Методическая статья

Формулировка доз трассеров витамина А для введения людям с использованием техники разбавления изотопов ретинола

187 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69240

⸱

31 марта 2026 г.

 , 
1Human Nutrition and Exercise Research Centre, Newcastle University, 2Fera Science Ltd

В этой статье

Краткое содержание

Подготовка стабильного изотопного витамина А, необходимого для технологии разбавления изотопов ретина, должна соответствовать стандартам безопасности пищевых продуктов. Протокол показывает подготовку дозировки растительного масла в концентрациях, подходящих для выбранной системы доставки и применяемой аналитической платформы.

Аннотация

Метод разведения изотопов ретинола (RID) основан на введении изотопно маркированных трассеров витамина А человеку. Здесь мы представляем метод, который помогает исследовательским командам подготовить стабильные изотопные трассеры витамина А как для исследований, так и для популяционных обследований. В статье представлен обзор подготовки, закупки материалов, необходимого оборудования и процедур для обеспечения безопасности трассеров для употребления человеком. Стабильные изотопные трассеры витамина А могут быть получены коммерчески и обычно маркируются либо дейтерием [2H], либо углеродом-13 [13C] с чистотой >95% полностью транс-изомерной чистоты и >99% изотопным обогащением. Подготовка стабильных изотопных трассеров витамина А включает растворение трассера в съедобном растительном масле с помощью соникации и нагрева. Трассеры должны быть подготовлены в концентрации, которая находится в пределах объемных пределов системы подачи. Наконец, трассер алицитируется в стерильных ампулах из янтарного стекла, а концентрации трассеров подтверждаются спектрофотометрически.

Введение

Для эффективного мониторинга программ вмешательства, направленных на снижение дефицита витамина A, метод разведения изотопов ретинола (RID) успешно применяется для получения информации о общих запасах витамина A в организме (TBS) в различных группахнаселения 1,2,3,4. Хотя для подтверждения дефицита витамина А часто применяются тесты наретинол в сыворотке 5, белок связывающего ретинол в сыворотке (RBP)6,7,8 и модифицированный относительный дозовый ответ (MRDR) 9, RID является единственным методом, который точно количественно оценивает общие запасы витамина А в организме по всему спектру — от субклинического дефицита дотоксичности 3,10. Вводя известную дозу маркированного витамина А и измеряя его разбавление в плазме после равновесия, метод RID даёт точные оценки ТБС и запасов витамина А впечени 11,12. Важно, что метод RID остаётся надёжным даже в популяциях с воспалением, что делает его незаменимым для оценки эффективности вмешательства и оценки токсичных рисков в пересекающихся программах добавки ифортификации 13,14.

Для проведения метода RID изотопно маркированный витамин A необходимо вводить в виде пероральной дозы ретинилэфира, который в большинстве случаев представляет собой ретинилацетат, растворённый в съедобном растительном масле. Большинство лабораторий получают изотопно-маркированный витамин А от коммерческихпоставщиков 1,3,7,15,16,17,18,19,20,21,22. Почти все коммерчески доступные трассеры изотопов витамина А маркируются стабильными изотопами углерода-13 [13C] или дейтерия [2H] (Таблица 1). Выбор дозы применяемого изотопа зависит от аналитического инструмента, используемого для определения концентрации массово-маркированного ретинола в сыворотке или плазме. В то время как газовая хроматография-масс-спектрометрия (GC-MS) и жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (LC-MS/MS) могут анализировать как [13C], так и [2H]22,23,24,25,26,27, газовая хроматография-комгорание-изотопная масс-спектрометрия (GC-C-IRMS) может анализировать только [13C] маркированные трассерыретинола 4,25,28. Пределы обнаружения выбранного аналитического инструмента, целевой группы (дети или взрослые) и продолжительность исследования определят размер необходимойдозы 3,25,29. На сегодняшний день применяемые дозы изотопов варьировались от 0,3 до 4,3 мг эквивалента ретинола (RE; эквивалент 1 - 15 мкмоль RE) удетей 3,4,30 и от 0,6 до 10,0 мг RE (эквивалент 2 - 35 мкмоль RE) увзрослых 2,3,31, при этом более поздние исследования применяли более низкие дозы от 0,3 до 0,6 мг RE (1 - 3 мкмоль RE) для детей и 0,6 - 2,0 мг RE (2 - 7 мкмоль RE) у взрослых. Хотя выражались опасения, что высокая масса витамина А в дозе может нарушить основную кинетику витамина А, недавний анализ с использованием компартментального моделирования подтвердил, что дозы изотопов до 7 мкмоль RE для детей или 14 мкмоль RE для взрослых не должны влиять на точность прогнозовTBS 29. Здесь мы покажем, как подготовить изотопно-маркированный трассер для перорального применения метода RID с учётом вопросов безопасности пищевых продуктов и точной концентрации дозы. Подготовка дозы изотопа крайне важна для метода RID.

Протокол

Исследование 1 было одобрено Национальной службой этики исследований, Комитетом Северо-Восточного Сандерленда (REC 09/H0904/20) до регистрации в Клинической исследовательской сети Великобритании (UKCRN: 7413). Исследование 2 было одобрено Советом по этике исследований Университета Филиппин, Манила (IRB ID: UPMREB 2016-282-01), Институциональным обзорным советом UC, Дэвис (IRB ID: 903681-2) и зарегистрировано в ClinicalTrials.gov (ID: NCT03030339). Второе исследование было частью проекта GloVitAS, финансируемого Фондом Билла и Мелинды Гейтс (OPP1115464: Оценка риска токсичности витамина А вследствие крупномасштабного обогащения продуктов питания и других вмешательств). Георг Лиц был ведущим исследователем проекта GloVitAS и курировал реализацию полевых исследований. Обзор протокола исследования приведён на рисунке 1.

1. Критерии включения и исключения

  1. Для исследования 1 приведённые критерии были следующими: Критерии включения: Включить здоровых мужчин и женщин-добровольцев в возрастном диапазоне от 18 до 45 лет. Критерии исключения: Исключить добровольцев с беременностью, курением, высоким кровяным давлением, диабетом, ИМТ >30, заболеваниями печени/почек/желудочно-кишечного тракта, нарушениями липидного обмена веществ и потреблением мультивитаминов (содержащих витамины A, C, E) или добавок β-каротина за 3 месяца до начала исследования.
  2. Для исследования 2 приведённые критерии были следующими: Критерии включения: включать детей в возрасте 12-18 месяцев, которые оставались в зоне исследования на протяжении всего исследования. Критерии исключения: исключать, если дети не получали высокие дозы витамина А и жили в районах, где не подвергались воздействию продуктов, обогащённых витамином А, на местных рынках.

2. Определение общего количества трассера стабильных изотопов для RID

  1. Определите, какое количество трассера стабильных изотопов должен получить каждый испытуемый с учётом чистоты изомеров. Рекомендуется использовать стабильные изотопы витамина А с чистотой >95% алл-транс, поскольку биологическая активность и метаболические пути значительно различаются между геометрическими изомерами. Рассчитайте уровень дозы на основе эквивалентов ретинола (RE). Пример того, как это вычисляется, приведён в Таблице 2.
  2. Умножьте уровень дозы на общее количество испытуемых. Базовое общее число участников по расчетам мощности для необходимого размера выборки с увеличением на основе ожидаемой потери (см. Таблицу 2 , например). Увеличить общее количество требуемого трассера, учитывая потери при пипетировании до 20%.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, подготовка изотопа должна содержать избыток, так как невозможно извлечь весь материал из флакона. Потери будут дополнительно возникать из-за вязкости масла, которая остаётся на внешней стороне кончика пипетки. Для получения точных объёмов дозы во время подачи необходимо стереть избыточное масло с внешней стороны кончика пипетки. Операторы могут минимизировать потери при пипетировании, если кончик пипетки не погружается слишком глубоко в масло.

3. Определение количества растительного масла, необходимого для растворения стабильного изотопного трассера

  1. Определитесь, какое растительное масло использовать и какую дозу нужно для каждого участника (Таблица 2). Определите количество добавленного масла с помощью системы подачи, используемой при дозировке испытуемых.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем подсолнечное масло из-за высокого содержания витамина E, что способствует стабильности витаминаA 32,33. Однако другие растительные масла использовались другими группами для удовлетворения местных диетических норм. Поскольку RID опирается на точную доставку стабильных изотопных трассеров, рекомендуется использовать пипетку с положительным смещением для нанесения дозы, приготовленную в съедобном масле. В большинстве последних исследований использовались объёмы до 250 мкл, особенно если дозу вводятдетям 1,7,23.
  2. Рассчитайте концентрацию доза трассера стабильных изотопов в растительном масле [мг/мл]. Определите общий объём растительного масла. Рассчитайте вес необходимого масла на основе рассчитанного объёма и относительной плотности растительного масла (см. Таблицу 2 для примера).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для точности рекомендуется взвешивать масло для стабильной подготовки трассера изотопов. После расчёта общего объёма необходимого масла можно заказать стабильный трассер с меткой изотопами. Важно попросить отправку изотопного трассера в бутылке достаточного объёма, чтобы исследовательская группа могла взвесить растительное масло непосредственно в бутылке с меткой изотопа.

4. Подготовка стабильного трассера с меткой изотопов в выделенных зонах для приготовления пищи

