Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Миокиновый протокол CLCF1, индуцированный физической нагрузкой, для исследования механизмов защиты костей RANKL/OPG при остеопорозе в постменопаузе

598 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69172

⸱

7 ноября 2025 г.

 ,  , 
1Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

В этой статье

Краткое содержание

В данной статье представлен комплексный протокол исследования кардиотропин-подобного цитокинового фактора 1 (CLCF1) в качестве индуцированного физической нагрузкой медиатора защиты костей посредством модуляции оси RANKL/OPG при остеопорозе в постменопаузе.

Аннотация

Недавние исследования идентифицировали кардиотропин-подобный цитокиновый фактор 1 (CLCF1) как индуцированную физическими упражнениями «молекулу молодости», которая опосредует преимущества для опорно-двигательного аппарата, но снижается с возрастом. Этот протокол описывает систематический подход к исследованию регуляторной роли CLCF1 в защите костей, опосредованной физическими упражнениями, с помощью механизмов перекрестных помех иммунной кости. Методология включает в себя клинический анализ образцов, методы молекулярной характеризации и функциональные анализы для выяснения влияния CLCF1 на рецепторный активатор сигнальной оси ядерного фактора-κB лиганда (RANKL)/остеопротегерина (OPG). С помощью количественной полимеразной цепной реакции (qPCR), вестерн-блоттинга, редактирования гена CRISPR/Cas9 и систем совместного культивирования этот протокол демонстрирует двойное протекторное действие CLCF1 на кости через STAT1-опосредованное ингибирование остеокластов и STAT3-опосредованное продвижение остеобластов. Описанные методы позволяют всесторонне оценить паттерны экспрессии CLCF1, провести корреляционный анализ с параметрами минеральной плотности костной ткани, а также механистическую оценку потенциальных интервенций по лечению физической нагрузкой. В отличие от традиционной антирезорбтивной терапии, которая в первую очередь нацелена на остеокласты, вмешательства на основе CLCF1 могут иметь уникальное преимущество, одновременно способствуя формированию кости и подавляя резорбцию. Этот протокол предоставляет исследователям стандартизированные процедуры для исследования цитокин-опосредованной регуляции костного метаболизма, вызванной физической нагрузкой, и способствует разработке целевых терапевтических вмешательств при возрастных заболеваниях костей.

Введение

Постменопаузальный остеопороз (ПМОП) представляет собой парадигматический пример возрастного снижения опорно-двигательного аппарата, при котором нарушение регуляции иммунной системы ускоряет патологическую потерю костной массы 1,2,3. Несмотря на то, что физические упражнения широко признаны наиболее эффективным нефармакологическим вмешательством для предотвращения возрастного ухудшения состояния костей, точные молекулярные механизмы, лежащие в основе защиты костей, вызванной физическими упражнениями,до недавнего времени оставались неясными. Современное понимание костного метаболизма вышло за рамки традиционных эндокринологических рамок и включает в себя сложные остеоиммунные взаимодействия и вызванные физическими упражнениями миокины, которые управляют скелетным гомеостазом.

Недавняя идентификация кардиотропиноподобного цитокинового фактора 1 (CLCF1) в качестве фактора, вызванного физическими упражнениями, который борется с возрастным снижением опорно-двигательного аппарата, представляет собой сдвиг парадигмы впонимании перекрестных связей костей и мышц. Это революционное открытие объясняет хорошо установленные защитные эффекты физических упражнений для костей с помощью ранее неизвестного молекулярного механизма, позиционирующего CLCF1 в качестве ключевого медиатора остеоанаболизма, вызванного физическими упражнениями. Трансгенные мыши с гиперэкспрессией CLCF1 продемонстрировали улучшенное формирование костной ткани, улучшенную толерантность к глюкозе и превосходную физическую работоспособность по сравнениюс контрольной группой дикого типа6, что позволяет предположить, что добавки CLCF1 потенциально могут имитировать преимущества физических упражнений у малоподвижных людей или людей с нарушениями подвижности.

Миметическая терапия физическими упражнениями определяется как фармакологические вмешательства, которые воспроизводят кинетику CLCF1, вызванную физической нагрузкой, обеспечивая терапевтические эффекты, аналогичные физической активности, через молекулярные пути8. Кардиотропин-подобный цитокиновый фактор 1 (CLCF1), альтернативно обозначаемый как нейротрофин-1 (NNT-1) или В-клеточный стимулирующий фактор-3 (BSF-3), принадлежит к суперсемейству цитокинов интерлейкина-6 (IL-6) и проявляет плейотропные биологическиефункции8. Первоначально охарактеризованный своими нейротрофическими свойствами в выживании и развитии спинальных моторных нейронов, роль CLCF1 в качестве миокина, индуцированного физическими упражнениями, стала важной областью исследований. Недавние клинические исследования подтвердили, что CLCF1 является биомаркером состояния здоровья костей, продемонстрировав, что уровни белка CLCF1 в мононуклеарных клетках периферической крови значительно снижены у женщин в постменопаузе с остеопорозом по сравнению со здоровыми контрольными группами9. Эти исследования показали положительную корреляцию между экспрессией CLCF1 и минеральной плотностью костной ткани в нескольких участках скелета, обеспечивая клиническую валидацию, которая усиливает трансляционный потенциал терапевтических вмешательств, направленных на CLCF1.

Цитокины действуют через гетеромерные рецепторные комплексы, включая растворимые рецепторы цилиарного нейротрофического фактора (sCNTFR) и цитокин-рецептороподобный фактор-1 (CRLF-1), для организации различных клеточных реакций10,11. Недавние механистические исследования пролили свет на парадигму двойной сигнализации, в соответствии с которой CLCF1 одновременно ингибирует резорбцию кости и способствует формированию кости 2,6,7,9. Это двойное действие происходит через дифференциальный сигнальный преобразователь и активацию пути транскрипции (STAT): фосфорилирование STAT1 опосредует подавление остеокластов, вмешиваясь в рецепторный активатор индуцированной ядерным фактором-κB лигандом (RANKL) передачей сигналов ядерного фактора-κB (NF-κB), в то время как активация STAT3 в остеобластах способствует экспрессии маркеров формирования костей, включая щелочную фосфатазу и остеокальцин.

Понимание того, как острая реакция на физическую нагрузку приводит к хронической адаптации костей, остается критически важнымдля разработки терапии. В то время как острое повышение уровня CLCF1 после одиночных тренировок дает механистическое понимание, повторяющиеся острые реакции в течение нескольких недель или месяцев могут привести к устойчивым защитным эффектам костей за счет кумулятивной передачи сигналов и клеточнойадаптации.

Обоснование исследования CLCF1 в остеоиммунной патофизиологии вытекает из его установленной роли в регуляции В-лимфоцитов и признания того, что В-клетки являются значимыми продуцентами как RANKL, так и остеопротегерина (ОПГ)12,13. Рецепторный активатор оси ядерный фактор-κB лиганд (RANKL)/остеопротегерин (ОПГ) служит центральным регуляторным механизмом для дифференцировки остеокластов и резорбции кости14,15. В отличие от других членов семейства IL-6, которые продемонстрировали регуляторный контроль над скелетным гомеостазом посредством модуляции ремоделирования кости, уникальный двойной механизм защиты кости CLCF1 обладает превосходным терапевтическим потенциалом 16,17,18.

Преимущества этого протокола по сравнению с существующими методологиями включают в себя его комплексный подход к остеоиммунным исследованиям упражнений, включающий как клинический корреляционный анализ, так и механистические клеточные исследования для обеспечения трансляционного понимания CLCF1-опосредованной регуляции костного метаболизма. Клиническая значимость этого протокола еще больше усиливается новыми доказательствами того, что уровни CLCF1 могут модулироваться с помощью вмешательств в образ жизни, что позиционирует его как действенную терапевтическую мишень для возрастных заболеваний костей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Этот протокол был одобрен комитетом по этике институциональных исследований (протокол #2024-CHSD-0156) и соответствует Хельсинкской декларации. Все процедуры для животных соответствовали руководящим принципам комитета по уходу за животными и их использованию (протокол #2024-037). Все участники дали письменное информированное согласие.

1. Сбор клинических образцов и оценка вмешательства при физических нагрузках

  1. Набор участников и оценка истории учений
    1. Набирайте женщин в постменопаузе в возрасте 55-75 лет с минимальной продолжительностью постменопаузы 1 год.
    2. Оцените подробную историю упражнений, включая частоту, интенсивность, тип и продолжительность физической активности за последние 6 месяцев, используя стандартизированные анкеты физической активности.
    3. Разделите участников на сидячие (< 150 минут в неделю), умеренно активные (150-300 минут в неделю) и высокоактивные (> 300 минут в неделю) группы в соответствии с рекомендациями ВОЗ по физическим упражнениям.
    4. Проведите всестороннюю оценку истории болезни и физикальное обследование, включая обзор лекарств и скрининг сопутствующих заболеваний.
    5. Получение двухэнергетических измерений рентгеновской абсорбциометрии (DXA) с помощью денситометра Hologic Discovery A с программным обеспечением APEX v4.5. Выполняйте ежедневную калибровку с помощью фантома позвоночника. Расположите пациента на спине с приподнятыми ногами на позиционном блоке в соответствии с рекомендациями Международного общества клинической денситометрии (ISCD).
    6. Классифицируйте участников в соответствии с критериями остеопороза Всемирной организации здравоохранения (Т-критерий ≤ -2,5 SD).
    7. Применяйте критерии исключения: предыдущая антиостеопоротическая терапия в течение 12 месяцев, иммуносупрессивное лечение, метаболические заболевания костей, вторичный остеопороз или противопоказания к нагрузочному тесту.
  2. Оценка реакции CLCF1, вызванной физической нагрузкой
    1. Соберите исходные образцы крови с 8:00 до 10:00 утра после 12-часового ночного голодания в пробирках ЭДТА.
    2. Внедрите стандартизированный протокол интенсивной физической нагрузки: 45 минут ходьбы умеренной интенсивности с максимальной частотой сердечных сокращений 65-70%. Рассчитайте максимальную частоту сердечных сокращений по формуле Карвонена (возраст 220)19. Выполняйте упражнения на моторизованной беговой дорожке с непрерывным мониторингом сердечного ритма с помощью монитора на нагрудном ремне. Поддерживайте скорость ходьбы на уровне 3,5-4,5 км/ч с регулировкой уклона для достижения целевой частоты сердечных сокращений.
    3. Соберите образцы крови после тренировки через 1 ч, 4 ч и 24 ч для оценки кинетики CLCF1, поддерживая постоянные условия сбора.
    4. Храните аликвоты сыворотки при температуре -80 °C для последующего количественного определения CLCF1. Используйте набор Human CLCF1 ELISA Kit с диапазоном обнаружения 31,2-2000 пг/мл. Разведите образцы в соотношении 1:2 в разбавителе анализа. Подготовьте 7-точечную стандартную кривую с использованием 2-кратных последовательных разведений. Запуск образцов в двух экземплярах. Считывающие пластины с длиной волны 450 нм с коррекцией длины волны 540 нм. Примите коэффициент вариации (CV) < 20 % между дубликатами.
  3. Протокол вмешательства при продольной нагрузке
    1. Разработайте 12-недельную программу прогрессивных упражнений с тремя занятиями в неделю.
    2. Соберите образцы крови на исходном уровне, через 4, 8 и 12 недель для анализа траектории CLCF1.
    3. Оценивайте улучшения физической формы с помощью тестирования VO2 max на исходном уровне и в конечной точке.
    4. Коррелируют изменения CLCF1 с улучшениями МПК, измеренными с помощью DXA через 12 недель.
    5. Документируйте адаптацию к тренировкам, включая толерантность к физическим нагрузкам и схемы восстановления.

2. Усиленная изоляция и процессинг мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ)

  1. Оптимизированная изоляция PBMC для анализа CLCF1
    1. Соберите 20 мл образцов венозной крови в пробирки, содержащие ЭДТА (5 мл ЭДТА на пробирку) в стерильных условиях.
    2. Обрабатывайте образцы в течение 2 часов после сбора для обеспечения оптимальной жизнеспособности клеток и сохранения экспрессии CLCF1.
      1. Разбавьте образцы крови в соотношении 1:1 фосфатно-солевым буфером (PBS) при комнатной температуре. Смешайте 20 мл крови с 20 мл PBS.
      2. Слой разбавленной кровью градиентной среды по плотности в конические пробирки объемом 50 мл. Используйте среду с градиентом плотности 15 мл на 20 мл разбавленной крови (соотношение 1:1,33).
    3. Центрифуга при 400 × г в течение 30 мин при комнатной температуре без тормоза.
    4. Осторожно отсасывайте слой PBMC на границе плазма-Фиколл с помощью стерильной пипетки Пастера.
    5. Дважды промойте клетки PBS, содержащим 2% фетальную бычью сыворотку (FBS), центрифугированием при 300 × г в течение 10 минут.
  2. Оценка жизнеспособности клеток и измерение исходного уровня CLCF1
    1. Определение жизнеспособности клеток с помощью метода исключения трипанового синего (целевой > 95% жизнеспособности)20.
    2. Оценивайте исходную внутриклеточную экспрессию CLCF1 сразу после выделения.
    3. Отрегулируйте концентрацию клеток до 1 ×10 6 клеток/мл в соответствующей среде.
    4. Выделите ячейки для последующего применения или храните в жидком азоте. Заморозьте PBMC в замораживающей среде, содержащей 90% FBS + 10% DMSO. Используйте контейнер для заморозки с контролируемой скоростью при температуре от -1 °C/мин до -80 °C. Храните 1 мл аликвот (5 ×10, 6 клеток/флакон) в криовиалах.

3. Комплексный количественный анализ экспрессии генов

  1. Экстракция и очистка РНК с учетом специфики CLCF1
    1. Лиз 1 × 106 PBMCs в 1 мл реагента для лизиса РНК в течение 1 ч после выделения.
    2. Добавьте 200 μл хлороформа, энергично взбейте и инкубируйте в течение 3 минут при комнатной температуре.
    3. Центрифугируйте при 12 000 × г в течение 15 мин при 4 °C для достижения разделения фаз.
    4. Переложите водную фазу в свежую пробирку, добавьте равный объем изопропанола.
    5. Осаждение РНК центрифугированием при 12 000 × г в течение 10 мин при 4 °C.
    6. Промойте гранулу РНК с 75% этанолом, высушите на воздухе и растворите в воде без нуклеаз.
    7. Оцените целостность РНК с помощью электрофореза в агарозном геле или биоанализатора (целевой RIN >7,0).
  2. Обратная транскрипция и количественная ПЦР с обновленными наборами праймеров
    1. Количественно оценить концентрацию РНК с помощью спектрофотометрического анализа (целевое соотношение А260/А280 1,8-2,2).
    2. Выполните обратную транскрипцию с использованием 1 мкг общей РНК с помощью набора реагентов для обратной транскрипции.
    3. Подготовка реакций количественной ПЦР: Подготовка 20 мкл реакций, содержащих 10 мкл мастер-смеси, 0,8 мкл каждого праймера (10 мкМ стока, итоговые 400 нМ), 2 мкл матрицы кДНК (50 нг), 6,4 мкл воды, не содержащей нуклеаз. Запускайте тройками. Используйте систему ПЦР в реальном времени.
    4. Используйте проверенные последовательности праймеров:
      1. CLCF1 нападающий: 5'-CCTCCTGCTTCTTGCCTACC-3',
        реверс: 5'-TGCCACCATGTTTTTTTCCT-3'
      2. CRLF1 впереди: 5'-TGAAGCTCATCCTGCAGTTC-3',
        реверс: 5'-CAGCATCTCCTCCTTGATGC-3'
      3. STAT1 нападающий: 5'-CAGCTTCAGCAGCTTGACTC-3',
        реверс: 5'-AAGGTCAGCGATGTCTTCAG-3'
      4. STAT3 нападающий: 5'-CAGCAGCTTGACACACGGTA-3',
        реверс: 5'-AAACACCAAAAGGTGGCATGA-3'
    5. Выполните протокол количественной ПЦР: 95 °C в течение 10 минут, затем 40 циклов при 95 °C в течение 15 с и 60 °C в течение 1 минуты.
    6. Анализ результатов с помощью метода 2(-ΔΔCt) с нормализацией β-актина21.
  3. Анализ панели генов реакции на физическую нагрузку
    1. Включите гены, реагирующие на физическую нагрузку: IL-6, TNF-α, IL-1β, BDNF, IGF-1 и миостатин.
    2. Используйте проверенные последовательности праймеров:
      1. Ил-6 впереди: 5'-AGCCACTCACCTCTTCAGAAC-3',
        реверс: 5'-GCCTTTTTGCTGCTCTCACAC-3';
      2. ФНО-α впереди: 5'-CCCAGGGACCTCTCTCTAATC-3',
        реверс: 5'-ATGGGCTACAGGCTTGTCACT-3';
      3. ИЛ-1β вперед: 5'-ACAGATGAAGTGCTCCTTCCA-3',
        реверс: 5'-GTCGGAGATTCGTAGCTGGAT-3';
      4. BDNF вперед: 5'-TAACATGGCTGCGCGTGT-3',
        реверс: 5'-CGAGTGGGTCACAGCGGCAG-3';
      5. ИФР-1 вперед: 5'-GCTCTTCAGTTCGTGTGTGGA-3',
        реверс: 5'-GCCTCCTTAGATCACAGCTCC-3';
      6. Миостатин форвард: 5'-AGTGACGGGCTTTTTGGAAGA-3',
        реверс: 5'-GTTTCAGAGGCCGGTCAAGT-3'.
    3. Коррелируют вызванные физической нагрузкой изменения CLCF1 с другими паттернами экспрессии миокинов.
    4. Оценивайте соотношения экспрессии CLCF1/CRLF1 как индикаторы формирования функционального комплекса цитокинов.

4. Улучшенный анализ экспрессии белка с фокусом на пути STAT

  1. Экстракция белка и количественное определение для анализа STAT
    1. Лиз PBMCs в буфере для лизиса (150 мМ NaCl, 1% NP-40, 0,5% дезоксихолат натрия, 0,1% SDS, 50 мМ Tris-HCl pH 8,0) с добавлением коктейлей протеаз и ингибиторов фосфатазы.
    2. Добавьте некоторые специфические ингибиторы фосфатазы: ортванадат натрия (1 мМ) и фторид натрия (50 мМ) непосредственно перед применением.
    3. Лизаты инкубировать на льду в течение 30 мин с периодическим вихревым движением на средней скорости каждые 10 мин.
    4. Центрифуга при 12 000 × г в течение 15 мин при 4 °C для удаления клеточного мусора.
    5. Количественное определение концентрации белка с помощью анализа Брэдфорда или метода BCA22.
    6. Отрегулируйте концентрацию белка до 2 мкг/мкл в буфере для образца и храните при -80 °C до дальнейшего анализа для применения в западном блоттинге.
  2. Комплексный анализ вестерн-блоттинга с фокусом на передачу сигналов STAT
    1. Приготовьте 10 мл 10% гелей SDS-PAGE с использованием стандартных растворов акриламида/бисакриламида.
    2. Загрузите 20 мкг белка на дорожку вместе с предварительно окрашенными молекулярными маркерами массы и разрешите при 120 В в течение 90 минут.
    3. Перенос белков на мембраны PVDF при напряжении 100 В в течение 2 ч при 4 °C с использованием буфера переноса (25 мМ Трис, 192 мМ глицина, 20% метанола).
    4. Блокируйте мембраны 50 мл 5% обезжиренного сухого молока в трис-буферном физрастворе с 0,1% Tween-20 (TBST).
    5. Инкубировать с первичными антителами в течение ночи при 4 °C: Anti-CLCF1 (1:1,000); Анти-CRLF1 (1:1,000); Анти-ОПГ (1:1,000); Anti-RANKL (1:1,000); Анти-JAK2 (1:1,000); Антифосфо-JAK2 (Tyr1007/1008, 1:1,000); Anti-STAT1 (1:1,000); антифосфо-STAT1 (Tyr701, 1:1,000); Анти-STAT3 (1:1,000); антифосфо-STAT3 (Tyr705, 1:1,000); Анти-β-актин (1:1,000)
    6. Промойте мембраны 3 раза по 10 мин каждый 15 мл TBST. Инкубировать с соответствующими вторичными антителами в течение 1 ч при комнатной температуре.
    7. Обнаружение белковых полос с помощью усиленной хемилюминесцентной подложки. Изображение с помощью хемилюминесцентной системы визуализации с автоматической оптимизацией экспозиции. Количественная оценка с помощью денситометрического анализа с помощью инструмента анализа геля ImageJ v1.53.
  3. Анализ двух путей STAT1/STAT3
    1. Рассчитайте соотношения фосфо-STAT1/общий STAT1 и фосфо-STAT3/общий STAT3 с помощью программного обеспечения ImageJ/Fiji версии 1.54f.
    2. Оценивайте баланс активации STAT1/STAT3 как индикатор функциональной активности CLCF1.
    3. Коррелируют паттерны активации STAT с соотношением экспрессии RANKL/OPG.
    4. Оценивайте фосфорилирование STAT1/STAT3 с помощью вестерн-блоттинга через 0, 15, 30, 60, 120 и 240 минут после лечения CLCF1. Нормализовать уровень фосфо-белка до общего белка с помощью денситометрии.

5. Продвинутый CRISPR/Cas9-опосредованный нокаут гена с валидацией

  1. Улучшенная конструкция лентивирусного вектора
    1. Разработка однонаправляющей РНК (sgRNA), нацеленной на последовательность гена CLCF1:
      TTGAAGTCTGGCTCGTTGAA-3'.
    2. Включите дополнительные последовательности sgRNA для повышения эффективности нокаута:
      GCTTGAACGAGCCAGACTTC-3'.
    3. Клонируйте sgРНК в лентивирусный вектор с использованием стандартных методов молекулярного клонирования.
    4. Проверка целостности конструкции с помощью анализа секвенирования ДНК.
    5. Оцените эффективность разрезания sgRNA с помощью анализа эндонуклеазы T7 I23.
    6. Включите валидацию специфичности пути с использованием ингибиторов: AG490 (JAK2, 50 мкМ), флударабина (STAT1, 10 мкМ) и Stattic (STAT3, 5 мкМ).
    7. Проводите спасательные эксперименты с использованием конститутивно активных конструкций STAT для проверки необходимости пути.
  2. Оптимизированный протокол лентивирусной трансдукции
    1. Культуру клеток Raji в среде RPMI-1640 (500 мл) с добавлением 10% FBS. Поддерживайте все клеточные культуры при температуре 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%CO2. Предварительно уравновесьте питательную среду в течение не менее 30 минут перед использованием.
    2. Предварительно обработайте клетки полибреном (8 мкг/мл) для повышения эффективности трансдукции.
    3. Получение лентивируса с использованием HEK293T клеток с упаковкой и плазмидами в оболочке путем трансфекции фосфата кальция. Определите титр по p24 ИФА (требуется > 108 TU/мл). Соблюдайте условия содержания BSL-223.
    4. Трансдуцировать клетки лентивирусом при кратности инфекции (MOI) 100. Смена среды через 24 часа после трансдукции. Отбирают трансдуцированные клетки с помощью пуромицина (4 мкг/мл) в течение 7 дней, затем амплифицируют область 500.о., охватывающую целевой сайт, используя следующие условия ПЦР: начальная денатурация при 95 °С в течение 3 мин, затем 35 циклов денатурации при 95 °С в течение 30 с, отжиг при 60 °С в течение 30 с и удлинение при 72 °С в течение 30 с, с окончательным продлением при 72 °C в течение 5 мин. Для анализа эндонуклеазы Т7 денатурировать и повторно отжечь продукты ПЦР, расщепить с эндонуклеазой Т7E1 в течение 30 мин при 37 °C, затем проанализировать продукты на 2% агарозном геле.
    5. Валидация эффективности нокаута гена с помощью вестерн-блоттинга и секвенирования по Сэнгеру24,25.
    6. Выполнение нецелевого анализа с использованием GUIDE-seq или аналогичной методологии26.
      Примечание: Последние данные показывают, что эффективность секреции CLCF1 требует совместной экспрессии с шапероновым белком CRLF1. Рассмотрите подходы с двойным нокаутом для полной функциональной абляции27.

6. Комплексная система ко-культуры с миметиками упражнений

ПРИМЕЧАНИЕ: Для трансляционной валидации адаптируйтесь к овариэктомическим моделям мышей, вводя rhCLCF1 в дозе 10 мкг/кг в/ч ежедневно в течение 4 недель, оценивая МПКТ с помощью микро-КТ.

  1. Усовершенствованная настройка кокультуры Raji-MG-63
    1. Посев остеобластоподобных клеток MG-63 в 24-луночные тарелочные нижние камеры при плотности 2 × 104 клеток/лунки в увлажненном инкубаторе при 37 °С с 5%СО2 и 95% влажности. Предварительно уравновесить среду в инкубаторе за 30 минут до использования. Для улучшения трансляции замените на первичные остеобласты человека (плотность 1 × 104 лунки) из коммерческих источников.
    2. Поместите мембранные вставки размером 0,4 мкм в лунки, содержащие клетки MG-63.
    3. Засейте клетки Raji (дикого типа, CLCF1-нокаут или сверхэкспрессия CLCF1) в верхних камерах при плотности 1 × 105 клеток/лунка.
    4. Сокультуры выдерживают в полной среде RPMI-1640 (2 мл в нижней камере, 1,5 мл в верхней камере) в течение определенных периодов эксперимента (7, 14, 21 день) при температуре 37 °C с 5%CO2.
    5. Включите группы лечения рекомбинантным CLCF1 (5-10 нг/мл) для оценки зависимости доза-ответ.
  2. Протокол лечения с помощью физической нагрузки и миметики CLCF1
    1. Обрабатывайте системы совместного культивирования физиологическими концентрациями рекомбинантного CLCF1 (5-10 нг/мл) в зависимости от уровней, вызванных физической нагрузкой.
    2. Применяйте пульсирующую схему лечения CLCF1: Применяйте CLCF1 в течение 2 часов импульсов в 0, 8 и 16 часов в 1-й день, затем непрерывное воздействие в течение 24 часов, затем повторите цикл. Общая продолжительность процедуры: 7 дней с 9 импульсами.
    3. Оценивайте зависящие от времени эффекты через 1 ч, 4 ч, 24 ч и 7 дней после лечения.
    4. Контролируйте кинетику фосфорилирования STAT1/STAT3 в обеих клеточных популяциях с помощью вестерн-блоттинга через 0, 15, 30, 60 мин. Лизируют клетки в буфере (500 мкл) с ингибиторами, нормализуют до общего STAT1/3 и β-актина.
  3. Расширенная оценка остеогенной дифференцировки
    1. Индуцировать остеогенную дифференцировку с помощью стандартной остеогенной среды, содержащей аскорбиновую кислоту (50 мкг/мл), β-глицерофосфат (10 мМ) и дексаметазон (10 нМ). Смену остеогенной среды проводить каждые 3 дня (2 мл нижней камеры, 1,5 мл верхней). Готовьте свежий раствор аскорбиновой кислоты для каждой смены; β-глицерофосфат и дексаметазон остаются стабильными.
    2. Оцените активность щелочной фосфатазы (ЩФ) с помощью колориметрического ферментного анализа на 7, 14 и21-28 день. Используйте 500 μл объема экстракции. Читается при 405 нм. Нормализуют до общего содержания белка. Ожидаемая цветовая гамма: от светло-желтого (низкий) до темно-желтого (высокий).
    3. Оцените осаждение кальция с помощью окрашивания Ализарином Red S и количественного определения на 21-й день. Экстракт содержит 500 мкл цетилпиридиния хлорида, считывается при 540 нм, ожидаемая цветовая гамма: от светло-розового (низкая минерализация) до темно-красного (высокая минерализация).
    4. Количественно оцените минерализацию путем измерения абсорбции на длине волны 540 нм после экстракции хлорида цетилпиридиния.
    5. Проанализируйте экспрессию остеогенных генов: RUNX2, ALP, COL1A1, OCN и OPG с использованием протоколов количественной ПЦР, описанных в шаге 3.2.
    6. Оцените маркеры, связанные с остеокластами: TRAP, катепсин К и RANKL в клетках MG-63.

7. Расширенный статистический анализ и интерпретация данных

  1. Комплексная статистическая методология
    1. Выполнение проверки нормальности с использованием теста Шапиро-Уилка для всех непрерывных переменных29. Используйте непараметрические тесты при нарушении предположений о нормальности (p < 0,05).
    2. Применение U-критерия Манна-Уитни для непараметрических сравнений между группами30.
    3. Проведение корреляционного анализа по методу Спирмена для исследований ассоциации между уровнями CLCF1 и клиническими параметрами31.
    4. Выполнение множественного регрессионного анализа для оценки независимых предикторов МПК.
    5. Используйте повторные измерения ANOVA для анализа времени и хода упражнений32.
    6. Применение коррекции Бонферрони для множественных сравнений33.
    7. Установите порог статистической значимости на уровне p < 0,05 для всех анализов.
  2. Улучшенное представление и анализ данных
    1. Представляйте непрерывные данные в виде среднего значения ± стандартного отклонения или медианы с межквартильным диапазоном.
    2. Создание графиков корреляции для экспрессии CLCF1 в зависимости от МПК, количества лимфоцитов и параметров упражнений с помощью GraphPad Prism v9 для статистики, ImageJ v1.53 для денситометрии. Пользовательские скрипты не требуются. Сгенерируйте ROC с помощью встроенного инструмента Prism; корреляции через Спирмена в призме.
    3. Построение графиков временного хода для кинетики реакции CLCF1, вызванной физической нагрузкой.
    4. Разработка кривых рабочих характеристик приемника (ROC) для CLCF1 в качестве биомаркера остеопороза.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Репрезентативные изображения вестерн-блоттинга были созданы с использованием количественного денситометрического анализа.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Реализация этого протокола успешно демонстрирует регуляторную роль CLCF1 в иммуноопосредованном метаболизме костей с использованием нескольких экспериментальных подходов. Клинические валидационные исследования показывают значительное снижение экспрессии CLCF1 у пациентов с PMOP по сравнению со здоровыми контрольными группами, как показано на рисунке 1A, количественный ПЦР-анализ мононуклеарных клеток периферической крови пока...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь протокол обеспечивает всестороннюю методологическую основу для исследования роли CLCF1 в качестве индуцированного упражнениями медиатора защиты кости посредством систематического анализа оси RANKL/OPG. Недавние прорывные исследования определили CLCF1 как фактор, вызванный физическими упражнениями, который борется с возрастным снижением опорно-двигательного аппарата, позиционируя его как центральный медиатор защиты костей, вызванной физическими упражнениями 34,35,36.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, о котором можно было бы заявить.

Благодарности

Авторы выражают признательность участникам, которые вызвались принять участие в этом исследовании, и клиническому персоналу Центральной больницы при Первом медицинском университете Шаньдуна за их помощь в наборе пациентов и сборе образцов. Мы благодарим лаборантов за поддержку в проведении экспериментов по клеточным культурам и молекулярной биологии. Х.З. задумал и разработал исследование, провел эксперименты, проанализировал данные и написал рукопись. Х.Л. внес свой вклад в планирование эксперимента, сбор данных и редактирование рукописи. Е.С. руководил проектом, предоставлял критические отзывы и редактировал рукопись. Все авторы рассмотрели и одобрили окончательную версию рукописи к подаче.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
<сильные>клеточные культурные среды и медиа Реагенты< сильные>
Диметилсульфоксид (DMSO)Сигма-ОлдричD2650Purpose_Application:  Компонент криоконсервационной среды
Specifications_Comments: молекулярно-биологический класс, стерильная фильтрация
Среда DMEMТермо Фишер Сайентифик11965092Purpose_Application:  Среда культуры остеобластов MG-63
Specifications_Comments: высокоглюкозная формула с L-глутамином
Сыворотка для плода быка (FBS)Термо Фишер Сайентифик16000044Purpose_Application:  Добавка для клеточной культуры (инактивированная теплом)
Specifications_Comments: Инактивирована теплом при 56 и Acirc; ° C на 30 минут
Пенициллин-стрептомицинТермо Фишер Сайентифик15140122Purpose_Application:  Антибиотиковая добавка для стерильного посева
Specifications_Comments: 100 раз, конечная концентрация 1%
Полибрен (гексадиметриновый бромид)Санта-Крус БиотехнологияSC-134220Purpose_Application:  Лентивирусный усилитель трансдукции
Specifications_Comments: 8 Î ¼ г/мл рабочей концентрации
Пуромицин дигидрохлоридInvivoGenant-pr-1Purpose_Application:  Селекционный антибиотик для трансдуцированных клеток
Specifications_Comments: 4 Î ¼ концентрация отбора g/ml в течение 7 дней
Средний RPMI-1640Термо Фишер Сайентифик11875093Purpose_Application:  Raji B-лимфоцитная среда
Specifications_Comments: С L-глутамином, без фенол-красного предпочтительно
Раствор Trypan BlueТермо Фишер Сайентифик15250061Purpose_Application:  Оценка жизнеспособности клеток
Specifications_Comments: раствор 0,4% для теста на исключение
Контейнер с контролируемой скоростью заморозкиТермо Фишер Сайентифик5100-0001Purpose_Application:  Замораживание клеток с контролируемой скоростью (-1Â ° C/min)
Specifications_Comments: Мистер Фрости или эквивалент для -1Â ° Охлаждение на с/мин
Трубки для сбора крови EDTABD Biosciences366643Purpose_Application:  Венозная кровь с антикоагулянтом
Specifications_Comments: ёмкость 10-20 мл, фиолетовые трубки
Градиент плотности Ficoll-Paque PLUSCytiva (GE Healthcare)17144003Purpose_Application:  Изоляция PBMC с помощью центрифугирования по плотности
Specifications_Comments: стерильный, тестируемый с помощью эндотоксинов для разделения клеток
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Термо Фишер Сайентифик14190144Purpose_Application:  Буфер промывания и разведения клеток
Specifications_Comments: стерильный, клеточная культура
<Сильная>РНК и экстракция qPCR
Хлороформ (класс ACS)Сигма-ОлдричC2432Purpose_Application:  Фазовое разделение при экстракции РНК<бр/> Specifications_Comments: реагент ACS, и ацирк; и пермил; ¥ Чистота 99%
Этанол (75%, молекулярный класс)Сигма-ОлдричE7023Purpose_Application:  Промывка РНК-гранул
Specifications_Comments: Молекулярно-биологический класс, свежая подготовка
Изопропанол (молекулярный сорт)Сигма-ОлдричI9516Purpose_Application:  РНК-преципитация
Specifications_Comments: молекулярно-биологический уровень и acirc; и пермил; ¥ Чистота 99,5%
Вода без нуклеазыТермо Фишер СайентификAM9930Purpose_Application:  Подготовка к ПЦР-реакции
Specifications_Comments: без ДНКаз/РНаз, протестирована для применения ПЦР
Оптическая клеевая плёнкаТермо Фишер Сайентифик4311971Purpose_Application:  Оптическая герметизация для qPCR-пластин
Specifications_Comments: Оптическое качество для qPCR-приложений
ПЦР-пластины (96-скважинные)Термо Фишер СайентификN8010560Purpose_Application:  96-колодный формат для высокопроизводительного qPCR
Specifications_Comments: белый, прозрачный дно для оптического обнаружения
Полоски для ПЦР-трубокТермо Фишер СайентификAB0451Purpose_Application:  ПЦР-реакции малого объёма
Specifications_Comments: 8-трубочные полоски с отдельными крышками
PrimeScript RT Reagent KitTakara BioRR037APurpose_Application:  Обратная транскрипция РНК в cДНК
Specifications_Comments: с помощью стирателя gDNA для удаления геномной ДНК
SYBR Green Master MixПрикладные биосистемы4309155Purpose_Application:  Амплификация и обнаружение ПЦР в реальном времени
Specifications_Comments: с использованием референсного красителя ROX для нормализации
Реагент тризола (лизис РНК)Термо Фишер Сайентифик15596026Purpose_Application:  Лизис клеток и экстракция РНК
Specifications_Comments: храните в 4Â ° C, используйте в течение 6 месяцев
Protein Analysis - Western Blot
Акриламид/бисакриламид (29:1)Био-Рад1610146Purpose_Application:  Гель-полимеризация SDS-PAGE
Specifications_Comments: 30% акриламидный раствор
Набор для анализа белков BCAТермо Фишер Сайентифик23225Purpose_Application:  Количественная оценка концентрации белка
Specifications_Comments: Совместимость с редукцией для точной количественной оценки
Усиленная хемилюминесцентная (ECL) подложкаТермо Фишер Сайентифик32106Purpose_Application:  Обнаружение хемилюминесцентных белков
Specifications_Comments: Обнаружение чувствительности к фемтограмме
Обезжиренное сухое молокоLab Scientific170-6404Purpose_Application:  Средство для блокировки западных пятен
Specifications_Comments: Градация блокировки, низкий фон
Коктейль с ингибиторами фосфатазыRoche Applied Science4906845001Purpose_Application:  Предотвращение дефосфорилирования белка
Specifications_Comments: включает окадаиновую кислоту и каликулин A
Белковая лестница с предварительной окрашенностьюБио-Рад1610394Purpose_Application:  Эталонные стандарты молекулярной массы
Specifications_Comments: диапазон 10-250 кДа с 11 полосами
Коктейль с ингибиторами протеазыRoche Applied Science11697498001Purpose_Application:  Предотвращение деградации белков во время лизиса
Specifications_Comments: Не содержит ЭДТА для металлозависимых фосфатаз.
Мембраны PVDF (0,45 и Icirc; ¼ m)Миллипор СигмаIPVH00010Purpose_Application:  Мембрана переноса белков (0,45 и Icirc; ¼ m pore)
Specifications_Comments: Фон низкой флуоресценции
RIPA Lysis BufferТехнология клеточной сигнализации9806SPurpose_Application:  Экстракция цельных клеток белка
Specifications_Comments: готовый к использованию буфер лизиса с моющими средствами
Буфер загрузки образца (4X)Био-Рад1610747Purpose_Application:  Подготовка образца белка для SDS-PAGE
Specifications_Comments: Загрузка красителя с помощью Icirc; ²-меркаптоэтанол
SDS-PAGE Буфер ЗапускаБио-Рад1610732Purpose_Application:  Электрофорез белков
Specifications_Comments: Буферная система трис-глицин-SDS
Фтор натрияСигма-Олдрич201154Purpose_Application:  Дополнительное ингибирование фосфатазы<бр/> Specifications_Comments: рабочая концентрация 50 мМ
Ортованадат натрияСигма-ОлдричS6508Purpose_Application:  Сохранение фосфорилирования JAK2/STAT
Specifications_Comments: 1 мМ, рабочая концентрация, подготовка свежей
Концентрат буферного переносаБио-Рад1704156Purpose_Application:  Полусухой перенос белка
Specifications_Comments: концентрат 10 раз, разбавляю перед использованием
Трис-буферный физиологический раствор с Tween-20 (TBST)Технология клеточной сигнализации9997SPurpose_Application:  Промывка мембраны и разбавление антител
Specifications_Comments: 0,1% Tween-20, pH 7,6
<сильный>CRISPR/редактирование генов
Набор для трансфекции фосфата кальцияPromegaE1200Purpose_Application:  Трансфекция ДНК в упаковочные клетки
Specifications_Comments: Высокая эффективность трансфекции для производства лентивирусов
Набор для экстракции ДНК-геляЦягэн28706Purpose_Application:  Очистка продуктов ПЦР для секвенирования
Specifications_Comments: Система очистки на основе колонок
Лентивирусный вектор GV371GeneChem Co., LtdGV371Purpose_Application:  Экспрессия CRISPR/Cas9 для генного knockout
Specifications_Comments: Готовая к использованию лентивирусная система CRISPR/Cas9
HEK293T Клеточная линияATCCCRL-3216Purpose_Application:  Лентивирусная клеточная линия упаковки
Specifications_Comments: Высокотрансфектируемая упаковочная линия клеток
Служба секвенирования SangerMacrogen Inc.ОбычайPurpose_Application:  Валидация нокаута и анализ вне цели
Specifications_Comments: стандартное секвенирование с пользовательскими праймерами
T7 Эндонуклеаза INew England BiolabsM0302SPurpose_Application:  Валидация эффективности резки CRISPR
Specifications_Comments: Специфическая эндонуклеаза с несоответствием для валидации CRISPR
ELISA и Иммуноанализы< сильные>
Пластины ELISA (96-колодцевец, плоское дно)Корнинг3590Purpose_Application:  Реакция субстрата ELISA
Specifications_Comments: Высоко связывающая, плоскодонная реакция для ИФП
Человеческий CLCF1 DuoSet ELISAR& D SystemsDY1234Purpose_Application:  Количественная оценка белка CLCF1 (31,2–2000 пг/мл)<бр/> Specifications_Comments: диапазон обнаружения: 31,2–2000 пг/мл, CV и 10%
p24 ELISA Kit (титр лентивируса)Корпорация ZeptoMetrix801111Purpose_Application:  Определение титра лентивируса
Specifications_Comments: Для определения титра лентивируса (>10â и цедил; TU/mL)
<Сильные>функциональные анализы
Набор для окрашивания красного S Alizarin RedСигма-ОлдричA5533Purpose_Application:  Визуализация кальциевого отложения
Specifications_Comments: 2% раствор в дистиллированной воде, pH 4,1-4,3
Набор активности по щелочной фосфатазеAbcamab83369Purpose_Application:  Измерение ферментативной активности ALP
Specifications_Comments: колориметрический анализ, измеряемый при 405 нм
Аскорбиновая кислота (L-аскорбиновая кислота)Сигма-ОлдричA4544Purpose_Application:  Компонент остеогенной среды
Specifications_Comments: 50 Î ¼ Итоговая концентрация по г/мл
Цетилпиридиний хлоридСигма-ОлдричC9002Purpose_Application:  Экстракция Alizarin Red S для количественной оценки
Specifications_Comments: 10% раствор для экстракции красителя
ДексаметазонСигма-ОлдричD4902Purpose_Application:  Компонент остеогенной среды
Specifications_Comments: конечная концентрация 10 нМ
Î ²-ГлицерофосфатСигма-ОлдричG9422Purpose_Application:  Компонент остеогенной среды
Specifications_Comments: 10 мМ конечная концентрация
Остеогенная дифференциационная средаPromoCellC-28010Purpose_Application:  Индукция дифференцировки остеобластов
Specifications_Comments: готовая к использованию полноценная остеогенная среда
Вставки для культуры клеток Трансвелла (0.4 Î ¼ m)Корнинг3470Purpose_Application:  Система совместной культуры с 0.4 и Icirc; ¼ m сепарация
Specifications_Comments: полиэтилентерефталатная мембрана, стерильная
<Сильно>Оборудование — Основные инструменты
Центрифуга (высокоскоростная, охлаждённая)Эппендорф5430RPurpose_Application:  Обработка образцов и разделение клеток
Specifications_Comments: В холодильнике, максимум 30 000 x г
Система хемилюминесцентной визуализацииБио-Рад Лаборатории12003154Purpose_Application:  Вестерн-блот визуализация и количественная оценка
Specifications_Comments: Гелевая документация и вестерн-блот визуализация
CO2-инкубатор (увлажнённый)Термо Фишер Сайентифик51030287Purpose_Application:  Поддержание клеточной культуры (37Â ° C, 5% CO2)
Specifications_Comments: тройной газ (CO2/O2/N2), контроль влажности
Монитор сердечного ритма (нагрудный ремень)Polar ElectroH10Purpose_Application:  Непрерывный мониторинг сердечного ритма
Specifications_Comments: Bluetooth-соединение и Acirc; ± Точность 1 удара в минуту
Hologic Discovery: DXA-сканерHologic Inc.Discovery APurpose_Application:  Измерение минеральной плотности костей
Specifications_Comments: С программным обеспечением APEX v4.5 требуется ежедневное качество качества
Считыватель микропластин (многорежимный)BioTek InstrumentsСинергия H1Purpose_Application:  Измерение и измерение поглощения пластин ELISA
Specifications_Comments: UV-Vi, флуоресценция, обнаружение люминесценции
Моторизованная беговая дорожкаЖизненная форма95TiPurpose_Application:  Стандартизированное вмешательство в упражнениях<бр/> Specifications_Comments: Переменная скорость 0-16 км/ч, уклон 0-15%
Система ПЦР в реальном времени (CFX96 или эквивалент)Био-Рад Лаборатории1855195Purpose_Application:  Усиление и обнаружение ПЦР в реальном времени
Specifications_Comments: блок на 96 лунок с градиентным способом
Software & Software Инструменты анализа< сильные>
Программное обеспечение APEX v4.5 (анализ DXA)Hologic Inc.v4.5Purpose_Application:  Анализ DXA и расчёт BMD
Specifications_Comments: анализ BMD с использованием базы данных данных
Bio-Rad CFX MaestroБио-Рад ЛабораторииCFX MaestroPurpose_Application:  анализ данных qPCR и определение КТ
Specifications_Comments: анализ ПЦР в реальном времени и экспорт данных
GraphPad Prism v9.0Программное обеспечение GraphPadv9.0Purpose_Application:  Статистический анализ и генерация графов
Specifications_Comments: статистическое программное обеспечение с генерацией графов
ImageJ/Fiji v1.53Национальные институты здравоохраненияv1.53Purpose_Application:  Денситометрия вестерн-блот и анализ изображений
Specifications_Comments: анализ изображений с помощью инструментов измерения
Microsoft Excel 365Microsoft Corporation365Purpose_Application:  Организация данных и базовые вычисления
Specifications_Comments: Организация данных и базовые статистические функции
<сильные>расходники и расходники Пластиковая посуда< прочная>
Микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 млЭппендорф22363204Purpose_Application:  Хранение и обработка образцов малого объёма
Specifications_Comments: ДНКазы/РНазы без ДНК, с низким уровнем связывания
Конические трубки объёмом 15 млКорнинг430766Purpose_Application:  Обработка образцов среднего объёма
Specifications_Comments: полипропилен, градуированный, с конденсаторами
24-ячественные клеточные культивные пластиныКорнинг3524Purpose_Application:  Совместная культура и настройка функционального анализа<бр/> Specifications_Comments: обработка тканевой культуры, плоское дно
Конические трубки объёмом 50 млКорнинг430829Purpose_Application:  Сбор и обработка образцов большого объёма
Specifications_Comments: полипропилен, с постепенными конденсаторами
Криовиалы (1 мл)Термо Фишер Сайентифик375418Purpose_Application:  Длительное хранение клеток и образцов при -80 градусов (Acirc); ° C
Specifications_Comments: Внешняя резьба, уплотнение O-кольца, -196Â ° Рейтинг C
Пипетки Пастера (стерильные)Fisher Scientific13-678-20APurpose_Application:  Стерильный сбор и перенос образцов
Specifications_Comments: Индивидуально упакованный, стерильный

Ссылки

  1. Rachner, T. D., Khosla, S., Hofbauer, L. C. Osteoporosis: now and the future. Lancet. 377 (9773), 1276-1287 (2011).
  2. Chen, X., et al. Association of cardiotrophin-like cytokine factor 1 levels in peripheral blood mononuclear cells with bone mineral density and osteoporosis in postmenopausal women. BMC Musculoskelet Disord. 22 (1), 62(2021).
  3. Ilesanmi-Oyelere, B. L., et al. Inflammatory markers and bone health in postmenopausal women: a cross-sectional overview. Immun Ageing. 16, 15(2019).
  4. Ahn, N., Kim, K. Effects of 12-week exercise training on osteocalcin, high-sensitivity C-reactive protein concentrations, and insulin resistance in elderly females with osteoporosis. J Phys Ther Sci. 28 (8), 2227-2231 (2016).
  5. Graves, D. T., Li, J., Cochran, D. L. Inflammation and uncoupling as mechanisms of periodontal bone loss. J Dent Res. 90 (2), 143-153 (2011).
  6. Kang, J. S., et al. Exercise-induced CLCF1 attenuates age-related muscle and bone decline in mice. Nat Commun. 16 (1), 4743(2025).
  7. Sims, N. A. Cardiotrophin-like cytokine factor 1 (CLCF1) and neuropoietin (NP) signalling and their roles in development, adulthood, cancer and degenerative disorders. Cytokine Growth Factor Rev. 26 (5), 517-522 (2015).
  8. Oliveira, M. C., Vullings, J., van de Loo, F. A. J. Osteoporosis and osteoarthritis are two sides of the same coin paid for obesity. Nutrition. 70, 110486(2020).
  9. Yokota, S., et al. Cardiotrophin-like cytokine factor 1 alleviates bone loss in osteoporosis mouse models by suppressing osteoclast differentiation through activating interferon signaling and repressing the nuclear factor-κB signaling pathway. Bone. 153, 116140(2021).
  10. Ponzetti, M., Rucci, N. Updates on osteoimmunology: what's new on the cross-talk between bone and immune system. Front Endocrinol (Lausanne). 10, 236(2019).
  11. Larsen, J. V., et al. Cytokine-like factor 1, an essential facilitator of cardiotrophin-like cytokine:ciliary neurotrophic factor receptor α signaling and sorLA-mediated turnover. Mol Cell Biol. 36 (8), 1272-1286 (2016).
  12. de Vries, T. J., et al. What are the peripheral blood determinants for increased osteoclast formation in the various inflammatory diseases associated with bone loss. Front Immunol. 10, 505(2019).
  13. Weitzmann, M. N. The role of inflammatory cytokines, the RANKL/OPG axis, and the immunoskeletal interface in physiological bone turnover and osteoporosis. Scientifica (Cairo). 2013, 125705(2013).
  14. Srivastava, R. K., Dar, H. Y., Mishra, P. K. Immunoporosis: immunology of osteoporosis-role of T cells. Front Immunol. 9, 657(2018).
  15. Ming, J., Cronin, S. J. F., Penninger, J. M. Targeting the RANKL/RANK/OPG axis for cancer therapy. Front Oncol. 10, 1283(2020).
  16. Sobacchi, C., Menale, C., Villa, A. The RANKL-RANK axis: a bone to thymus round trip. Front Immunol. 10, 629(2019).
  17. Wang, T., He, C. TNF-α and IL-6: the link between immune and bone system. Curr Drug Targets. 21 (3), 213-227 (2020).
  18. Jones, S. A., Jenkins, B. J. Recent insights into targeting the IL-6 cytokine family in inflammatory diseases and cancer. Nat Rev Immunol. 18 (12), 773-789 (2018).
  19. Villafaina, S., Biehl-Printes, C., Parraca, J. A., de Oliveira Brauner, F., Tomas-Carus, P. What mathematical models are accurate for prescribing aerobic exercise in women with fibromyalgia. Biology (Basel). 11 (5), 704(2022).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. 111, A3.B.1-A3.B.3 (2015).
  21. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(−ΔΔC(T)) method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
  22. Kielkopf, C. L., Bauer, W., Urbatsch, I. L. Bradford assay for determining protein concentration. Cold Spring Harb Protoc. 2020 (4), 102269(2020).
  23. Sentmanat, M. F., Peters, S. T., Florian, C. P., Connelly, J. P., Pruett-Miller, S. M. A survey of validation strategies for CRISPR-Cas9 editing. Sci Rep. 8 (1), 888(2018).
  24. Mousavi Kahaki, S. A., Ebrahimzadeh, N., Fahimi, H., Moshiri, A. Development of an optimized protocol for generating knockout cancer cell lines using the CRISPR/Cas9 system, with emphasis on transient transfection. PLoS One. 19 (11), e0310368(2024).
  25. Eren, K., Taktakoğlu, N., Pirim, I. DNA sequencing methods: from past to present. Eurasian J Med. 54 (Suppl1), 47-56 (2022).
  26. Wienert, B., Wyman, S. K., Yeh, C. D., Conklin, B. R., Corn, J. E. CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq. Nat Protoc. 15 (5), 1775-1799 (2020).
  27. Crisponi, L., Buers, I., Rutsch, F. CRLF1 and CLCF1 in development, health and disease. Int J Mol Sci. 23 (2), 992(2022).
  28. Ansari, S., Ito, K., Hofmann, S. Alkaline phosphatase activity of serum affects osteogenic differentiation cultures. ACS Omega. 7 (15), 12724-12733 (2022).
  29. Ghasemi, A., Zahediasl, S. Normality tests for statistical analysis: a guide for non-statisticians. Int J Endocrinol Metab. 10 (2), 486-489 (2012).
  30. Rousseaux, C. G., Gad, S. C. Haschek and Rousseaux's handbook of toxicologic pathology. , 3rd ed, Academic Press. (2013).
  31. Spiegelman, D. Commentary: some remarks on the seminal 1904 paper of Charles Spearman: the proof and measurement of association between two things. Int J Epidemiol. 39 (5), 1156-1159 (2010).
  32. Cleophas, T. J., Zwinderman, A. H., van Ouwerkerk, B. M. Methods for analyzing cardiovascular studies with repeated measures. Neth Heart J. 17 (11), 429-433 (2009).
  33. Haynes, W. Encyclopedia of systems biology. , Springer. New York. (2013).
  34. Kang, J. S., et al. Exercise-induced CLCF1 attenuates age-related muscle and bone decline in mice. Nat Commun. 16 (1), 4743(2025).
  35. Zhao, C., Gong, Y., Zheng, L., Zhao, M. Untargeted metabolomic reveals changes in muscle metabolites of mice during exercise recovery and mechanisms of whey protein and whey protein hydrolysate in promoting muscle repair. Food Res Int. 184, 114261(2024).
  36. Koltun, K. J., et al. Effect of acute resistance exercise on bone turnover in young adults before and after concurrent resistance and interval training. Physiol Rep. 12 (3), e15906(2024).
  37. Li, J. JAK-STAT and bone metabolism. JAK-STAT. 2 (3), e23930(2013).
  38. Sims, N. A. The JAK1/STAT3/SOCS3 axis in bone development, physiology, and pathology. Exp Mol Med. 52 (8), 1185-1197 (2020).
  39. Zhao, X., et al. Puerarin alleviates osteoporosis in rats by targeting the JAK2/STAT3 signaling pathway. Biomol Biomed. 24 (6), 1651-1661 (2024).
  40. Terpos, E., Ntanasis-Stathopoulos, I., Gavriatopoulou, M., Dimopoulos, M. A. Pathogenesis of bone disease in multiple myeloma: from bench to bedside. Blood Cancer J. 8 (1), (2018).
  41. Okamoto, K., et al. Osteoimmunology: the conceptual framework unifying the immune and skeletal systems. Physiol Rev. 97 (4), 1295-1349 (2017).
  42. Sims, N. A. Influences of the IL-6 cytokine family on bone structure and function. Cytokine. 146, 155655(2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

CLCF1RANKL OPGCRISPR
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.