Методическая статья

Неонатальная мышиная модель некротизирующего энтероколита и выделение собственной пластинки для профилирования иммунных клеток

DOI:

10.3791/69233

⸱

19 сентября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2Division of Pediatric Gastroenterology, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом протоколе описана неонатальная мышиная модель некротизирующего энтероколита (НЭК) и последующее выделение собственных иммунных клеток lamina из тонкой кишки неонатальной мыши.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Некротизирующий энтероколит (НЭК) является тяжелым воспалительным заболеванием кишечника новорожденных, поражающим в первую очередь недоношенных детей. НЭК характеризуется повреждением эпителия, микробным дисбактериозом и нерегулируемым иммунным ответом, что часто приводит к некрозу кишечника и системному воспалению. Экспериментальные мышиные модели, которые обобщают ключевые аспекты болезней человека, сыграли важную роль в углублении нашего понимания механизмов, которые приводят к заболеванию и информируют о разработке терапии. Этот протокол описывает хорошо зарекомендовавшую себя неонатальную модель некротизирующего энтероколита (НЭК) у мышей с использованием искусственного вскармливания, периодической гипоксии, перорального введения липополисахарида (ЛПС) и кишечных бактерий, культивируемых у младенца с НЭК. Эта комбинация надежно индуцирует гистологические, транскрипционные и иммунологические признаки, соответствующие НЭК у младенцев человека, и стала основой для многих ключевых открытий в этой области. Кроме того, в этом протоколе описывается выделение иммунных клеток из собственной пластинки тонкого кишечника неонатальных мышей. Выделение собственных клеток Lamina позволяет детально профилировать иммунные клетки с помощью проточной цитометрии, облегчая анализ как врожденных, так и адаптивных клеточных популяций в кишечнике.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Некротизирующий энтероколит (НЭК) – это тяжелое воспалительное заболевание кишечника, которое поражает почти исключительно недоношенных новорожденных. Примерно 7-8% младенцев с очень низкой массой тела при рождении (<1500 г) будут подвержены НЭК, а смертность, связанная с этим заболеванием, может приближаться к 50% у новорожденных, которым требуется хирургическоевмешательство. Патогенез НЭК остается до конца не изученным; тем не менее, имеющиеся данные свидетельствуют о том, что НЭК возникает в результате стечения нескольких факторов, включая незрелый кишечный барьер, нерегулируемую иммунную сигнализацию и дисбиотический микробиом 2,3,4. Конвергенция этих факторов может инициировать и усугублять воспалительные реакции в кишечнике, в первую очередь за счет активации толл-подобного рецептора 4 (TLR4), что приводит к повреждению эпителия и различным типам гибели клеток, включая апоптоз и некроз 5,6. Целью данного протокола является представление воспроизводимой и физиологически значимой мышиной модели НЭК, которая воспроизводит воспаление кишечника и кишечный пневматоз (газ в стенке кишечника), наблюдаемые у новорожденных человека, что позволяет проводить механистическое исследование патогенеза заболевания. Кроме того, этот протокол описывает выделение иммунных клеток из собственно пластинки тонкого кишечника неонатальных мышей, что позволяет исследователям выполнять профилирование иммунных клеток с помощью проточной цитометрии.

По сравнению с более крупными животными моделями, такими как неонатальные крысы или поросята 7,8, неонатальные модели мышей имеют ряд явных преимуществ, включая более низкую стоимость, более широкий доступ к трансгенным животным и возможность проводить эксперименты на больших когортах. Мышиные модели NEC в основном используют комбинацию кормления смесью, холодового стресса и гипоксии для моделирования сложной патофизиологии NEC, наблюдаемой у пациентов 7,8,9. Тем не менее, многие мышиные модели НЭК ограничены их зависимостью от широких микробных стрессоров или искусственных изменений микробиоты, что может поставить под угрозу их клиническую значимость. В отличие от этого, модель, описанная в данном протоколе, преодолевает эти ограничения за счет интеграции нескольких ключевых факторов, участвующих в патогенезе НЭК у младенцев человека10,11. В частности, эта модель сочетает гипоксический стресс, который был вовлечен в нарушение целостности кишечного барьера 3,12, с пероральным введением детской смеси с добавлением липополисахарида (ЛПС), хорошо охарактеризованного лиганда TLR4, который вызывает воспаление кишечника, а также клинически значимый дисбиотический микробиом с кишечными бактериями, культивируемыми у пациента с тотальным НЭК. Самая тяжелая форма заболевания, характеризуется паннекрозом кишечника10,13. Интегрируя эти клинически значимые и специфические для заболевания стрессоры, наша модель точно отражает клинические и молекулярные особенности НЭК. Кроме того, чтобы предоставить исследователям основу для изучения иммуноопосредованных механизмов, лежащих в основе патогенеза NEC, в этом протоколе описывается выделение собственных клеток lamina из тонкой кишки новорожденных мышей для анализа проточной цитометрии. Являясь основным местом иммунной активности слизистой оболочки кишечника, собственная пластинка содержит динамический репертуар резидентных и инфильтрирующих иммунных клеток, которые играют центральную роль в NEC-ассоциированном воспалении14. Проточная цитометрия обеспечивает надежную и масштабируемую платформу для характеристики этих иммунных клеточных популяций с высоким разрешением, позволяющую проводить детальный анализ клеточных фенотипов, количественно оценивать иммунные реакции и идентифицировать иммунологические сигнатуры, участвующие в патогенезе NEC15.

