Методическая статья

Мультиплексный серологический анализ для выявления ответов антител к арбовирусам

1.5K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69259

⸱

4 ноября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Infectious Diseases Epidemiology and Analytics G5 Unit, Department of Global Health, Institut Pasteur, Université Paris-Cité, INSERM U1347, 2Laboratory for Urgent Response to Biological Threats (CIBU), Environment and Infectious Risks (ERI) Unit, Institut Pasteur, Université Paris Cité, 3Immunology of Infectious Diseases Unit, Institut Pasteur de Madagascar, 4MRC Centre for Infectious Disease Analysis and Modelling, School of Public Health, Imperial College London, 5Immunophysiopathology and Infectious Diseases Department, Institut Pasteur de Dakar, 6Pasteur Network, Institut Pasteur, 7Department of Immunology, Institut Pasteur

В этой статье

Краткое содержание

Мультиплексные флуоресцентные иммунологические анализы становятся эталоном для серологического тестирования. Их применение, однако, ограничено сложностью и трудоемкими процессами соединения гранул и аналита. В этом отчете представлен полуавтоматизированный, воспроизводимый мультиплексный протокол связывания микросферных шариков, который сопоставим со стандартным методом и при этом значительно сокращает время получения результатов.

Аннотация

Вирусы, переносимые членистоногими (арбовирусы), представляют собой группу патогенов, переносимых комарами, которые распространены по всему миру. С момента вспышки вируса Зика (ЗИКА) в Северной и Южной Америке в 2016 году, которая привлекла внимание общественности к этим инфекциям, арбовирусы продолжают оказывать значительное бремя на общественное здравоохранение. Их появление в ранее неэндемичных регионах вызывает обеспокоенность общественного здравоохранения. Эпиднадзор за арбовирусными инфекциями и борьба с ними в настоящее время являются приоритетом для Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), которая в 2024 году запустила глобальный стратегический план по борьбе с арбовирусными заболеваниями. Мультиплексная® технология произвела революцию в области серологического надзора, позволив одновременно измерять несколько антител при минимальном объеме образца. Основываясь на опыте в разработке мультиплексных серологических тестов, был разработан мультиплексный анализ на основе гранул для выявления антител к арбовирусным антигенам. Анализ включает в себя несколько антигенов, специфичных для распространенных арбовирусов, включая вирусы денге (DENV), желтой лихорадки (YFV), Зика и чикунгуньи (CHIKV). Для ковалентного связывания антигенов с микросферными шариками был использован полуавтоматический метод. Этот новый протокол обладает высокой эффективностью, позволяя связывать до 96 антигенов в одном эксперименте, обеспечивая при этом воспроизводимые результаты. Данные о медианной интенсивности флуоресценции (MFI) были получены с помощью удобной для пользователя системы флуоресцентной визуализации. Мы ожидаем, что при применении к образцам сыворотки крови человека из эндемичных стран этот анализ станет мощным инструментом для усилий по серологическому надзору.

Введение

Арбовирусы в совокупности являются причиной тысяч смертей каждый год. Эти вирусы передаются человеку через инфицированных членистоногих, в основном комаров и клещей. Тяжесть арбовирусных инфекций разнообразна и варьируется от бессимптомной инфекции до тяжелого заболевания, которое может привести к смерти. В 2024 году Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ) зарегистрировала более 10 000 смертей, вызванных только четырьмя серотипами вируса денге (DENV)1. В том же году вирус заразил более 14 миллионов человек, в том числе 50 000 тяжелыхслучаев1. В то время как DENV является наиболее известным арбовирусом, в эту группу входят и другие опасные для жизни патогены, которые были ответственны за многочисленные вспышки во всем мире. Недавний сводный обзор арбовирусных инфекций в Африке показал, что эти вирусы, включая DENV, вирус желтой лихорадки (YFV), вирус чикунгуньи (CHIKV), вирус геморрагической лихорадки Крым-Конго (CCHFV), вирус лихорадки Рифт-Валли (RVFV), вирус Западного Нила (WNV) и вирус Зика (ZIKV), вызвали по меньшей мере 29 вспышек на континенте в 2023году2. В 2022 г. в докладе, опубликованном Региональным бюро ВОЗ для стран Африки, были отмечены существующие ограничения в эпиднадзоре за арбовирусами в регионе, а также подчеркнута настоятельная необходимость разработки методов эпиднадзора за арбовирусами и борьбы с ними3.

Клиническая диагностика арбовирусных инфекций затруднена из-за сходства симптомов, таких как лихорадка, артралгия и общее недомогание, которые являются общими для других патогенов, присутствующих в эндемичных регионах4. Кроме того, из-за коциркуляции и потенциальной коинфекции вирусов дифференциация этиологического патогена затруднена5. Лабораторное подтверждение имеет решающее значение для дифференциальной диагностики. Существует несколько методов обнаружения арборвирусов в образцах человека. Прямые методы, включая молекулярные диагностические тесты, обнаружение вирусных антигенов и выделение вируса, обнаруживают присутствие патогена, в то время как косвенные методы, такие как серологическая диагностика, измеряют иммунный ответ на вирусную инфекцию6.

