Мы показываем, простой и быстрый метод для загрузки предварительно определенные числа клеток в microfabricated скважин и поддерживать их на эмбриоидных развития организма.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Shrinky-Динка Висячие Капли: Простой способ Форма и культуры эмбриоидные тела
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Эмбриоидных органов (EB) являются агрегатами эмбриональных стволовых клеток. Наиболее распространенным способом создания этих агрегатов методом висячей капли, трудоемкий подход пипетирования произвольное количество клеток в хорошо пластин. Взаимодействий между стволовыми клетками вынуждены непосредственной близости друг от друга способствует поколения EBS. Потому что средства массовой информации в каждой из скважин вручную обменялись каждый день, этот подход вручную интенсивно.
Более того, поскольку параметры окружающей среды, включая сотовые-ячейки и растворимые взаимодействия фактора, рН и наличие кислорода могут быть функциями EB размер, клеточных популяций получены от традиционных висят капли могут резко меняться даже при культивировании в одинаковых условиях. Недавние исследования показали, что действительно начальное количество клеток, образующих совокупности может оказать существенное воздействие на стволовые дифференциации клеток. Мы разработали простой, быстрой и масштабируемой культуры метод для загрузки предварительно определенные числа клеток в microfabricated скважин и сохранить их для эмбриоидных развития организма. Наконец, эти клетки были легко доступны для дальнейшего анализа и экспериментов. Этот метод поддается любой лаборатории и не требует специализированного оборудования. Мы показываем этот метод путем создания эмбриоидных органов использованием красного флуоресцентного клеточной линии мыши (129S6B6-F1).
Протокол
1. Создание Shrinky-Mold Динка
- Печать желаемый рисунок на shrinky-Динка листа с помощью хорошего принтера определение.
- Выпекать shrinky-Динка листа при 163 ° С около 10 минут, или пока он полностью не уменьшились, а получив правильной формы.
- После shrinky-Динка плесень остынет, погрузите его в бане, пока изопропанола всей поверхности почти не охвачены.
- Осторожно, спрей некоторые ацетона над плесень и встряхните контейнер несколько раз. Добавить еще изопропанола, чтобы смыть ацетоном избыточных и повторить этот шаг несколько раз, пока shrinky-плесень выглядит чистым.
- Погрузите плесени в дистиллированной воде в течение ....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Мы разработали простой, быстрой и масштабируемой культуры метод для загрузки предварительно определенные числа клеток в microfabricated скважин (отлит из Shrinky-Dinks) и сохранить их для эмбриоидных развития организма. Наконец, эти клетки были легко доступны для дальнейшего анализа и экспериментов. Этот метод поддается любой лаборатории и не требует никакого специализированного оборудования, потому что мы устранить необходимость в фотолитографии. Мы можем варьировать размер лунки, а также концентрации клеток / скважины, чтобы изменить коли.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Благодарности
Мы хотели бы поблагодарить CIRM за поддержку этой работы. Клеточная линия была щедро пожертвовал от доктора Андраш Надь в больнице Маунт Синай в Торонто, Онтарио.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
Для мЭСК СМИ (Макклоски лаборатории протокола): (для общего СМИ подготовлено: 50 мл, 100 мл) KO DMEM: 40.8ml; 81.6ml 15% KSR: 7.5ml; 15мл 1x Пенн-Strep: 0,5 мл, 1 мл 2 мМ L-глутамина: 0,5 мл, 1 мл NEAA: 0,5 мл, 1 мл LIF: 100 мкл; 200ul BMP-4 (10ng/ml): 50ul; 100 мкл Разводненная BME. 50ul; 100 мкл (Добавить 35ul стерильных фильтруется BME в 5 мл PBS и шприцев фильтр стерилизуют Отменить через 2 недели. Конечная концентрация в растворе 0,1 ммоль)
Ссылки
- Keller, G. M. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).
- Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. The in vitro de....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