  1. Аккуратно откройте крышку янтарной бутылки, содержащей заранее определённое общее количество стабильного трассера изотопов, и положите его на аналитические весы, которые затем смазаются до нуля.
  2. Добавляйте масло по капле до достижения желаемого веса (с точностью ± 0,1 г) с помощью стерильного шприца на 10 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку некоторые кристаллы ретинилацетата могут застрять внутри крышки янтарной бутылки, бутылку нужно открывать очень аккуратно. После добавления растительного масла в янтарную бутылку крышка аккуратно помещается обратно на бутылку, затем аккуратно встряхивается вручную, чтобы убрать кристаллы ретинилацетата, оставшиеся внутри крышки.
  3. Поместите бутылку в звуковую водяную ванну с ультразвуковой мощностью: 14 Вт/л и рабочей частотой: 44 кГц. Наполните водой до уровня масла выше уровня бутылки, но ниже уровня крышки, чтобы вода случайно не попала в препарат.
  4. Сделайте соник в течение 15 минут, затем аккуратно перемешивайте вручную, затем сделайте соник ещё 15 минут. Необходимо следить за тем, чтобы температура звуковой водяной бани не превышала 50 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используя подсолнечное масло для приготовления, мы обнаружили, что изомеризация в цис-ретиноиды не происходит при воздействии дозы при температуре 50 °C в течение 30 минут (см. рисунок 2). Однако препараты следует анализировать с помощью HPLC для оценки степени термической изомеризации.
  5. Поместите бутылку в нагретую водяную ванну при 50 °C на 30 минут, чтобы полностью растворить микрокристаллы.
  6. Возьмите образец масла объёмом 20 мкл, чтобы проверить наличие микрокристаллов под световым микроскопом при увеличении в 200 раз в лаборатории. Если присутствуют микрокристаллы, повторите процедуру соникации и нагрева.
  7. После полного растворения аликвотируйте всю готовность масла в стерильные стеклянные янтарные флаконы объёмом 2–4 мл. Используйте пипетки с положительным смещением для этой процедуры, чтобы избежать перекрёстного загрязнения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем стабильного изотопного трассера, добавленного в стеклянные янтарные флаконы, может зависеть от ежедневной частоты набора, например, если в день набирается 5 испытуемых и объём дозы составляет 150 мкл, флакон должен содержать достаточный объём для 5 доз плюс потери при пипетировании: 5 x 150 мкл x 1,2 = 900 мкл.
  8. Определите стабильную концентрацию изотопов в трёхкратном виде. Резервируйте 200 мкл чистого растительного масла (используемого для приготовления спектрофотометрического заготовки) и 200–350 мкл стабильной дозы изотопа в отдельных ампулах янтаря объемом 2 мл во время приготовления индикатора с меткой стабильного изотопа.
    1. Если концентрация дозы ≤ 0,5 мг RE, оставьте 350 мкл стабильного изотопа в отдельном ампуле янтаря объемом 2 мл. Для концентраций дозы > 0,5 мг RE резервируйте 200 мкл стабильной дозы изотопа в отдельном ампуле янтаря объемом 2 мл.
  9. Наполните флаконы инертным газом (Ar), чтобы задержать потенциальное окисление трассера с меткой изотопом, плотно закройте и храните в криобоксе с маркировкой концентрации изотопов, объемом дозы (определяемым позже), датой приготовления и названием проекта. Храните криобокс в морозильнике при температуре -20 °C до отправки. При таких условиях доза трассера стабильна как минимум 2 года.

5. Определение стабильной концентрации трассера изотопов в лаборатории

  1. Разбавить стабильный изотопный трассер в 3 объёмных колбах с помощью n-гексана. Заполните объёмные колбы n-гексаном на 1 см ниже калибровочной линии перед добавлением дозы трассера.
    1. Определите разбавление трассера стабильных изотопов на концентрацию дозы трассера. Если концентрация дозы стабильного изотопного трассера ≤ 0,5 мг RE, разведите 100 мкл стабильной дозы изотопа в объёмной колбасе объёмом 50 мл с помощью n-гексана. Если концентрация дозы составляет от 0,5 до 2 мг RE, то 50 мкл стабильной изотопной дозы в объёмной колбе объёмом 50 мл с n-гексаном. Если концентрация дозы >2 мг RE, то 50 мкл стабильной дозы изотопа в объёмной колбе объемом 100 мл с n-гексаном.
    2. Напрямую наливаете 50 или 100 мкл масла в гексан и собирайте колбу до объёма 50 или 100 мл с дополнительным гексаном с помощью стеклянной пипетки Пастера. Переверните колбу 10 раз, чтобы смешать масло с гексаном.
      ВНИМАНИЕ: Гексан следует держать в шкафу с дымом, используя соответствующие средства индивидуальной защиты. Отходы гексана собираются в специализированный контейнер для специализированной утилизации одобренным подрядчиком.
  2. Подготовьте спектрофотометрическую заготовку с помощью пипета того же объёма растительного масла, что и стабильный изотопный трассер (50 или 100 мкл), и вливая его в гексан. Убедитесь, что приложенное разбавление (50 или 100 мл) совпадает с трассером стабильных изотопов. Переверните колбу 10 раз, чтобы смешать масло с гексаном.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для пипетирования либо трассера стабильных изотопов, либо чистого масла используется пипетка с положительным смещением 100 мкл. Для обеспечения точного пипетирования крайне важно протирать наконечник вниз бумагой без ворса, чтобы удалить остатки трассера/масла с внешней стороны наконечника. При протирке наконечника наконечника пипетки необходимо быть осторожным, чтобы бумага не касалась отверстия наконечника, так как масло будет забираться изнутри.
  3. Измерьте стабильные концентрации трассеров изотопов в кварцевом кювете с помощью спектрофотометра, установленного на длину волны 325 нм, используя растительное масло в гексане в качестве спектрофотометрической заготовки (см. Таблицу 3 для примера).
    1. Начинайте измерения с использованием растительного масла в гексане в качестве спектрофотометрической заготовки. Очистите кварцевую УФ-кювету между измерениями, промывая её 3 раза с помощью n-гексана. После того как все образцы будут измерены, аккуратно очистите кювету чистым n-гексанам.
  4. Определите концентрацию стабильного изотопного трассера по средним показаниям AU и примените изотопно-специфический молярный коэффициент вымирания с помощью закона Беера-Ламберта. Исходя из этого рассчитывается объём подготовленного стабильного изотопного трассера, необходимого на одну дозу (см. пример в репрезентативных результатах ниже и в таблице 3).

Результаты

Расчёт общего размера дозы трассера изотопов
Для исследования выборки из 100 участников было рассчитано общее количество [13C 10]ретинацетата для определения количества [13C 10]ретинилацетата, необходимо синтезировать (Таблица 2). Сумма основана на расчёте мощности для необходимого размера образца (n = 100), ожидаемой истощения (n=15; 15% истощения), потерь при пипетировании (20%) и концентрации ретинацетата[13 C 10]на дозу (0,4 мг RE; на основе чувствительности приложенного масс-спектрометра, продолжительности эксперимента и возрастной группы участников). Полученное общее количество необходимого RE (55,2 мг RE) затем преобразуется в необходимый вес для [13C 10]ретинилацетата (63 мг).

Для расчёта объёма подсолнечного масла, необходимого для растворения [13C 10]ретинилацетата в нужной концентрации, мы сначала установили объём подачи дозы на 150 мкл/дозу (0,15 мл/дозу). После этого рассчитывается концентрация [13C 10]ретинилацетата в 1 мл подсолнечного масла (Таблица 2). Деля требуемый вес для [13C 10]ретинилацетата (63 мг) на необходимую концентрацию дозы, получается общий объём подсолнечного масла. Наконец, вес подсолнечного масла определяется с помощью относительной плотности подсолнечного масла.

Точная целевая концентрация [13C10]ретинацетата в нефти была подтверждена путём измерения стабильных концентраций изотопных трассеров с помощью спектрофотометра, основанного на законе Беера-Ламберта (Таблица 3). Учитывая разбавление трассера стабильных изотопов во время измерения (коэффициент разбавления 500), получается концентрация ретинилацетата в масле 2,58 мкмоль/мкл [13°C 10]ретинилацетата. Таким образом, окончательный объём подготовленного стабильного изотопного трассера, необходимого для дозы 0,4 мг RE, был определен как 155 мкл (Таблица 3).

Проверка возможной изомеризации дозы трассера
Изомерная чистота полученной дозы трассера была определена путём проверки на цис-изомеризацию с помощью высококачественной жидкостной хроматографии (HPLC; Рисунок 2). Для этого образец разбавлённого трассерного раствора с шага 5.1.2 сушили под воздействием азота, а остаток растворялся в 100% этаноле для впрыскивания. Анализ ВЭЖХ трёх повторных образцов проводился с использованием метода Лю и др.34 для проверки цис-изомеризации (см. рисунок 2). Чистота дозы трассера следует контролировать на протяжении всего исследования, чтобы убедиться, что доза не ухудшается.

Влияние концентраций трассерных доз на долю дозы со временем
Применение различных уровней дозы приведёт к изменяющейся доле принимаемой дозы со временем, что может повлиять на способность аналитической платформы обнаруживать [13C 10]ретинол у всех испытуемых в нужные моменты времени. Применение дозы 1 мг или 0,4 мг [13C10]ретинацетата в масле у взрослых (рисунок 3A) или детей (рисунок 3B) показало более высокую долю дозы после введения 1 мг по сравнению с 0,4 мг [13C 10]ретинацетата и подтвердило способность применяемого LC-MS/MS обнаруживать [13C10Ретинол у пациентов до 28 дней после приёма. Это подтверждает, что информация о доли дозы в разные моменты времени критична для определения того, достаточно ли высокий уровень применяемой дозы для получения сигнала выше уровня обнаружения для применяемой аналитической платформы, и что эта информация должна быть получена в ходе пилотного исследования с представительными образцами.

figure-results-1
Рисунок 1: Блок-схема для приготовления доз трассеров витамина А. Ключевые шаги для проведения стабильной дозы изотопов, включая определение необходимых доз, концентрацию полученной дозы трассера и подтверждение чистоты дозы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Хроматограмма ВЭЖХ дозы трассера для изучения изомеризации ретинилацетата. Потенциальная изомеризация [13C 10]ретинацетата после (A) соникации и (B) нагрева до 50 °C в течение 30 минут оценивалась с помощью анализа ВЭЖХ дозы изотопа после каждого этапа. Анализ проводился на ВЭЖХ с помощью детектора диодных массивов с использованием метода Лю и др.34. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Наблюдаемая доля дозы ретинола в плазме со временем после приема [13C 10]ретинацетата. Доля дозы от (A) 45 взрослых из Великобритании16 лет и (B) 112 филиппинскихдетей, которым были введены соответственно дозы ретинацетата 1 мг или 0,4 мг [13C10]. Доля дозы = {плазма [13C]концентрация ретинола (μмоль/л) x оценочный объем плазмы (L) / [13C]доза (μmol). Данные отображаются в виде геометрического среднего ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Стабильный изотопПоставщик/производитель
[D4]-ретинацетатBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Кембриджская лаборатория изотопов
[D6]-ретинилацетатBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Кембриджская лаборатория изотопов
[D8]-ретинилацетатBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Кембриджская лаборатория изотопов
[13C3]-ретинацетатBuchem BV/ReseaChem GmbH
[13C4]-ретинилацетатBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Кембриджская лаборатория изотопов
[13C8]-ретинилацетатBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Кембриджская лаборатория изотопов
[13C10]-ретинилацетатBuchem BV/ReseaChem GmbH/ Кембриджская лаборатория изотопов

Таблица 1: Коммерчески доступные стабильные трассеры изотопов витамина А. Список трассеров ретинилацетата с маркировкой 13C и 2H от разных поставщиков.

