Исследовательская статья

Микротравма сухожилийно-костного соединения в результате острой изнурительной физической нагрузки у крыс: ультраструктурные изменения и механизм

353 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69184

⸱

14 ноября 2025 г.

 ,  ,  ,  , 
1Department of Rehabilitation, Sichuan college of traditional Chinese medicine, 2Department of Rehabilitation, Mian-yang Orthopedic hospital, 3Sports Medicine Center, West China Hospital, Sichuan University, 4Department of Orthopedics and Orthopedic Research Institute, West China Hospital, 5Department of Geriatric Medicine, Mian-yang hospital of traditional Chinese medicine, 6Department of Rehabilitation Medicine, Sichuan Provincial Orthopedic Hospital

В этой статье

Краткое содержание

Это исследование было направлено на изучение ультраструктурных изменений и механизмов в сухожильно-костном соединении, вызванных острыми изнурительными физическими нагрузками. Острая изнурительная физическая нагрузка вызывает микротравму на сухожилийно-костном соединении, временно активируя стресс ER и его опосредованные апоптотические сигнальные пути. Тем не менее, эти микротравмы и стресс ER могут быть постепенно восстановлены после тренировки.

Аннотация

Микротравмы на сухожилийно-костном соединении (энтез) могут привести к тендинопатии. Изучение ультраструктурных изменений и механизмов в энтезе после интенсивной изнурительной физической нагрузки может улучшить наше понимание тендинопатии и направить клиническое лечение. В этом исследовании тридцать шесть самцов крыс Спрэга-Доули были случайным образом распределены в две группы: контрольные и изнурительные упражнения. Группа с исчерпывающими упражнениями была дополнительно разделена на пять подгрупп в зависимости от времени после тренировки: 0 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч и 48 ч. Окрашивание гематоксилин-эозином и электронная микроскопия были использованы для изучения изменений в пяточно-костном соединении. Экспрессия белков GRP78, CHOP и Casspase-12, связанных со стрессом эндоплазматического ретикулума (ERS), в соединении сухожилия и кости была количественно определена с помощью иммуногистохимии (ИГХ). После интенсивных изнурительных упражнений сухожильные и костные соединения крыс, которые подвергались изнурительным упражнениям, демонстрировали значительные структурные изменения. Хондроциты и коллагеновые волокна продемонстрировали заметные ультраструктурные изменения, свидетельствующие о ЭРЗ. Уровень белка ERS увеличивался сразу после тренировки, достигая пика через 6 часов. Эти уровни белка начали снижаться через 12 часов после тренировки и вернулись к исходному уровню через 48 часов. В заключение, острая изнурительная физическая нагрузка вызывает микроповреждение и напряжение эндоплазматического ретикулума в месте соединения сухожилий и костей у крыс, но необратимых повреждений не происходит. Своевременное лечение и коррекция этих микротравм может предотвратить чрезмерное повреждение и развитие тендинопатии.

Введение

Тендинопатия ахиллова сухожилия является распространенным клиническим заболеванием, вызванным частыми травмами голеностопного сустава. Это расстройство характеризуется отеком сухожилий, болью и дисфункцией. Он чаще встречается у пожилых людей и спортсменов, особенно у бегунов и прыгунов. Тендинопатия ахиллова сухожилия подразделяется на неинсерционную и инсерционную тендинопатию. Неинсерционная тендинопатия поражает сухожилие на 2-6 см выше его костного прикрепления, в то время как инсерционная тендинопатия поражает сухожилийно-костное соединение1. Кроме того, неинсерционная тендинопатия имеет тенденцию возникать у людей с избыточным весом, пожилых и менее активных людей, в то время как инсерционная тендинопатия имеет тенденцию возникать у более активных людей1.

Сухожилийно-костное соединение, где сухожилие прикрепляется к кости, включает в себя постепенный переход от сухожильной ткани к костной ткани, включая некальцинированный фиброзный хрящ и кальцинированный фиброзный хрящ2. Это изменение обеспечивает переход от мягкой и гибкой сухожильной ткани к твердой кости. С точки зрения инженерии, эта область служит опорной точкой, передавая мышечную силу для облегчения движения суставов 3,4. Поэтому эта область является местом концентрации стресса и часто подвергается травмам при чрезмерной нагрузке в спорте.