Было разработано множество методов для выявления ответа антител на арбовирусы. К ним относятся иммуноферментный анализ (ИФА), фиксация комплемента, ингибирование гемагглютинации и микросферный иммуноанализ 6,7. В данном отчете представлен мультиплексный флуоресцентный иммуноферментный анализ на основе микросфер (FMIA) для выявления ответов антител на арбовирусные антигены. Микросферные анализы8 широко используются в серологии и обладают рядом преимуществ, наиболее важным из которых является возможность обнаружения нескольких аналитов в одной реакции с минимальным объемом образца. Оптически кодируемые микросферы (магнитные гранулы полистирола), покрытые представляющими интерес рекомбинантными антигенами, используются в непрямом серологическом иммунологическом анализе. Затем сопряженные шарики инкубируют с образцами, и антиген-специфические антитела обнаруживают с помощью вторичного антитела против человеческого IgG, конъюгированного с флуорофорным репортером фикоэритрина (ПЭ). Существует несколько анализаторов для обнаружения излучаемой флуоресценции, которая обозначается как MFI.

Принцип проведения анализа подробно описан в работе Angeloni et al.8. Вкратце, представляющие интерес антигены химически связаны с микросферами с цветовой кодировкой. Для этого шарики первоначально обрабатывают 1-этил-3-[3-диметиламинопропил]карбодиимидом (EDC) и N-гидроксисульфосукцинимидом (sulfo-NHS), которые активируют карбоксильную группу на поверхности шариков, создавая аминоспособное соединение. Это промежуточное полустабильное соединение затем смешивают с интересующим белком, в результате чего аминные фрагменты белка ковалентно связываются с гранулами, образуя стабильные микрогранулы, покрытые интересующим белком на поверхности. Связанные с антигеном шарики инкубируются с образцами, что позволяет антителам связываться со специфическими антигенами. Антитела, связанные с антигеном, обнаруживаются с помощью вторичного антитела против иммуноглобулина, конъюгированного с флуоресцентным красителем. Мы используем меченые ПЭ вторичные антитела. МФИ измеряются с помощью светового тепловизора (подробная информация об инструменте приведена в Таблице материалов). В инструменте используются два светодиодных индикатора, красный светодиод и зеленый светодиод, которые отдельно возбуждают внутренние красители бусин и репортерную флуоресценцию на поверхности бусин9. Затем фильтры используются для классификации шариков на основе цвета и для количественной оценки флуоресценции, излучаемой аналитами.

Ранее мы применяли эту технологию для выявления ответа антител на SARS-CoV-210 и вакциноуправляемые заболевания11 и показали, что мультиплексные анализы представляют собой бесценный инструмент для исследований серопревалентности и эпиднадзора. Целью данного проекта является расширение использования FMIA для выявления ответов антител на множественные антигены, принадлежащие арбовирусам, с целью применения анализа к скрининговым образцам из африканского региона.

Мультиплексные анализы арбовирусов с использованием мультиплексной технологии были описаны в других работах с использованием различных антигенных мишеней, таких как неструктурный белок 1 (NS1)12,13 или домен оболочки III (EDIII)14. Представлен 50-плексный анализ, который включает 26 арбовирусных антигенов (включая NS1, EDIII, вирусоподобные частицы (VLP) и множество других антигенов для тестирования на патогены, которые совместно циркулируют в регионе. Анализ позволит оценить интенсивность передачи этих патогенов. Краткое описание рекомбинантных антигенов, использованных для разработки анализа, представлено в таблице 1. Протокол, представленный в этом отчете, был разработан в дополнение к обширному исследованию по разработке метода, направленному на оптимизацию обнаружения арбовирусов.

Обычно связывание (или фиксация) антигенов с микросферными шариками осуществляется в одиночных пробирках8 (ручное соединение). Этот процесс занимает много времени, громоздкий и подвержен ошибкам воспроизводимости. В этой статье представлен протокол с использованием автоматизированного прибора для выполнения последовательных этапов, связанных с химическим связыванием антигенов с гранулами. В этой рукописи мы сообщаем о шагах, предпринятых для валидации нового протокола. Валидация нового протокола была выполнена путем сравнения ответов IgG, измеренных с помощью 50-плексного FMIA с использованием антигенных гранул, приготовленных либо ручным методом, либо автоматизированным протоколом. Дальнейшая валидация метода была проведена путем анализа образцов сыворотки крови человека из африканских и французских когорт.

Протокол автоматического сопряжения шариков является быстрым, что позволяет одновременно связывать до 96 аналитов за один прогон. Что еще более важно, результаты сопоставимы с результатами, полученными при использовании установленного ручного протокола, с меньшими вариациями от партии к партии.

Протокол

Для использования образцов на людях было получено соответствующее этическое одобрение. Образцы представляли собой анонимизированные остатки из предыдущих исследований. Протокол использования «стандартного пула» образцов ORPAL был одобрен Национальным советом по этике Суринама (CMWO (Commissie voor Mensgebonden Wetenschappelijk Onderzoek), Opinion Number VG 25-17). Использование образцов из Мадагаскара было одобрено в рамках проекта PvSTATEM Комитетом по этике Лондонской школы гигиены и тропической медицины (28541) и Мадагаскарским комитетом по этике биомедицинских исследований (135MSANP/SG/AMM/CERBM ), в то время как использование сенегальских образцов было одобрено в рамках текущего проекта Dielmo и Ndiop Сенегальским национальным комитетом по этике исследований в области здравоохранения (CNERS Sénégal). Разрешение на измерение антител к ДНТ в этих образцах было выдано CNERS Sénégal (N 00000007 MSAS/CNERS/Sec). Неэндемичные французские образцы были получены в результате обычного медицинского тестирования во французских больничных лабораториях и обработаны в соответствии с существующими правилами и руководящими принципами Французской комиссии по защите данных (Commission Nationale de l'Informatique et des Libertes). Образцы сыворотки крови человека были получены от пациентов из регионов с высокой распространенностью арбовирусов и от наивного населения Франции. Образцы сыворотки перед использованием инактивировали при нагревании путем инкубации при 56 °C в течение 30 минут. Если образцы не инактивированы, переместите их под защитный шкаф. Большинство рекомбинантных антигенов были коммерчески получены, за исключением рекомбинантных белков EDIII, которые были синтезированы собственными силами. Для сбора данных использовался анализатор9 на основе визуализации. Используемые реагенты и оборудование приведены в Таблице материалов.

1. Определение оптимальных концентраций антигена для сопряжения

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить фотообесцвечивание, сведите к минимуму воздействие света на микросферные шарики на протяжении всей процедуры. Перед объемным связыванием оптимизируйте концентрации связывания для каждого антигена с помощью протокола ручного связывания. Протокол был адаптирован из Angeloni et al.8. Буферы и растворы подробно описаны в дополнительной таблице 1.

  1. Выберите области валика, которые будут использоваться для соединения. Тщательно завихрить в течение 20 с. Обрабатывайте трубку ультразвуком в течение не менее 60 с.
  2. Переложите 200 μл (2,5 М шариков) шариков в пробирку объемом 1,5 мл.
  3. Промойте шарики 200 μL 100 mM моноосновного фосфата натрия/0,125x Triton.
    1. Поместите трубку на магнитный сепаратор трубок на 60 с. Осторожно удалите надосадочную жидкость, не касаясь бусин.
    2. Добавьте одноосновной фосфат натрия в буфере. Оставьте на магнитной решетке на 60 с. Удалите надосадочную жидкость.
  4. Активируйте гранулы с помощью буфера, содержащего 80 мкл 100 мМ одноосновного фосфата натрия, 0,125x Triton, 10 мкл sulfo-NHS и 10 мкл EDC.
    1. Добавляйте в пробирки одноосновной фосфат натрия -sulfo-NHS -EDC. Выдерживать в темноте 20 мин при комнатной температуре на ролике.
    2. Промойте шарики в 250 μL PBS (1x) и 0,125x Triton. Повторите стирку три раза.
  5. Связывают антигены.
    1. Готовят различные концентрации (серийные разведения) антигенов в общем объеме 1 мл 1x PBS и 0,125x Triton. Проверьте не менее двух концентраций антигенов.
    2. Добавьте растворы антигена в активированные шарики. Инкубировать в темноте 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C на ролике.
  6. Промойте сопряженные шарики в 500 μL PBS-TBN и 0,125x Triton. Повторите стирку три раза.
  7. Ресуспендируйте связанные шарики в 1 мл PBS-TBN и 0,125x Triton.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните соединенные шарики при температуре 4 °C не менее 24 часов перед использованием. Спаренные шарики показали вариабельность MFI при тестировании сразу после сцепки по сравнению с тестированием через 24 часа.
  8. Выберите оптимальную концентрацию для использования в последующем крупномасштабном соединении. Используйте разные парные шарики для иммуноферментного анализа на стандартном бассейне. Выберите наименьшую концентрацию, при которой была получена линейная стандартная кривая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пример линейности ответа антител на стандартный пул представлен в разделе результатов, рисунок 1.

2. Крупномасштабное автоматизированное соединение бортов

  1. Подготовьте бусины Pro Magnetic COOH.
    1. Рассчитайте необходимое количество бусин: Используя 500 бусин на образец, 2,5 миллионов бусин достаточно для 5000 образцов.
    2. Подготовьте области валика для использования для соединения, как описано выше.
    3. Перенесите нужный объем бусин в выделенные лунки. Для 2,5 миллионов было использовано 200 μL гранул (стандартная концентрация Luminex составляет 1,25e7 бусин/мл).
  2. Подготовьте антигены. Это критически важный шаг для обеспечения точного количества антигенов.
    1. Рассчитайте необходимое количество антигена, после оптимизации. Концентрации, используемые для каждого антигена, подробно описаны в таблице 1.
    2. В микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл тщательно смешайте достаточное количество интересующих антигенов с 1x PBS /0,125x Triton до общего количества 1 мл.
  3. Подготовьте пластины с реактивами. Подготовьте пластины для лунок глубиной 96 следующим образом. Объемы указаны в расчете на одну скважину и рассчитаны на сцепку 2,5 млн швов.
    1. Пластина 1 (Tip Combs): нагрузочные гребни с наконечниками.
    2. Пластина 2 (Шарики): Добавьте 8 μL 0,125x Triton и 200 μL интересующих областей гранул.
    3. Пластина 3 (Wash1): Добавьте 200 мкл 100 мМ одноосновного фосфата натрия / 0,125x Тритон.
    4. Планшет 4 (активация): Добавьте 80 мкл 100 мМ одноосновного фосфата натрия / 0,125x Triton + 10 мкл sulfo-NHS + 10 μL EDC.
    5. Тарелка 5 (Wash2): Добавьте 250 мкл 1x PBS /0,125x Triton.
    6. Пластина 6 (муфта): Переведите 1 мл раствора антигена в выделенную лунку.
    7. Тарелка 7 (Wash3): Добавьте 500 μL PBS-TBN/0,125x Triton.
    8. Пластина 8 (Конечная пластина, содержит связанные шарики): Добавьте 1 мл PBS-TBN + 0,125x Triton.
  4. Настройте прогон цикла сопряжения в автоматизированном процессоре.
    1. Следуйте инструкциям производителя, чтобы включить устройство и настроить протокол. Необходимое программное обеспечение можно загрузить на ПК15. Параметры, специфичные для выполнения, подробно описаны в дополнительной таблице 2.
    2. Загрузите пластины в выделенный слот на машине. Выберите протокол. Запустите цикл. Расчетное время для завершения программы - 2:50 ч.
  5. Окончание цикла
    1. Следуйте инструкциям производителя, чтобы выключить устройство. Выгрузите пластины в соответствии с инструкциями. Визуально убедитесь, что на пластине 8 находятся бусины (коричневые гранулы). Кроме того, из приборов экспортируется отчет о прогоне.
    2. Переложите связанные шарики с пластины 8 на отдельные пробирки объемом 1,5 мл для хранения. Храните спаренные бусины при температуре 4 °C до использования.
  6. Посчитайте бусины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использовался счетчик ячеек. Для ручного подсчета с помощью гемацитометра обратитесь к руководству по кулинарной книге Luminex8.
    1. Тщательно спариваем бусины. Перелейте 10 μL в камеру для подсчета клеток. Следуйте инструкциям производителя, чтобы узнать количество валиков на мл.
    2. Проверьте агрегацию, визуализировав изображение на счетчике ячеек. На дополнительном рисунке 1 приведено репрезентативное изображение неагрегированных бусин.
    3. Если агрегаты присутствуют, тщательно провести вортс и обработать ультразвуком не менее 5 минут. Повторный подсчет
      Примечание: После подсчета гранул эффективность связывания оценивали путем проведения иммуноферментного анализа связанных гранул на стандартном пуле для оценки линейности ответа антител.

Таблица 1: Панель антигенов, входящих в 50-плекс. Анализ включает в себя несколько антигенов для выявления арбовирусных инфекций и сопутствующих патогенов. Приведены количества антигенов, используемых для соединения 1,25 миллиона бусин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

3. Мультиплексный иммуноферментный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Подробные инструкции по протоколу измерения МФО приведены в соответствующем руководстве9. Чтобы свести к минимуму воздействие света на бусины и риск фотообесцвечивания, все растворы и образцы подготавливаются перед тем, как достать бусины из холодильника.

  1. Настройте раскладку тарелок. Использовались 96-луночные планшеты, которые включали в себя последовательные разведения стандартного пула, а также заготовку (только буфер) в первом ряду.
  2. Разведите образцы и стандартные в PBT буфере в отдельном несвязывающем планшете. Для отбора проб использовали разведение в соотношении 1:200 (конечная концентрация 1:400). Для стандартной кривой использовали разведение стандартного пула сыворотки в соотношении 1:50 (в результате чего конечная концентрация составила 1:100) и десять 2-кратных серийных разведений.
  3. Определите количество используемых спаренных шариков в общем объеме 50 мкл/лунка. Было использовано 500 гранул каждой бусины на лунку и отрегулировано по объему с помощью PBT-буфера.
  4. Тщательно перемешайте спаренные бусины в течение 30 с. Обрабатывайте ультразвуком не менее 60 с.
  5. Рассчитайте объем каждой связанной бусины для добавления в мультиплексный премикс, чтобы обеспечить одинаковое количество бусин для каждого аналита. Объемы бусин рассчитывались следующим образом: Объем бусин в лунке = количество бусин в лунке/количество бусин.
    Примечание: Пример расчета гранул и буферных объемов, необходимых для премикса, проиллюстрирован в дополнительной таблице 3.
  6. Перенесите достаточный объем шариков-антигена в центрифужную пробирку.
  7. Отрегулируйте громкость с помощью PBT.
  8. Тщательно перемешиваем премикс.
  9. Распределите 50 мкл премикса на микропланшет для визуализации (например, ps, f-донные планшеты).
  10. Добавьте в гранулы 50 μл разведенных образцов.
  11. Перемешайте на шейкере в течение 30 минут при комнатной температуре, 700 об/мин.
  12. Вымойте тарелки три раза следующим образом (ручная мойка).
    1. Поместите пластину на магнитную решетку на 60 с при комнатной температуре. Плотно зажмите пластину на решетке и выбросьте надосадочную жидкость.
    2. Добавьте 100 мкл PBT буфера. Оставьте на магнитной решетке на 60 с. Повторите стирки
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать пластинчатую шайбу16 . Шайба была настроена следующим образом: 1 цикл замачивания, затем 3 цикла (аспирация, дозирование и замачивание) и заключительный цикл аспирации.
  13. Выбросьте надосадочную жидкость и добавьте 50 мкл разведенного вторичного антитела.
    1. Следуйте инструкциям поставщика, чтобы приготовить исходный раствор вторичного антитела. Использовали раствор вторичного антитела в разведении 1/120. Объемы вторичного антитела рассчитывали следующим образом: объем вторичного антитела = общий объем/коэффициент разведения.
    2. Смешайте вторичное антитело с достаточным объемом буфера PBT. Тщательно перемешиваем. Добавьте 50 мкл разведенного вторичного антитела к промытым гранулам.
  14. Выдерживать в шейкере в течение 15 минут при комнатной температуре, 700 об/мин.
  15. Выполните три промывки, как описано выше.
  16. Суспендируйте гранулы в буфере PBT объемом 150 μL.
  17. Выдерживать в шейкере в течение 5 минут при комнатной температуре, 700 об/мин. Следуйте инструкциям производителя для настройки приборов9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использовалось программное обеспечениеxPONENT 17 , входящее в комплект поставки тепловизора. Настройки для считывания флуоресценции были установлены следующим образом: объем сбора был установлен на 50 мкл, с минимальным измерением 50 шариков, без нагревателя XY и тип анализа как отсутствует.

4. Анализ данных

  1. Запуск валидации
    1. Убедитесь, что достигнуто минимальное количество валиков. Для получения статистически достоверного MFI8 рекомендуется вносить не менее 35 шариков в лунку.
    2. Контрольная пустая и отрицательная контрольная выборка значений MFI минимальна.
    3. Проверьте значения MFI на соответствие стандартам, построив стандартную кривую. Они выше, чем у пустого и/или отрицательного контрольного образца.
  2. Пример анализа данных
    1. Экспортируйте данные в виде файлов CSV и проанализируйте их с помощью программного обеспечения R.

Результаты

Чтобы проиллюстрировать процесс, используемый для валидации протокола, мы выбрали три антигена, которые представляют три семейства арбовирусов: флавивирусы (белок DENV1 NS1), альфавирусы (белок CHIKV VLP) и буньявирусы (RVFV NP). Антигены были протестированы на стандартном пуле предварительно облученной популяции (ORPAL), французской (не подвергшейся воздействию) популяции sera и двух когортах из Африки (Сенегал и Мадагаскар).

Линейность разведения ответа антител
Концентрацию антигенов, используемых для сопряжения шариков, определяли с помощью серийных разведений пула ORPAL. Оптимальной концентрацией была выбрана наименьшая концентрация, при которой была получена линейная стандартная кривая (данные не показаны). На рисунке 1 показана линейность выбранных арбовирусных антигенов при оптимальной концентрации для каждого антигена. Для контроля качества муфты каждая партия спаренных шариков была проверена на линейность разбавления в стандартном пуле ORPAL с использованием заранее выбранной концентрации.

Сопоставимость со стандартным ручным анализом связи
Чтобы оценить сопоставимость данных, полученных с помощью нового автоматизированного протокола с хорошо зарекомендовавшей себя ручной связью, мы сравнили стандартные кривые, построенные на основе результатов, полученных при ручном сопряжении, с автоматизированными. На рисунке 2 показана параллельная линейность для обоих анализов. Значения MFI варьируются в зависимости от антигена.

Вариация партийной муфты
Вариация партии муфты, по мере того как оценивалась воспроизводимость тестов из одной и той же партии муфты, оценивалась с помощью диаграммы Леви-Дженнингса18. Были использованы репрезентативные антигены и контрольные шарики, сопряженные с БСА, и протестированы на стандартном пуле ORPAL. На рисунке 3 показаны МФИ с 19 различных планшетов, протестированных в разные дни для каждого антигена. Полученные МФИ находятся в диапазоне среднего значения ± 3 SD для трех антигенов и контроля.

Влияние мультиплексирования на МФИ
Для дальнейшей оценки эффективности анализа мы проверили, влияет ли мультиплексирование нескольких антигенов на измеряемый ответ антител. Ответ сравнивали с одним антигеном (или одиночной бусиной) с использованием стандартного пула ORPAL. На рисунке 4 показана сильная корреляция (R = 0,99, p < 2,2e-16) между результатами, полученными при измерении MFI на отдельных антигенах или на премиксе, содержащем 50 антигенов.

Ответы антител из образцов сыворотки крови человека в африканских популяциях
Чтобы оценить применимость анализа к образцам из различных когорт, мы сравнили ответы антител в образцах сыворотки крови человека из африканских популяций, которые имеют высокую вероятность контакта с арбовирусами, с антителами из французской когорты, которая, предположительно, имеет более низкий контакт с этими вирусами. В общей сложности было протестировано 1 596 образцов для Мадагаскара, 1 428 для Сенегала и 84 из французской когорты. На рисунке 5 представлены графики плотности для различных когорт. Для когорты из Сенегала наблюдается четкое бимодальное распределение данных по ответам на CHIKV VLP, что позволяет предположить два различных ответа на CHIKV в популяции. Тонкий бимодальный хвост также наблюдается у DENV1 NS1 и RVFV NP в когорте из Сенегала, в то время как между французской и мадагаскарской когортами нет никакой разницы.

figure-results-1
Рисунок 1: Линейность ответа антител протестирована на стандартном пуле ORPAL. В качестве примера приведены выбранные антигены арбовируса. Медианные интенсивности флуоресценции (MFI) отображаются по оси y (логарифмическая шкала), а серийное разведение стандартного пула — по оси x. Все антигены в панели были предварительно протестированы на стандартном пуле перед массовым тестированием на образцах. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Параллельная линейность ответа антител методами сопряжения. Log MFI (ось y) репрезентативных антигенов (фасетка), протестированных на серийных разведениях стандартного пула ORPAL (ось x). Цвета обозначают разные способы сопряжения: автоматизацию (красный, зеленый, синий) и ручную (фиолетовый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Вариация от пластины к пластине. Levey_Jennings графики для связанного шарика BSA (контроль), DENV1 NS1, CHIKV VLP и RVFV показаны для стандартного пула ORPAL в концентрации 1:400. Результаты представляют собой 19 тарелок, запущенных в разные дни. МФИ представлены по оси y, количество тестов — по оси x. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Корреляция ответа антител на моно- и мультиплексный анализ. Стандартный пул был разбавлен до конечной концентрации 1:400 и протестирован на премиксе, содержащем 50-плексные антигены, параллельно с гранулами, покрытыми одним антигеном. Для анализа использовалась корреляция Пирсона. В качестве примера приведены три репрезентативных антигена. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-5
Рисунок 5: Применение анализа на эндемичной и неэндемичной когорте образцов. Анализ был протестирован на образцах из Мадагаскара (зеленый), Сенегала (синий) и Франции (красный). Образцы разбавляли до конечной концентрации 1:400. Ось X представляет нормализованные МФО (нМФИ), рассчитанные как отношение выборочных МФИ к стандартным пуловым МФИ при той же концентрации (1:400). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Дополнительный рисунок 1: Пример репрезентативного изображения агрегации шариков. На панели (A) показаны неагрегированные бусины, а на панели (B) — агрегаты бусин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 1: Таблица буферов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 2: Настройки протокола соединения шариков KingFisher Apex. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица 3: Пример расчета объемов шариков для премикса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Обсуждение

Использование FMIA изменило ландшафт серологического тестирования. Сила анализов заключается в способности оценивать реакцию антител на несколько антигенов в одной реакции, сокращая время получения результатов и снижая стоимость тестирования. Это особенно важно при серологическом надзоре. Однако рутинное использование анализов FMIA затруднено трудоемким и трудоемким этапом ручного связывания шариков, который требует работы с отдельными антигенами в каждой реакции. В данном отчете представлен автоматизированный метод химического связывания антигенов с гранулами. Автоматика позволяет одновременно связывать до 96 антигенов за один прогон, что значительно сокращает время, необходимое для высокопроизводительного связывания антигенов.

На рисунке 1 видно, что антигены были успешно связаны с бусинами. Результаты также демонстрируют сильный параллелизм между новым автоматизированным протоколом и хорошо зарекомендовавшим себя ручным протоколом (рис. 2), что указывает на не меньшую точность в обнаружении ответов IgG на оцениваемые антигены. Результаты вариации межпластинчатой муфты (Рисунок 3) и вариации партии сварных швов (Рисунок 2) показывают сопоставимость данных при использовании автоматизированного метода муфтирования. Высокая корреляция между мультиплексными и одиночными MFI (рис. 4) показывает, что мультиплексирование большого количества антигенов не влияет на ответ антител на набор отдельных антигенов, используемых в этом анализе.

Для валидации анализа были протестированы образцы как из эндемичных, так и из неэндемичных когорт (Рисунок 5). В то время как исследования серопревалентности арбовирусов в Африке все еще недостаточны, имеющиеся данные 19,20,21,22 позволяют получить неоднозначную картину с вариабельной серопревалентностью IgG между отдельными странами и внутри них. Примечательно, что имеющиеся данные свидетельствуют о более высокой распространенности трех вирусов (чикунгунья, денге и рифтовая долина) в Сенегале по сравнению с Мадагаскаром, например,19. Эти показатели распространенности согласуются с наблюдениями, содержащимися в настоящем докладе, которые показали четкий, отчетливый ответ на различные антигены в Сенегале по сравнению с другими когортами. Это подтверждает способность анализа различать профили антител в контексте относительно высокой серопревалентности. Наблюдаемые данные по когорте Мадагаскара можно объяснить сообщениями о низкой распространенности вирусов в пункте сбора выборки22, в то время как сопоставимость данных с неэндемичной когортой может быть частично объяснена небольшим размером выборки французской когорты. Кроме того, сообщаемая изменчивость между регионами может объяснить различия, наблюдаемые в наборах данных. Необходимо обширное исследование для оценки серопревалентности IgG; тем не менее, данные, представленные в этом отчете, показывают, что разработанный анализ специфичен для выявления ответов IgG на оцениваемые арбовирусные антигены, различая данные из эндемичных регионов, а также нюансированные, различные ответы в пределах одной и той же популяции.

Ключевые технические проблемы включали в себя получение однородных решений на основе антигенов, несмотря на их использование в очень малых количествах, обеспечение эквимолярного представления областей гранул в премиксе и минимизацию агрегации гранул. Чтобы преодолеть трудность получения однородного раствора в 96-луночном планшете, был реализован этап, на котором все антигенные растворы были тщательно смешаны в пробирке объемом 1,5 мл перед распределением в планшете. Кроме того, был добавлен шаг для подсчета соединенных бусин и регулировки объемов, чтобы гарантировать, что в премикс будет добавлено равное количество областей бисера. Также был включен этап ультразвуковой обработки для облегчения смешивания гранул и минимизации агрегации в премиксе.

В этом ограниченном исследовании стабильность спаренных бусин и их влияние на эффективность анализа не оценивались, так как все образцы были протестированы в течение одного месяца после соединения швов. Эта оценка вышла за рамки настоящего доклада и будет проанализирована в будущих исследованиях. Несмотря на эти ограничения, в данном отчете представлен быстрый и надежный метод обнаружения реакции антител на различные патогены, включая арбовирусы. Серологический надзор за арбовирусными инфекциями имеет решающее значение для борьбы с этими болезнями, и наличие воспроизводимого, быстрого метода выявления иммунного ответа на эти вирусы представляет собой значительный шаг вперед в глобальных усилиях по оценке гетерогенности передачи и целенаправленных вмешательств для смягчения бремени этих инфекций. Кроме того, несмотря на то, что основное внимание в этом отчете уделяется арбовирусам, этот протокол широко применим к широкому спектру антигенов и представляет собой значительный прогресс в этой области.

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

Авторы искренне благодарят участников исследования и работников общественного здравоохранения в каждом из исследовательских центров. Мы также выражаем признательность всем сотрудникам лабораторий и полевых сотрудников за их самоотверженные усилия по сбору образцов, сбору данных и лабораторным анализам. Эта работа была поддержана грантом «Реконструкция интенсивности передачи арбовирусов в Африке и влияние вмешательств в условиях изменения климата» (xSTAR) от Wellcome Trust [228185/Z/23/Z]. В целях открытого доступа авторы применили публичную лицензию CC BY на любую версию рукописи, принятой автором, возникшую в результате этой заявки. Мы также благодарим за разрешение использовать образцы: Роба Ван Дер Плюйма (Эпидемиология и аналитика инфекционных заболеваний, Институт Пастера, Париж) и Майлис Дуин и Алису Санну (Центр клинических исследований Антильских островов Гайаны, Госпитальный центр Кайенны, Кайенна).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Микроцентрифугальные трубки объемом 1,5 мл -Общие лабораторные расходные материалы
1000 мл фильтрующих агрегатов 0,2 мкмТермофишер Сайентифик567-0020
водохранилища объёмом 25 мл;Thermo scientific95128095
50 mLFalcon ламп-Общие лабораторные расходные материалы
96 глубоких скважин — KingFisher DWThermo scientific10373480
Автоматическая мойка пластин (по опциональности)TECANМикропластинчатая шайба HydroFlex Plus
Коклюш B FHAНативный антиген BP-FHA-50
Баланс-Общее лабораторное оборудование
Настольная центрифуга  - Общее лабораторное оборудование
BioPlex Pro Magnetic COOH бусины LuminexMC10xxx  (x=область бусин)
Бычий сывороточный альбумин, BSASigmaA7906
Branson Ultrasonic Bransonic Ultrasonic Cleaner Модель B200Фишер Сайентифик15-337-22
BSAСигма ОлдричA7906
Гран-при CCHFРодной антигенREC31639-100
Счётчик/ГемацитометрBiorad/MerckTC20 /Z359629
CHIKV E2Родной антигенREC31617-100
CHIKV VLPРодной антигенCHIKV-VLP-100
Прозрачные плоскодонные иммунно-нестерильные пластины с 96 лункамиThermo scientific3455
cmv-частицыРодной антигенCMV-HP-100
Подсчётные слайды, двойная камера для ячейкового счетчика и nbsp;BioradL003662 А
CP23Родной антигенProduction Prot
CT694Родной антигенProduction Prot
CtxB
DENV1 EDIII + SNAPВнутреннее производство-
DENV1 NS1Родной антигенDENV1-NS1-100
DENV1 VLPРодной антигенDENVX4-VLP-100
DENV2 EDIII + SNAPВнутреннее производство-
DENV2 NS1Родной антигенDENV2-NS1-100
DENV2 VLPРодной антигенDENVX4-VLP-100
DENV3 EDIII + SNAPВнутреннее производство-
DENV3 NS1Родной антигенDENV3-NS1-100
<имя="ДИАПАЗОН! A33">DENV3 VLPРодной антигенDENVX4-VLP-100
DENV4 EDIII + SNAPВнутреннее производство-
DENV4 NS1Родной антигенDENV4-NS1-100
DENV4 VLPРодной антигенDENVX4-VLP-100
дифтерия ТоксНативный антиген DIP-TNL-100
EBV-GP125Родной антигенREC31601-100
EDC Sigma03449
Этанол 100% -Общая лаборатория и bbsp;
Плёнка, алюминиевая герметизация, нестерильная -Общие заведения
Аппарат флуоресцентной визуализации — система MAGPIXLuminex MAGPIX-XPON4.1-CEIVD
Портативный магнит для пластин — магнитный разделитель на 96 ямLuminexCN-0269-01
hev-ORF2Нативный антиген REC31653-100
Инаба OSPBoston_MGH -
Kingfisher DeepWell 96-колодец с наконечникомThermo scientific17170069
Leishmania K28КлининаукиMBS3040095
Калибровочный набор Luminex MAGPIXLuminexMPX-CAL-K25
Набор для проверки Luminex MAGPIXLuminexMPX-PVER-K25
Магнитный трубочный сепараторИнвитрогенDynaMag
MAGPIX Drive Fluid PlusLuminex40-50030
НП по кориРодной антигенREC31796
Микропластинчатый шейкер Рандокс
МИКРОПЛАСТИНА, 96-Я КОЛОДЦА, PS, F-ДНО (ДЫМОХОД)Greiner-Bio один655096
MiliQ H20 -Общая лаборатория и bbsp;
Многоканальные пипетки 10, 300САРТОРИЙ
NIEРодной антигенProduction Prot
Огава OSPBoston_MGH -
ONNV E2КлининаукиIT-022-006EP
Инструмент процессора частицThermo scientificThermo Scientific KingFisher Flex
PBS 10x PH~7.0EUROMEDEXET330
PE-конъюгированное анти-человеческое IgG Fc вторичное антителоИсследования Jackson Immuno709-116-098
PfAMA1Внутреннее производство-
PfMSP1Родной антигенREC32013-100
PGP3Родной антигенProduction Prot
Пипетные наконечники (поставщик) 10 & micro; L, 200 и микро; L, 1000 и микро; L -Общие лабораторные расходные материалы
Pm MSP1КлининаукиCUST-PRT-31102024-1B
Po MSP1КлининаукиCUST-PRT-31102024-1A
PvMSP1Родной антигенREC31724-100
R software R4.4.1--
НП RVFVРодной антигенREC31640-100
Одноканальные пипетки 10p, 20p, 200p, 1000pЭппендорф
ЩЕЛЧОКВнутреннее производство-
S-NHS Sigma56485
Натрий-азидSigmaS2002
Раствор гипохлорита натрия (отбеливатель) -Общий бытовой отбеливатель
Токсин столбнякаРодной антигенREC31801-100
Thermo Scientific BindIx Software версии 1.1ThermoFisher Scientific-
ТРИТОНThermo ScientificA16046
Трубчатый ролик и bbsp;IKARoller 6D -100219627
Tween-20SigmaP7949
USUV EDIII + SNAPВнутреннее производство-
USUV NS1Родной антигенUSUV-NS1-100
Vortex  -Общее лабораторное оборудование
VSP3Родной антигенProduction Prot
VSP5Родной антигенProduction Prot
WNV EDIII + SNAPВнутреннее производство-
WNV NS1Родной антигенWNV-NS1-100
Программное обеспечение xPONENTLuminex89-30000-00-759 Rev A Май-19
YFV EDIII + SNAPВнутреннее производство-
YFV NS1Родной антигенYFV-NS1-100
ZIKV EDIII + SNAPВнутреннее производство-
ZIKV NS1Родной антигенZIKV-NS1-100
ZIKV VLPРодной антигенZIKV-VLP-100

Ссылки

  1. Global dengue surveillance. , World Health Organization. https://worldhealthorg.shinyapps.io/dengue_global (2025).
  2. Bangoura, S. T., et al. Arbovirus epidemics as global health imperative, Africa, 2023. Emerg Infect Dis. 31 (2), e240754(2024).
  3. World Health Organization. Surveillance and control of arboviral diseases in the WHO African Region: assessment of country capacities. , WHO. (2022).
  4. Starolis, M. W., Perez, O., Powell, E. A. Clinical features and laboratory diagnosis of emerging arthropod-transmitted viruses. J Clin Virol. 132, 104651(2020).
  5. Alves, R. P. D. S., Amorim, J. H. Editorial: Arboviruses: Co-circulation, co-transmission, and co-infection. Front Microbiol. 14, 1321166(2023).
  6. Pan American Health Organization. Recommendations for laboratory detection and diagnosis of arbovirus infections in the region of the Americas. , PAHO. (2023).
  7. Fischer, C., et al. Challenges towards serologic diagnostics of emerging arboviruses. Clin Microbiol Infect. 27 (9), 1221-1229 (2021).
  8. Angeloni, S., Das, S., De Jager, W., Dunbar, S. xMAP cookbook: A collection of methods and protocols for developing multiplex assays with xMAP technology. Luminex. , https://info.diasorin.com/en-us/research/download-the-xmap-cookbook (2025).
  9. Luminex MAGPIX user manual. , Luminex Corporation. (2023).
  10. Rosado, J., et al. Multiplex assays for the identification of serological signatures of SARS-CoV-2 infection: An antibody-based diagnostic and machine learning study. Lancet Microbe. 2 (2), e60-e69 (2021).
  11. Bloch, E., et al. Investigation of the sero-epidemiology of vaccine preventable diseases and common viral infections in French populations using a multiplex serological assay. medRXiv. , (2024).
  12. Venkateswaran, N., Sarwar, J., Nelson, W., Venkateswaran, K. Determination of IgG antibody profile to arboviruses using a multiplex serology panel. , (2024).
  13. Lawford, H. L. S., et al. Integrated serological surveillance for neglected tropical diseases, vaccine-preventable diseases, and arboviruses in Samoa, 2018. Sci Rep. 15 (1), 12667(2025).
  14. Bailly, S., et al. Spatial distribution and burden of emerging arboviruses in French Guiana. Viruses. 13 (7), 1299(2021).
  15. KingFisher Apex purification system: User guide. , Thermo Fisher Scientific Inc. https://documents.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0018970_kingfisher_apex_UG.pdf (2025).
  16. Instructions for use for HydroFlex Plus. , Tecan. (2025).
  17. XPONENT 4.3 installation instructions. , Luminex Corporation. https://us.diasorin.com/sites/default/files/products-documentation-tool/89-30000-00-759.pdf (2025).
  18. Van Den Hoogen, L. L., et al. Quality control of multiplex antibody detection in samples from large-scale surveys: the example of malaria in Haiti. Sci Rep. 10 (1), 1135(2020).
  19. Bangoura, S. T., et al. Seroprevalence of seven arboviruses of public health importance in sub-Saharan Africa: a systematic review and meta-analysis. BMJ Glob Health. 9 (10), e016589(2024).
  20. Awuah, A. A., et al. Seroprevalence of dengue in the Democratic Republic of Congo, Ghana and Senegal: results of the SERODEN study. Int J Infect Dis. 152, 107428(2025).
  21. Mhamadi, M., et al. Human and livestock surveillance revealed the circulation of Rift Valley Fever virus in Agnam, Northern Senegal, 2021. Trop Med Infect Dis. 8 (2), 87(2023).
  22. Broban, A., et al. Seroprevalence of IgG antibodies directed against dengue, chikungunya and West Nile viruses and associated risk factors in Madagascar, 2011 to 2013. Viruses. 15 (8), 1707(2023).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи