Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Ингибирование остеокластогенеза путем LY90009 через модуляцию сигнальной сигнализации Notch в моделях остеолитических заболеваний

502 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69178

⸱

7 октября 2025 г.

 ,  , 
1Department of Rheumatology, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University, 2Department of Geriatrics, Feicheng People's Hospital, 3Department of Trauma Center, Central Hospital Affiliated to Shandong First Medical University

В этой статье

Краткое содержание

В данной работе мы представляем протокол для оценки ингибиторных эффектов ингибитора γ-секретазы LY900009 на RANKL-индуцированный остеокластогенез в макрофагах, полученных из костного мозга. Протокол включает оценку цитотоксичности, функциональные анализы, молекулярные анализы и валидацию in vivo на остеолитической модели мышей с применением в терапевтической разработке остеолитических заболеваний.

Аннотация

Нерегулируемая активность остеокластов вносит существенный вклад в прогрессирование остеолитической болезни, однако масштабы терапевтических вмешательств ограничены побочными эффектами. В этом исследовании изучался LY900009, ингибитор γ-секретазы, и его способность подавлять RANKL-индуцированный остеокластогенез посредством модуляции передачи сигналов Notch. Используя макрофаги, полученные из костного мозга, мы провели комплексную оценку in vitro цитотоксичности, дифференцировки и функциональных анализов. Анализ экспрессии генов и белков с использованием количественной ПЦР и вестерн-блоттинга был использован для выяснения основных молекулярных механизмов. Эффективность in vivo была подтверждена с использованием модели резорбции кости, индуцированной липополисахаридами у мышей. LY900009 ингибировал индуцированное RANKL образование остеокластов и резорбтивную функцию дозозависимым образом без цитотоксичности в терапевтических концентрациях. Такое лечение значительно снижало количество TRAP-положительных остеокластов, нарушало формирование актинового пояса и подавляло деградацию костного матрикса. Экспрессия маркеров остеокластов, включая NFATc1, c-Fos, катепсин К и TRAP, была заметно снижена. Механически LY900009 нарушил передачу сигналов Notch и нисходящие пути MAPK/Akt. Введение in vivo значительно снижает индуцированное ЛПС разрушение костей, улучшая параметры кости и уменьшая присутствие остеокластов. Эти результаты демонстрируют, что LY900009 эффективно ингибирует остеокластогенез и резорбцию кости, модулируя сигнальную ось Notch/MAPK/Akt, что делает его перспективным терапевтическим кандидатом для остеолитических нарушений.

Введение

Костный гомеостаз представляет собой тонко организованную физиологическую парадигму у позвоночных, гармонизированную тонким равновесием между остекленным остеобластом образованием костей и резорбциейкости, вызванной остеокластами1. Этот сложный баланс поддерживает целостность скелета, биомеханическую устойчивость и метаболическую верность на протяжении всей жизни, динамически реагируя на механические требования, эндокринные нарушения и патологические проблемы2. Цикл ремоделирования кости включает в себя последовательные фазы активации, резорбции, перехода, формирования и окончания, каждая из которых регулируется сложными молекулярными каскадами, обеспечивающими пространственно-временную синхронизацию клеточнойактивности.

Нарушение этого гомеостатического механизма, в частности из-за чрезмерной активности остеокластов или недостаточной функции остеобластов, провоцирует патологическую потерю костной массы, характерную для многочисленных остеолитических нарушений 4,5. Эти состояния охватывают широкий спектр заболеваний, включая постменопаузальный и стареющий остеопороз, ревматоидный артрит, воспалительный артрит, опухолевое поражение костей, болезнь Педжета и пародонтоз6. Клинические проявления чрезмерной резорбции кости включают повышенный риск переломов, деформацию скелета, хроническую боль, функциональную инвалидность и значительную нагрузку на здравоохранение 6,7. Современные эпидемиологические показатели показывают, что только остеопороз поражает более 200 миллионов человек во всем мире, при этом связанные с ним переломы приводят к значительной заболеваемости, смертности и экономическим издержкам, превышающим миллиарды долларов в год.

Остеокласты проявляются в виде высокоспециализированных многоядерных гигантских клеток, полученных из гемопоэтических предшественников линии мононуклеарных фагоцитов, в частности, макрофагов, полученных из костного мозга9. Их формирование представляет собой сложный многоступенчатый процесс, требующий точной координации внеклеточных сигналов, внутриклеточных сигнальных каскадов и транскрипционныхпрограмм10. К основным цитокинам, регулирующим остеокластогенез, относятся рецепторный активатор ядерного фактора κB лиганда (RANKL) и макрофагальный колониестимулирующий фактор (M-CSF), которые связываются с соответствующими рецепторами RANK и c-Fms для инициирования программ дифференцировки11. Взаимодействие RANKL-RANK запускает активацию нескольких нисходящих сигнальных путей, включая митоген-активируемые протеинкиназы (MAPKs), ядерный фактор κB (NF-κB), фосфоинозитид-3-киназа/протеинкиназа B (PI3K/Akt) и кальциевриновые/кальциневриновые пути, которые сходятся на ядерном факторе активированных Т-клеток cytoplasmic 1 (NFATc1), главном транскрипционном регуляторе остеокластогенеза 10,11,12.

Среди различных регуляторных механизмов, контролирующих биологию остеокластов, передача сигналов Notch стала критическим модулятором со сложными и зависящими от контекстафункциями. Путь Notch представляет собой эволюционно консервативную систему межклеточной коммуникации, которая управляет определением судьбы клеток, дифференцировкой, пролиферацией и апоптозом в различных тканяхи на различных стадиях развития. У млекопитающих четыре рецептора Notch (Notch1-4) взаимодействуют с пятью каноническими лигандами (Delta-подобными 1, 3 и 4, а также Jagged 1 и 2), опосредуя межклеточную сигнализацию. Активация путей включает связывание лигандов, конформационные изменения и последовательное протеолитическое расщепление металлопротеиназами ADAM и комплексом γ-секретазы, что в конечном итоге высвобождает внутриклеточный домен Notch (NICD) для ядерной транслокации и транскрипционной регуляции генов-мишеней, включая семейства Hes и Hey14,15. Роль передачи сигналов Notch в остеокластогенезе остается спорной и, по-видимому, сильно зависит от контекста, при этом в исследованиях сообщается как о стимулирующих, так и об ингибирующих эффектах в зависимости от конкретных подтипов рецепторов, доступности лиганда, клеточного микроокружения и экспериментальных условий 16,17,18.

Преобладающие терапевтические подходы к остеолитическим заболеваниям в первую очередь сосредоточены на антирезорбтивных стратегиях, включая бисфосфонаты, деносумаб (ингибитор RKL), селективные модуляторы рецепторов эстрогена и кальцитонин 7,8,19. Хотя эти методы лечения эффективно снижают резорбцию кости и риск переломов, они связаны со значительными ограничениями, включая желудочно-кишечную токсичность, остеонекроз челюсти, атипичные переломы, повышенный риск инфекций и опасения по поводу долгосрочной безопасности. Кроме того, эти агенты могут чрезмерно подавлять костный обмен, потенциально ухудшая качество кости и механизмы восстановления. Следовательно, существует острая клиническая потребность в новых терапевтических агентах, которые могут избирательно ингибировать патологическую активность остеокластов, сводя к минимуму побочные эффекты и сохраняя физиологическую способность к ремоделированию костей 8,14.

Ингибиторы γ-секретазы представляют собой перспективный класс соединений с потенциальными применениями при остеолитических заболеваниях за счет модуляции передачи сигналов Notch14,20. Эти агенты широко изучались в онкологии и исследованиях нейродегенеративных заболеваний, при этом несколько соединений прошли клинические испытания для лечения болезни Альцгеймера и различных видов рака. LY900009, мощный и селективный ингибитор γ-секретазы, продемонстрировал благоприятные фармакологические свойства, включая высокую специфичность, биодоступность и управляемый профиль безопасности в предварительных исследованиях21,22. Тем не менее, его специфическое влияние на RANKL-индуцированный остеокластогенез и потенциальную терапевтическую полезность при остеолитических заболеваниях остаются не полностью охарактеризованными. Это исследование было разработано для оценки того, может ли LY900009 ингибировать остеокластогенез за счет нарушения передачи сигналов Notch, потенциально предлагая новый терапевтический подход к остеолитическим заболеваниям. Мы разработали комплексные протоколы для оценки их влияния на образование остеокластов, активность резорбции кости, сигнальные пути и эффективность in vivo в моделях воспалительной потери костной массы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры на животных проводились в соответствии с институциональными рекомендациями и были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Центральной больницы при Первом медицинском университете провинции Шаньдун (номер одобрения IACUC-2024-015). Исследование проводилось в соответствии с установленными этическими принципами исследований на животных и рекомендациями ARRIVE, включая содержание животных в стандартных клетках (5 мышей в клетке, 12-часовой цикл света/темноты, еда/вода в неограниченном количестве ) и рандомизацию в группы

1. Выделение и бактериологическое исследование макрофагов костного мозга

  1. Усыпить 5-недельных самцов мышей C57BL/6 (n=5 на изоляцию), поместив их в камеру CO2 со скоростью потока 30% объема камеры в минуту в течение 5 минут. Подтвердите смерть от вывиха шейки матки.
  2. Опрыскайте мышь 70% этанолом. Сделайте разрез по средней линии от лобка до грудины с помощью стерильных ножниц. Удалите бедренные и большеберцовые кости асептическим способом. Поместите кости в стерильный PBS на лед.
  3. Очистите кости от мягких тканей с помощью стерильной марли. Разрежьте оба конца костей стерильными ножницами. Промойте костный мозг с помощью иглы 25G с 10 мл холодного α-MEM на каждую мышь. Пропустите клеточную суспензию через сетчатое фильтр 70 мкм.
  4. Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C. Ресуспендируйте пеллеты в α-MEM, содержащем 10% FBS и 33,3 нг/мл M-CSF. Подсчитывают клетки с помощью гемоцитометра с исключением трипанового синего. Тарелка при концентрации 2 x 106 клеток/мл в колбах T75.
  5. Поддерживайте культуру при температуре 37 °C в атмосфере с 5%CO2 со сменой среды каждые 48 часов.
  6. Соберите 1x 106 ячеек. Умывайтесь PBS, содержащим 2% FBS. Инкубировать с анти-CD11b-FITC (1:100) и анти-F4/80-PE (1:100) в течение 30 минут при температуре 4 °C в темноте. Анализ с помощью проточной цитометрии с использованием следующей стратегии стробирования: во-первых, гейт-клетки на основе прямого рассеяния (FSC) и бокового рассеяния (SSC) для исключения мусора и выбора жизнеспособных клеток. Во-вторых, ворота CD11b-положительных клеток из жизнеспособной клеточной популяции. В-третьих, из CD11b-положительных клеток, гейт F4/80-положительных клеток для идентификации CD11b+/F4/80+ двойных положительных макрофагов. Настройка стробов на основе неокрашенных элементов управления и одноцветных элементов управления. Продолжайте только в том случае, если >95% клеток составляют CD11b+/F4/80+.

2. Оценка цитотоксичности

  1. Затравочные макрофаги, полученные из костного мозга (BMM) в концентрации 1 x 104 клеток на лунку в 96-луночных планшетах с использованием 100 мкл среды на лунку. Дайте ячейкам прилипнуть в течение 4 часов при 37 °C.
  2. Готовят LY900009 разведения в полной среде: 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4, 12,8, 25,6 мкМ. Удаляют старую среду. Добавьте 100 мкл лечебной среды на лунку. Приготовьте тройные блюда для каждой концентрации.
  3. Инкубируйте в течение 24 ч, 48 ч или 96 ч. Удалите питательную среду полностью. Добавьте 100 мкл свежей среды, содержащей 10% реагента CCK-8 (10 мкл CCK-8 на 90 мкл среды). Выдерживать ровно 2 ч при 37 °C. Используйте считыватель микропланшетов для измерения поглощения при длине волны 450 нм с эталонным значением при длине волны 650 нм.
  4. Рассчитайте IC50 с помощью GraphPad Prism. Открытое программное обеспечение, входная концентрация (ось X) и процент жизнеспособности (ось Y). Выберите Анализ > нелинейной регрессии > Доза-реакция > Ингибирование > логарифм (ингибитор) в сравнении с реакцией с переменным наклоном. Установите ограничения: Низ = 0, Верх = 100. Запись IC50 с 95% доверительным интервалом.

3. Дифференцировка остеокластов и окрашивание TRAP

  1. Затравочные макрофаги, полученные из костного мозга (BMM) в концентрации 1 x 104 клеток на лунку в 96-луночных планшетах. Посев на ночь в α-MEM с 10% FBS и 33,3 нг/мл M-CSF.
  2. Замените среду на 100 мкл среды для дифференцировки: α-MEM, содержащую 10% FBS, 33,3 нг/мл M-CSF, 100 нг/мл RANKL и LY900009 (0, 100, 200, 400 нМ). Подготовьте четверки для каждого состояния.
  3. Заменяйте среду каждые 48 часов свежей средой для дифференцировки. Продолжайте в течение 6 дней. Ежедневно контролируйте образование остеокластов с помощью инвертированного микроскопа при 100-кратном увеличении.
  4. Удалите всю среду с помощью аспирации. Промойте один раз 200 μL PBS. Добавьте 100 мкл 4% параформальдегида в PBS. Выдерживать ровно 15 минут при комнатной температуре. Снимите фиксатор. Промойте 3 раза 200 μл PBS.
  5. Приготовьте окрашивающий раствор TRAP: смешайте 50 мл 0,1 М буфера ацетата натрия (pH 5,0), 10 мл 50 мМ тартрата натрия, 1 мл 5 мг/мл нафтола AS-MX фосфата в диметилформамиде и 0,5 мл 11 мг/мл соли Fast Red Violet LB. Профильтруйте через фильтр 0,22 мкм. Внесите 200 μл на лунку. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 30 минут в темноте. Остановите реакцию, промыв 3 раза дистиллированной водой.
  6. Идентифицируйте остеокласты как TRAP-положительные клетки (фиолетовые/красные), содержащие три или более ядер. Посчитайте с помощью инвертированного микроскопа при 100-кратном увеличении. Сфотографируйте пять случайных полей на лунку.
  7. Количественная оценка с помощью ImageJ. Нажмите на изображение > Преобразовать в 8-бит (Тип изображения > > 8-бит) > Установите порог (Изображение > Настройте > порог) > Выберите TRAP-положительные области > Анализируйте частицы (Анализ > Анализ частиц: размер 100-бесконечностьмкм 2, круговость 0-1.0) > Экспортируйте результаты в Excel 23.

4. Функциональный анализ резорбции кости

  1. Культивирование BMM в шестилуночных планшетах (2 x 10,5 клеток/лунка) с M-CSF в течение 24 ч. Добавьте RANKL (100 нг/мл), чтобы вызвать образование преостеокластов в течение 3 дней.
  2. Соберите клетки с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА в течение 5 мин при 37 °C. Нейтрализовать полной средой. Подсчитайте жизнеспособные клетки с помощью трипанового синего цвета.
  3. Посев 1 х 104 преостеокластов на лунку на 96-луночных планшетах, покрытых гидроксиапатитом. Оставьте насадку на 4 часа.
  4. Обрабатывайте M-CSF (33,3 нг/мл), RANKL (100 нг/мл) и LY900009 (0, 100, 200, 400 нм) в течение 4 дней. Меняйте среду каждые 2 дня.
  5. Удалите клетки с помощью 10% отбеливателя в течение 10 минут. Умойте 5 раз дистиллированной водой. Полностью высушите на воздухе.
  6. Визуализируйте резорбционные ямки с помощью автоматического считывателя изображений с 4-кратным увеличением. Захват всей площади скважины. Количественно оцените резорбированную площадь в процентах от общей площади с помощью ImageJ.

5. Иммунофлуоресцентная микроскопия

  1. Культивируйте остеокласты на стеклянных покровных стеклах в 24-луночных планшетах в течение 5-7 дней, как описано в шаге 3.
  2. Закрепить с 4% параформальдегидом в течение 15 минут. Пермеабилизируйте 0,1% Triton X-100 в PBS в течение 10 минут. Блок с 1% БСА в PBS в течение 1 ч при комнатной температуре.
  3. Инкубировать с родамином-фаллоидином (1:200) в блокирующем буфере в течение 45 минут при комнатной температуре в темноте. Ядра контрокрашивания DAPI (1 мкг/мл) в течение 10 мин.
  4. Закрепите покровные стекла на слайдах с помощью монтажной среды, предотвращающей выцветание. Исследуйте с помощью флуоресцентного микроскопа с 200-кратным увеличением. Измерьте площадь актинового кольца с помощью ImageJ.

6. Количественный анализ ПЦР в реальном времени

  1. Извлеките общую РНК из 2 x 106 клеток с помощью реагента для экстракции РНК. Гомогенизировать путем пипетирования. Выдерживать 5 мин при комнатной температуре.
  2. Добавьте 200 μл хлороформа. Энергично встряхивайте в течение 15 с. Инкубировать 3 мин. Центрифуга при 12 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
  3. Перенесите водную фазу в новую трубку. Добавьте 500 мкл изопропанола. Аккуратно перемешайте. Выдерживать 10 минут при комнатной температуре. Центрифуга при 12 000 x g в течение 10 минут при 4 °C.
  4. Промойте гранулы 1 мл 75% этанола. Сушить на воздухе в течение 10 минут. Растворите в 30 мкл воды, не содержащей РНКазы. Измерьте концентрацию с помощью спектрофотометра (требуется соотношение А260/А280 >1,8).
  5. Синтезировать кДНК с помощью 1 мкг РНК с помощью набора для обратной транскрипции в соответствии с протоколом производителя.
  6. Приготовьте реакции количественной ПЦР: 10 мкл мастер-микса, 1 мкл кДНК, 0,5 мкл каждого праймера (10 мкМ), 8 мкл воды. Запуск на системе ПЦР в реальном времени: 95 °C в течение 10 мин, затем 40 циклов по 95 °C в течение 15 с и 60 °C в течение 60 с. Расчет относительной экспрессии с помощью метода 2-ΔΔCt с GAPDH в качестве референсного гена.

7. Вестерн-блоттинг

  1. Лизировать клетки в буфере RIPA, содержащем ингибиторы протеазы и фосфатазы, на льду в течение 30 мин. Центрифуга при 14 000 x g в течение 15 мин при 4 °C.
  2. Определите концентрацию белка с помощью анализа BCA в соответствии с инструкциями производителя. Приготовьте образцы белка по 30 мкг в загрузочном буфере. Варить 5 минут.
  3. Загрузите образцы на 10% гели SDS-PAGE. Работайте при напряжении 80 В в течение 30 минут, затем при напряжении 120 В в течение 90 минут. Перенос на мембраны PVDF при напряжении 100 В в течение 90 мин в холодный буфер.
  4. Блокируйте мембраны с 5% обезжиренным молоком в Трис-буферном физиологическом растворе с 0,1% Tween-20 (TBST) в течение 1 ч при комнатной температуре с легким покачиванием.
  5. Инкубировать с первичными антителами, указанными в Таблице материалов (1:1000), в течение ночи при температуре 4 °C с легким покачиванием. Постирайте 3 раза с TBST по 10 минут каждый.
  6. Инкубировать с HRP-конъюгированными вторичными антителами (1:5000) в течение 1 ч при комнатной температуре. Постирайте 3 раза с TBST.
  7. Детектирование с помощью реагента ECL в соответствии с инструкциями производителя. Съемка изображений с помощью инфракрасной системы формирования изображений. Количественно оцените интенсивность канала с помощью ImageJ.

8. Модель ЛПС-индуцированной резорбции кости in vivo

  1. Рассчитайте размер выборки с помощью G*Power 3.1 (размер эффекта = 0,8, α=0,05, мощность = 0,80, что дает n=5 на группу). Случайным образом распределите 7-8-недельных самцов мышей C57BL/6 по группам с помощью генератора случайных чисел. Содержание 5 мышей в клетке с 12-часовым циклом света/темноты, температура 22 ± 2 °C, влажность 55% ± 10%, свободный доступ к стандартному корму и воде.
  2. Обезболивают мышей с помощью внутрибрюшинного введения пентобарбитала натрия (50 мг/кг). Подтвердите анестезию с помощью рефлекса пережатия пальца ноги.
  3. Подготовьте систему управления транспортным средством: PBS, содержащую 1% ДМСО. Приготовьте LY900009: Низкая доза (2,5 мг/кг) и высокая доза (5 мг/кг) в транспортном средстве. Вводите 100 мкл подкожно в кальварию с помощью иглы 27G ежедневно в течение 14 дней. Вводите ЛПС (10 мг/кг) в 1-й и 8-й дни.
  4. Наблюдайте за мышами 2 раза в день на предмет признаков дистресса. Определите гуманные конечные точки: потеря веса >20%, неспособность передвигаться, сгорбленная осанка, снижение груминга. Немедленно усыпляйте при достижении конечных точек.
  5. Усыпить на 15-й день с использованием передозировки пентобарбитала (100 мг/кг внутрибрюшинно). Собирайте урожай кальварии. Зафиксировать в 4% параформальдегиде в течение 48 ч при 4 °C.

9. Микрокомпьютерная томография и гистологический анализ

  1. Сканирование неподвижных кальварий с помощью микрокомпьютерного томографа со следующими параметрами: 70 кВ, 114 мкА, алюминиевый фильтр 0,5 мм, разрешение 9 мкм, вращение 180° с шагом 0,4°.
  2. Реконструируйте изображения с помощью программы NRecon. Анализируйте с помощью программного обеспечения CTAn. Определите область интереса как область размером 3 x 3 мм с центром на сагиттальном шве. Рассчитать БМД, БВ/ТВ, Tb.N, Tb.Th.
  3. Декальцинируйте образцы при 10% ЭДТА (pH 7,4) в течение 14 дней с ежедневными изменениями. Завершение теста на декальцинацию с помощью теста на оксалат кальция24.
  4. Процесс заделки парафина: обезвоживание с помощью сортированного спирта, процеживание в ксилоле, инфильтрация парафином. Разрез толщиной 4 мкм с помощью микротома.
  5. Обеспечьте ослепление: закодируйте все выборки, используя случайные трехзначные числа. Попросите коллегу вести ключ кода. Выполняйте все анализы без знания групп лечения. Декодируйте только после завершения сбора данных.
  6. Выполнить окрашивание H&E: депарафинизировать, регидратировать, окрашивать гематоксилином в течение 5 минут, дифференцировать в кислом спирте, окрашивать эозином в течение 2 минут, обезвоживать и монтировать.
  7. Выполните окрашивание TRAP, как показано в шаге 3.5. Подсчитайте TRAP-положительные многоядерные клетки вдоль поверхности кости. Выражается в виде числа на миллиметр периметра кости.

10. Статистический анализ

  1. Рассчитайте необходимый размер выборки с помощью G*Power 3.1: Размер входного эффекта f=0.8, α=0.05, power=0.80, количество групп. Запишите минимальное число n на группу.
  2. Проверьте нормальность с помощью теста Шапиро-Уилка в SPSS 28.0. Рассмотрим p > 0,05 как нормально распределенное. Проверка однородности вариации с помощью теста Левена. Рассмотрим p > 0,05 как равные дисперсии.
  3. Применяйте соответствующие тесты на основе распределения: Для нормальных данных с равными дисперсиями используйте параметрические тесты. Для двух групп примените непарный t-критерий Стьюдента. Для нескольких групп используйте одностороннюю ANOVA.
  4. Выполнение апостериорного анализа: для получения значимого ANOVA (p<0,05) примените честно значимый разностный тест Тьюки для всех парных сравнений.
  5. Используйте непараметрические альтернативы для ненормальных данных: Примените U-критерий Манна-Уитни для двух групп и критерий Краскала-Уоллиса с апостериорным критерием Данна для нескольких групп.
  6. Вычислите величины эффекта: d Коэна для t-критериев, частичное eta в квадрате для ANOVA.
  7. Выводите точные p-значения с точностью до трех знаков после запятой и 95% доверительных интервалов. Представляем нормальные данные как среднее значение ± стандартное отклонение, ненормальные — как медиану (межквартильный диапазон).
  8. Рассмотрим p < 0,05 статистически значимыми. Применяйте коррекцию Бонферрони при выполнении множественных сравнений.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Успешная реализация этого протокола показала, что LY900009 оказывает мощное ингибиторное действие на образование и функционирование остеокластов через множество взаимосвязанных механизмов. Первоначальная оценка цитотоксичности макрофагов, полученных из костного мозга, показала зависящее от времени увеличение токсичности при расчетных значениях IC50 4,44 мкМ, 3,66 мкМ и 2,93 мкМ через 24 ч, 48 ч и 96 ч соответственно (рис. 1A, B). Важно отметить, что эти цитотоксич...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Настоящее исследование предоставляет убедительные доказательства того, что LY900009 представляет собой многообещающее терапевтическое средство для остеолитических заболеваний благодаря своему мощному и избирательному ингибированию остеокластогенеза, что согласуется с растущим интересом к ингибиторам γ-секретазы для лечения заболеваний, связанных с костями 14,20,21. Полученные данные показывают, ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов или конфликта интересов. Ни один из авторов не имеет никаких финансовых отношений с коммерческими структурами, упомянутыми в этой работе. Все авторы заполнили формы раскрытия информации ICMJE.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить персонал Центральной больницы при Первом медицинском университете провинции Шаньдун и Народной больницы Фэйчэн за их техническую поддержку и помощь в ходе этого исследования. Мы также ценим вклад наших коллег из лаборатории за их ценные обсуждения и помощь в проведении экспериментов на животных.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24-луночные планшеты для культивирования клетокКорнинг3524Иммунофлуоресцентная микроскопия
6-луночные планшеты для культивирования клетокКорнинг3516Клеточная культура и вестерн-блоттинг
70% этанолСигма-ОлдричЕ7023Стерилизация и дезинфекция
75% этанолСигма-ОлдричЕ7148Буфер для промывки РНК
96-луночные планшеты для клеточных культурКорнинг3596Клеточное культивирование и анализы
Алюминиевый фильтр (0,5 мм)БрукерН/ДСканирующий фильтр для микрокомпьютерной томографии
Антитела к CD11b-FITCБиолегенда101206Проточная цитометрия - маркер макрофагов
Антитело против расщепления Notch1 (моноклональное кролико)Технология клеточной сигнализации4147СВестерн-блот - Сигнализация надреза
Антитела против F4/80-PEБиолегенда123108Проточная цитометрия - маркер макрофагов
Защитная от выцветания монтажная средаЛаборатория «Вектор»Н-1000Монтаж для флуоресцентной микроскопии
Антитело к Hes1 (моноклональное антитело кролика)Технология клеточной сигнализации11988СЗападный блот - Цель выреза ниже по течению
Антитела к NFATc1 (мышиные моноклональные)Санта Крус БиотехнологииСК-7294Вестерн-блот - главный регулятор остеокластов
Антитело к фосфо-Акту (Ser473)Технология клеточной сигнализации4060СВестерн-блот - сигнализация PI3K/Akt
Антитела к фосфо-ERK1/2 (Thr202/Tyr204)Технология клеточной сигнализации4370СВестерн-блот - сигнализация МАПК
Антифосфо-НФ-&каппа; Антитела к B p65 (Ser536)Технология клеточной сигнализации3033СВестерн-блот - NF-κ Сигнализация B
Антитело к фосфо-p38 MAPK (Thr180/Tyr182)Технология клеточной сигнализации4511СЗападный блот - p38 MAPK сигнализация
Антитела к анти-&бета;-актину (мышиные моноклональные)Технология клеточной сигнализации4970СКонтроль загрузки вестерн-блоттинга
Автоматический считыватель изображенийМолекулярные приборыImageXpress MicroКоличественное определение резорбционной ямы
Набор для анализа белка BCAПирс/Термофишер23225Определение концентрации белка
Отбеливатель (10% гипохлорита натрия)Сигма-Олдрич425044Удаление ячеек из резорбционных планшетов
BSA (Бычья сыворотка альбумина)Сигма-ОлдричА7906Блокирующий буфер для иммунофлюоресценции
C57BL/6 мышей (самец, 5-8 недель)Лаборатории Чарльза Ривера27Выделение ВММ in vitro и исследования in vivo
Реактив для испытаний на оксалат кальцияСигма-ОлдричС0350Испытание на завершение декальцинации
Реагент CCK-8 (Набор для подсчета клеток-8)Молекулярные технологии ДодзиндоСК04Оценка жизнеспособности клеток
Сетчатый фильтр для ячеек (70 μ m)BD Falcon352350Фильтрация клеток костного мозга
Центрифуга (охлаждаемая)Эппендорф5424РПодготовка клеток и образцов
ХлороформСигма-ОлдричС2432Разделение фаз экстракции РНК
CO2 камераКорпорация «Эвтанекс»ЕХ-075Эвтаназия животных
Программное обеспечение CTAnБрукерВерсия 1.20Анализ изображений с помощью микрокомпьютерной томографии
DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол)Сигма-ОлдричД9542Противоядерные противозагрязняющие вещества
Диметилформамид (ДМФА)Сигма-ОлдричД4551Растворитель для окрашивания TRAP
ДМСО (диметилсульфоксид)Сигма-ОлдричД2650Подготовка к управлению автомобилем
ECL Западный блоттинговый субстратПирс/Термофишер32106Обнаружение белка при вестерн-блоттинге
ЭДТА (10%, pH 7,4)Сигма-ОлдричЕ6758Решение для декальцинации
Эозин ЮСигма-ОлдричЕ4009H& Е гистологическое окрашивание
Быстрая соль Red Violet LBСигма-ОлдричФ3381Окрашивающий хромоген TRAP
Фетальная бычья сыворотка (FBS)Gibco/Thermo Fisher16140-071Добавка для клеточных культур
Проточный цитометрBD BiosciencesFACSCaliburОпределение характеристик BMM
Флуоресцентный микроскопОлимпIX73Иммунофлуоресцентная визуализация
Программное обеспечение G*PowerУниверситет имени Генриха ГейнеВерсия 3.1Статистический анализ мощности
Стеклянные покровные стекла (22 &; 22 мм)Научный центр Фишера12-541-БИммунофлуоресцентная микроскопия
ГрафПад ПризмаПрограммное обеспечение GraphPadВерсия 9.0Расчет и построение графиков IC50
ГематоксилинСигма-ОлдричН3136H& Е гистологическое окрашивание
ГемоцитометрХауссер Сайентиал3200Подсчет ячеек
Набор для обратной транскрипции кДНК большой емкостиПрикладные биосистемы4368814Синтез кДНК из РНК
HRP-конъюгированный антимышиный IgGТехнология клеточной сигнализации7076СВторичное антитело вестерн-блоттинга
HRP-конъюгированный антикроличий IgGТехнология клеточной сигнализации7074СВторичное антитело вестерн-блоттинга
96-луночные планшеты с гидроксиапатитовым покрытиемCorning BioCoat354651Функциональный анализ резорбции кости
ИзображениеJНИЗВерсия 1.53eАнализ и количественная оценка изображений
Инкубатор (CO2)Термо Фишер51033058Поддержание клеточных культур
Инфракрасная система визуализацииБио-РадХемиДок МПОбнаружение вестерн-блоттинга
Инвертированный микроскопОлимпСКХ41Мониторинг клеточных культур, подсчет TRAP
ИзопропанолСигма-ОлдричИ9516Осаждение РНК
ЛПС (липополисахарид из кишечной палочки)Сигма-ОлдричЛ4391Резорбция воспалительной кости in vivo
LY900009 (ингибитор гамма-секретазы)Селлек КемикалсС7999Испытуемое соединение - ингибитор остеокластов
M-CSF (макрофагальный колониестимулирующий фактор)НИР Системы D416-МЛ-010Выживаемость макрофагов и дифференцировка остеокластов
Микрокомпьютерный томографБрукерСкайСкан 1272Анализ микроархитектуры костей
Считыватель микропланшетовБиоТекСинергия H1Измерение поглощения (CCK-8)
МикротомЛейкаRM2255Гистологическое сечение
Фосфат Naphthol AS-MXСигма-ОлдричН5000Подложка для окрашивания TRAP
Иглы (25G, 27G)БД305122, 305109Промывание костного мозга, инъекции
Программное обеспечение NReconБрукерВерсия 1.7Реконструкция изображения с помощью микрокомпьютерной томографии
ПарафинСигма-ОлдричП3683Встраивание тканей
Параформальдегид (4%)Сигма-ОлдричП6148Фиксация клеток и тканей
PBS (фосфатно-солевой буфер)Gibco/Thermo Fisher14190-144Промывка ячеек и подготовка буфера
Пентобарбитал натрияСигма-ОлдричП3761Обезболивание животных и эвтаназия
Коктейль ингибиторов фосфатазыРош4906837001Консервация фосфорилирования
PowerUp SYBR Green Master MixПрикладные биосистемыА25742Количественная ПЦР в реальном времени
Коктейль ингибиторов протеазыРош11697498001Профилактика деградации белка
Мембрана из ПВДФ (0,45 μ m)Био-Рад1620177Перенос белка вестерн-блоттингом
RANKL (рецептор-активатор NF-κ В Лиганд)НИР Системы D462-TEC-010Индукция дифференцировки остеокластов
Система ПЦР в реальном времениПрикладные биосистемы7500 БыстрыйКоличественный анализ экспрессии генов
Родамин-фаллоидинИнвитроген/ТермофишерР415Визуализация F-актина
Буфер RIPAТехнология клеточной сигнализации9806СЭкстракция белка
Вода без РНКазыАмбион/Термо ФишерАМ9937Растворение РНК и ПЦР
SDS-PAGE гели (10%)Био-Рад4561036Разделение белков методом вестерн-блоттинга
Сухое обезжиренное молокоБио-Рад1706404Блокировка вестерн-блоттинга
Буфер из ацетата натрия (0,1 М, pH 5,0)Сигма-ОлдричС2889Буфер для окрашивания TRAP
Тартрат натрия (50 мМ)Сигма-ОлдричС4297Специфика окрашивания TRAP
СпектрофотометрТермо ФишерНаноДроп 2000Измерение концентрации РНК/белка
СПССКорпорация IBMВерсия 28.0Статистический анализ
Шприцы (1 мл, 10 мл)БД309659, 309604Промывание костного мозга, инъекции
Колбы для клеточных культур T75Корнинг430641Первичная культура BMM
TBST (Трис-буферный физиологический раствор с 0,1% Tween-20)Био-Рад1706531Буфер для промывки вестерн-блоттинга
Буфер передачиБио-Рад1704270Перенос белка вестерн-блоттингом
Тритон Х-100Сигма-ОлдричТ8787Пермеабилизация клеток
Реагент ТРИзолИнвитроген/Термофишер15596026Экстракция общей РНК
Трипан синий (0.4%)Сигма-ОлдричТ8154Оценка жизнеспособности клеток
Трипсин-ЭДТА (0,25%)Gibco/Thermo Fisher25200-056Сбор и отслоение клеток
Система переноса вестерн-блоттингаБио-РадТранс-Блот ТурбоПеренос белка на мембрану
КсилолСигма-ОлдричХ3750Обработка и очистка тканей
α-MEM (Alpha Minimum Essential Medium)Gibco/Thermo Fisher12561-056Среда для культивирования клеток

Ссылки

  1. Langdahl, B., Ferrari, S., Dempster, D. W. Bone modeling and remodeling: potential as therapeutic targets for the treatment of osteoporosis. Ther Adv Musculoskeletal Dis. 8 (6), 225-235 (2016).
  2. Shah, M. A. A., et al. Functional morphology of trabecular system in human proximal femur: a perspective from P45 sectional plastination and 3D reconstruction finite element analysis. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  3. Shah, M. A. A., et al. Microvasculature and trabecular bone in beagle proximal femur: Microstructural insights. Ann Anatomy. 258, 152368(2025).
  4. Mukherjee, K., Chattopadhyay, N. Pharmacological inhibition of cathepsin K: A promising novel approach for postmenopausal osteoporosis therapy. Biochem Pharmacol. 117, 10-19 (2016).
  5. Bertuglia, A., et al. Osteoclasts are recruited to the subchondral bone in naturally occurring post-traumatic equine carpal osteoarthritis and may contribute to cartilage degradation. Osteoarth Cartilage. 24 (3), 555-566 (2016).
  6. Alami, S., Hervouet, L., Poiraudeau, S., Briot, K., Roux, C. Barriers to Effective Postmenopausal Osteoporosis Treatment: A Qualitative Study of Patients' and Practitioners' Views. PLoS One. 11 (6), e0158365(2016).
  7. Hiligsmann, M., et al. A Systematic Review of Cost-Effectiveness Analyses of Drugs for Postmenopausal Osteoporosis. PharmacoEconomics. 33 (3), 205-224 (2014).
  8. Hadji, P., et al. Persistence, adherence, and medication-taking behavior in women with postmenopausal osteoporosis receiving denosumab in routine practice in Germany, Austria, Greece, and Belgium: 12-month results from a European non-interventional study. Osteoporosis Int. 26 (10), 2479-2489 (2015).
  9. Udagawa, N., et al. Osteoblasts/stromal cells stimulate osteoclast activation through expression of osteoclast differentiation factor/RANKL but not macrophage colony-stimulating factor. Bone. 25 (5), 517-523 (1999).
  10. Lee, K., et al. Selective Regulation of MAPK Signaling Mediates RANKL-dependent Osteoclast Differentiation. Int J Biol Sci. 12 (2), 235-245 (2016).
  11. Huang, H., et al. Osteoclast differentiation requires TAK1 and MKK6 for NFATc1 induction and NF-κB transactivation by RANKL. Cell Death Diff. 13 (11), 1879-1891 (2006).
  12. Matsumoto, Y., et al. RANKL coordinates multiple osteoclastogenic pathways by regulating expression of ubiquitin ligase RNF146. J Clin Investigat. 127 (4), 1303-1315 (2017).
  13. Lai, E. C. Notch signaling: control of cell communication and cell fate. Development. 131 (5), 965-973 (2004).
  14. Chen, X., et al. LY411575, a potent γ-secretase inhibitor, suppresses osteoclastogenesis in vitro and LPS-induced calvarial osteolysis in vivo. J Cellular Physiol. 234 (11), 20944-20956 (2019).
  15. Chen, S., Lee, B. H., Bae, Y. Notch Signaling in Skeletal Stem Cells. Calcified Tiss Int. 94 (1), 68-77 (2013).
  16. Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), (2012).
  17. Duan, L. Notch is activated in RANKL-induced osteoclast differentiation and resorption. Front Biosci. (13), 7064(2008).
  18. Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
  19. Hough, F. S., et al. The safety of osteoporosis medication. South African Med J. 104 (4), 279(2013).
  20. Espinosa, L. S., Inglés-Esteve, J., Robert-Moreno, A., Bigas, A. IκBα and p65 Regulate the Cytoplasmic Shuttling of Nuclear Corepressors: Cross-talk between Notch and NFκB Pathways. Mol Biol Cell. 14 (2), 491-502 (2003).
  21. Wang, Z., Li, Y., Sarkar, F. Notch Signaling Proteins: Legitimate Targets for Cancer Therapy. Curr Prot Peptide Sci. 11 (6), 398-408 (2010).
  22. Zhou, Z., et al. PP121 suppresses RANKL-Induced osteoclast formation in vitro and LPS-Induced bone resorption in vivo. Exp Cell Res. 388 (2), 111857(2020).
  23. Shah, M. A. A., et al. Regional distribution of microvasculature within the canine femoral head: a study of plastinated tissue histology and 3D reconstruction. J Ortho Surg Res. 20 (1), (2025).
  24. Clayden, E. C. Practical Section Cutting and Staining. , Churchill. (1955).
  25. McHorney, C. A., Schousboe, J. T., Cline, R. R., Weiss, T. W. The impact of osteoporosis medication beliefs and side-effect experiences on non-adherence to oral bisphosphonates ates. Curr Med Res Opin. 24 (3), 707-708 (2008).
  26. Canalis, E. Notch in skeletal physiology and disease. Osteoporosis Int. 29 (12), 2611-2621 (2018).
  27. Zanotti, S., Canalis, E. Notch Signaling and the Skeleton. Endocrine Rev. 37 (3), 223-253 (2016).
  28. Grevers, L. C., et al. Immune complex-induced inhibition of osteoclastogenesis is mediated via activating but not inhibitory Fcγ receptors on myeloid precursor cells. Ann Rheumatic Dis. 72 (2), 278-285 (2013).
  29. Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505 (7483), 327-334 (2014).
  30. Weber, J. M., Calvi, L. M. Notch signaling and the bone marrow hematopoietic stem cell niche. Bone. 46 (2), 281-285 (2010).
  31. Kovtonyuk, L. V., Fritsch, K., Feng, X., Manz, M. G., Takizawa, H. Inflamm-Aging of Hematopoiesis, Hematopoietic Stem Cells, and the Bone Marrow Microenvironment. Front Immunol. 7, (2016).
  32. Khosla, S., Hofbauer, L. C. Osteoporosis treatment: recent developments and ongoing challenges. Lancet Diabet Endocrinol. 5 (11), 898-907 (2017).
  33. Reid, I. R. Efficacy, effectiveness and side effects of medications used to prevent fractures. J Inter Med. 277 (6), 690-706 (2015).
  34. Cosman, F., et al. Clinician's Guide to Prevention and Treatment of Osteoporosis. Osteoporosis Int. 25 (10), 2359-2381 (2014).
  35. Chen, Y. H., et al. Melatonin protects against lipopolysaccharide-induced intra-uterine fetal death and growth retardation in mice. J Pineal Res. 40 (1), 40-47 (2005).
  36. Abu-Amer, Y., Ross, F. P., Edwards, J., Teitelbaum, S. L. Lipopolysaccharide-stimulated osteoclastogenesis is mediated by tumor necrosis factor via its P55 receptor. J Clin Investigat. 100 (6), 1557-1565 (1997).
  37. Black, D. M., Rosen, C. J. Postmenopausal Osteoporosis. New Engl J Med. 374 (3), 254-262 (2016).
  38. Eastell, R., et al. Pharmacological Management of Osteoporosis in Postmenopausal Women: An Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metabol. 104 (5), 1595-1622 (2019).
  39. Leder, B. Z. Optimizing Sequential and Combined Anabolic and Antiresorptive Osteoporosis Therapy. JBMR Plus. 2 (2), 62-66 (2018).
  40. Grey, A., Bolland, M., Cundy, T. Maintaining Order in Osteoporosis Treatments. Journal of Bone Miner Res. 32 (5), 1147-1147 (2017).
  41. McClung, M. R. Role of bone-forming agents in the management of osteoporosis. Aging Clin Exp Re. 33 (4), 775-791 (2021).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Ингибирование остеокластогенезаLY900009остеокластыиндуцированные RANKLрезорбция костной тканимакрофаги костного мозгавестерн-блоттингокрашивание на ТРАПпуть MAPK Akt
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.