Мышиная модель НЭК, описанная в этом протоколе, дополняет модели in vitro , позволяя изучать взаимодействие хозяина и микробиома, иммунные реакции и воспалительную сигнализацию в сложной среде неонатального кишечника. Он воспроизводит ключевые аспекты патогенеза НЭК, которые не могут быть смоделированы in vitro, что делает его ценным инструментом для выяснения механизмов заболевания и оценки терапевтических стратегий. Несмотря на то, что видоспецифичные различия остаются ограничением, эта модель предлагает надежную и доступную платформу для углубления нашего понимания НЭК и ускорения разработки целевых вмешательств.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все методы были выполнены в соответствии с этическими рекомендациями, предоставленными Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) в Медицинской школе Чапел-Хилл Университета Северной Каролины. Мышей разводили, содержали и содержали в соответствии с процедурами, описанными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных в соответствии с предложением об исследовании, одобренным IACUC (протокол No 24-114) Университета Северной Каролины в Медицинской школе Чапел-Хилл. Мыши C57BL/6J использовались для всех экспериментов, описанных в этом исследовании. Детеныши были запущены в модели на 4-й день после рождения с массой тела от 1,8 до 2,3 г; Животные за пределами этого весового диапазона были исключены. Экспериментальные когорты имели сбалансированное распределение по полу, при этом самцы и самки составляли примерно 50% обработанных животных. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Модель Murine NEC

ПРИМЕЧАНИЕ: Кишечный бактериальный запас получают путем получения кишечного содержимого от младенца, у которого была самая тяжелая форма НЭК, всего НЭК 13,16. Кишечнорастворимое содержимое культивируют в течение ночи при 1 х г в течение 16 ч при 37 °С, центрифугируют при 3000 х г в течение 10 мин при 4 °С и ресуспендируют в 50% глицерине. Аликвоты объемом 20 мкл пипетируют в криовиалы и хранят при температуре -80 °C для длительного хранения. Выбранное время обработки языка и региональных параметров в этом протоколе было выбрано с учетом эффективности рабочего процесса. Эти временные точки могут быть скорректированы по мере необходимости, чтобы соответствовать индивидуальным лабораторным графикам без влияния на общую модель. Кроме того, этот протокол был оптимизирован для максимальной емкости в 40 мышей, но может быть масштабирован по мере необходимости.

  1. Подготовка бактериального посева
    1. В день эксперимента 0 в 15:00 добавьте 20 мкл аликвоты кишечных бактерий, культивированных от младенца с тотальным НЭК , в культуральную пробирку объемом 15 мл, содержащую 2 мл бульона Лурия-Бертани (ЛБ). Инкубируйте бактериальную культуру с крышкой пробирки в вентилируемом положении в орбитальном шейкере при 37°C, 1 x g, в течение ночи в течение 16 ч и инкубируйте культуральную пробирку, содержащую только 2 мл бульона LB, одновременно в качестве контроля для оценки любого загрязнения LB.
      1. Визуально подтвердите культуру за ночь путем сравнения мутности между бактериальной культурой и прозрачным контролем, содержащим только LB; Приступайте к работе только в том случае, если бактериальный посев выглядит мутным и контроль остается прозрачным.
    2. В 1-й день эксперимента, в 07:00, аликвоту 125 мкл инокулированной ночной культуры в колбу для клеточных культур Т75 с вентилируемой крышкой, содержащую 25 мл LB-бульона. Приготовьте в общей сложности четыре колбы T75 и инкубируйте их в вертикальном положении в орбитальном шейкере при температуре 37°C, 1 x g, в течение 2 часов, чтобы расширить бактериальную культуру.
      Примечание: Ночные культуры готовятся в экспериментальные дни 0, 1 и 2 модели NEC.
  2. Распределение щенков по экспериментальным группам
    1. В 1-й день эксперимента в 07:00 взвесить щенков на 4-й день после рождения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальный диапазон веса составляет от 1,8 до 2,3 г, и выбросы должны быть удалены из эксперимента.
    2. Сгруппируйте подопытных мышей в когорты с искусственным питанием и когортами и рассчитайте средний вес мышей, которых кормили смесью. Отделите мышей, которых кормили смесью, от плотины и поместите их в новую клетку, размещенную в инкубаторе для младенцев, предварительно нагретом до 37 °C. Держите щенков, которых кормили от матери, в исходной клетке с матерью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Неонатальные мыши особенно чувствительны к изменениям температуры окружающей среды. Для поддержания постоянной регуляции температуры после отделения от матери щенки, выращенные на искусственном вскармливании, содержатся в инкубаторе для младенцев с регулируемой температурой, установленной при температуре 37 °C. Такой подход согласуется с установленными протоколами НЭК, которые сохраняют физиологическую температуру без применения дополнительных тепловых вмешательств 11,17,18,19.
    3. Повторите эксперимент на 2 и 3 дни эксперимента, взвешивая мышей, которых кормили смесью, и рассчитывая средний вес до 07:00 времени кормления ежедневно.
  3. Измерение оптической плотности (OD) бактериальной культуры
    1. После 2 ч инкубации при 37 °C и 1 x g извлеките четыре колбы T75 с расширенной культурой из орбитального шейкера в 1, 2 и 3 дни эксперимента. Смешайте содержимое четырех колб T75, хорошо перемешайте и издайте пипеткой 1 мл бактериальной культуры в кювету.
      1. Приготовьте заглушку, добавив в кювету 1 мл стерильного бульона LB. Измерьте оптическую плотность бактериальной культуры на длине волны 600 нм (наружный диаметр600 нм) с помощью спектрофотометра.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Целевой наружный диаметр600 нм составляет 0,6 ± 0,02. Если наружный диаметр600 нм бактериальной культуры ниже целевого значения, продолжайте инкубацию, как описано в шаге 1.3.1. до тех пор, пока не будет достигнут целевой внешний диаметр600 нм 0,6 ± 0,02. Если наружный диаметр600 нм превышает 0,6, разведите бактериальную культуру стерильным бульоном LB.
    2. Перелейте 80 мл бактериальной культуры в две центрифужные пробирки объемом 50 мл и центрифугируйте при 3000 x g в течение 10 минут при 4 °C. Подтвердите успешное культивирование, проверив наличие видимой гранулы на дне каждой пробирки.
  4. Приготовление смеси
    1. Приготовление смеси начинается в 09:00 в 1, 2 и 3 дни экспериментов. Смешайте 16 мл детской смеси и 8 мл молока для щенков в соотношении 2:1 в стерильной центрифужной пробирке объемом 50 мл.
    2. Удалите надосадочную жидкость из двух пробирок центрифуги объемом 50 мл, содержащих гранулированную бактериальную культуру (шаг 1.3.2).
    3. Тщательно суспендируйте каждую из двух гранул в 2 мл смеси и перенесите ресуспензию в смесь для приготовления 24 мл формулы NEC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация бактерий в формуле NEC должна составлять от 4 до 5 x 109 КОЕ/мл.
    4. Нанесите маркировку на шесть пробирок центрифуги объемом 50 мл для каждой из шести точек времени подачи (10:00, 13:00, 16:00, 19:00, 22:00, 07:00).
    5. Пипеткой нанесите 4 мл формулы NEC в каждую пробирку с маркировкой.
    6. Приготовьте шесть одноразовых аликвот ЛПС (5 мг/мл) и храните в микропробирках с низким уровнем связывания при температуре -20°C. Добавляйте ЛПС (см. ПРИМЕЧАНИЕ для концентрации) в формулу НЭК непосредственно перед кормлением в каждый момент времени.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество ЛПС, добавленное в формулу NEC, основано на средней массе тела щенков, вскармливаемых смесью, рассчитанной на 07:00 каждого дня, с использованием дозировки 5 г ЛПС на грамм массы тела щенков. Конечная концентрация ЛПС варьируется в зависимости от массы тела. Например, при объеме кормления 80 мкл и среднем весе когорты детенышей 2 грамма концентрация ЛПС в смеси составит 0,125 мг/мл.
  5. Кормление
    Примечание: В 1-й день эксперимента мышей, которые должны быть помещены в модель NEC, голодают в течение 3 часов после отделения от их матери. Первая подача смеси NEC происходит в 10:00 и продолжается каждые 3 часа до 22:00. Во 2 и 3 дни эксперимента мышей кормят в 07:00, 10:00, 13:00, 16:00, 19:00 и 22:00. Мышей не кормят на 4-й день эксперимента.
    1. Непосредственно перед кормлением мышей разморозьте и приготовьте одну аликвоту ЛПС в течение 15 с. Добавьте соответствующее количество ЛПС в зависимости от среднего веса мышей в приготовленную пробирку с формулой NEC объемом 4 мл (расчет см. в шаге 1.4.6) и тщательно перемешайте с помощью пипетирования.
    2. Наполните шприц объемом 1 мл формулой NEC и прикрепите неонатальный периферически вводимый центральный катетерный катетер (ПВЦК). Убедитесь, что в шприце или катетере ПВЦК нет пузырьков или воздуха.
    3. Вводите формулу NEC щенкам через пероральный зонд с помощью линии ПВЦК.
      1. Аккуратно удерживайте каждого щенка за дряблую кожу у основания шеи и держите мышь в вертикальном положении. С помощью щипцов проведите дистальный конец ПВЦК в ротоглотку и пищевод, расположив кончик ПВЦК в пределах желудка.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Расстояние введения ПВЦК равно расстоянию от угла рта до верхней части молочного пятна в желудке. Затем оптимальная точка введения должна быть четко обозначена на линии ПВЦК с помощью перманентного маркера.
      2. Если во время введения капельницы ПВЦК ощущается значительное сопротивление, удалите линию ПВЦК, измените положение и осторожно повторите попытку введения.
      3. Медленно вводите 8 мкл смеси NEC в желудок, внимательно наблюдая за щенком на предмет признаков аспирации на протяжении всего кормления. Наблюдайте за появлением белого молочного пятна для подтверждения успешной желудочной доставки.
      4. Удалите линию ПВЦК. Наблюдайте за щенком на предмет затрудненного дыхания или рвоты. Если щенок срыгивает смесь, промокните рот и нос лабораторной салфеткой с низким ворсом.
    4. Повторяйте этот процесс в каждый момент кормления.
    5. Два раза в день подвергайте щенков гипоксии в течение 10 минут сразу после кормления в 13:00 и 19:00.
      1. После двух кормлений в день поместите щенков в камеру гипоксии, соединенную с газовым баллоном, содержащим 95% азота и 5% кислорода. Откройте клапан бака и контролируйте уровень кислорода в герметичной камере гипоксии с помощью портативного монитора. Как только камера гипоксии достигнет 5%± 0,5% кислорода, поддерживайте этот уровень кислорода в течение 10 минут.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость потока должна быть оптимизирована таким образом, чтобы она снижалась с 20% до 5% кислорода при постоянной, контролируемой скорости в течение 2 минут.
    6. Наблюдайте за детенышами мышей между кормлениями на предмет любых признаков респираторного дистресса, бледного обесцвечивания или апноэ. Если эти признаки присутствуют, извлеките пораженного щенка из камеры гипоксии, внимательно следите за выздоровлением и, при необходимости, усыпьте щенков в соответствии с политикой IACUC.
    7. Продолжайте пероральное кормление через зонд и воздействие гипоксии в запланированные моменты времени в течение всех 72 часов использования модели NEC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если экспериментальный день 1 начинается в понедельник в 10:00, то 72-часовая конечная точка произойдет в 10:00 в четверг. Это обозначено как 4-й день модели. Мышей не кормят в 07:00 на 4-й день модели, а усыпляют в этот последний момент времени для сбора тканей в 10:00.
  6. Усыпление животных и сбор тканей
    1. Утром 4-го дня работы модели взвесьте и запишите пол каждого щенка, а затем усыпьте в соответствии с рекомендациями IACUC.
    2. После эвтаназии соберите кровь от каждого щенка в пробирку-сепаратор сыворотки, содержащую активатор тромба и гель.
    3. Центрифугируйте при 16 000 x g в течение 20 минут при 4 °C для отделения сыворотки. Пипетируйте сыворотку в помеченные пробирки объемом 1,7 мл и храните при температуре -80 °C.
    4. Сделайте разрез по средней линии на 1-2 см через брюшную стенку и брюшину, чтобы обнажить желудочно-кишечный тракт. Осмотрите открытый кишечник на наличие отличительных признаков НЭК, включая вздутие, эритему, скопление газов в стенке кишечника (пневматоз кишечника) и видимые пузырьки воздуха.
    5. Определите и резецируйте двенадцатиперстную кишку через дистальный отдел прямой кишки. Поместите салфетку в чашку Петри на лед. Используйте ледяной фосфатно-солевой буфер (PBS) для полоскания кишечника.
    6. Определите слепую кишку и разрежьте ее проксимально, чтобы отделить слепую кишку и толстую кишку от тонкой кишки. Отделите части, начиная с дистального отдела подвздошной кишки и двигаясь к тощей кишке. Поместите кусочек размером 1 см в пробирку, содержащую буфер для лизиса РНК и шарики оксида циркония толщиной 1,5 мм, на лед для транскрипционного анализа.
      1. Промойте кусок диаметром 1,5 см шприцем, содержащим PBS, прикрепленным к игле с тупым концом 24 G, а затем поместите его в микроцентрифужную пробирку, содержащую 1 мл 4% параформальдегида (PFA). Заморозьте кусочек кишечника размером 1 см и храните при температуре -80 °C для анализа белка. Заморозьте кусочек кишки размером 1 см и храните при температуре -80 °C для проведения дополнительных анализов.
    7. Обработать ткань, собранную в буфер для лизиса РНК, в бисере (5,50 м/с, 1,0 мин., цикл = 1,0, пауза: 10 с, 4 °C) для гомогенизации ткани, затем хранить при -80 °C.
  7. Фиксация тканей
    1. Поместите кусочки ткани, собранные в 4% PFA, на коромысло при температуре 4 °C и зафиксируйте на 24 часа. Через 24 ч удалите 4% PFA из каждой пробирки и замените 1 мл PBS для промывания ткани. Верните трубки в коромысло при температуре 4 °C на 15 минут. Повторите промывку PBS один раз.
      1. Снимите PBS и добавьте 1 мл 50% этанола в каждую трубку и верните трубки в коромысло при температуре 4 °C на 15 минут. Удалите 50% этанол и добавьте 1 мл 70% этанола и храните при температуре 4 °C до тех пор, пока ткань не будет переработана в парафиновые гистологические блоки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости могут быть собраны дополнительные сегменты кишечника или образцы кала для дальнейшего анализа.

2. Выделение собственных иммунных клеток Lamina

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирован для выделения собственных клеток lamina от неонатальных мышей в возрасте примерно одной недели. Если для спектральной проточной цитометрии необходимы эталонные образцы, можно использовать отъемышей (3-4 недели после рождения). Для образцов для отъема необходимо удвоить все объемы реагентов, указанные в протоколе.

  1. Приготовление реагентов
    1. Приготовьте 1x сбалансированный раствор соли Хэнка без Ca2+ и Mg2+ (HBSS W/O), содержащий 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазитансульфоновую кислоту (HEPES) и храните при комнатной температуре.
    2. Приготовьте буфер для сортировки флуоресцентно-активируемых клеток (FACS) путем растворения 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) в PBS + 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) и храните при 4 °C.
    3. За день до проведения выделения собственных клеток lamina приготовьте раствор для предварительного разложения, добавив 5 мМ ЭДТА, 5% фетальную бычью сыворотку (FBS) и 1 мМ дитиотреитол (DTT) в HBSS W/O.
    4. Приготовьте раствор для дигезирования непосредственно перед проведением выделения собственных клеток lamina, добавив среду Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI) с 10% FBS и мг/мл коллагеназы внутривенно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: HBSS без O можно приготовить заранее и хранить при комнатной температуре. Буфер FACS должен быть подготовлен заранее и храниться при температуре 4 °C. Растворы для предварительного разложения и разложения должны быть приготовлены свежими непосредственно перед выполнением выделения собственной пластинки и храниться на льду.