Параметры
Размер выборки [n]:100
Истощение [n] (%):15 (15%)
Потери от пипетирования:20%
MW [13C10]ретинилацетат:338,5 мкг/мкмоль
MW [13C10]ретинол:296,46 мкг/мкмоль
Размер дозы:0,4 мг RE [13C10]ретинилацетата на добровольца
Расчёт
Общее количество требуемых RE:= размер дозы в мг RE x размер образца x истощение x потери при пипетировании
= 0,4 мг RE x 100 x 1,15 x 1,2
= 55,2 мг RE
Общее количество [13C10]ретинацетата требуется:= мг RE x MW [13C10]ретинацетат / MW [13C10]ретинол
= 55,2 мг RE x 338,5 мкг/мкмоль / 296,46 мкг/мкмоль
= 63,0 мг [13C10]ретинилацетат
Концентрация [13C10]ретинацетата в масле:[13C10]ретинилацетат [мг/мл] =
(мг RE x MW [13C 10]ретинацетат / MW [13C 10]ретинол) / 0,15 мл
= (0,4 мг RE x 338,5 мкг/мкмоль / 296,46 мкг/ммоль) / 0,15 мл
= 3,04 мг/мл
Общий объём подсолнечного масла:= Общий [13C10] масса/концентрация дозы ретинилацетата в масле
= 63,0 мг / 3,04 мг/мл
= 20,7 мл масла
Вес подсолнечного масла необходим:= Общий объём подсолнечного масла x относительная плотность подсолнечного масла
= 20,7 мл x 0,92 г/мл
= 19,0 г подсолнечного масла

Таблица 2: Пример расчетов размера дозы трассера стабильных изотопов. Указание параметров и расчёты для определения дозы трассера и количества растительного масла.

Параметры
Коэффициент вымирания моляра (E1%1 см) при [13C10]ретинацетате в гексане:52718 L mol-1 cm-1 x 1 cm
Коэффициент разбавления:500 (100 мкл масла в 50 мл гексана)
Измеряемая средняя поглощение:0.917
MW [13C10]ретинол:296,46 мкг/мкмоль
Расчёт
Концентрация (моль/л) [13C10]ретинилацетата в гексане:Концентрация (моль/л) = Всасывание /E 1%1 см x Длина кюветы (1 см)
= 0,917 / 52718 Л моль-1 см-1 x 1 см = 1,739 x 10-5 моль/л
Преобразование концентрации в мкмоль/мкл:Концентрация (моль/л) = концентрация (мкмоль/мкл)
1,739 x 10-5 моль/л эквивалентно 1,739 x 10-5 мкмоль/мкл
Коррекция разбавления:1,739 x 10-5 мкмоль/мкл x 500 = 8,697 x 10-3 мкмоль/мкл в масле
Вес на мкл (мкг/мкл):= [13C10]ретинилацетат мкмоль/мкл в масле x МВт [13C10]ретинол
= 8,697 x 10-3 мкмоль/мкл x 296,45 мкг/мкмоль = 2,58 мкг/мкл
Объём на дозу:= Объём (мкл / доза 400 мкг) = 400 мкг / 2,58 мкг/мкл = 155 мкл

Таблица 3: Определение стабильной концентрации дозы трассера изотопов. Необходимые параметры и расчёты для определения концентраций дозы трассеров и объёмов для перорального дозирования.

Обсуждение

Стабильные изотопные трассеры, используемые в исследованиях на людях, обычно считаются безопасными, при этом при применяемых концентрациях не сообщается о побочных биологических или физиологическихэффектах 25,35. Однако, поскольку стабильный изотопный трассер должен вводиться перорально, крайне важно, чтобы его доза соответствовала стандартам безопасности пищевых продуктов. Этого можно достичь, требуя от поставщиков и производителей стабильного изотопного витамина А провести тесты на безопасность пищевых продуктов на поставленныхизотопах 7,20,24. Аналогично, крайне важно, чтобы подготовка и хранение изотопов проводились только в специально отведённых местах для приготовления пищи. Кроме того, всё оборудование, используемое для приготовления стабильных изотопов, должно быть предназначено исключительно для подготовки изотопов и хранится в помещениях для приготовления пищи.

Изотопы, маркированные ретинилацетатом, ранее растворялись с помощью этанола, затем сушили под азотным газом, прежде чем растворяться в растительноммасле 36. Здесь представлен метод, позволяющий растворить изотопно-маркированный трассер в растительном масле с помощью сочетания соникации и тепла. Хотя этот метод проще применять в пищевой зоне, при нагревании трассера в растительном масле необходимо проявлять осторожность. Полностью транс-ретинол изомеризуется до 13-цис-ретинола при термической обработке, что ускоряется при повышениитемпературы 37. Изомеризация ретинола дополнительно увеличивается благодаря воздействию света32. Кроме того, стабильность ретинола зависит от липидного окисления растительногомасла 32,38. Поскольку содержание α-токоферола в растительном масле положительно влияет на удержаниевитамина А 32, а подсолнечное масло содержит одно из самых высоких содержаний α-токоферола33, мы решили использовать подсолнечное масло для приготовления трассерных доз. Решение о применении тепла до 50°C для растворения трассера было основано на применении тепла для растворения кристаллов ретинола в косметических изделиях без значительныхпотерь 39. Хотя по описанному протоколу мы не наблюдали значительного разрушения ретинилацетата, крайне важно проверить цис-изомеризацию дозы трассера сразу после термической обработки (см. рисунок 2). Мы также рекомендуем отслеживать стабильность дозы трассера на протяжении всего исследования, чтобы подтвердить применённую концентрацию дозы трассера.

Трассер должен быть приготовлен в концентрации, значительно соответствующей объемным пределам системы подачи, используемой для введения нужной дозы. Поскольку RID опирается на точную доставку стабильных изотопных индикаторов, рекомендуется использовать пипетку с положительным смещением для применения дозы. Хотя ранее дозы до 1 мл применялись взрослым16, 20, 40 мл, объёмы от 100 до 250 мл проще, так как эти объемы хорошо переносятся младенцами идетьми 1. Альтернативно, дозы могут вводиться и в формекапсул 17, но важно выбирать капсулы, специально разработанные для предотвращения утечки масла и обеспечения приемлемости среди исследуемой популяции. Наконец, применяемые уровни дозы зависят от возрастной группы целевойпопуляции 29 лет, способности применяемой аналитической платформы обнаруживать низкиеуровни 3 и общего количества запасов организма целевой популяции, при этом при более высоких общих запасах организма — более низкой плазменной долидозы 1.

Как показано в приведённом выше примере, [13C 10]ретинацетат при концентрации 2,58 мкг/мкл в подсолнечном масле обеспечит дозу 0,4 мг RE трассера в 155 мкл подсолнечного масла, что можно точно доставить с помощью пипетки с положительным смещением на 250 мкл. Для получения концентраций в пределах объемных пределов системы подачи крайне важно, чтобы растительное масло, выбранное для растворителей трассера, точно взвешивалось с помощью аналитических весов (точностью до 0,1 г) в бутылке с трассером стабильных изотопов. Например, если в бутылке с трассером необходимо приготовить в общей сложности 63 мг [13C10] ретинилацетата с концентрацией 3,04 мг/мл, а удельный вес подсолнечного масла составляет 0,92 г/мл при 25 ◦C, то необходимо взвесить 19,0 г (20,7 мл x 0,92 г/мл) масла в бутылку с трассером. Хотя окончательная концентрация трассера стабильных изотопов будет подтверждена с помощью показаний спектрофотометра, точное взвешивание трассера изотопа и нанесённого масла гарантирует, что полученные концентрации будут близки к выбранному объёму подачи для каждой дозы.

Рекомендуется использовать аликвоты масляных препаратов в зависимости от предполагаемой суточной потребности, чтобы все дозы в флаконе были использованы в течение 2 недель после открытия флакона. Лучше всего хранить масло на ледяных пакетах во время использования и замораживать их как можно скорее после завершения дозировки. Хотя масляные препараты не подвергаются повторяющимся циклам замораживания и оттаивания, их всегда нужно защищать от света и замораживать при неиспользовании.

В итоге этот протокол подробно описывает точную подготовку и контроль качества доз трассеров для метода RID, обеспечивая точную дозировку, стабильность и безопасность. Метод рассчитывает требования к трассерам, оптимизирует растворение в растительном масле и проверяет чистоту и концентрацию с помощью спектрофотометрии и ВЭЖХ. Строгие рекомендации по обработке и хранению гарантируют надёжную целостность трассеров для точных оценок на основе изотопов.

Раскрытие информации

Авторам нечего заявлять.

Благодарности

Поддержку этой работы оказали Фонд Билла и Мелинды Гейтс (номер проекта: OPP1115464) и Международное агентство по атомной энергии (МАГАТЭ) в Вене (номер проекта E4.30.30).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2 мл янтарные стеклянные флаконы для аналогового количества дозФишер11573690В зависимости от размера выборки исследования и количества добровольцев, получаемых ежедневно, может быть эффективнее использовать более крупные, например, 4 мл ампулы янтаря
Колбы объемом 100 млФишер11323644Пирекс боросиликатное стекло сертифицированного объемного колбы класса A
Колбы объемом 50 млФишер11313644Пирекс боросиликатное стекло сертифицированного объемного колбы класса A
Аналитические весы Фишер13592970
Капиллярные поршни (наконечники пипетки) CP100 10x96 TIPACKГилсонFD148314
Капиллярные поршни CP1000ST 2x91ГилсонF148180
Капиллярные поршни CP250ST 6x96ГилсонF148714
Картонный криобоксСтарлабA9623-8181
УФ-кварц Hellma cuvetteSLSCEL1600
Гексан 95% n-гексан для сертифицированного ВЭЖХФишерH/0406/17
Крышки для флаконов янтарного стекла по 2 млФишер11573542
Microman E M1000E Pipette (положительное перемещение)ГилсонFD10006
Microman E M100E Pipette (положительный рабочий объем)ГилсонFD10004
Microman E M250E Pipette (положительный объём)ГилсонFD10005
МикроскопNikonEclipse E400
Стеклянные стекла для микроскопа Sigma41122601
Звуковая водяная баняVWRUSC100T
СпектрофотометрТермо Фишер СайентификA51119600C
Индикатор ретинилацетатного стабильного изотопаBuchem BVН/ДДля метода RID можно использовать ряд стабильных изотопов. Список различных коммерчески доступных изотопов приведён в таблице 1.  
Неразмешиваемая водяная баняSLSSLS1176
Растительное маслоВ любом продуктовом магазинеН/ДВажно использовать свежее растительное масло с достаточным сроком хранения для приготовления доз изотопов.
Стеклянная пипетка Volac без розетки Pasteur 150 ммSLSPIP4150

Ссылки

  1. Ford, J. L., et al. Use of Model-Based Compartmental Analysis and a Super-Child Design to Study Whole-Body Retinol Kinetics and Vitamin A Total Body Stores in Children from 3 Lower-Income Countries. J Nutr. 150 (2), 411-418 (2020).
  2. Haskell, M. J., Jamil, K. M., Peerson, J. M., Wahed, M. A., Brown, K. H. The paired deuterated retinol dilution technique can be used to estimate the daily vitamin A intake required to maintain a targeted whole body vitamin A pool size in men. J Nutr. 141 (3), 428-432 (2011).
  3. Lietz, G., et al. Current Capabilities and Limitations of Stable Isotope Techniques and Applied Mathematical Equations in Determining Whole-Body Vitamin A Status. Food Nutr Bull. 37, S87-S103 (2016).
  4. Pinkaew, S., et al. Triple-Fortified Rice Containing Vitamin A Reduced Marginal Vitamin A Deficiency and Increased Vitamin A Liver Stores in School-Aged Thai Children. J Nutr. 144 (4), 519-524 (2014).
  5. VMNIS: Serum retinol concentrations for determining the prevalence of vitamin A deficiency in populations. , World Health Organisation. https://www.who.int/publications/i/item/WHO-NMH-NHD-MNM-11.3 (2011).
  6. Engle-Stone, R., et al. Plasma retinol-binding protein predicts plasma retinol concentration in both infected and uninfected Cameroonian women and children. J Nutr. 141 (12), 2233-2241 (2011).
  7. Engle-Stone, R., et al. Filipino Children with High Usual Vitamin A Intakes and Exposure to Multiple Sources of Vitamin A Have Elevated Total Body Stores of Vitamin A But Do Not Show Clear Evidence of Vitamin A Toxicity. Curr Dev Nutr. 6 (8), nzac115(2022).
  8. Larson, L. M., et al. Approaches to Assess Vitamin A Status in Settings of Inflammation: Biomarkers Reflecting Inflammation and Nutritional Determinants of Anemia (BRINDA) Project. Nutrients. 10 (8), (2018).
  9. Sheftel, J., Tanumihardjo, S. A. Systematic Review and Meta-Analysis of the Relative Dose-Response Tests to Assess Vitamin A Status. Adv Nutr. 12 (3), 904-941 (2021).
  10. Tanumihardjo, S. A., et al. Biomarkers of Nutrition for Development (BOND)-Vitamin A Review. J Nutr. 146 (9), 1816-1848 (2016).
  11. Furr, H. C., et al. Vitamin A concentrations in liver determined by isotope dilution assay with tetradeuterated vitamin A and by biopsy in generally healthy adult humans. Am J Clin Nutr. 49 (4), 713-716 (1989).
  12. Haskell, M. J., et al. Assessment of vitamin A status by the deuterated-retinol-dilution technique and comparison with hepatic vitamin A concentration in Bangladeshi surgical patients. Am J Clin Nutr. 66 (1), 67-74 (1997).
  13. Green, M. H., Ford, J. L., Green, J. B. Development of a Compartmental Model to Investigate the Influence of Inflammation on Predictions of Vitamin A Total Body Stores by Retinol Isotope Dilution in Theoretical Humans. J Nutr. 151 (3), 731-741 (2021).
  14. Suri, D. J., et al. Association between Biomarkers of Inflammation and Total Liver Vitamin A Reserves Estimated by (13)C-Retinol Isotope Dilution among Preschool Children in 5 African Countries. J Nutr. 153 (13), 622-635 (2023).
  15. Furr, H. C., et al. Stable isotope dilution techniques for assessing vitamin A status and bioefficacy of provitamin A carotenoids in humans. Public Health Nutr. 8 (6), 596-607 (2005).
  16. Green, M. H., et al. A Retinol Isotope Dilution Equation Predicts Both Group and Individual Total Body Vitamin A Stores in Adults Based on Data from an Early Postdosing Blood Sample. J Nutr. 146 (10), 2137-2142 (2016).
  17. Green, M. H., et al. Use of Population-Based Compartmental Modeling and Retinol Isotope Dilution to Study Vitamin A Kinetics and Total Body Stores among Ghanaian Women of Reproductive Age. Curr Dev Nutr. 8 (11), 104484(2024).
  18. Haskell, M. J., et al. Population-based plasma kinetics of an oral dose of [2H4]retinyl acetate among preschool-aged, Peruvian children. Am J Clin Nutr. 77 (3), 681-686 (2003).
  19. Lopez-Teros, V., et al. Use of a "Super-child'' Approach to Assess the Vitamin A Equivalence of Moringa oleifera Leaves, Develop a Compartmental Model for Vitamin A Kinetics, and Estimate Vitamin A Total Body Stores in Young Mexican Children. J Nutr. 147 (12), 2356-2363 (2017).
  20. Oxley, A., et al. An LC/MS/MS method for stable isotope dilution studies of beta-carotene bioavailability, bioconversion, and vitamin A status in humans. J Lipid Res. 55 (2), 319-328 (2014).
