Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

В естественных условиях Конфокальная микроскопия в диагностике и лечении синдрома сухого глаза: фокус на протоколах визуализации и интерпретации

1.4K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69156

⸱

11 ноября 2025 г.

 ,  , 
1Hankou Aier Eye Hospital, 2Aier Eye Hospital of Wuhan University, 3School of Stomatology and Ophthalmology, Xianning Medical College, Hubei University of Science and Technology

В этой статье

Краткое содержание

В этой статье демонстрируется работа и эффект конфокальной микроскопии in vivo в диагностике и лечении сухого глаза, а также исследуется применение и результаты конфокальной микроскопии in vivo , чтобы обеспечить основу для будущих исследований.

Аннотация

Конфокальная микроскопия in vivo (ИВКМ) привлекла значительное внимание благодаря своему неинвазивному характеру и высокому разрешению. Он позволяет in vivo наблюдать и объективно количественно оценивать многочисленные структуры глазной поверхности, связанные с болезнью сухого глаза (DED), включая роговицу, конъюнктиву, край века, мейбомиевые железы и паразитов, таких как демодекс, на клеточном уровне. Эта возможность помогает офтальмологам выявлять конкретные этиологии и подтипы ДЭД, тем самым способствуя точной диагностике, целенаправленному лечению и прогностической оценке. Тем не менее, стандартизированные протоколы для работы IVCM и отчетности по-прежнему отсутствуют. Владение как офтальмологическими знаниями, так и технической эксплуатацией имеет важное значение для эффективного использования этого устройства и создания высококачественных отчетов. В данной статье подробно описаны процедурные этапы и нюансы обследования ИВКМ у пациентов с СДД. Это первый пошаговый протокол IVCM в JoVE для DED. Он призван служить ориентиром для клиницистов, помогая им избежать операционной неэффективности и постоянно получать высококачественные изображения роговицы и глазной поверхности для руководства клиническим ведением.

Введение

Из-за ограниченности местных медицинских ресурсов или финансового бремени пациента клинический диагноз ДЭД часто фокусируется только на базовом аспекте (например, наблюдение под микроскопом с щелевой лампой, жалобы на сухость и зуд глаз) или даже на одном показателе (например, время разрушения инвазивной слезной пленки, тест слезной секреции или заражение демодексом). Приложение IVCM не является широко доступным, не говоря уже о стандартизации протоколов для него. Тем не менее, для офтальмологических учреждений, оснащенных IVCM, автор рекомендует впервые пройти комплексное микроскопическое обследование, чтобы избежать пропусков, включая роговицу, конъюнктиву и пальпебральный край. Для неоднозначных случаев DED или для обнаружения демодекса, IVCM особенно подходит для явного ответа.

Болезнь сухого глаза (ДЭД) определяется как хроническое заболевание глазной поверхности, вызванное аномалиями качества или количества слезной жидкости и снижением стабильности слезной пленки. На семинаре по сухости глаз II (DEWS II) DED классифицируется на пять типов: синдром сухого глаза с дефицитом воды (ADE), испаряемый сухой глаз (EDE), смешанная сухость глаз (MDE), предрасположенность к сухости глаз и доклиническое состояние сухого глаза1. Ralene et al. обобщили важную клиническую практику IVCM при различных типах сухого глаза, включая литературу, опубликованную с 2017 по 2022 год2. Последние исследования показали, что воспаление играет ключевую роль в патогенезе DED 3,4. В частности, плотность дендритных клеток (ДК) может быть хорошим индикатором ДЭД, связанного с системным иммуноопосредованным процессом5.

В IVCM используется технология конфокальной лазерной томографии. Он обеспечивает горизонтальное и вертикальное разрешение 1 мкм. Подробные технические характеристики устройства задокументированы в отчете Jeremy et al6. При обследовании глазной поверхности ИВКМ сначала наносят на роговицу7, затем на конъюнктиву и мейбомиавы железы8. Демодексный блефарит привлекает все большее клиническое внимание в последние годы 9,10. IVCM обеспечивает четкие изображения роговицы, конъюнктивы и пальпебрального края. Эти изображения позволяют клиницистам оценить статус заболевания и облегчить визуализацию и количественную оценку воспалительных и иммунных клеток.

При оценке DED мы уделяем особое внимание: эпителиальные клетки роговицы (CEC); субэпителиальные нервные волокна (ОСН); межэпителиальные и субэпителиальные воспалительные/иммунные клетки; конъюнктивальные бокаловидные клетки (КГК); воспалительные/иммунные клетки конъюнктивы; ацинусы и отверстия мейбомиевых желез; Demodex folliculorum и Demodex brevis; и воспалительные клетки в окружающих тканях. Этот акцент обусловлен патофизиологией: дисфункция мейбомиевых желез приводит к снижению секреции или изменению состава липидного слоя слезной пленки, что приводит к ускоренному испарению слезы и повреждению глазной поверхности. Заражение демодексом способствует зуду и дискомфорту в глазах. CGC секретируют муцин, критически важный компонент слезной пленки; их истощение может вызвать дефицит муцина DED. И наоборот, сам DED повреждает поверхностные структуры глаза, включая CEC и SNF, и впоследствии повышает плотность воспалительных/иммунных клеток в тканях роговицы и конъюнктивы. После получения идеальных картин мы можем эффективно использовать встроенные в программное обеспечение количественные инструменты для подсчета множества упомянутых ячеек (Рисунок 1). Но для определения морфологического разнообразия ОЯТ нам необходимо полагаться на аналитическое программное обеспечение, которое поможет в количественной оценке 11,12.

IVCM незаменим для оценки слоев роговицы, нервных волокон и воспалительных/иммунных клеток в тканях глазной поверхности в режиме реального времени. Для оценки ХГК альтернативным методом служит импрессионная цитология. Этот метод нацелен на конъюнктиву свода, где плотность бокаловидных клеток достигает пика, давая значения, обычно превышающие измерения IVCM13,14. Тем не менее, результаты зависят от вариабельности окрашивания и опыта оператора, в то время как трудоемкий протокол ограничивает рутинное клиническое внедрение. Обструкцию отверстия мейбомиевой железы можно непосредственно наблюдать с помощью микроскопии с помощью щелевой лампы, однако этот метод не может обнаружить закупорку, вызванную Demodex brevis, которую точно идентифицирует IVCM. Для диагностики заражения демодексом недорогим методом является эпиляция ресниц с помощью световой микроскопии. Несмотря на техническую простоту, этот подход имеет существенные ограничения: дискомфорт пациента ограничивает многократный отбор проб, клещи, находящиеся глубоко в фолликулах ресниц или отверстиях мейбомиевых желез, остаются необнаруживаемыми15. В отличие от этого, IVCM позволяет всесторонне исследовать множественные участки края века, включая фолликулы ресниц и отверстия мейбомиевых желез, с минимальным дискомфортом для пациента. Этот подход позволяет достичь значительно более высоких показателей диагностического положительного результата за счет визуализации паразитов in vivo в режиме реального времени в их микросреде обитания16,17.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Процедура обследования была одобрена Этическим комитетом офтальмологической больницы Ханькоу Айер, и от всех пациентов было получено информированное согласие.

ПРИМЕЧАНИЕ: Критерии включения для отбора пациентов включают пациентов с жалобами на сухость и зуд в глазах, а также лиц, обращающихся за регулярными осмотрами глаз. Критериями исключения для отбора пациентов являются пациенты с перфорацией роговицы или предстоящей перфорацией роговицы, пациенты с аллергией на местные глазные анестетики, лица слишком молоды (например, до 3 лет) или слишком стары, чтобы сотрудничать, пациенты с узкими глазными щелями, неспособными вместить зеркало века, беременные женщины и лица, неспособные сотрудничать по другим причинам. Краткая схема рабочего процесса приведена на рисунке 2. А подробные этапы операции следующие.

1. Предварительное обследование

  1. Подготовка материалов: аппарат IVCM, контактный колпачок роговицы, офтальмологический анестетик для местного применения, связующее вещество, ватные палочки медицинские, зеркало для век, спиртовые шарики, спиртовой резервуар, противовоспалительные глазные капли (рис. 3).
  2. Разберитесь в ключевых компонентах оборудования IVCM (модуль Гейдельбергского томографа сетчатки Rostock Cornea Module (HRT-RCM)), ручку фокусировки, камеру мониторинга, индикатор для наведения взгляда, подставку для подбородка, подставку для лба, кнопку для переключения между левым/правым глазом, поворотные ручки для трехосного перемещения HRT-RCM, кнопку захвата изображения и ножную педаль, компьютер со специальным программным обеспечением IVCM) и подготовьте устройство IVCM с помощью соединительного геля.
  3. Подготовка к экзаменатору: Наденьте маску и продезинфицируйте руки гелем на спиртовой основе или наденьте одноразовые перчатки.
  4. Дезинфекция прибора: Протрите лоб и подбородок оборудования спиртовыми тампонами.
  5. Объяснение процедуры: Кратко объясните пациенту, что обследование безболезненно, чтобы облегчить беспокойство.

2. Во время обследования

  1. Проверьте и создайте новую карту пациента с помощью соответствующего программного обеспечения на компьютере.
  2. Введение местного анестетика: Введите две капли в нижний свод с интервалом в 3 минуты до процедуры.
  3. Подготовьте модуль роговицы rostock (RCM) устройства IVCM: Покройте область, излучающую лазер, RCM гелем для связывания (убедитесь в отсутствии пузырьков воздуха) (Рисунок 4 и Рисунок 5), и только достаточное количество связующего агента (обычно одна или две капли, не слишком много) может обеспечить полный контакт с контактным колпачком роговицы и в конечном итоге достичь идеального интерфейса обнуления. Прикрепите одноразовый контактный колпачок роговицы.
  4. Позиционирование устройства: Полностью втяните RCM. Закрепите упор для лба горизонтально. Настройте камеру наблюдения на временную сторону объекта. Найдите положение точки остановки камеры, которое перпендикулярно оптической оси RCM.
  5. Калибровка фокуса: вращайте ручку фокусировки до тех пор, пока программное обеспечение не отобразит максимально развернутый белый фильтр со значением качества изображения ровно 100. Сбросьте значение глубины в ноль (обнуление).
  6. Выбор режима сканирования: по умолчанию используется режим раздела , если не указано иное. Для наблюдения за активностью клещей демодекса можно использовать режим последовательности для непрерывной записи динамических изображений.
  7. Расположите пациентов: Плотно положите подбородок на подбородок. Прижмитесь лбом к упору для лба. Отрегулируйте смотровой стол и подбородок в соответствии с ростом пациента.
  8. Вставьте зеркало для век: Попросите пациента смотреть вниз, используя ватный тампон, чтобы поднять верхнее веко для размещения, и попросите пациента смотреть вверх, осторожно опуская нижнее веко ватным тампоном для размещения.
  9. Заключительные инструкции: Подтвердите правильное положение головы. Напомните пациенту о необходимости оставаться расслабленным и избегать движений. Немедленно сообщите о любом дискомфорте.
  10. Протокол обследования роговицы
    1. Начните с макроскопического выравнивания: визуально отрегулируйте RCM, чтобы приблизиться к верхушке роговицы (Рисунок 6). Переключитесь на камеру наблюдения устройства для тонкой настройки по мере приближения RCM к роговице. Помогите пациенту повернуть взгляд в поисках пораженной роговицы, центрируя поражение под RCM. Поддерживайте мягкий контакт, чтобы избежать повреждения роговицы.
    2. Основной метод: контактный колпачок роговицы имеет большой физический размер, но чрезвычайно маленькую оптическую зону (ограниченную центральной областью, излучающей лазер). Важнейшее требование: Обеспечьте высокоточный контакт между колпачком и тканью мишени, так как плохая адгезия приводит к появлению артефактов визуализации (например, пузырьков, масляных помех или полной потери сигнала).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для непрерывной визуализации нажмите ножную педаль для длительного сканирования, чтобы получить последовательные изображения глубины и не пропустить важные данные.
  11. Оценка слоистости роговицы: сканирование от поверхностных к глубоким слоям в следующем порядке: CEC, SNF, субэпителиальные воспалительные клетки.
    1. Сосредоточьтесь на нижней мутовке, которая является рекомендуемым ориентиром, и прилегающих верхних/нижних областях18.
  12. Исследование конъюнктивы носа
    1. Сбросьте фокальную плоскость до нулевого значения глубины. Нанесите соединительный гель на колпачок. Проинструктируйте пациента смотреть во времени или в нижневременном направлении. Аккуратно нанесите RCM на поверхность конъюнктивы. Одновременные маневры: отрегулируйте положение RCM для оптимального поля зрения правой рукой. Поверните ручку фокусировки, чтобы определить бокальные клетки в самом внешнем слое конъюнктивы левой рукой.
  13. Удаление зеркала века: Проинструктируйте пациента смотреть вниз и с помощью ватного тампона приподнять верхнее веко для удаления. И проинструктируйте пациента посмотреть вверх, и аккуратно надавите на нижнее веко тампоном для удаления.
  14. Сброс устройства: Отпустите и поднимите подставку для лба. Обнулите ручку фокусировки. Повторно нанесите соединительный гель на поверхность RCM.
  15. Оценка мейбомиевой железы и фолликулов ресниц
    1. Положение пациента: Проинструктируйте взгляд вниз. Маневр осмотрителя: Осторожно приподнимите и надавите на кожу верхнего века внутрь, чтобы выровнять край века параллельно плоскости роговичного колпачка. Переместите RCM по горизонтали, чтобы просмотреть больше изображений с однотипной структурой; Перемещайте RCM вертикально (снизу вверх), чтобы переключиться с осмотра отверстий мейбомиевой железы на ацинусы, а затем на корни ресниц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Новички могут отвести веко для лучшего раскрытия при осмотре отверстий мейбомиевых желез. Мы предлагаем расположение осмотра в центральной 1/3 верхнего века для этой части.
    2. Количественные стандарты (институциональный протокол): Оцените 8 последовательных фолликулов с соседними15 ацинусами и исследуйте 4-8 последовательных отверстий желез. Калибровка глубины: Для получения четких изображений фолликулов сосредоточьтесь до тех пор, пока клещи Demodex не покажут резкие границы (если они присутствуют). Для получения четких изображений ациниса рекомендуемое значение составляет около 30-50 мкм глубины. А для отверстий она составляет около 30 μм (отрегулируйте видимость Demodex brevis в случае заражения)19.

3. Последующий осмотр

  1. Уход после процедуры: Соблюдайте гигиену рук и тщательно дезинфицируйте руки. Аккуратно сотрите остатки геля, разрывы или мусор с поверхности глаза с помощью ватного тампона. Введите глазные капли с антибиотиком для предотвращения инфекции.
  2. Инструкции для пациента: Посоветуйте пациенту не тереть глаза в день обследования.
  3. Отчеты: всесторонний анализ всех полученных изображений и создание диагностического отчета. Требования к отчетности: Включите по крайней мере одно изображение для каждой структуры ткани, добавляя больше для аномальных результатов по мере необходимости. Все отобранные изображения должны быть упорядочены по последовательности исследования и значению глубины, за которыми последуют точные описания и измерения.
  4. Инструкции по утилизации отходов: Одноразовые материалы (контактные колпачки, тампоны, контейнеры для анестетиков) выбрасывайте их в мусорное ведро для дальнейшей профессиональной утилизации.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Все микроскопические изображения IVCM были получены с разрешением 384 пикселя × 384 пикселей, поле наблюдения 400 мкм × 400 мкм. При правильном «обнулении» это исследование покажет только три возможных результата в кадре изображения: 1) Изображение вообще отсутствует (неудачный эксперимент): Центральная оптическая зона не контактировала с целевой тканью. ii) Только частичное изображение (Рисунок 7) или другие аномальные ситуации (Рисунок...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Поиск литературы в PubMed по ключевым словам «конфокальная микроскопия in vivo » и «болезнь сухого глаза» (по состоянию на июнь 2025 года) дал > 300 публикаций. Примечательно, что с 2021 года ежегодные темпы публикаций стабилизировались на уровне примерно 40 статей в год. Более широкое применение IVCM при заболеваниях глазной поверхности привело к > 2000 исследований за последние два десятилетия (2004-2024). С клинической точки зрения, IVCM произвел революцию в оценке патологий ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы благодарят Лину Цзинь из офтальмологической больницы Ханькоу Айер и Мин Чен из офтальмологического отделения Уханьской азиатской кардиологической больницы за помощь в подготовке нескольких снимков, а также всех участников и сотрудников, работающих над операционной процедурой. Это исследование было поддержано грантом от Научно-исследовательских проектов Муниципальной комиссии здравоохранения Уханя (WX23A20).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Впитывающие ватные шарикиЦзянь Ци, Китайhttp://www.hnjianqi.comДля изготовления спиртовых шариков, маленьких
Гель на спиртовой основеЛи Кан, Шанхай, Китай31107904Гель для антисептиков для рук без ополаскивания, 500 мл
Глазные капли КарбомерВидишик, Германия8187195Стерильный офтальмологический гель для соединяющего агента, 10 г
Контактная колпачка роговицы (TomoCap)Гейдельберг, Германия18829Оптическая среда и асептический контакт с роговицей
Спекулум векаАсикон, Китай6102AЗа открытие глаз
Программное обеспечение Heidelberg Eye ExplorerГейдельберг, ГерманияВерсия 1.5.2.0Программное обеспечение, которое идёт в комплекте с устройством IVCM
Устройство IVCMГейдельберг, ГерманияHRT-?,08398Основное оборудование экзамена
Медицинские ватные палочкиEsound Med, Китайwww.e-soundmed.comДля очистки глаз пациента и помощи при их открытии — 10 см
75% лекарственного алкоголяХУИЧАНГ, Китайwww.huichang888.cnДля изготовления спиртовых шариков — 75% и плюсм; 5% 500 мл
0,4% глазные капли с оксибупрокаином и гидрохлоридомСантэн, Японияhttp://www.santen.co.jpОфтальмологический топический анестетик, 0,4% (0,5 мл: 2 мг)
Глазные капли тобрамицинаTOBREX, Бельгия8453824Противовоспалительные глазные капли, 0,3% (5 мл: 15 мг)

Ссылки

  1. Craig, J. P., et al. TFOS DEWS II definition and classification report. Ocul Surf. 15 (3), 276-283 (2017).
  2. Ralene, S., Kenneth, Y., Yu-Chi, L., Louis, T. In vivo confocal microscopy in different types of dry eye and meibomian gland dysfunction. J Clin Med. 11, 2349(2022).
  3. Bron, A. J., et al. TFOS DEWS II pathophysiology report. Ocul Surf. 15, 438-510 (2017).
  4. Kheirkhah, A., Rahimi, D. R., Cruzat, A. Corneal epithelial immune dendritic cell alterations in subtypes of dry eye disease: a pilot in vivo confocal microscopic study. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56, 7179-7185 (2015).
  5. Jodi, H., Harrison, D., Anat, G. Can in vivo confocal microscopy differentiate between subtypes of dry eye disease? A review. Clin Exp Ophthalmol. 49 (4), 373-387 (2021).
  6. Jeremy, C. B. C., et al. In vivo corneal confocal microscopy: imaging analysis, biological insights and future directions. Commun Biol. 6 (1), 652(2023).
  7. Lemp, M. A., Dilly, P. N., Boyde, A. Tandem-scanning (confocal) microscopy of the full-thickness cornea. Cornea. 4 (4), 205-209 (1985).
  8. Kobayashi, A., Yoshita, T., Sugiyama, K. In vivo findings of the bulbar/palpebral conjunctiva and presumed meibomian glands by laser scanning confocal microscopy. Cornea. 24 (8), 985-988 (2005).
  9. Yiran, H., et al. Demodex folliculorum infestation in meibomian gland dysfunction-related dry eye patients. Front Med (Lausanne). 24 (9), 833778(2022).
  10. Orla, M., Veronica, O. D., Aoife, L. M. Ocular Demodex folliculorum: prevalence and associated symptoms in an Irish population. Int Ophthalmol. 39 (2), 405-417 (2019).
  11. Al-Aqaba, M. A., et al. Corneal nerves in health and disease. Prog Retin Eye Res. 73, 100762(2019).
  12. Liu, Y. C., Lin, M. T. Y., Mehta, J. S. Analysis of corneal nerve plexus in corneal confocal microscopy images. Neural Regen Res. 16, 690-691 (2021).
  13. Zhixin, W., Xuguang, S. Progress in the study of conjunctival goblet cell. Int Rev Ophthalmol. 4 (3), 1673-5803 (2005).
  14. Bilian, K., et al. Quantitative study of goblet cells in human conjunctiva. Chin J Anat. 3 (10), 1001-1633 (2001).
  15. Yan, T., Dai, Q., Yu, G. In vivo confocal microscopy: a standard operating procedure for the detection of Demodex mites at the eyelid margin. J Vis Exp. (221), e68534(2025).
  16. Matthieu, R., et al. In vivo confocal microscopy as a novel and reliable tool for the diagnosis of Demodex eyelid infestation. Br J Ophthalmol. 99 (3), 336-341 (2015).
  17. Jalbert, I., Rejab, S. Increased numbers of Demodex in contact lens wearers. Optom Vis Sci. 92 (6), 671-678 (2015).
  18. Patel, D. V., McGhee, C. N. J. Mapping of the normal human corneal sub-basal nerve plexus by in vivo laser scanning confocal microscopy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46, 4485-4488 (2005).
  19. Nanyu, Z., et al. Lid margin score is the strongest predictor of meibomian area loss. Cornea. 41 (6), 699-708 (2022).
  20. Cañadas, P., Alberquilla, G. V. M., Hernández, V. J. L., Teus, M. A. Update on corneal confocal microscopy imaging. Diagnostics. 13, 46(2023).
  21. Xu, J., et al. In vivo confocal microscopic evaluation of corneal dendritic cell density and subbasal nerve parameters in dry eye patients: a systematic review and meta-analysis. Front Med. 8, 578233(2021).
  22. Baikai, M., et al. Quantification of increased corneal subbasal nerve tortuosity in dry eye disease and its correlation with clinical parameters. Transl Vis Sci Technol. 10, 26(2021).
  23. Michael, J. D. On the in vivo assessment of goblet cells of the human bulbar conjunctiva by confocal microscopy: a review. Cont Lens Anterior Eye. 43 (4), 315-321 (2020).
  24. Allgeier, S., et al. A novel approach to analyze the progression of measured corneal sub-basal nerve fiber length in continuously expanding mosaic images. Curr Eye Res. 42, 549-556 (2017).
  25. Matuszewska-Iwanicka, A., et al. Mosaic vs single image analysis with confocal microscopy of the corneal nerve plexus for diagnosis of early diabetic peripheral neuropathy. Ophthalmol Ther. 11 (6), 2211-2223 (2022).
  26. Kryszan, K., et al. Artificial-intelligence-enhanced analysis of in vivo confocal microscopy in corneal diseases: a review. Diagnostics. 14, 694(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Синдром сухого глазавизуализация поверхности глазаоценка состояния роговицывизуализация мейбомиевых железплотность бокаловидных клетоксуббазальные нервные волокнаобнаружение Demodexдиагностика на клеточном уровне
В естественных условиях Конфокальная микроскопия в диагностике и лечении синдрома сухого глаза: фокус на протоколах визуализации и интерпретации
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.