Методическая статья

Подготовка и обработка кальцифицированных артерий с сохраненной морфологией и РНК для цифрового пространственного профилирования

DOI:

10.3791/69159

⸱

23 января 2026 г.

 ,  ,  , 
1Division of Vascular Surgery, Department of Surgery, University of Washington, 2Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Washington, 3Division of Vascular Surgery, VA Puget Sound Health Care System

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол включает пошаговый рабочий процесс для кальцифицированных сосудистых образцов: обработка тканей, декальцификация, валидация РНК, обнаружение уровня кальцификации и стратегии выбора интересующих областей на Nanostring GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). Цель — представить комплексный метод сохранения морфологии сосудистых тканей и РНК для надёжного пространственного транскриптомного анализа.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пространственная транскриптомика отображает профили целых транскриптомов непосредственно на срезы тканей, коррелируя между клетовыми окрестностями и экспрессией генов, а также определяя, как эти действия влияют на здоровье и заболевания. Хотя этот подход изменил онкологию, нейронауку, иммунологию, науки о развитии и многие области, он стал менее широко применяться в сосудистой биологии, несмотря на то, что сосудистые заболевания остаются одной из ведущих причин смерти во всём мире. Выделяются два препятствия: артерии и вены дают мало ровной поверхности для сечения, а больные экземпляры, часто атеросклеротичные, тромбозовые, насыщенные бляшками или кальцифицированные, требуют жёстких методов, таких как декальцификация, что угрожает морфологии и целостности РНК. Тем не менее, эти же сосуды с концентрическими слоистыми структурами интимы, среды и адвентиции идеально подходят для пространственного анализа, поскольку каждый слой содержит разные типы клеток и генные программы, взаимодействующие через стенку.

Мало подробных протоколов посвящены подготовке сосудистых тканей для пространственной транскриптомики. Этот дефицит ограничивает возможности исследователей полностью использовать потенциал этой технологии. Чтобы преодолеть этот разрыв, мы представляем пошаговый рабочий процесс, оптимизированный для человеческих большеберцовых артерий с завышенными поражениями. Протокол охватывает обработку тканей, фиксацию и правильную декальцификацию для сохранения качества структуры и РНК, а затем гистологическое окрашивание для степени степени кальцификации. Мы также описываем создание тканевых микрочипов (TMA) для снижения пакетных эффектов и стратегий выбора интересующих областей (ROI) на NanoString GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP).

Снижая технические барьеры, этот протокол позволяет сосудистым исследователям получать надёжные пространственные транскриптомные данные и изучать специфическую для слоя транскрипционную активность в здоровых и больных сосудах. Мы ожидаем, что это ускорит открытие механизмов, лежащих в основе кальцификации, воспаления, интимального атеросклероза и других сосудистых патологий, а также способствует более широкому распространению пространственной транскриптомики в сосудистой биологии.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

За последнее десятилетие секвенирование следующего поколения и высокоразрешающая визуализация объединились, чтобы продвинуть пространственную транскриптомику — метод количественной оценки всего транскриптома при сохранении точного расположения каждой стенограммы в секцияхткани 1,2. В сочетании с быстро созревающим полем секвенирования одноклеточной РНК (scRNA-seq) пространственные подходы обеспечивают эффективный путь связи генных сигнатур с конкретными типами клеток, состояниями и нишами в ткани или органе, значительно обогащая наше понимание механизмовзаболеваний 3,4,5,6,7 . Разрабатывается несколько коммерческих платформ, таких как 10X Visium, NanoString GeoMx и CosMx, Slide-seq и DBiT-seq, каждая из которых поддерживается протоколами, оптимизированными для мягких, высококлеточных тканей, таких как опухоли и мозговые ткани. Область переживает стремительный рост: PubMed индексировал примерно 150 публикаций в 2023 году, почти 300 в 2024 году и планирует превысить 500 в 2025 году. Несмотря на этот всплеск, сосудистая биология остаётся недостаточно представленной по сравнению с раком, нейронаукой и иммунологией.

Твёрдые или минерализованные ткани, такие как кости, хрящи, зубы и насыщенные налётом, кальцифицированные артерии или вены, оказались гораздо менее склонными. Технические препятствия многогранны. Во-первых, ткани с плотными минеральными матрицами требуют хелатирования или удаления на кислотной основе — агрессивных методов, которые могут фрагментировать РНК и искажать морфологию тканей. Во-вторых, больные ткани, повреждённые или фиброзные, часто содержат мало живых клеток, встроенных в обильный внеклеточный матрикс (ЭКМ), что снижает доходность транскриптов и усложняет нормализацию данных. Кроме того, сосудистые ткани обладают тонкой, концентрической структурой (интима, среда, адвентиция), обёрнутой вокруг полого просвета. Ограниченная толщина стенок, особенно у одноклеточной интимы, означает, что участки захвата могут содержать скудные ткани, а участки могут разрываться или отслоиваться в ходе многочасового окрашивания и гибридизации. В результате пространственные транскриптомические исследования сосудистой ткани остаются редкими, несмотря на то, что сердечно-сосудистые заболевания постоянно занимают одно из ведущих причин смерти и серьёзной заболеваемости во всём мире. Существующие статьи по протоколам в подавляющем большинстве сосредоточены на обработке данных, визуализации или платформах, отличных от NanoStringGeoMx 8,9,10,11,12,13. Среди этих работ немногие описывают лабораторные методы обработки больных большеберцовых артерий — клинически значимого сосуда при заболеваниях периферических артерий (ПАП), особенно для диабетиков, составляющих растущую долю поражённого населения.

Чтобы устранить этот пробел, мы представляем комплексный рабочий процесс для кальцифицированных человеческих большеберцовых артерий, полученный у пациентов с ПАД, перенесших ампутацию. Протокол охватывает: (1) обрезку и вскрытие тканей сразу после забора в операционной; (2) правильная фиксация и декальцификация тканей, сохраняющие целостность морфологии тканей и РНК; (3) создание экономичных тканевых микрочипов (TMA) для минимизации пакетного эффекта; (4) гибридизация RNAscope in situ и гистологическое кальциевое окрашивание для контроля качества; и (5) Стратегия выбора регионов интереса (ROI), специально разработанная для кальцифицированных большеберцовых артерий на платформе GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP). Эти этапы включают все процедуры до сбора образцов на DSP-инструменте, подготовку библиотеки, секвенирование и анализ данных.

Хотя эти принципы демонстрируются на упомянутой платформе DSP, они могут направлять подготовку тканей для 10X Visium или других платформ, а методология легко адаптируется к дополнительным сосудистым слоям или животным моделям. Этот протокол может быть адаптирован для биобанковских и посмертных тканей, но его успех критически зависит от условий сохранения, фиксации и хранения. Ткани следует фиксировать сразу после сбора убора, чтобы минимизировать ишемическое время (желательно в течение 1 часа). Стандартный формалин с нейтральным буфером 10% (NBF) рекомендуется не менее 16 часов при комнатной температуре (RT). Ткани должны встраиваться сразу после фиксации и не хранить в этаноле более 3 дней. Блоки с фиксированным парафином (FFPE), обработанные и хранящиеся в рекомендуемых условиях, остаются пригодными для пространственного профилирования примерно 3 года, хотя качество РНК ухудшается с возрастом блоков. Соответственно, оценка качества РНК рекомендуется для образцов с низкой клеточной степенью, блоков, хранящихся в течение 6 месяцев, биобанковских образцов и посмертных тканей. Минимально допустимое качество РНК зависит от выбранного анализа, выбора ROI, желаемого разрешения и рекомендаций по основным объектам. На практике обычно рекомендуется примерно 50-100 ядер на сегмент для получения надёжных результатов. Платформа DSP поддерживает как FFPE, так и свежезамороженные ткани. В этом протоколе мы сосредотачиваемся на тканях FFPE.

Хотя это исследование сосредоточено на пространственной транскриптомике, оно легко интегрируется с scRNA-seq. Используя опубликованные наборы данных scRNA-seq и вычислительную пространственную деконволюцию, можно оценить пропорции клеточного типа для каждого пространственного участка, а клеточные состояния, определённые scRNA-seq, можно проецировать на архитектуру ткани. Сохраняя как структуру, так и целостность РНК, наш протокол позволяет проводить последующей проверке на одной клеточной или одномолекулярной системе, максимизируя биологические знания из ценных сосудистых образцов и широко применяя пространственную транскриптомику в исследованиях сосудистой биологии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры сбора образцов человеческих артерий были одобрены Институциональным обзорным советом отдела человеческих субъектов Университета Вашингтона (IRB) и IRB системы здравоохранения VA Puget Sound Health Care System (Сиэтл, Вашингтон). Письменные информированные согласия получались от пациентов перед сбором тканей. Материалы и оборудование, использованные для этого исследования, перечислены в Таблице материалов.

1. Обрезание и исправление тканей

  1. Обрезка тканей
    1. Подготовьте транспортный мешок с помощью многослойной упаковки, содержащей внутреннюю трубку, вторичный контейнер, внешний контейнер для перевозки и мешок для биологических опасностей. Заполните внутреннюю трубку центрифугы объемом 50 мл 30 мл накопительной среды Dulbecco Modified Eagle's Medium (DMEM), содержащей 1% 4-[2-гидроксиэтил]-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES) и 1% пенициллин-стрептомицина (P/S).
    2. Разместите выделенные передней большеберцовой (AT), задней большеберцовой (PT) и перонеальной большеберцовой (PR) артерии (желательно > 5 см в длину) отдельно в центрифугных трубках объемом 50 мл. Перенесите баллончики на льду из операционной в комнату для культуры тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется, чтобы длина взятого образца была не менее 5 см, чтобы обеспечить репликации и обеспечить достаточное количество тканей для криохранения для других оценок или валидации.
    3. Перенесите каждую артерию в чашку Петри диаметром 100 мм вместе с медиа. Удалять лишние периваскулярные соединительные ткани с помощью стерильных ножниц и щипцов, оставляя только стенку артерии (адвентиция внутрь).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте ткани в биобезопасном шкафе, протрившем раствором для инактивации РНК, чтобы предотвратить загрязнение РНК. Используйте стерильные скальпели и щипцы; Между образцами промывайте их стерильной и безнуклеазной водой, чтобы удалить остатки, и тщательно протирайте 70% этанолом.
    4. Ненадолго прополосните подрезанную артерию физиологическим раствором Dulbecco Phosphate Buffered (PBS) в новой чашке Петри. Положите стерильную разделочную доску внутрь свежей тарелки и переместите артерию на неё.
    5. Разрежьте артерию поперечным сечением на сегменты диаметром 1 см хирургическим лезвием.
  2. Фиксация и хранение тканей
    1. Мгновенно заморозить два сегмента в криотрубках для криоконсервации в жидком азоте (LN 2) и сохранить их для будущей работы с белками и РНК.
    2. Оставшиеся сегменты поместите в трубки объёмом 15 мл с содержанием 10% NBF и фиксируйте при 4 °C на 24-48 часов для артериальных сегментов длиной 1 см.
      ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется использовать 10% NBF. Если используется 4% параформальдегид (PFA), подготовьте его свежим или проверьте нейтральный pH перед использованием, чтобы минимизировать повреждение РНК.

2. Декальцификация, обработка тканей и сечение

  1. Приготовьте раствор для декальцификации: растворите твёрдую этилендиамин-тетрауксусную кислоту (ЭДТА) до 10% (w/v) в растворе стабилизации РНК (RSS). Фильтрация не требуется. Скорректируйте pH до 9,2 с помощью гранул гидроксида натрия (NaOH) для полного растворения EDTA, затем снизите до 5,2 с 10 M HCl — это типичный рабочий pH RSS и помогает сохранить целостность РНК.
  2. Ненадолго прополосните фиксированные ткани в PBS вручную. Переместите каждый образец в пробирку объемом 15 мл с раствором декальцификации и перемешивайте при 4 °C в течение 72 часов.
  3. После завершения декальцации промывайте образцы в PBS (2 × 5 мин). Помещайте ткани в кассеты и загружайте их в процессор с помощью четырёхчасовой обработки.
  4. Встраивайте несколько сегментов артерии на блок ткани. Отметьте область ограниченной ткани на задней части слайда и убедитесь, что все секции попадают в эту область.
  5. Уберите лишний парафин. Разрезать блоки на 5 мкм с помощью микротома и низкопрофильных лезвий, а тканевые секции закрепить в отмеченной области слайда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Отбросьте первые несколько секций после облицовки и соберите последующие срезы тканей. Используйте кисти без РНазы и очищайте водяную ванну между партиями образцов.
  6. Подготовьте не менее четырёх последовательных секций на блок для различных окрасок и эксперимента цифрового пространственного профилирования (DSP). Храните стекли при 4 °C до использования (желательно < 6 месяцев).

3. РНК-скопическая гибридизация (ISH) и гистологическое окрашивание

  1. РНКоскоп
    1. Запекание в сухой духовке при 60 °C на ночь для улучшения прилипления тканей к слайдам.
    2. Депарафинизация: погружение в ксилол (3 × 5 мин), затем 100% этанол (2 × 3 мин). Сухие слайды при 60 °C в течение 7 минут.
    3. Проведите анализ RNAscope 2.5 HD Red ISH согласно протоколу производителя. Блокировать эндогенную пероксидазу 3% H2O2 на 10 минут при RT; промывать в дистиллированной (DI) воде.
    4. Инкубировать стекли в предварительно нагретом буфере при 100 °C (разбавленный 1:10 в DI-воде) в течение 15 минут (использовать 200 мл буфера для извлечения для стойки до 24 затворов в пароварке), 5 раз окунать в 100% этанол и сухие стекли при 60 °C в течение 7 минут. Создайте гидрофобный барьер для растворов вокруг тканей с помощью гидрофобного барьерного PAP-ручки.
    5. Поставьте слайды в решетку для гибридизации, добавьте 200 мкл добавки с ферментами пищеварения (предварительно разбавленной продавцом в бутылочках с пипеткой) в каждый слайд и инкубировать при 40 °C в течение 15 минут. Прополосните стекли дважды в DI-воде.
    6. Примените положительный контрольный зонд Human PPIB к стеклам и инкубируемые в течение 2 часов при 40 °C. Стирайте стекли 2 раза в буфере для стирки.
    7. Выполнить последовательное усиление: AMP1 при 40 °C в течение 30 минут; AMP2 при 40 °C в течение 15 минут; AMP3 при 40 °C в течение 30 минут; AMP4 при 40 °C в течение 15 минут; AMP5 на RT в течение 30 минут; и AMP6 на RT в течение 15 минут. Мойте по 2 минуты между процессами.
    8. Добавьте рабочий раствор Fast Red, инкубируем на RT 10 минут. Слийте слив, окуните горки в DI-воду, затем окуньте 5 раз в свежую DI-воду. Убедитесь, что положительные контрольные пятна Ppib выглядят как отдельные, точкие красные точки.
    9. Контрокрашивание 1 гематоксилином Гилла, окуньте 5 раз в 2 смены воды DI, синий в 0,02% гидроксида аммония и 5 раз в 2 смены воды DI. Подтвердите, что ядра окрашиваются в синий цвет, а морфология тканей сохраняется. Дайте затворам высохнуть на ночь и накрывайте монтажной средой.
  2. Окраска Alizarin Red S
    1. Для дополнительных последовательных срезов повторяйте депарафинизацию и регидратацию в шагах 3.1.2.
    2. Подтвердите, что pH рабочего раствора Alizarin Red S составляет 4,1-4,3.
    3. Погружайте слайды в Alizarin Red S на 30-60 секунд или пока кальциевые отложения не приобретут оранжево-красный цвет.
    4. Стряхните избыточное пятна от краски. Обезвоживайте 20 быстрых погружений в 100% ацетон, затем 20 погружений в ацетон:ксилол (1:1).
    5. Очистите стекли в двух свежих ваннах с ксилолом, по 3 минуты каждая. Накладка с монтажным медиумом.

4. Подготовка слайдов GeoMx DSP и выбор возврата инвестиций

  1. Перед началом очистите всё оборудование и контейнеры раствором, инактивирующим РНК, и высушите или прополосните водой, обработанной DEPC, чтобы предотвратить загрязнение РНК. Следуйте инструкциям по пространственному анализу РНК.
  2. Запекание в сухой духовке при 60 °C на ночь для улучшения прилипления тканей к слайдам.
  3. Депарафинизация и регидратация: погружение в ксилол (3 × 5 мин), затем 100% этанол (2 × 5 мин) и 95% этанола, разбавленный в воде, обработанной DEPC, в течение 5 минут. Перенесите слайды на 1× PBS на 1 минуту.
  4. Инкубировать стекли в предварительно нагретом буфере для взятия антигена при температуре 100 °C Tris/EDTA pH 9.0 в течение 20 минут и перенести стекли на 1× PBS на 5 минут при RT.
  5. Инкубировать слайды в предварительно разогретой 1,0 мкг/мл протеиназы K в течение 15 минут и промывать через 1× PBS в течение 5 минут при RT.
  6. Постфиксируйте стекли в 10% NBF (200 мкл на затвор) на 5 минут при RT и стирайте в PBS 5 минут.
  7. Снимите стекли с PBS, постучите по бумажному полотенцу, протрите лишнюю жидкость вокруг салфетки Kimwipe и поставьте в стойку для окрашивания для гибридизации.
  8. Добавьте 200 мкл раствора для гибридизации (разбавленного 1:10 в буфере W) на каждый затвор и примените гибридизационный фильтр. Закройте камеру гибридизации, вставьте её в духовку и инкубуйте при 37 °C ночью.
  9. Погружайте стекли в буфер из солевого раствора и натрия цитратного раствора (SSC, 2×) и позволяйте гибридизационным скользящим скользить самостоятельно в течение 5 минут.
  10. Промывайте стекли в строгом буфере для промывки, состоящем из равных частей 4× SSC и деионизированного формамида при 37 °C, по 25 минут на промывку. Мойте стекли в буфере 2× SSC, по 2 минуты за одну стирку.
  11. Заблокируйте затворы буфером W на RT на 30 минут.
  12. Покройте ткань первичным раствором антител (Rabbit anti-CD45) на 1 час в фильтре камеры влажности на RT, затем промыйте буфером 2× SSC 3 раза.
  13. Нанесите вторичный раствор антител (Goat anti-Rabbit IgG-AF647) в течение 1 часа и промывайте в буфере SSC 2×.
  14. Накройте ткани маркированными антителами (Mouse anti-SMA-AF488) на 1 час в фильтре камеры влажности в RT. Промывайте в буфере 2× SSC.
  15. Окрашивайте стекли 10 минут в 2 мкм ядерном маркере Syto83, разбавленной в буфере W в течение 10 минут.
  16. Отсканируйте слайды с помощью инструмента для профилирования РНК, чтобы визуализировать окрашивание морфологических маркеров. Выберите ROI от проксимальной и дистальной до кальцифицированных поражений каждой артериальной ткани, указывая специфическое расположение ROI каждого слоя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы предотвратить образование воздушных пузырьков при нанесении гибридизационного сливателя на тканевые срезы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Протокол, описанный здесь, помогает исследователям от получения большеберцовых артерий до создания ТМА-слайдов, сохраняющих как морфологию, так и целостность РНК для пространственного транскриптомного анализа. Также описываются гистологические методы визуализации кальциевых отложений в артериях, окрашивание морфологических маркеров и стратегии отбора ROI.

На рисунке 1 артерии фиксированы в 10% NBF (шаг 2). NBF быстро проникает в т...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол подробно описывает этапы, необходимые для подготовки кальцифицированных человеческих большеберцовых артерий для пространственного транскриптомного профилирования на NanoString GeoMx DSP. Большеберцовые артерии, как и все сосуды, имеют концентрические слои интима, среды и адвентиции, каждая из которых содержит отдельные популяции клеток, организующие повреждения и восстановление. Сохранение архитектуры этих слоёв крайне важно для слоевого транскриптомного анализа, однако нес...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана стартовым грантом от VA Puget Sound, VA Merit Award I01 BX004975-02, а также ресурсами и использованием объектов VA Puget Sound Health Care Center.  Эта работа принадлежит авторам и не обязательно отражает позицию или политику Департамента по делам ветеранов или правительства США.  Мы хотели бы выразить признательность услуге визуализации, предоставляемой Ядром гистологии и визуализации (HIC) Университета Вашингтона.  Мы хотели бы поблагодарить доктора Шрирама Акилеша за руководство по экспериментам с DSP в Университете Вашингтона и его группу в лабораториях MANTIS: UW Spatial Biology Core.  Мы также хотели бы отметить Ниши Иванова из Центра исследований диабета при Университете Вашингтона за гистологическое окрашивание.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Модифицированный орлиный средой Dulbecco (DMEM), высокий уровень глюкозы, пирувата и bbsp;Термо Фишер Сайентифик11995065
Буферный раствор 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота (HEPES), 1 мТермо Фишер Сайентифик15630080
Пенициллин-стрептомицин (P/S), 10 000 U/mLТермо Фишер Сайентифик15140122
10% нейтральный буферизованный формалин (NBF)Миллипор Сигма65346-М
Этилендиамин-тетрауксусная кислота (ЭДТА)Миллипор Сигма3620
Решение для стабилизации РНКТермо Фишер СайентификAM7024Решение для стабилизации РНК (RSS)
Перекись водорода (H2O2)Advanced Cell Diagnostics, Inc322335
Решение для поиска целейAdvanced Cell Diagnostics, Inc322001
Protease PlusAdvanced Cell Diagnostics, Inc322331Добавка пищеварительных ферментов
DapB (отрицательный контроль)Advanced Cell Diagnostics, Inc310043
Буфер промывания RNAscope (набор RNAscope 2.5 HD Red ISH assay kit)Advanced Cell Diagnostics, Inc320058
AMP1Advanced Cell Diagnostics, Inc324511
AMP2Advanced Cell Diagnostics, Inc324512
AMP3Advanced Cell Diagnostics, Inc324513
AMP4Advanced Cell Diagnostics, Inc324514
AMP5 RedAdvanced Cell Diagnostics, Inc324515
AMP6 RedAdvanced Cell Diagnostics, Inc324516
Fast Red AAdvanced Cell Diagnostics, Inc324517
Человеческий PPIBAdvanced Cell Diagnostics, Inc313901
Гилл' гематоксилин sМиллипор СигмаGHS132
Извлечение антигена, pH Tris/EDTA 9Термо Фишер Сайентифик00-4956-58
Протеиназа KТермо Фишер СайентификAM2546
Гибридизационное решение — Hs WTAНаноструна121401102
HybrislipГибридизация скользя
Решение гибридизации — Buffer RНаноструна121300313
Rabbit anti-CD45 Клеточная сигнализация1317
Buffer WНаноструна121300313
Козий противокроличий IgG-AF647Jackson Immunoresearch111-605-144
мышь против SMA-AF488 Термо Фишер Сайентифик53-9760
Syto83 Термо Фишер СайентификS11364
Хирургическое лезвиеBD Biosciences371110
Superfrost  Плюс микроскопические стеклиТермо Фишер Сайентифик1255015
Ручка ImmEdge
Клинки микротомовТермо Фишер Сайентифик22-500-125
RNase AWAYРаствор, инактивирующий РНКаз
<Сильно>Снаряжение
Гибридизационная печь HybEZ Advanced Cell Diagnostics, Inc321710
GeoMx Digital Spatial ProfilerNanostring Модель: GeoMx DSP
Платформа доступа к данным: GeoMx DSP Control Center (версия 3.1.2.12)		Настройка сканирования канала: для FITC время взрыва составляет 300 мс, а для флуорофора — AlexaFluro 488; для канала Cy3 время экспозиции составляет 50 мс, а флюорофор — Syto83; а для канала Cy5 время экспозиции составляет 300 мс, а для флюорофора — AlexaFluor 647.

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rao, A., Barkley, D., França, G. S., Yanai, I. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 596 (7871), 211-220 (2021).
  2. Dries, R., et al. Advances in spatial transcriptomic data analysis. Genome Res. 31 (10), 1706-1718 (2021).
  3. Schmitd, L. B., et al. Spatial and transcriptomic analysis of perineural invasion in oral cancer. Clin Cancer Res. 28 (16), 3557-3572 (2022).
  4. Bassiouni, R., et al. Spatial transcriptomic analysis of a diverse patient cohort reveals a conserved architecture in triple-negative breast cancer. Cancer Res. 83 (1), 34-48 (2023).
  5. Hirz, T., et al. Dissecting the immune suppressive human prostate tumor microenvironment via integrated single-cell and spatial transcriptomic analyses. Nat Commun. 14 (1), 663(2023).
  6. Wang, F., et al. Single-cell and spatial transcriptome analysis reveals the cellular heterogeneity of liver metastatic colorectal cancer. Sci Adv. 9 (24), eadf5464(2023).
  7. Eyers, M., et al. Digital spatial profiling of the microenvironment of muscle invasive bladder cancer. Commun Biol. 7 (1), 737(2024).
  8. Del Rossi, N., Chen, J. G., Yuan, G. C., Dries, R. Analyzing spatial transcriptomics data using giotto. Curr Protoc. 2 (4), e405(2022).
  9. Sona, S., Bradley, M., Ting, A. H. Protocols for single-cell RNA-seq and spatial gene expression integration and interactive visualization. STAR Protoc. 4 (1), 102047(2023).
  10. Ibarra-Lopez, V., et al. Spatial profiling of protein and rna expression in tissue: An approach to fine-tune virtual microdissection. J Vis Exp. (185), e62651(2022).
  11. Mancinelli, L., Schoedel, K. E., Weiss, K. R., Intini, G. Methods to enable spatial transcriptomics of bone tissues. J Vis Exp. (207), e66850(2024).
  12. Sun, P., Li, M., Ye, K. Protocol to decipher complex spatial transcriptomics data using stminer. STAR Protoc. 6 (2), 103838(2025).
  13. Luo, Z., Schmitz, R. J. Protocol for preparing fresh frozen soybean tissues for spatial transcriptomics. STAR Protoc. 6 (2), 103790(2025).
  14. Li, B., et al. Spatial gene expression of human coronary arteries revealed the molecular features of diffuse intimal thickening in explanted hearts. Int J Mol Sci. 26 (5), 1949(2025).
  15. Pelisek, J., et al. Swiss vascular biobank: Evaluation of optimal extraction method and admission solution for preserving RNA from human vascular tissue. J Clin Med. 12 (15), 5109(2023).
  16. Nam, S. K., et al. Effects of fixation and storage of human tissue samples on nucleic acid preservation. Korean J Pathol. 48 (1), 36(2014).
  17. Juwayria,, et al. Microarray integrated spatial transcriptomics (MIST) for affordable and robust digital pathology. NPJ Syst Biol Appl. 10 (1), 142(2024).
  18. Wang, H., et al. Systematic benchmarking of imaging spatial transcriptomics platforms in ffpe tissues. bioRxiv. , (2023).
  19. Smith, K. D., et al. Rigor and reproducibility of spatial transcriptomics performed on clinically sourced human tissues. Lab Invest. 104190, (2025).
  20. Amancherla, K., et al. Dynamic responses to rejection in the transplanted human heart revealed through spatial transcriptomics. bioRxiv. , (2025).
  21. Bolen, M., Xue, Q. -S., Tansey, M. G. Ffpe tissue microarray protocol. , (2024).
  22. Wisner, L., Larsen, B., Maguire, A. Manual construction of a tissue microarray using the tape method and a handheld microarrayer. J Vis Exp. (184), e63086(2022).
  23. Zhao, P., et al. Single-cell RNA-seq reveals a critical role of novel pro-inflammatory endothelial cells in mediating adverse remodeling in coronary artery-on-a-chip. Sci Adv. 7 (34), eabg1694(2021).
  24. Fu, M., et al. Single-cell RNA sequencing of coronary perivascular adipose tissue from end-stage heart failure patients identifies SPP1+ macrophage subpopulation as a target for alleviating fibrosis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 43 (11), 2143-2164 (2023).
  25. Mao, A., et al. Single-cell RNA-seq reveals coronary heterogeneity and identifies CD133+ TRPV4high endothelial subpopulation in regulating flow-induced vascular tone in mice. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (3), 653-665 (2024).
  26. Li, C., et al. Single-cell RNA sequencing of the carotid artery and femoral artery of rats exposed to hindlimb unloading. Cell Mol Life Sci. 82 (1), 50(2025).
  27. Deroo, E., et al. A vein wall cell atlas of murine venous thrombosis determined by single-cell RNA sequencing. Commun Biol. 6 (1), 130(2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

RNAscope

Похожие статьи