  21. Ribaya-Mercado, J. D., et al. Quantitative assessment of total body stores of vitamin A in adults with the use of a 3-d deuterated-retinol-dilution procedure. Am J Clin Nutr. 77 (3), 694-699 (2003).
  22. Tang, G. W., Qin, J., Hao, L. Y., Yin, S. A., Russell, R. M. Use of a short-term isotope-dilution method for determining the vitamin A status of children. Am J Clin Nutr. 76 (2), 413-418 (2002).
  23. Oxley, A., et al. Determination of Vitamin A Total Body Stores in Children from Dried Serum Spots: Application in a Low- and Middle-Income Country Community Setting. J Nutr. 151 (5), 1341-1346 (2021).
  24. Oxley, A., Lietz, G. Use of stable isotopes to study bioconversion and bioefficacy of provitamin A carotenoids. Methods Enzymol. 670, 399-422 (2022).
  25. Preston, T. Existing and emerging technologies for measuring stable isotope labelled retinol in biological samples: isotope dilution analysis of body retinol stores. Int J Vitam Nutr Res. 84 (Suppl 1), 30-39 (2014).
  26. Tang, G. W., Qin, J., Dolnikowski, G. Deuterium enrichment of retinol in humans determined by gas chromatography electron capture negative chemical ionization mass spectrometry. J Nutr Biochem. 9 (7), 408-414 (1998).
  27. Wang, J., et al. Vitamin A equivalence of spirulina beta-carotene in Chinese adults as assessed by using a stable-isotope reference method. Am J Clin Nutr. 87 (6), 1730-1737 (2008).
  28. Gannon, B., et al. Biofortified orange maize is as efficacious as a vitamin A supplement in Zambian children even in the presence of high liver reserves of vitamin A: a community-based, randomized placebo-controlled trial. Am J Clin Nutr. 100 (6), 1541-1550 (2014).
  29. Green, M. H., Lopez-Teros, V., Green, J. B. Does the Amount of Stable Isotope Dose Influence Retinol Kinetic Responses and Predictions of Vitamin A Total Body Stores by the Retinol Isotope Dilution Method in Theoretical Children and Adults. J Nutr. 152 (1), 86-93 (2022).
  30. Ribaya-Mercado, J. D., et al. Bioconversion of plant carotenoids to vitamin A in Filipino school-age children varies inversely with vitamin A status. Faseb J. 14 (4), A486-A486 (2000).
  31. Valentine, A. R., Davis, C. R., Tanumihardjo, S. A. Vitamin A isotope dilution predicts liver stores in line with long-term vitamin A intake above the current Recommended Dietary Allowance for young adult women. Am J Clin Nutr. 98 (5), 1192-1199 (2013).
  32. Hemery, Y. M., et al. Influence of light exposure and oxidative status on the stability of vitamins A and D3 during the storage of fortified soybean oil. Food Chem. 184, 90-98 (2015).
  33. Shahidi, F., de Camargo, A. C. Tocopherols and Tocotrienols in Common and Emerging Dietary Sources: Occurrence, Applications, and Health Benefits. Int J Mol Sci. 17 (10), (2016).
  34. Liu, Z., Lee, H. J., Garofalo, F., Jenkins, D. J. A., El-Sohemy, A. Simultaneous Measurement of Three Tocopherols, All-trans-retinol, and Eight Carotenoids in Human Plasma by Isocratic Liquid Chromatography. J Chromatograph Sci. 49 (3), 221-227 (2011).
  35. Davies, P. S. W. Stable isotopes: their use and safety in human nutrition studies. Eur J Clin Nutr. 74 (3), 362-365 (2020).
  36. Haskell, M. J., Ribaya-Mercado, J. D. Handbook on Vitamin A Tracer Dilution Methods to Assess Status and Evaluate Intervention Programs. , Harvest Plus Technical Monographs. (2005).
  37. Han, S. H., et al. Quantitative characterization of degradation behaviors of antioxidants stabilized in lipid particles. Talanta. 71 (5), 2129-2133 (2007).
  38. Park, H., Mun, S., Kim, Y. R. UV and storage stability of retinol contained in oil-in-water nanoemulsions. Food Chem. 272, 404-410 (2019).
  39. Retinol 50C, 15D and 10S. , BASF. https://www.skinident.world/fileadmin/img/spanish-pictures/pdf/BASF_Vitamin_A.pdf (2005).
  40. Green, M. H., et al. Plasma Retinol Kinetics and beta-Carotene Bioefficacy Are Quantified by Model-Based Compartmental Analysis in Healthy Young Adults with Low Vitamin A Stores. J Nutr. 146 (10), 2129-2136 (2016).

Перепечатки и разрешения

Теги

13
Формулировка доз трассеров витамина А для введения людям с использованием техники разбавления изотопов ретинола
Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.