  2. Сбор и подготовка тканей кишечника к пищеварению
    1. Найдите слепую кишку и сделайте разрез проксимально, чтобы удалить слепую кишку и толстую кишку. Отрежьте 2-3 см дистального отдела тонкой кишки (подвздошной кишки) и поместите его на ледяной HBSS W/O в чашку Петри (возобновив с шага 1.6.5).
    2. С помощью иглы с тупым концом 24 G, прикрепленной к шприцу, полностью промойте просвет кишечника ледяным HBSS W/O, стабилизируя ткань щипцами. Визуально подтвердить, что просвет кишечника свободен от стула после промывки.
    3. Осторожно удалите остатки соединительной ткани из кишечного сегмента с помощью тонких щипцов или ножниц.
    4. Разрежьте кишку в продольном направлении, чтобы раскрыть, затем разрежьте поперечно на сегменты по 1-1 см.
  3. Диссоциация собственной пластинки
    1. Перенесите кишечные сегменты в центрифужную пробирку объемом 1 мл, содержащую 1 мл раствора предварительного сбраживания, охлажденного на льду.
    2. Инкубируйте образец при температуре 37 °C в течение 20 минут при непрерывном вращении для облегчения диссоциации тканей.
    3. Аккуратно перекрутите пробирку, затем вылейте содержимое через клеточное ситечко 10 мкм, помещенное на центрифужную пробирку объемом 5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Фильтрат, собранный через фильтр 10 мкм, содержит внутриэпителиальные лимфоциты (ИЭЛ) и при желании может быть использован для последующего анализа.
    4. Перенесите фрагменты ткани в новую центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 10 мл предварительно нагретого до 37 °C раствора для сбраживания. Затем инкубируйте образец в течение 40 минут при температуре 37 °C при непрерывном вращении.
    5. Перенесите весь образец в автоматизированную пробирку для диссоциации тканей и запустите программу диссоциации, состоящую из четырех циклов вращения по 15 с каждый, чередующихся между направлениями по часовой стрелке и против часовой стрелки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой автоматическому тканевому диссоциатору является ручное измельчение кишечной ткани с помощью матовых наконечников двух предметных стекол микроскопа. При использовании этого метода применяйте мягкое, равномерное давление, чтобы избежать чрезмерного механического воздействия, так как это может значительно снизить жизнеспособность клеток.
    6. Осторожно нанесите вихревую суспензию на клетки, затем центрифугируйте образцы в пробирке для диссоциации тканей при давлении 300 × г в течение 5 минут при 4 °C.
    7. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, не нарушая гранулу, затем повторно суспендируйте клетки в мл ледяного буфера FACS.
    8. Поместите сетчатый фильтр для клеток 10 μм на центрифужную пробирку объемом 5 мл. Пропустите суспензию ресуспендированных элементов через фильтр, затем промойте фильтр дополнительным мл ледяного буфера FACS.
    9. Подсчитайте клетки и оцените жизнеспособность с помощью трипанового синего или красителя на жизнеспособность. Центрифугируйте объем, необходимый для проточной цитометрии, при 30 × г в течение 5 мин при 4 °C. Используйте ячейки сразу для последующих приложений, чтобы сохранить жизнеспособность и экспрессию маркеров.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Неонатальная мышиная модель НЭК, описанная в этом протоколе, повторяет ключевые особенности заболевания. Анализ выживаемости по методу Каплана-Мейера (рис. 1A) показал значительное снижение выживаемости в группе, получавшей НЭК, по сравнению с контрольной группой, получавшей материнский корм (9/21 против 8/8; p = 0,0063). Общий осмотр кишечника у мышей, подвергшихся воздействию модели (рис. 1B), продемонстрировал отличи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол объединяет физиологически значимую неонатальную мышиную модель НЭК с выделением иммунных клеток собственной пластинки, обеспечивая комплексную платформу для исследования иммунных реакций слизистых оболочек во время воспаления кишечника. Комбинируя клинически значимые воздействия, такие как кишечный микробиом от случаев НЭК человека, гипоксический стресс и искусственное вскармливание, эта модель резюмирует сложный и многофакторный патогенез, наблюдаемый при заболеваниях чело...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с данной рукописью.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта рукопись была поддержана R01DK124614, R01HD105301, DP1DK140012, грантом Chan Zuckerberg Initiative No 2022-316749, премией Yang Biomedical Scholar Award и Университетом Северной Каролины в Чапел-Хилл на кафедре педиатрии.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
1 mL Syringe-Tuberculin Slip TipBecton Dickinson309659Шприц для искусственного вскармливания
1.5 mL semi-micro Disposable CuvettesBRAND GMBH + CO KG759085D
1.7 ml Microtubes ClearAxygen - Corning Inc.MCT-175-CНепирогенные & свободные от Рназы/Дназы
5% Oxygen, Balance Nitrogen Certified Reference Material, Size 200 High Pressure Steel Cylinger, CGA 580AirgasX02NI95C2003186
Anti-Mo CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-85
Anti-Mouse CD16/CD32 Purified Clone: 93eBioscience Inc. 14-0161-86
APC anti-mouse Ly-6C Clone: HK1.4 Isotype: Rat IgGcBioLegend128015
autoMACS Rinsing SolutionMiltenyi Biotec130-091-222
BB515 Rat Anti-CD11b Clone: M1/70BD Biosciences564455
BB700 Rat Anti-Mouse CD4 Clone: RM4-5BD Biosciences566408
BD Microtainer SSTBecton Dickinson365867Сыворотка Tube
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p1200Fisher Scientific12-111-365
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p20Fisher Scientific12-111-366
BIOTIX Rainin LTS Compatible Racked Filter Tips, p200Fisher Scientific12-111-362
Brilliant Stain BufferBD Biosciences563795
BUV615 Rat Anti-Mouse Ly-6G Clone: 1A8BD Biosciences751263
BV650 Rat Anti-Mouse I-A/I-E Clone: M5/114.15.2BD Biosciences563415
C57BL/6J Neonatal MiceThe Jackson Laboratory000664
CD45-VioGreen mouseMiltenyi Biotec 130-102-412
CD64 Antibody, anti-mouse, PE-Vio 770, REAfinity Clone REA286Miltenyi Biotec 130-119-659
CFX Opus Real-Time PC Systems Bio-Rad12011319
Collagenase Type 4Worthington Biochemical Corporation LS004188
DL-dithiothreitol SigmaD9779-5g
eBioscience FOXP3/Transcription Factor Staining Buffer SetLife Technologies Corp. 00-5523-00
EDTA (0.5M), pH 8.0Quality Biological Inc351-027-721
Esbilac Puppy Milk ReplacerPet-Ag, Inc.99502-1Питомец молоко
Fisherbrand Disposable CuvettesFisher Scientific14-955-127
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 10mLFisher Scientific13-678-11E
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 25mLFisher Scientific13-678-11
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 50mLFisher Scientific13-678-11F
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe (paper/plastic wrap), 5mLFisher Scientific13-678-11D
Genie Temp-Shaker 300USA Scientific, Inc.SI-G1600
gentleMACS Dissociator (protocol; m_intestine-01)Miltenyi Biotec 130-093-235
gentleMACS  C TubesMiltenyi Biotec 130096334
Ghost Dye Red 780 Viability DyeTonbo Biosciences13-0865-T100
Glycerol ReagentPlusSigma-AldrichG7757-500ML
GraphPad Prims Software, Version 10.0GraphPadN/A
Greiner Bio-One Round Bottom Polypropylene Culture Tube with Two-Position Vent StopperFisher Scientific07-000-212
Handi+ Oxygen analyzerMaxtecN/A
Hanks' Balanced Salt SolutionGibco141650-095
HEPES BufferMediatech, Inc. 25-060-CI
Hypoxia ChamberBillups-Rothenburg, Inc.N/A
ImageJSchneider et al., 2012N/A
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 10.2cmFisher Scientific12-460-655
Integra Miltex MeisterHand Iris Scissors, 9cmFisher Scientific12-460-598
Integra Miltex™ Swiss Jeweler-Style ForcepsFisher Scientific12-460-110
Isolette Infant IncubatorAir-Shields VickersC100-200-2 Series 02Инкубатор для мышей
Kimtech Science Kimwipes Delicate Task WipesKimberly-Clark34120
LPSSigma-AldrichL3129-10mg
Luria Broth Broth, Miller Molecular Genetics PowderFisher ScientificBP1426-500
MACS BSA Stock SolutionMiltenyi Biotec 130-091-376
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec 130-090-753
Microcentrifuge TubesThermo Scientific34511.5 ml, clear, graduated, sterile
NanoDrop OneC Microvolume UV-Vis SpectrophotometerThermoFisher ScientificND-ONEC-W
Ohaus scout portable balance

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Alsaied, A., Islam, N., Thalib, L. Global incidence of necrotizing enterocolitis: A systematic review and meta-analysis. BMC Pediatr. 20 (1), 344(2020).
  2. Warner, B. B., Tarr, P. I. Necrotizing enterocolitis and preterm infant gut bacteria. Semin Fetal Neonatal Med. 21 (6), 394-399 (2016).
  3. Rose, A. T., Patel, R. M. A critical analysis of risk factors for necrotizing enterocolitis. Semin Fetal Neonatal Med. 23 (6), 374-379 (2018).
  4. Tanner, S. M., et al. Pathogenesis of necrotizing enterocolitis: Modeling the innate immune response. Am J Pathol. 185 (1), 4-16 (2015).
  5. Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair1. J Immunol. 179 (7), 4808-4820 (2007).
  6. Hackam, D. J., Sodhi, C. P. Toll-like receptor-mediated intestinal inflammatory imbalance in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 6 (2), 229-238.e1 (2018).
  7. Sulistyo, A., Rahman, A., Biouss, G., Antounians, L., Zani, A. Animal models of necrotizing enterocolitis: Review of the literature and state of the art. Innov Surg Sci. 3 (2), 87-92 (2018).
  8. Lopez, C. M., et al. Models of necrotizing enterocolitis. Semin Perinatol. 47 (1), 151695(2023).
  9. Jilling, T., et al. The roles of bacteria and TLR4 in rat and murine models of necrotizing enterocolitis. J Immunol. 177 (5), 3273-3282 (2006).
  10. Mihi, B., Lanik, W. E., Gong, Q., Good, M. A mouse model of necrotizing enterocolitis. Methods Mol Biol. 2321, 101-110 (2021).
  11. Nolan, L. S., Gong, Q., Hofmeister, H. N., Good, M. A protocol for the induction of experimental necrotizing enterocolitis in neonatal mice. STAR Protoc. 2 (4), 100951(2021).
  12. Kaplina, A., et al. Necrotizing enterocolitis: The role of hypoxia, gut microbiome, and microbial metabolites. Int J Mol Sci. 24 (3), 2471(2023).
  13. Good, M., et al. Lactobacillus rhamnosus hn001 decreases the severity of necrotizing enterocolitis in neonatal mice and preterm piglets: Evidence in mice for a role of TLR9. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 306 (11), G1021-G1032 (2014).
  14. Denning, T. L., Bhatia, A. M., Kane, A. F., Patel, R. M., Denning, P. W. Pathogenesis of nec: Role of the innate and adaptive immune response. Semin Perinatol. 41 (1), 15-28 (2017).
  15. Yu, Y. -R. A., et al. A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues. PLOS ONE. 11 (3), e0150606(2016).
  16. Mihi, B., et al. Interleukin-22 signaling attenuates necrotizing enterocolitis by promoting epithelial cell regeneration. Cell Rep Med. 2 (6), 100320(2021).
  17. Bautista, G. M., Cera, A. J., Chaaban, H., Mcelroy, S. J. State-of-the-art review and update of in vivo models of necrotizing enterocolitis. Front Pediatr. 11, 1161342(2023).
  18. Sodhi, C. P., et al. The human milk oligosaccharides 2'-fucosyllactose and 6'-sialyllactose protect against the development of necrotizing enterocolitis by inhibiting toll-like receptor 4 signaling. Pediatr Res. 89 (1), 91-101 (2021).
  19. Blum, L., Vincent, D., Boettcher, M., Knopf, J. Immunological aspects of necrotizing enterocolitis models: A review. Front Immunol. 15, 1434281(2024).
  20. Nolan, L. S., et al. Indole-3-carbinol-dependent aryl hydrocarbon receptor signaling attenuates the inflammatory response in experimental necrotizing enterocolitis. Immunohorizons. 5 (4), 193-209 (2021).
  21. Valle-Noguera, A., Gómez-Sánchez, M. J., Girard-Madoux, M. J. H., Cruz-Adalia, A. Optimized protocol for characterization of mouse gut innate lymphoid cells. Front Immunol. 11, 563414(2020).
  22. Booth, J. S., et al. Characterization and functional properties of gastric tissue-resident memory T cells from children, adults, and the elderly. Front Immunol. 5, 294(2014).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи