525 (2008).
  36. Lawson, R. J., et al. Selective deletion of Tsc1 from mouse cerebellar Purkinje neurons drives sex-specific behavioral impairments linked to autism. Front Behav Neurosci. 18, 1474066(2024).
  37. Sherrington, C. S. The Integrative Action of the Nervous System. , Yale University Press. New Haven. (1911).
  38. Russell, J. S. R., Horsley, V. A. H. II Experimental researches into the functions of the cerebellum. Proc R Soc Lond. 55, 57-60 (1894).
  39. Rudolph, S., et al. Cognitive-affective functions of the cerebellum. J Neurosci. 43 (45), 7554-7564 (2023).
  40. Schmahmann, J. D. The cerebellum and cognition. Neurosci Lett. 688, 62-75 (2019).
  41. Beuriat, P. -A., Cristofori, I., Gordon, B., Grafman, J. The shifting role of the cerebellum in executive, emotional and social processing across the lifespan. Behav Brain Funct. 18 (1), 6(2022).
  42. Stoodley, C. J. Distinct regions of the cerebellum show gray matter decreases in autism, ADHD, and developmental dyslexia. Front Syst Neurosci. 8, 92(2014).
  43. Bruchhage, M. M. K., Bucci, M. -P., Becker, E. B. E. Cerebellar involvement in autism and ADHD. Handb Clin Neurol. 155, 61-72 (2018).
  44. Mosconi, M. W., Wang, Z., Schmitt, L. M., Tsai, P., Sweeney, J. A. The role of cerebellar circuitry alterations in the pathophysiology of autism spectrum disorders. Front Neurosci. 9, 296(2015).
  45. Weber, A. M., Egelhoff, J. C., McKellop, J. M., Franz, D. N. Autism and the cerebellum: evidence from tuberous sclerosis. J Autism Dev Disord. 30 (6), 511-517 (2000).
  46. Wang, S. S. -H., Kloth, A. D., Badura, A. The cerebellum, sensitive periods, and autism. Neuron. 83 (3), 518-532 (2014).
  47. Ransdell, J. L., Nerbonne, J. M. Voltage-gated sodium currents in cerebellar Purkinje neurons: functional and molecular diversity. Cell Mol Life Sci. 75 (19), 3495-3505 (2018).
  48. Bettencourt, J. C., Lillis, K. P., Stupin, L. R., White, J. A. Effects of imperfect dynamic clamp: computational and experimental results. J Neurosci Methods. 169 (2), 282-289 (2008).
  49. Clausen, C., Valiunas, V., Brink, P. R., Cohen, I. S. MATLAB implementation of a dynamic clamp with bandwidth of >125 kHz capable of generating INa at 37°C. Pflugers Arch. 465 (4), 497-507 (2013).
  50. Preyer, A. J., Butera, R. J. The effect of residual electrode resistance and sampling delay on transient instability in the dynamic clamp system. Annu Int Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. 2007, 430-433 (2007).
  51. Preyer, A. J., Butera, R. J. Causes of transient instabilities in the dynamic clamp. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 17 (2), 190-198 (2009).
  52. McDougal, R. A., et al. Twenty years of ModelDB and beyond: building essential modeling tools for the future of neuroscience. J Comput Neurosci. 42 (1), 1-10 (2017).
  53. Ranjan, R., et al. Channelpedia: an integrative and interactive database for ion channels. Front Neuroinform. 5, 36(2011).
  54. Carbonell-Pascual, B., Godoy, E., Ferrer, A., Romero, L., Ferrero, J. M. Comparison between Hodgkin-Huxley and Markov formulations of cardiac ion channels. J Theor Biol. 399, 92-102 (2016).
  55. Andreozzi, E., Carannante, I., D'Addio, G., Cesarelli, M., Balbi, P. Phenomenological models of NaV1.5. A side by side, procedural, hands-on comparison between Hodgkin-Huxley and kinetic formalisms. Sci Rep. 9 (1), 17493(2019).
  56. Schoening, M. E., Silva, J. R. Creating Computational Models of Ion Channel Dynamics. Potassium Channels: Methods and Protocols. , Springer. New York. (2024).
  57. Mangold, K. E., et al. Identification of structures for ion channel kinetic models. PLoS Comput Biol. 17 (8), e1008932(2021).
  58. Silva, J. R., Cooper, P., Nichols, C. G. Modeling KATP-dependent excitability in pancreatic islets. Biophys J. 107 (9), 2016-2026 (2014).
  59. Sharp, A. A., O'Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. J Neurophysiol. 69 (3), 992-995 (1993).
  60. Desai, N. S., Gray, R., Johnston, D. A dynamic clamp on every rig. eNeuro. 4 (5), (2017).
  61. Han, L., et al. Reconciling computer models and stem cell models of human cardiac repolarization: reply. Cardiovasc Res. 106 (1), 6-7 (2015).
  62. Wilders, R. Dynamic clamp: a powerful tool in cardiac electrophysiology. J Physiol. 576 (2), 349-359 (2006).
  63. Kullmann, P. H. M., Wheeler, D. W., Beacom, J., Horn, J. P. Implementation of a fast 16-bit dynamic clamp using LabVIEW-RT. J Neurophysiol. 91 (1), 542-554 (2004).

Перепечатки и разрешения

Теги

Методы динамического зажима для исследования нарушенной возбудимости нейронов, связанной с аутизмом
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.