Клинические исследования в основном были сосредоточены на тендинопатии без инсерции, при этом меньше внимания уделялось инсерционной тендинопатии в месте соединения сухожилия и кости2. Исследования показывают, что чрезмерная нагрузка способствует дезорганизации и фрагментации коллагена, инфильтрации жировой ткани и неоваскуляризации в сухожилии. Это также приводит к гиперплазии фиброхондроцитов, эндохондральному окостенению и образованию костных шпор как в некальцинированных, так и в кальцинированных фиброзно-хрящевых областях5. Тем не менее, недавние исследования показывают, что паттерны мышечных сокращений могут играть более значительную роль, чем количество упражнений при инсерционной тендинопатии 6,7. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять влияние чрезмерной нагрузки на сухожилийно-костные соединения. В предыдущих исследованиях изучалось влияние чрезмерного использования, такого как длительные прыжки или бег, на эти соединения. Тем не менее, мало кто исследовал влияние острых изнурительных физических упражнений. Недавнее исследование предполагает, что острая физическая нагрузка вызывает стресс эндоплазматического ретикулума в почках крыс, что указывает на повышение уровня сигнальных белков IL-6 и белков теплового шока (HSP), а также на снижение митохондриального респираторного комплексамРНК 8. О том, происходят ли такие изменения в сухожильно-костных соединениях, не сообщалось. Это исследование сосредоточено на сухожильно-костном соединении (энтезе) для выяснения изменений и основных механизмов, вызванных острыми изнурительными физическими нагрузками. Полученные результаты направлены на то, чтобы внести вклад в разработку профилактических стратегий инсерционной тендинопатии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с этическими стандартами для подопытных животных, установленными Отделом науки и технологий Сычуаньского высшего института традиционной китайской медицины (Одобрение No: 2023DS01). Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. План и методика проведения эксперимента

  1. Животные
    Тридцать шесть самцов 12-недельных крыс CD-Sprague-Dawley содержались и получали неограниченное питание в течение всего экспериментального периода. В окружающей среде поддерживалась температура 20-25 °C и уровень влажности 50%-60%, с 12-часовым циклом свет/темнота.
  2. Групповой дизайн
    После недели адаптивного кормления крысы были случайным образом распределены либо в контрольную группу (Con, n = 6), либо в группу с интенсивными упражнениями (EE, n = 30). Крысы в группе ЭЭ проходили адаптационную подготовку путем бега со скоростью 10 м/мин в течение 15 мин на беговой дорожке в гору с наклоном 10 градусов в течение трех дней. После адаптивной тренировки группа ЭЭ была дополнительно разделена на пять временных подгрупп: 0 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч и 48 ч после изнурительных упражнений.
  3. Процедура вмешательства
    Крысы в контрольной группе не занимались физическими упражнениями, в то время как крысы в группе ЭЭ подвергались изнурительному бегу на беговой дорожке в гору под углом наклона 10 градусов (рис. 1А). В соответствии с Бедфордским протоколом9 нагрузка была разделена на три уровня: Уровень 1 со скоростью 10 м/мин в течение 15 минут, Уровень 2 со скоростью 15 м/мин в течение 15 минут и Уровень 3 со скоростью 20 м/мин до истощения (Рисунок 1B). Истощение определяли, когда крыса больше не могла бегать и оставалась застрявшей на дорожке три раза в течение менее 1 минуты10 минут, несмотря на неоднократную электрическую (150 В, переменный ток 0,5 мА) и звуковую стимуляцию (70 дБ).

Крысы были умерщвлены путем чрезмерного внутрибрюшинного введения 3% пентобарбитала натрия (200 мг/кг) в указанное время (0 ч, 6 ч, 12 ч, 24 ч и 48 ч после изнурительных упражнений). Кожа и подкожные ткани пяточной кости были тщательно рассечены, а ахиллово сухожилие было разрезано на 2 см выше пяточной кости офтальмологическими ножницами. Правая пяточная кость (включая прикрепленное ахиллово сухожилие) была сохранена в 4% параформальдегиде для гистопатологического исследования и иммуногистохимического исследования. Кроме того, три случайных образца с левой стороны были сохранены в 2% растворе параформальдегида-2,5% глутаральдегида для электронной микроскопии с целью изучения ультраструктурных изменений ( рис. 1C).

2. Гистология сухожилийно-костного соединения

Образцы фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 48 ч и декальцинировали 15% ЭДТА в течение 4 недель при комнатной температуре (20-25 °С), при этом раствор меняли ежедневно. Процесс декальцинации завершался, когда кость можно было легко проткнуть иглой без приложения какой-либо силы. После декальцификации образцы подвергались обезвоживанию с помощью автоматизированного процесса, включающего градационную серию этанола и ксилола, за которой следовали три промывки PBS. Образцы погружали в парафин сагиттально и разрезали с температурой 5 мкм. Окрашивание гематоксилин-эозином проводилось в соответствии со стандартными процедурами, а изображения были получены с помощью цифровой триокулярной микрокамеры Panthera с увеличением 20× и 40×.

3. Электронная микроскопия

В оставленные образцы добавляли префикс 2% параформальдегид-2,5% глутаральдегида в течение 48 ч, затем обезвоживали в серии растворов ацетона, инфильтрировали в анализатор отверждения эпоксидной смолы и внедряли сагиттал. Полутонкие срезы окрашивали метиленовым синим для идентификации области соединения сухожилия и кости. Ультратонкие участки, толщиной примерно 60-90 нм, были разрезаны с помощью алмазного ножа. Эти срезы окрашивали уранилацетатом в течение 10-15 мин, а затем цитратом свинца в течение 1-2 мин. Срезы исследовали под просвечивающим электронным микроскопом при увеличениях 6000×,12000× и 25000×.

4. Иммуногистохимический анализ

Сухожилийно-костное соединение обычно декальцинировали и разрезали, как описано ранее. После инкубации с раствором для извлечения цитратного буферного антигена в течение 10 мин образцы обрабатывали 3% H2O2 в течение 10 мин для блокирования активности эндогенной пероксидазы, а затем блокировали нормальной сывороткой коз в течение 20 мин при 25 °C. Затем срезы инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами, включая GRP78 (1:100), CHOP (1:100) и Casspase-12 (1:100). Впоследствии образцы инкубировали со вторичными антителами в течение 2 ч при 25 °С. Развитие цвета достигали с помощью DAB в течение 8 мин при 25 °C, в результате чего получался коричнево-желтый положительный сигнал. Ядра задерживали гематоксилином в течение 3 мин. Для анализа средней плотности использовали программное обеспечение Image-Pro Plus 6.0. Для анализа были выбраны три области представляющего интерес области сухожильного и костного соединения (сухожилие, фиброзный хрящ и минерализованный фиброзный хрящ) и рассчитано среднее значение.

5. Статистический анализ

Для анализа данных и создания диаграмм использовался GraphPad Prism 8. Все данные выражаются в виде среднего ± стандартного отклонения. Сравнения между различными группами проводились с использованием одностороннего метода ANOVA, а для парных сравнений использовался тест на наименьшую значимую разницу (LSD). P-значение < 0,05 было признано статистически значимым.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Как показано на рисунке 2А, в контрольной группе хондроциты и коллагеновые фиброциты в соединении сухожилия и кости расположены регулярно, и между фиброзным хрящом и минерализованным фиброзным хрящом проходит гладкая синяя линия, известная как отметка прилива (желтые стрелки). В группах с исчерпывающими упражнениями ультраструктурные изменения происходили в области сухожилийно-костного соединения. Изменения включают в себя ув...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Сухожилийно-костное соединение, также известное как энтезисы или места введения, позволяет вставлять сухожилия в кость и является местом концентрации напряжения, где связки и сухожилия прикрепляются к кости4. В качестве опорной точки он облегчает движение голеностопного сустава, передает силу сокращения икроножной мышцы на связки и сухожилия стопы, а также участвует в движении голеностопного сустава и стопы2. Сухожилийно-костное соединение ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Авторы хотели бы выразить искреннюю благодарность за поддержку, полученную от Фонда естественных наук (грант No 23ZRYB03), Проекта группы исследований и инноваций (TD-2022-04), Группы инноваций в науке и образовании клинической медицины и Сычуаньского колледжа традиционной китайской медицины, а также за исследовательский проект 2025 года (25MSZX329), финансируемый Управлением традиционной китайской медицины провинции Сычуань.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2% параформальдегид — 2,5% глутаральдегид растворMKBio, КитайMM1515, Сканирование электронной микроскопии
Anti-Caspase12AntibodyБиотехнологическая компания Ханчжоу ХуаньHA500144Иммуногистохимический анализ
Анти-CHOP антителаБиотехнологическая компания Ханчжоу ХуаньET1703-05Иммуногистохимический анализ
Антитела к GRP78Биотехнологическая компания Ханчжоу ХуаньER1706-50Иммуногистохимический анализ
БиомикроскопияMotic Industrial Group Co., Ltd. КИТАЙBA210DigitalБиомикроскопия для гистологии сухожилия-костного соединения иммуногистохимический анализ
Крысы CD-Sprague-DawleyПекинская лаборатория по технологиям животных на реке ВиталSCXK2021-0007 CD
Раствор для извлечения антигена с буфером цитратовZSGB-Bio, КитайZLI-9065, Иммуногистохимический анализ
DAB   ZSGB-Bio, КитайZLI-9018 Иммуногистохимический анализ
ЭДТАSinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009717Окрашивание гематоксилин-эозина 
Epox 812Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.XW00000020Сканирование электронной микроскопии
Этанол Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10009218Окрашивание гематоксилин-эозина 
GraphPad Prism 8 GraphPad Software, Inc.  GraphPad Prism 8 Статистический анализ
H2O2 Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.011092708Иммуногистохимический анализ
Image-Pro Plus 6.0Media Cybernetics Co., Ltd. СШАImage-Pro Plus 6.0Иммуногистохимический анализ
Параформальдегид Sinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.20230408Окрашивание гематоксилин-эозина  Иммуногистохимический анализ
PBSZSGB-Bio, КитайZLI-9062Сканирование электронной микроскопии
Трансмиссионный электронный микроскопJAPAN ELECTRON OPTICS LABORATORY CO., LTDJEM-1400Flash, ЯпонияСканирование электронной микроскопии
Беговая дорожка для Крысы и Крысы МышьBioMed Easy Technologies Co., Ltd  КИТАЙSA101Выполнял изнурительные упражнения на беговой дорожке
ксилолSinopharm Chimical Reagant Co., Ltd.10023418Окрашивание гематоксилин-эозина 

Ссылки

  1. Li, H. Y., Hua, Y. H. Achilles tendinopathy: Current concepts about the basic science and clinical treatments. Biomed Res Int. 2016, 6492597(2016).
  2. Tits, A., et al. Local anisotropy in mineralized fibrocartilage and subchondral bone beneath the tendon-bone interface. Sci Rep. 11 (1), 16534(2021).
  3. Doschak, M. R., Zernicke, R. F. Structure, function and adaptation of bone-tendon and bone-ligament complexes. J Musculoskelet Neuronal Interact. 5 (1), 35-40 (2025).
  4. Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
  5. Warden, S. J. Animal models for the study of tendinopathy. Br J Sports Med. 41 (4), 232-240 (2007).
  6. Ozone, K., et al. Structural and pathological changes in the enthesis are influenced by the muscle contraction type during exercise. J Orthop Res. 40 (9), 2076-2088 (2022).
  7. Ozone, K., et al. Eccentric contraction-dominant exercise leads to molecular biological changes in enthesis and enthesopathy-like morphological changes. J Orthop Res. 41 (3), 511-523 (2023).
  8. da Silva, A. S. R., et al. Interleukin-6 modulates endoplasmic reticulum stress signaling and mitochondrial protein complexes in the kidney following acute exhaustive exercise. Cell Stress Chaperones. 30 (5), 100111(2025).
  9. Wang, Y., et al. Effect of one-time high load exercise on skeletal muscle injury in rats of different genders: oxidative stress and mitochondrial responses. Acta Cir Bras. 37 (8), e370805(2022).
  10. Świątkiewicz, M., et al. Increases in brain 1 H-MR glutamine and glutamate signals following acute exhaustive endurance exercise in the rat. Front Physiol. 8, 19(2017).
  11. Sun, Y., et al. Reconstruction of large chronic rotator cuff tear can benefit from the bone-tendon composite autograft to restore the native bone-tendon interface. J Orthop Translat. 24, 175-182 (2020).
  12. Gögele, C., Hahn, J., Schulze-Tanzil, G. anatomical tissue engineering of the anterior cruciate ligament entheses. Int J Mol Sci. 24 (11), 9745(2023).
  13. Sartori, J., et al. Three-dimensional imaging of the fibrous microstructure of Achilles tendon entheses in Mus musculus. J Anat. 233 (3), 370-380 (2018).
  14. Wang, L., et al. VEGF and BFGF expression and histological characteristics of the bone-tendon junction during acute injury healing. J Sports Sci Med. 13 (1), 15-21 (2014).
  15. Benjamin, M., Rufai, A., Ralphs, J. R. The mechanism of formation of bony spurs (enthesophytes) in the Achilles tendon. Arthritis Rheum. 43 (3), 576-583 (2000).
  16. Luo, J., et al. Animal model for tendinopathy. J Orthop Translat. 42, 43-56 (2023).
  17. Cook, J. L., et al. Revisiting the continuum model of tendon pathology: What is its merit in clinical practice and research. Br J Sports Med. 50 (19), 1187-1191 (2016).
  18. Yu, C., et al. Exercise effects on the biomechanical properties of the Achilles tendon: A narrative review. Biology (Basel). 11 (2), 172-184 (2022).
  19. Lu, H., et al. Treadmill running initiation times and bone-tendon interface repair in a murine rotator cuff repair model. J Orthop Res. 39 (9), 2017-2027 (2021).
  20. Schwarz, D. S., Blower, M. D. The endoplasmic reticulum: Structure, function and response to cellular signaling. Cell Mol Life Sci. 73 (1), 79-94 (2016).
  21. Oakes, S. A., Papa, F. R. The role of endoplasmic reticulum stress in human pathology. Annu Rev Pathol. 10, 173-194 (2015).
  22. Celik, C., Lee, S. Y. T., Yap, W. S., Thibault, G. Endoplasmic reticulum stress and lipids in health and diseases. Prog Lipid Res. 89, 101198(2023).
  23. Almanza, A., et al. Endoplasmic reticulum stress signaling - from basic mechanisms to clinical applications. FEBS J. 286 (2), 241-278 (2019).
  24. Huang, J., et al. Endoplasmic reticulum stress associates with the development of intervertebral disc degeneration. Front Endocrinol (Lausanne). 13, 1094394(2023).
  25. Murata, N., et al. Insulin reduces endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis by decreasing mitochondrial hyperpolarization and caspase-12 in INS-1 pancreatic β-cells. Physiol Rep. 12 (12), e16106(2024).
  26. Chen, Y., et al. Single-cell integration analysis of heterotopic ossification and fibrocartilage developmental lineage: Endoplasmic Reticulum Stress Effector Xbp1 transcriptionally regulates the notch signaling pathway to mediate fibrocartilage differentiation. Oxid Med Cell Longev. 2021, 7663366(2021).
  27. Yao, Z., et al. Hydroxycamptothecin inhibits peritendinous adhesion via the endoplasmic reticulum stress-dependent apoptosis. Front Pharmacol. 10, 967(2019).
  28. Yao, Z., et al. Hydroxycamptothecin prevents fibrotic pathways in fibroblasts in vitro. IUBMB Life. 71 (5), 653-662 (2019).
  29. Li, J., et al. Extracellular vesicles from hydroxycamptothecin primed umbilical cord stem cells enhance anti-adhesion potential for treatment of tendon injury. Stem Cell Res Ther. 11 (1), 500(2020).
  30. Liu, Y. C., et al. Alda-1, an activator of ALDH2, ameliorates Achilles tendinopathy in cellular and mouse models. Biochem Pharmacol. 175, 113919(2020).
  31. Liu, C., et al. Tendon microstructural disruption promotes tendon-derived stem cells to express chondrogenic genes by activating endoplasmic reticulum stress. J Orthop Res. 41 (2), 290-299 (2023).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи