Методическая статья

Визуализация эндоцитарного транспорта в живых клетках с использованием функционализированных нанотел в культивируемых клетках

DOI:

10.3791/69284

⸱

17 октября 2025 г.

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндоцитарный и ретроградный транспорт белков от плазматической мембраны к транс-сети Гольджи имеет важное значение для поддержания мембранного гомеостаза и регуляции передачи сигналов. В данной работе мы описываем метод визуализации и количественной оценки эндоцитарного транспорта трансмембранных грузовых белков с помощью микроскопии живых клеток с использованием дериватизированных нанотел анти-GFP в клетках HeLa.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндоцитоз рецепторов и других трансмембранных белков от поверхности клетки до эндосом и далее имеет решающее значение для гомеостаза, физиологии и функции. Для исследования эндоцитарного захвата и ретроградного транспорта белков мы создали универсальный инструментарий, включающий функционализированные нанотела, для мониторинга транспорта с поверхности клетки в транс-сеть Гольджи (TGN) с помощью визуализации фиксированных и живых клеток, электронной микроскопии и гелевого электрофореза в сочетании с авторадиографией. Мы разработали дериватизированные нанотела, нацеленные на зеленый флуоресцентный белок (GFP) или mCherry - мономерные, несшивающиеся, высокоаффинные связывающие белки - которые могут быть добавлены к клеточным линиям, экспрессирующим представляющие интерес мембранные белки, несущие соответствующие внеклеточные флуоресцентные метки. После связывания с трансмембранными репортерами, помеченными GFP или mCherry, нанотела специфически интернализуются и транспортируются параллельно с эндогенными маршрутами сортировки репортеров. Эти нанотела были функционализированы с помощью выбранных флуорофоров для отслеживания ретроградного транспорта с помощью флуоресцентной микроскопии и визуализации в реальном времени, с аскорбатпероксидазой 2 (APEX2) для разрешения ультраструктурной локализации с помощью электронной микроскопии, а также с мотивами сульфатации тирозина для количественной оценки кинетики прибытия TGN. В данном методологическом исследовании мы подробно описываем общий протокол бактериальной экспрессии и очистки функционализированных нанотел, а также генерации стабильных GFP-репортерных клеточных линий. Мы иллюстрируем полезность этого подхода для визуализации живых клеток на примере модифицированного mCherry нанотела анти-GFP (VHH-mCherry) для анализа эндоцитарного поглощения рецептора трансферрина (TfR) и катион-зависимого рецептора маннозы-6-фосфата (CDMPR).

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эндоцитоз рецепторов и других трансмембранных (ТМ) белков из плазматической мембраны в различные внутриклеточные компартменты важен для поддержания мембранного гомеостаза 1,2. После интернализации клатрин-зависимым или -независимым эндоцитозом, белковые грузы сначала заселяют ранние эндосомы, откуда они далее сортируются либо вдоль эндолизосомальной системы, либо перерабатываются в плазматическую мембрану, либо ретроградно транспортируются в транс-сеть Гольджи (TGN)3,4,5. Рециркуляция из эндосом и/или с поверхности клетки в TGN является частью функционального цикла ряда трансмембранных грузовых рецепторов, таких как катионзависимые и катион-независимые манноз-6-фосфатные рецепторы (CDMPR и CIMPR), доставляющие вновь синтезированные лизосомальные гидролазы из TGN к поздним эндосомам и лизосомам 6,7,8, Wntless (WLS) транспортирует Wnt-лиганды к поверхности клетки9, 10,11,12 или TGN46, который сопровождает растворимые секреторные грузовые белки, включая панкреатический повышенный фактор (PAUF) и другие грузы CARTS, из TGN13,14,15,16. В то время как все эти грузовые рецепторы коммутируют через TGN для сбора новых клиентских белков, рецептор трансферрина (TfR), который интернализует связанный с железом трансферрин, исключается из возврата Гольджи 17,18,19,20,21.

Для исследования эндоцитарного и ретроградного трафика мы ранее создали набор инструментов на основе нанотел, предназначенный для маркировки и отслеживания белков груза от поверхности клетки до внутриклеточных компартментов. Нанотела представляют собой новый класс связывающих белки белков, полученных из гомодимерных антител только с тяжелой цепью (hcAb), которые в природе встречаются у верблюдовых и хрящевых рыб22,23. Они представляют собой вариабельный домен тяжелой цепи (VHH) hcAb и обладают многочисленными преимуществами по сравнению с обычными антителами (например, IgG): они мономерны, малы (~15 кДа), хорошо растворимы, не имеют дисульфидных связей, могут экспрессироваться бактериями и поддаются отбору для высокоаффинного связывания24. Чтобы повысить универсальность и широкую применимость этого набора инструментов для нанотел, мы использовали функционализированные нанотела против GFP для поверхностной маркировки и отслеживания белков, помеченных тегами GFP, на их внеклеточных или люменальных доменах. Посредством рекомбинантной конъюгации нанотел с последовательностями mCherry, аскорбатпероксидазы 2 (APEX2) или тирозинсульфатионных последовательностей, ретроградный транспорт добросовестных трансмембранных карго-белков может быть проанализирован с помощью флуоресцентной микроскопии фиксированных и живых клеток, электронной микроскопии или биохимических анализов с использованием авторадиографии. Учитывая, что сульфатация тирозина, катализируемая тирозилпротеинсульфотрансферазами TPST1 и TPST2, является посттрансляционной модификацией, ограниченной транс-Гольджи/TGN, эта стратегия позволяет напрямую оценить динамику и кинетику переноса от поверхности клетки к компартментуГольджи 25,26,27. Совсем недавно мы расширили этот репертуар функционализированных связывающих белков, включив в него дериватизированные нанотела анти-mCherry. Эти реагенты оказались полезными для анализа машинозависимых путей транспортировки МПР, в частности CDMPR17,28, в TGN с помощью биохимического анализа.

В то время как предыдущее исследование в основном было сосредоточено на применении нанотел, модифицированных тирозиновыми сульфатионными последовательностями, для биохимической оценки поступления TGN с помощью авторадиографии19, в этой статье описывается генерация флуоресцентно меченных, функционализированных нанотел (VHH-mCherry) и репортерных клеточных линий для визуализации эндоцитарного транспорта в живых клетках. В сочетании с дополнительным резидентным флуоресцентным репортерным белком Гольджи этот протокол может быть дополнительно адаптирован для использования в качестве надежного рабочего процесса для количественного анализа визуализации живыми клетками транспорта от эндосомы к TGN выбранных грузовых белков.

Прежде чем применять этот протокол, исследователи должны убедиться, что целевой белок экспрессируется в виде GFP-меченой гибридной конструкции, обычно генерируемой стандартными подходами к молекулярному клонированию. Функционализированные нанотела могут быть легко получены в бактериях с выходами, достаточными для экспериментов по поверхностному мечению, при этом рабочие концентрации в низком наномолярном диапазоне подходят для большинства визуализирующих анализов живых клеток. Пользователи также должны учитывать, что кинетика переноса может варьироваться в зависимости от грузовых белков, что требует корректировки продолжительности мечения или частоты визуализации для оптимальной визуализации транспортировки эндоцитов или эндосом в TGN.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Бактериальная трансформация с помощью VHH-mCherry

Примечание: Данный протокол был оптимизирован для экспрессии, очистки и анализа функционализированных нанотел, анти-GFP, как описано ранее17. Следующие шаги адаптированы для VHH-mCherry и согласуются с более ранним методологическим отчетом19.

  1. Разморозьте хемокомпетентные бактерии (50-100 мкл), пригодные для экспрессии белка (например, клетки Escherichia coli Rosetta BL21 (DE3)) путем помещения их на лед.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте химиокомпетентные бактериальные клетки в соответствии со стандартными лабораторными протоколами. Для этого можно использовать коммерчески доступные элементы BL21 (DE3) от NEB.
  2. Добавьте 50 нг плазмиды, кодирующей функционализированную конструкцию VHH-mCherry (Addgene #109421). Чтобы обеспечить эффективное сайт-специфичное биотинилирование репортера нанотел во время бактериальной экспрессии, совместное преобразование с трехкратным избытком (150 нг) плазмиды, кодирующей бактериальную биотин-лигазу BirA (Addgene #109424). Аккуратно переверните пробирку в 4-5 раз, чтобы смешать клетки и плазмидную ДНК.
    Примечание: Котрансформация с BirA-кодирующей плазмидой не требуется, если биотинилирование пептидом акцептора биотина (BAP) не требуется.
  3. Выдержать смесь на льду в течение 30 минут. Избегайте волнения на этом этапе.
  4. Подвергните бактериальные клетки тепловому шоку, поместив их ровно на 20 с при температуре 42 °C в водяную баню или нагревательный блок.
  5. Добавьте 1 мл среды бульона Лурии (LB) комнатной температуры (ЛБ) и инкубируйте трансформированные бактерии в термошейке (250-500 об/мин) в течение 1 ч при 37 °C, чтобы обеспечить фенотипическую экспрессию генов устойчивости к антибиотикам.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить 1 л LB среды, добавьте 5 г дрожжевого экстракта, 10 г триптона, 10 г NaCl и смешайте объем с водой, а затем стерилизуйте автоклавированием.
  6. Гранулируйте бактерии центрифугированием при давлении 11 000 x g в течение 1 минуты и повторно суспендируйте гранулу в 100 μл свежей среды. Тщательно перемешайте с помощью пипетки.
  7. Поместите взвешенные бактерии на предварительно подогретые LB-планшеты, содержащие соответствующие антибиотики (например, 50 мкг/мл канамицина; при совместном преобразовании с BirA, также включите 50 мкг/мл карбенициллина, см. шаг 1.2).
  8. Инкубируйте планшеты с антибиотиками в перевернутом положении при температуре 37 °C в течение 13-15 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть приостановлен здесь. Планшеты с выращенными колониями можно хранить при температуре 4 °C и закрывать проницаемой пленкой для предотвращения высыхания.

2. Бактериальная жидкая культура и индукция экспрессии VHH-mCherry

  1. Выберите одну бактериальную колонию из трансформационной пластины и закиньте ее в колбу Эрленмейера, содержащую 20 мл LB-среды с добавлением антибиотиков. Инкубируйте культуру в встряхивающем инкубаторе в течение 13-15 ч при 37 °C (см. также шаг 1.7 относительно выбора антибиотиков).
  2. На следующий день разведите в течение ночи 20 мл бактериальной культуры в свежей колбе, содержащей 1 л LB среды с соответствующими антибиотиками подбора.
  3. Продолжайте инкубацию при 37 °C до тех пор, пока культура не достигнет оптической плотности при 600 нм (OD600) 0,6-0,7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте культуре остыть до температуры RT или до 16 °C перед индукцией экспрессии белка.
  4. Индуцируйте экспрессию VHH-mCherry (и BirA, если они экспрессируются совместно) путем добавления 1 мл 1 М изопропил-β-D-тиогалактопиранозида (IPTG) для достижения конечной концентрации индуктора в 1 мМ (разведение 1:1000). Если проводили котрансформацию с экспрессирующей плазмидой BirA, также добавляйте в культуру 10 мл стокового раствора D-биотина 20 мМ, получая конечную концентрацию 200 мкМ D-биотина в питательной среде. Это способствует биотинилированию in vivo эпитопа акцептора биотина (BAP), присутствующего в конструкции VHH-mCherry.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте запас D-биотина в ddH2O и растворите его путем постепенного добавления 500 мМ2PO4.
  5. Инкубируйте индуцированную IPTG культуру объемом 1 л в течение 13-15 ч при 16 °C для обеспечения оптимального сворачивания белка и выхода.
    Примечание: Условия экспрессии для вновь разработанных конструкций нанотел с другими флуоресцентными метками могут потребовать эмпирической оптимизации со стороны исследователя.
  6. Перелейте культуру в бутылку для центрифугирования объемом 1 л и соберите клетки центрифугированием при 5 000 x g при 4 °C в течение 45 минут. Выбросьте надосадочную жидкость в соответствующие жидкие биоотходы и приступайте к этапам очистки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе протокол можно приостановить, храня бактериальную гранулу при температуре -80 °C. Гранула VHH-mCherry обычно имеет розовый цвет, что указывает на правильное сворачивание флуоресцентного гибридного белка.

3. Очистка VHH-mCherry на основе IMAC

  1. При необходимости разморозьте замороженную бактериальную гранулу на льду (см. также шаг 2.6).
  2. Добавьте 30 мл ледяного связывающего буфера (20 мМ имидазола в 1x PBS) к бактериальной клеточной грануле и тщательно ресуспендируйте путем пипетирования вверх и вниз. Переложите суспензию в пробирку центрифуги объемом 50 мл с маркировкой.
  3. Дополните ресуспендированные клетки 200 мкг/мл лизоцимом, 20 мкг/мл ДНКазы I, 1 мМ MgCl2и 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (PMSF). Инкубируйте смесь в течение 10 мин при RT, а затем 1 ч при 4 °C на торцевом ротаторе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PMSF токсичен. Готовьте и обрабатывайте исходные растворы в вытяжном шкафу для химикатов в перчатках, лабораторном халате и средствах защиты глаз; Утилизировать отходы, содержащие PMSF, в контейнеры для галогенированных органических отходов. Для экспериментов использовали стоковый раствор 0,1 М и дополнительно разбавляли.
  4. Механически разрушают бактериальные клетки с помощью наконечника ультразвуковой аппарата, вставленного непосредственно в суспензию. Подайте три постоянных импульса ультразвуковой обработки по 1 минуте, обеспечивая интервал охлаждения в 1 минуту между каждым импульсом с заданными настройками ультразвука (размер наконечника зонда: 6 мм, сплошной наконечник; Амплитуда 40%; Рабочий цикл (импульсный режим): 1 с ВКЛ/1 с ВЫКЛ)
  5. Осветите лизат центрифугированием при 15 000 x g при 4 °C в течение 45 мин для гранулирования остатков бактериальных клеток и неповрежденных бактерий.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лизат можно перелить в бутылку для центрифуги или зализовать в пробирки объемом 5 мл для настольного центрифугирования.
  6. Осторожно перенесите полученный надосадочный контамент в новую пробирку объемом 50 мл и выбросьте гранулу в соответствующие биоотходы.
  7. Держите очищенный лизат на льду во время подготовки к иммобилизованной металлоаффинной хроматографии (IMAC). Для выделения нанотел, помеченных гистидином, используйте предварительно упакованные, одноразовые очистные колонки His-tag, оптимизированные для работы в режиме гравитационного потока.
  8. Закрепите колонны Ni-NTA (никель-нитрилотриуксусная кислота) на металлической подставке или соответствующем держателе колонны.
    1. Слейте буфер хранения из колонок и уравновесьте 10 мл связывающего буфера (20 мл имидазола в 1x PBS).
    2. Позвольте буферу пройти под действием силы тяжести; Выбрасывайте проточные воды как биоотходы.
  9. Постепенно нанесите очищенный бактериальный лизат (~30 мл) на колонку. Дайте ему протечь под действием силы тяжести и отбросьте проточный.
  10. Промойте колонку двумя последовательными объемами связывающего буфера по 10 мл (20 мМ имидазола в 1x PBS).
  11. Разбавьте связанные нанотела 2 мл элюирующего буфера (500 мМ имидазола в 1x PBS) в микроцентрифужной пробирке объемом 2 мл.
  12. Выполните замену буфера.
    1. Уравновесьте обессоливающую колонну, помещенную в адаптер для пробирки объемом 50 мл, промыв 5x 5 мл 1x PBS.
    2. Дайте буферу полностью войти в упакованную смолу; Откажитесь от протока. После окончательной промывки PBS центрифугируйте колонку при давлении 1000 x g в течение 2 минут.
    3. Откажитесь от проточной части. Поместите колонку с адаптером на новую трубку объемом 50 мл. Загрузите 2 мл элюированного функционализированного нанотела (из шага 3.11) в уравновешенную PBS-обессоливающую колонну и вращайте при давлении 1000 x g в течение 2 мин и соберите элюат.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Диализ может быть использован в качестве альтернативы для замены буфера.
  13. Количественно определите концентрацию очищенного белка VHH-mCherry с помощью бицинхониновой кислоты (BCA) или анализа Брэдфорда в соответствии с протоколами производителя.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для эффективного поглощения нанотел в приложениях визуализации живых клеток рекомендуется конечная концентрация 5-10 мг/мл.

4. Валидация экспрессии и чистоты VHH-mCherry (окрашивание Кумасси)

  1. Приготовьте 10% додецилсульфат-полиакриламидный гель натрия (SDS-PAGE) в соответствии с установленными лабораторными протоколами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы можно использовать коммерчески доступные сборные градиентные гели от Bio-Rad для удобства и воспроизводимости.
  2. Аликвот 20 мкг очищенного VHH-mCherry в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и денатурировать путем кипячения в буфере для образца при 95 °C в течение 5 мин.
  3. Загрузите образец денатурированного нанотела в SDS-полиакриламидный гель и выполняйте электрофорез в соответствии со стандартными процедурами PAGE до тех пор, пока отслеживающий краситель (например, бромфенольный синий) не достигнет дна разрешающего геля.
  4. Приступайте к окрашиванию и удалению геля из Кумасси.
    1. Осторожно извлеките гель из кассеты и погрузите его в раствор для окрашивания Coomassie (5% из 10 г/л Coomassie Brilliant Blue в 10% уксусной кислоте и 45% метанола в ddH2O) на 20-30 минут в RT на мягко встряхивающей платформе. Убедитесь, что гель полностью погружен в раствор для окрашивания.
    2. Удалить пятна из геля с помощью раствора для удаления пений (7,5% уксусной кислоты и 15% метанола в ddH2O), выполнив 2-3 последовательных промывки по 1 ч каждое при RT. Для оптимального уменьшения фона оставьте гель на 13-15 часов в свежем растворе для задержания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Излишки красителя могут быть эффективно поглощены, если положить бытовые бумажные полотенца вокруг геля во время процесса задержания. Окрашивающие/задерживающие растворы содержат легковоспламеняющийся метанол и раздражающую уксусную кислоту. Используйте в вытяжном шкафу, надевайте перчатки и защитные очки, а также собирайте отработанные растворы в специальные контейнеры для легковоспламеняющихся жидкостей для отходов.
  5. Визуализируйте гель с помощью системы документирования геля или камеры по выбору.
    Примечание: Для дополнительного подтверждения экспрессии нанотел может быть выполнен иммуноблоттинг с использованием эпитоп-специфических антител (см. также рисунок 1C).

5. Получение GFP-меченых репортерных клеточных линий HeLa с использованием ретровирусной трансдукции

Примечание: Различные репортеры GFP HeLa α Киотские клеточные линии (здесь они называются просто HeLa или HeLa α)были ранее сгенерированы. С целью демонстрации анализа визуализации живых клеток используются помеченные GFP CDMPR или TfR в качестве репрезентативных грузовых белков. В то время как TM-белки с топологией I типа помечены GFP на крайнем N-конце, TM-белки с топологией II типа требуют слияния C-концевых GFP.

  1. Гены, кодирующие EGFP-CDMPR (Addgene #182642) или TfR-EGFP (#243763), были ранее субклонированы в ретровирусный вектор pQCXIP с использованием стандартных методов клонирования рестрикционных ферментов17. После превращения в хемокомпетентную E. coli подготовьте плазмидную ДНК высокой чистоты с помощью наборов для подготовки midi (например, от Macherey-Nagel).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Химиокомпетентные бактериальные клетки должны быть подготовлены в соответствии со стандартными лабораторными протоколами. NEB 5-alpha Competent E. coli из NEB можно использовать для клонирования и очистки плазмид.
  2. Для получения стабильных репортерных GFP клеточных линий HeLa ретровирусные частицы получают путем трансфекции упаковочной клеточной линии Phoenix ampho. Вся работа с клеточными культурами проводится в условиях ламинарного потока BSL2.
    1. За день до трансфекции высейте 2,0-3,0 x 106 амфоклеток Феникса в чашку диаметром 10 см в 10 мл среды для достижения 60%-80% конфлюенции к следующему дню. Phoenix ampho поддерживают в DMEM с высоким содержанием глюкозы GlutaMAX-I с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина и 1 мМ пирувата натрия.
    2. В день трансфекции замените среду 10 мл свежей готовой среды.
    3. В микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл смешайте 1 мл бессывороточного и не содержащего добавок DMEM с высоким содержанием глюкозы GlutaMAX-I с 10 мкг pQCXIP-EGFP-CDMPR или pQCXIP-TfR-EGFP и 30 мкл реагента для трансфекции FuGENE HD. Тщательно перемешайте с помощью пипетки.
    4. Инкубировать смесь при комнатной температуре в течение 15 минут, чтобы дать возможность образования комплексов ДНК-реагент.
    5. Добавьте всю трансфекционную смесь по каплям в культуру амфо Феникс. Аккуратно покрутите пластину, чтобы равномерно распределить комплексы.
    6. Инкубировать трансфицированные амфо клетки Phoenix в течение 13-15 ч при 37 °C с 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать альтернативные упаковочные клеточные линии, при условии, что они совместимы с векторной системой Retro-X Q.
  3. На следующий день выбросьте трансфекционную среду и замените ее 7 мл свежей готовой среды для усиления вирусной продукции.
  4. Через 48 ч и, возможно, через 72 ч после трансфекции соберите супернатант культуры (~7 мл), содержащий вирусные частицы, с помощью пипетки. Контролируйте экспрессию GFP в трансфицированных клетках амфо Phoenix с помощью флуоресцентного микроскопа или системы визуализации (например, Bio-Rad ZOE).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Опять же, ретровирусные манипуляции требуют локализации BSL-2. Выполняйте все работы в сертифицированном шкафу биобезопасности, надевайте перчатки, лабораторный халат и средства защиты глаз, а также обеззараживайте поверхности с помощью 1% гексаварта и 70% этанола перед утилизацией отходов в автоклаве.
  5. Отфильтруйте собранный вирусный надосадочный продукт через фильтр размером 0,45 мкм. Отфильтрованную надосадочную жидкость можно использовать немедленно (см. шаг 5.7) или хранить при температуре 4 °C при кратковременном использовании или при -80 °C при длительном хранении. Обратите внимание, что при замораживании титры вируса могут снижаться.
  6. Чтобы установить стабильные репортерные клетки HeLa GFP, проводят ретровирусную трансдукцию с использованием отфильтрованного вирусного супернатанта. Все процедуры должны проводиться в условиях BSL2.
    1. За сутки до трансдукции засейте примерно 2,0-3,0 x 106 клеток HeLa α в чашку диаметром 10 см с 10 мл среды, чтобы достичь 60%-80% конфлюенции к следующему дню. Культуральные клетки HeLa α культивируют в DMEM с высоким содержанием глюкозы GlutaMAX-I с добавлением 10% FBS и 100 Ед/мл пенициллина/стрептомицина.
    2. Смешайте отфильтрованный вирусный надосадочный слой с полибреном 15 мкг/мл (гексадиметрина бромид) для повышения эффективности инфекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полибрен является раздражителем - во время подготовки массы обращайтесь в перчатках и средствах защиты глаз, избегайте образования аэрозоля, а полибреносодержащие растворы утилизируйте как опасные химические отходы.
    3. На следующий день замените стандартную среду для выращивания неразбавленной вирусной надосадочной жидкостью, содержащей полибрен, обеспечив покрытие всей поверхности чашки.
    4. Инкубировать клетки HeLa α процессе трансдукции в течение 13-15 ч при 37 °C с 5%CO2.
      Примечание: Для определения титра вируса можно проводить серийное разведение и анализ инфекции клеток HeLa α. Титрование в этом случае необязательно, так как ретровирусы заражают только делящиеся клетки.
  7. На следующий день после трансдукции выбросьте вирусную среду в отходы BSL2 и замените ее 10 мл свежей полной среды HeLa α. Инкубировать в течение 13-15 ч при 37 °C с 5%CO2.
  8. На следующий день начните отбор, заменив среду на полноценную среду, содержащую 1,5 мкг/мл пуромицина.
  9. Поддерживайте давление отбора в течение 2-3 недель, пропуская клетки по мере необходимости. Перед переносом генетически модифицированных клеток в среду BSL1 убедитесь, что они свободны от вирусных частиц, способных к репликации.
  10. Чтобы получить однородную популяцию, используйте клональную изоляцию с использованием клонирующих колец или цилиндров или сортировку клеток, активируемую флуоресценцией (FACS). FACS может быть выполнена на трансдуцированных клетках HeLa α с использованием FACSAria III или Fusion (BD Biosciences) для обогащения популяции равномерной экспрессией GFP на основе интенсивности флуоресценции.
    Примечание: Экспрессия репортера GFP в клетках HeLa α может быть дополнительно подтверждена с помощью флуоресцентной микроскопии с фиксированными клетками или иммуноблоттинга антителами против GFP (см. также рисунок 2C).

6. Поглощение VHH-mCherry культивируемыми клетками для визуализации живых клеток

Примечание: Все процедуры культивирования клеток проводятся в стерильных условиях в ламинарном колпаке перед микроскопией живых клеток.

  1. 6.1При стерильном ламинарном потоке засемените приблизительно 50 000–110 000 клеток HeLa, стабильно экспрессирующих CDMPPR или TfR, помеченных GFP, в каждую лунку μ-слайдового 4-луночного предметного стекла камеры ibiTreat. Используйте 700 мкл полнорационной питательной среды, содержащей антибиотики (DMEM с высоким содержанием глюкозы, фенол без красных), с добавлением 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина, 2 мМ l-глутамина и 1,5 мкг/мл пуромицина.
  2. Инкубируйте клетки в течение 13-15 часов при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5%CO2 для обеспечения надлежащей адгезии и пролиферации. К следующему дню слияние клеток должно достичь примерно 80%.
  3. В день визуализации, непосредственно перед экспериментом, аккуратно замените среду в каждой лунке 350 μл свежей полной среды, не содержащей фенола красного.
  4. Параллельно готовят рабочий раствор VHH-mCherry в конечной концентрации 2,5 мкг/мл (примерно 50 нМ) в предварительно подогретой среде, не содержащей феноловых красных. Поддерживайте температуру раствора при температуре 37 °C до использования.
  5. После инициализации автоматизированной системы визуализации живых клеток (например, FEI MORE или Nikon Ti2 X-Light V3) предварительно нагрейте инкубационную камеру микроскопа до 37 °C с 5%CO2 , прежде чем перенести камеру для микроскопии ибиди на микроскоп и настроить параметры сбора данных следующим образом.
    1. Выберите U PlanS Apo 100x NA 1.4 и установите камеру для микроскопии ibidi на предметный столик для микроскопа.
    2. Настройте два канала с соответствующей длиной волны возбуждения и однополосными фильтрами излучения для EGFP (например: 470/20 нм, em: 517/20 нм) и mCherry (например: 550/15 нм, em: 590/20 нм).
    3. Выберите короткое время экспозиции и низкую интенсивность освещения, чтобы избежать фотообесцвечивания (например, 50 мс и 5% мощности для EGFP, 160 мс и 25% для mCherry). Важно, чтобы выбранные значения оставались постоянными для всех экспериментов.
    4. В соответствии с условием (=well) сохраняйте координаты 10 различных полей зрения с 3-4 ячейками в фокусе в списке точек.
    5. Сфотографируйте каждую позицию в этом списке пунктов один раз с помощью одного снимка. Это референсные изображения до добавления VHH-mCherry.
    6. Чтобы инициировать эндоцитарное поглощение, осторожно добавьте 350 мкл предварительно подогретого раствора VHH-mCherry в каждую лунку, обеспечивая минимальное нарушение монослоя клетки. Продолжайте инкубацию при 37 °C с 5%CO2.
    7. Многократно визуализируйте каждую точку в списке пунктов в покадровом эксперименте в течение 100 кадров с задержкой в 36 секунд между кадрами при 37 °C и 5%CO2.
    8. Чтобы уменьшить фотообесцвечивание, заказывайте получение каналов для изображения сначала mCherry, затем EGFP.
    9. Чтобы увеличить пропускную способность, закажите захват так, чтобы сначала были получены все позиции последовательно, и повторяйте это для каждой временной точки.

7. Визуальный анализ эндоцитарного захвата VHH-mCherry

  1. Предварительная обработка изображений после получения и извлечение данных на Фиджи.
    1. Загрузите цейтраферное изображение с помощью плагина импорта био-форматов с активированной опцией разделения каналов.
    2. Корректируйте боковой дрейф с помощью плагина MultiStackReg. Используйте канал EGFP в качестве эталона и примените преобразование к каналу mCherry.
    3. Для каждой ячейки нарисуйте область интереса (ROI) с помощью инструмента полигон (например, вокруг перинуклеарной области) и добавьте ее в менеджер ROI.
    4. Для обоих каналов измерьте среднюю интенсивность во всех ROI и временных точках с помощью функции Multi measure менеджера ROI и сохраните полученную таблицу в виде текстового файла.
    5. Откройте соответствующее опорное изображение и повторите измерение для каждого ROI.
  2. Анализ данных для определения кривых поглощения эндоцитов
    1. Откройте текстовый файл и вычтите каждый номер кадра на 1 так, чтобы они начинались с 0, затем умножьте номер каждого кадра на задержку между кадрами в s (т. е. 36).
    2. Для каждого ROI вычтите среднюю интенсивность в канале VHH-mCherry эталонного изображения из каждого кадра соответствующего покадрового изображения в канале VHH-mCherry, чтобы удалить автофлуоресценцию и фон.
    3. Для каждого кадра и ROI разделите интенсивность VHH-mCherry с вычитанием фона на среднюю интенсивность каналов EGFP, чтобы учесть колебания интенсивности в пределах ROI, отличные от VHH-mCherry, например, движение Гольджи, сжатие ячейки, z-дрейф или нестабильность освещения.
    4. Нормализуем полученную кривую до собственного максимума.
    5. Выберите диапазон кадров, чтобы исключить любые артефакты в начале (например, добавление медиа) или в конце (т. е. смещение, обесцвечивание) интервальной съемки.
    6. Подгонка данных кривой с помощью одной экспоненциальной функции затухания, моделирующей кинетический процесс первого порядка:
      figure-protocol-1
      где I(t) — нормализованная интенсивность в момент времени t, а t0 — временная задержка между добавлением VHH-mCherry и началом записи. Исходя из константы скорости k, рассчитать период полураспада τ1/2 процесса по формуле:
      figure-protocol-2
      ПРИМЕЧАНИЕ: При проведении эксперимента с несколькими последующими изображениями поля зрения (FOV) в каждой временной точке, каждое соответствующее t0 может немного отличаться, но оно должно увеличиваться до более высоких значений от одного поля зрения к другому.
    7. Повторите эту процедуру для всех наборов данных и сообщите значения периода полураспада в виде ящичковых диаграмм.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для исследования ретроградного переноса белков в различные внутриклеточные компартменты мы недавно создали инструмент на основе нанотел анти-GFP для маркировки и отслеживания рекомбинантных гибридных белков с поверхности клетки. В этой статье мы описываем бактериальное производство таких дериватизированных нанотел и демонстрируем их полезность для мониторинга поглощения эндоцитов с помощью визуализации живых клеток. В сочетании с резидентным флуоресцентным репортером Гольджи этот протокол предлагает надежную платформу для количественного изучения ретроградного транспорта выбранных грузовых белков в транс-сеть Гольджи (TGN) в режиме реального времени.

Мы создали коллекцию различных функционализированных нанотел против GFP, имеющих общую модульную архитектуру, используястандартные методы молекулярного клонирования. Хотя текущее исследование сосредоточено на флуоресцентном варианте VHH-mCherry, мы также включили дополнительные дериватизированные нанотела, чтобы проиллюстрировать универсальность этого набора инструментов и подчеркнуть их потенциал для будущих применений. Наша самая простая конструкция, VHH-std (стандартная версия), включает в себя домен VHH, эпитопы T7 и HA для обнаружения антител, метку гексахистидина C-концевого (His6) для очистки и последовательность акцепторного пептида биотина (BAP) для обеспечения ферментативного биотинилирования и высокоаффинных анализов на основе стрептавидина (рисунок 1A). На основе этого ядра были разработаны различные производные нанотел для облегчения изучения эндоцитарного и ретроградного транспорта с помощью биохимического анализа, визуализации фиксированных и живых клеток, а также электронной микроскопии.

Для визуализации эндоцитарного транспорта на живых клетках мы разработали флуоресцентное нанотело против GFP, включающее флуорофор со спектрами возбуждения и излучения, отличными от спектров GFP, тем самым обеспечивая оптимальное спектральное разделение во время флуоресцентной микроскопии. Основываясь на его превосходных свойствах сворачивания в индуцированной IPTG E. coli и хорошо охарактеризованных фотофизических свойствах, мы выбрали mCherry в качестве флуоресцентной метки. Другие флуорофоры с красным смещением, такие как мономерный красный флуоресцентный белок (mRFP), также были бы подходящими альтернативами в принципе, но mCherry оказался особенно надежным и эффективным в этой системе.

Каков потенциал других функционализированных нанотел, кроме VHH-mCherry? Для исследования переноса белка с плазматической мембраны в транс-Гольджи сеть (TGN) мы использовали компартмент-специфичную локализацию TPST, которые находятся исключительно в TGN и транс-Гольджи цистернах. С этой целью мы модифицировали VHH-std тандемным мотивом сульфатации тирозина (2xTS), полученным из прохолецистокинина29 крысы, что позволило биохимически считывать информацию о прибытии груза в эти отсеки. В то время как слияние VHH-std с mCherry позволяет напрямую визуализировать ретроградный транспорт с помощью фиксированной визуализации или визуализации живых клеток, функционализация с пероксидазами, такими как APEX230 , позволяет осуществлять ультраструктурную локализацию с помощью электронной микроскопии, таргетной цитохимической абляции или биотинилирования на основе близости. Кроме того, включение сайта расщепления протеазы вируса травления табака (TEV) в каркас нанотел обеспечивает биохимические средства для различения интернализованных и поверхностно связанных нанотел (рис. 1A). Ранее мы использовали конструкцию VHH-tev для мониторинга кинетики переработки связанных с нанотелами EGFP-CDMPR и TfR-EGFP17. Повторное появление рецепторов, меченных нанотелами, на поверхности клетки может быть легко обнаружено путем применения рекомбинантной протеазы TEV внеклеточно, что приводит к специфической потере С-концевой эпитопной кассеты нанотела. Аналогичным образом, включение сайта расщепления TEV в представленное здесь нанотело VHH-mCherry с функционализацией mCherry позволяет динамически оценивать рециркуляцию репортера EGFP с помощью визуализации живых клеток. Функционализация с помощью альтернативных белковых доменов, таких как дополнительные флуорофоры, ферментативные метки или последовательные мотивы для посттрансляционной модификации, может быть легко осуществлена путем субклонирования желаемых вставок в опор VHH-std с помощью сайтов рестрикции SpeI и EcoRI. Все функционализированные конструкции нанотел против GFP, использованные в оригинальном исследовании17 , были депонированы вместе с Addgene для публичного распространения.

Используя описанный выше протокол, все варианты нанотел, проиллюстрированные здесь, были очищены до высокого выхода и чистоты (рис. 1B). Только при слиянии mCherry наблюдалось незначительное протеолитическое клиппинг белковых доменов после очистки (рис. 1B, дорожка 5). Два наблюдаемых продукта деградации, скорее всего, соответствуют отдельным доменам VHH и mCherry, что выведено из их видимой молекулярной массы и подтверждено эпитоп-специфическим иммуноблоттингом (рис. 1C). В отсутствие коэкспрессированного BirA, VHH-mCherry обычно восстанавливается при выходе около 20 мг на препарат. Основываясь на нашем опыте, совместная экспрессия BirA последовательно снижает выход нанотела примерно на 1/3-1 /2. Биотинилирование было достаточно полным, поскольку нанотела из смеси 1:1 с БСА были полностью восстановлены стрептавидин-агарозой (рис. 1D).

Чтобы оценить пригодность этого набора нанотел для изучения эндоцитарного транспорта, мы создали стабильные клеточные линии HeLa, экспрессирующие помеченные EGFP поверхностные рецепторные белки с четкими внутриклеточными путями транспортировки. К ним относятся TfR, который циркулирует между плазматической мембраной и ранними (сортировка и рециркуляция) эндосомами; TGN46, который перемещается между плазматической мембраной и TGN посредством ранних эндосом; и оба МПР, которые курсируют между TGN, плазматической мембраной и ранними и поздними эндосомами17. EGFP был присоединен к внеклеточному домену каждого рецептора - в частности, вставлен между сигнальным пептидом и последовательностью рецептора для CDMPR, CIMPR и TGN46 - и к С-концу TfR. Такая конструкция сохранила нативные цитоплазматические домены, гарантируя, что все известные сигналы сортировки останутся нетронутыми, а метка EGFP будет доступна для связывания внеклеточными нанотелами против GFP (рис. 1E). Для CIMPR, чей внеклеточный домен необычно велик, была использована усеченная версия, что согласуется с предыдущими исследованиями, демонстрирующими, что такое усечение сохраняет нормальное транспортное поведение31,32.

Стабильные клеточные линии были созданы с помощью ретровирусной трансдукции с последующей флуоресцентно-активируемой сортировкой клеток (FACS) для выделения однородных клеточных популяций с умеренными и сопоставимыми уровнями экспрессии. Следует отметить, что EGFP-CDMPR последовательно проявлялся в виде двойной полосы в иммуноблотах, аналогично его эндогенному аналогу33, что указывает на гетерогенное гликозилирование. Чтобы оценить, повторяют ли гибридные белки EGFP устойчивую локализацию и паттерны экспрессии эндогенных белков, стабильно экспрессирующие клетки были совместно культивированы с родительскими клетками HeLa и проанализированы с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии (рис. 2B). Сигнал EGFP точно отражал распределение соответствующих эндогенных белков. Как и ожидалось, CDMPR, CIMPR и их EGFP-меченые версии локализовались преимущественно в перинуклеарной области, отражая TGN и поздние эндосомальные компартменты, с дополнительной маркировкой в периферических эндосомах. Как эндогенные, так и меченые EGFP TGN46 были обнаружены почти исключительно в перинуклеарных TGN, в то время как TfR и TfR-EGFP продемонстрировали характерное раннее распределение эндосом, с заметной периферической сортировкой и перинуклеарной рециркуляцией эндосом. Несмотря на то, что используемые антитела обнаруживали как эндогенную, так и меченую EGFP формы (за исключением CIMPR), общая интенсивность окрашивания не была заметно увеличена в клетках, экспрессирующих гибридные белки, что позволяет предположить, что конструкции EGFP не были существенно сверхэкспрессированы. Мы включили EGFP-TGN46 и EGFP-CIMPR на рисунок 2B для прямого сравнения с EGFP-CDMPR и TfR-EGFP. Протоколы, используемые для фиксации клеток и визуализации флуоресцентной микроскопии, изложены в предыдущих исследованиях17,19.

С помощью VHH-mCherry можно контролировать эндоцитарный транспорт репортерных белков, меченных EGFP, с помощью визуализации живых клеток. Для этого мы использовали в качестве примеров клетки, экспрессирующие EGFP-CDMPR и TfR-EGFP. Клетки визуализировались с помощью инвертированного широкопольного флуоресцентного микроскопа после добавления VHH-mCherry в среду (видео 1 и видео 2). Неподвижные изображения в различные моменты времени показаны на рисунке 3. Поглощение количественно определяли путем измерения сигнала в канале mCherry, вычитания фона автофлуоресценции и нормализации к сигналу EGFP для устранения колебаний из-за движения помеченных отсеков или потенциальных небольших сдвигов в фокальной плоскости. Флуоресценция VHH-mCherry в среде при 25 нМ была пренебрежимо мала и не мешала измерениям. Анализ переноса репортеров с поверхности клетки на их внутриклеточные компартменты, в стационарное распределение, дал те же кинетические результаты, что и биохимические эксперименты, показанные на рисунке 2 предыдущей публикации17, с очевидным периодом полувыведения поглощения ~9 мин для EGFP-CDMPR и ~4 мин для TfR-EGFP, и насыщением через ~43 мин и ~20 мин. соответственно. Эти значения были сопоставимы со значениями, полученными в экспериментах по биохимическому поглощению с использованием иммуноблоттинга17. В принципе, кинетика ретроградного транспорта в представляющие интерес субклеточные области, такие как перинуклеарная область с наибольшей концентрацией МПР, также может быть проанализирована. Тем не менее, перинуклеарная область содержит не только Гольджи/TGN, но также обогащена поздними эндосомами и рециркулирующими эндосомами. Кинетика поглощения нанотел в перинуклеарной области недостаточно специфична для анализа ретроградного транспорта к определенной органелле. Для более надежной оценки транспорта от плазматической мембраны к TGN другой флуоресцентный белок, TGN-резидентный трансмембранный белок, должен стабильно коэкспрессироваться вместе с репортерным белком GFP таким образом, чтобы не было спектрального перекрытия свойств флуорофора. Использование этого дополнительного маркера позволяет обнаруживать импортируемый репортером VHH-mCherry, аналогичный сульфатированию тирозина, опосредованному TPSTs, как было задокументировано ранее19.

figure-results-1
Рисунок 1: Разработка и производство дериватизированных нанотел для отслеживания EGFP-меченых белков клеточной поверхности. (A) Схематический обзор дериватизированных нанотел. Стандартная конструкция нанотела включает в себя GFP-специфичный домен VHH, метки эпитопов T7 и HA, пептид акцептора биотина (BAP) и С-концевую гексахистидиновую метку (His6) для очистки. Дополнительные варианты нанотел включают модификации с тандемными сайтами сульфатации тирозина (2xTS), сконструированной пероксидазой APEX2 или флуоресцентным белком mCherry. Масштабная линейка показывает длину аминокислоты (aa). (B) Бактериально экспрессированные и аффинно-очищенные нанотела (20-50 мкг) были проанализированы с помощью градиента SDS-PAGE и визуализированы с помощью окрашивания Кумасси. Стандарты молекулярной массы (в кДа) указаны слева. Незначительное протеолитическое клипирование наблюдалось только для VHH-mCherry, вероятно, происходившее между доменами VHH и mCherry. (C) Иммуноблоттинг-анализ препаратов нанотел (10 нг) с использованием антител, направленных против эпитопов T7, HA или His6 , или обнаруженных с помощью стрептавидина-HRP (SA-HRP) для оценки биотинилирования. (D) Степень биотинилирования нанотел оценивали путем инкубации нанотел в соотношении 1:1 с БСА с последующим вытягиванием стрептавидин-агарозы, гранулированием и промывкой гранул. Равные объемы надосадочной жидкости (S) и связанного бисером материала (B) были впоследствии проанализированы с помощью SDS-PAGE и окрашивания Кумасси. Количественное восстановление нанотела в фракции, связанной с гранулами, указывает на полное биотинилирование. Присутствие фрагментов VHH и mCherry в связанной фракции предполагает частичную деградацию, вероятно, происходящую во время подготовки образцов для анализа SDS-PAGE. Белая линия между полосами 2 и 3 указывает на удаление двух несвязанных полос. Эта цифра была изменена с17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-2
Рисунок 2: Экспрессия и внутриклеточная локализация флуоресцентно меченных EGFP-меченых рецепторов груза. (A) Схематическое изображение конструкций слияния EGFP. Последовательности, полученные из секреторных трансмембранных белков, изображены черным цветом, а N-концевые сигнальные пептиды и внутренние трансмембранные домены выделены желтым. Группа EGFP показана зеленым цветом. Полноразмерные конструкции были сгенерированы для CDMPR, TfR и TGN46, в то время как хорошо охарактеризованный усеченный вариант был использован для CIMPR для сохранения нормального поведения при транспортировке. Масштабная линейка показывает длину аминокислоты (aa). EGFP-CDMPR и TfR-EGFP были описаны ранее17. (B) Для оценки субклеточной локализации клетки HeLa, стабильно экспрессирующие гибридные белки EGFP, культивировали совместно с родительскими клетками HeLa и анализировали с помощью флуоресцентной микроскопии. Масштабная линейка представляет 10 мкм. (C) Клетки HeLa, стабильно экспрессирующие меченые EGFP репортерные белки, лизировали, а белковые экстракты подвергали воздействию SDS-PAGE с последующим иммуноблоттингом с использованием антител против GFP и актина. Маркеры молекулярной массы (в кДа) указаны справа. Эта цифра была изменена с17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-3
Рисунок 3: Визуализация кинетики эндоцитарного захвата нанотел на живых клетках, опосредованная EGFP-CDMPR и TfR-EGFP. Визуализацию живых клеток проводили после добавления 25 нМ VHH-mCherry к клеткам HeLa, стабильно экспрессирующим (A) EGFP-CDMPR или (B) TfR-EGFP в полной среде без фенола красного цвета при 37 °C. Клетки визуализировали в каналах GFP и mCherry с помощью полуавтоматического широкопольного флуоресцентного микроскопа с интервалом 36 с. Ниже показаны репрезентативные объединенные неподвижные изображения, сопровождаемые увеличенными изображениями перинуклеарной области (увеличение: 2,2x) в отдельных каналах. (Масштабные линейки, 10 мкм.) Смотрите также Видео 1 и Видео 2. Количественный анализ кинетики захвата нанотел в (C) EGFP-CDMPR и (D) TfR-EGFP был проведен с использованием данных трех независимых экспериментов, каждый из которых захватывал около 40 отдельных клеток. Чтобы учесть движение органелл и вариабельность фокальной плоскости, интенсивность флуоресценции mCherry была нормализована (норма) по сигналу GFP и построена в виде среднего значения SD ± всех клетках из трех экспериментов. Средний максимальный сигнал поглощения нормализован до 1. Кинетика поглощения для каждой ячейки была индивидуально подобрана с использованием кинетической модели первого порядка. Построенные линии представляют собой усредненные кривые, полученные из среднего значения соответствующих констант скорости. Эта цифра была изменена с17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Видео 1: Визуализация поглощения mCherry-nanobody живыми клетками с помощью EGFP-CDMPR. Клетки HeLa, стабильно экспрессирующие EGFP-CDMPR, инкубировали при 37 °C в полной среде, содержащей 25 нМ VHH-mCherry, и визуализировали в флуоресцентных каналах EGFP и mCherry с интервалом 36 с. Рендеринг фильма был выполнен со скоростью воспроизведения 5 кадров/с, что соответствует сжатию в реальном времени 3 мин/с. Этот фильм был модифицирован из17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Видео 2: Визуализация поглощения mCherry-nanobody с помощью TfR-EGFP на живых клетках. Клетки HeLa, стабильно экспрессирующие TfR-EGFP, инкубировали при 37 °C в полной среде с добавлением 25 нМ VHH-mCherry и визуализировали для флуоресценции EGFP и mCherry с интервалом 36 с. Рендеринг фильма был выполнен со скоростью 5 кадров/с, что соответствует скорости покадровой съемки 3 мин/с. Этот фильм был изменен с17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нанотела представляют собой быстро развивающийся класс белок-связывающих скаффолдов, которые имеют множество преимуществ по сравнению с обычными антителами: они малы, очень стабильны, мономерны, не сшиваются, не имеют дисульфидных связей и могут быть выбраны для высокоаффинного связывания24. В нашем предыдущем исследовании мы разработали и применили функционализированные нанотела, полученные в результате бактериальной экспрессии, для маркировки поверхностно экспонированных белков и мониторинга их внутриклеточного транспорта в различные компартменты, уделяя особое внимание ретроградному транспорту в транс-сеть Гольджи (TGN)17. Мы использовали нанотело против GFP для обеспечения универсальности, что позволяет нацеливаться на гибридные белки, помеченные внеклеточными GFP, YFP или mCerulean — флуоресцентными метками, которые широко доступны и часто уже охарактеризованы. Функционализация нанотела, анти-GFP с мотивами mCherry, APEX2 или тирозинового сульфатирования, позволила нам визуализировать поглощение груза с помощью фиксированной визуализации и визуализации живых клеток, локализовать ретроградные транспортные компартменты на ультраструктурном уровне, выполнить целевую абляцию компартмента и количественно оценить кинетику переноса в TGN. Одним из ограничений этого подхода является предпосылка генетической модификации целевых клеточных линий — либо путем стабильной сверхэкспрессии, либо эндогенного мечения — до того, как можно будет эффективно использовать функционализированные нанотела, анти-GFP. Тем не менее, эта стратегия может быть легко адаптирована к растущему репертуару нанотел, направленных против немеченых, эндогенных белков-мишеней, полученных путем иммунизации животных или отбора in vitro из синтетических библиотек VHH сиспользованием технологий рибосомы или фагового дисплея. Кроме того, в последние годы были разработаны нанотела, нацеленные на широко используемые эпитопные метки, такие как mCherry, V5 или ALFA 35,36,37. В частности, недавно мы использовали сульфатионно-компетентное нанотело анти-mCherry для исследования ретроградного трафика CDMPR в истощенных GGA2 клетках HeLa посредством быстрой функциональной инактивации28. Маленькие эпитопные метки имеют преимущество в сохранении нативной конформации и функции целевого белка, поскольку они с меньшей вероятностью будут мешать критическим структурным доменам. Нанотела, распознающие эти компактные эпитопы (например, ALFA, V5), могут быть бесшовно интегрированы в инструментарий функционального нанотела, чтобы расширить его полезность в изучении эндоцитарных и ретроградных механизмов транспорта.

В настоящем исследовании мы демонстрируем применение VHH-mCherry в экспериментах по визуализации живых клеток. Используя EGFP-CDMPR и TfR-EGFP в качестве репортерных белков, мы смогли визуализировать рецептор-специфическое поглощение эндоцитов и их прогрессирование в направлении стационарного распределения. Количественный анализ перемещения этих репортеров из плазматической мембраны в соответствующие внутриклеточные компартменты выявил кинетику, согласующуюся с кинетикой, полученной с помощью биохимических анализов, представленных на рисунке 2 предыдущего исследования17. Мы обнаружили, что кажущийся период полувыведения был значительно дольше для EGFP-CDMPR (~9 мин), чем для TfR-EGFP (~4 мин), при этом сигналы насыщались примерно через 43 мин и 20 мин соответственно. Эти количественные результаты хорошо согласуются с ранее опубликованными данными о динамике трафика MPR и TfR 38,39,40. Примечательно, что конструкция VHH-mCherry привлекла значительное внимание со стороны исследовательского сообщества, о чем свидетельствуют многочисленные запросы на распространение Addgene, и уже была успешно реализована в нескольких независимых исследованиях 28,41,42,43,44.

В зависимости от конфигурации микроскопа или экспериментальных требований, нанотела анти-GFP с меткой mCherry не всегда могут быть оптимальными. В таких случаях альтернативные флуорофоры или варианты флуоресцентных белков могут обеспечить более подходящие спектральные свойства при использовании в сочетании с репортерными клеточными линиями GFP. Чтобы решить эту проблему, мы создали библиотеку функционализированных нанотел, включающую широкий спектр флуоресцентных белков, включая mTagBFP2, mNeptune2.5, mCardinal2, TagRFP657 и iRFP670 (243764-68). Эти дополнительные конструкции нанотел будут доступны через Addgene. Использование спектрально различных флуорофоров обеспечивает четкое разделение сигналов возбуждения и излучения, тем самым способствуя оптимальному изображению в реальном времени до трех флуоресцентных каналов в реальном времени с минимальным спектральным перекрытием.

В то время как мониторинг поглощения эндоцитов до устойчивого состояния может показаться простым, отслеживание ретроградного транспорта белков в TGN представляет собой более сложную экспериментальную задачу. В дополнение к VHH-mCherry и репортерному белку, меченному GFP, для визуализации и количественного определения требуется дополнительный флуоресцентный или конъюгируемый с красителем резидентный маркер TGN. Тем не менее, некоторые резидентные белки Гольджи демонстрируют частичную утечку на поверхность клетки, которая может еще больше усугубляться нарушениями внутриклеточных путей транспорта, такими как те, которые возникают при экспериментальных манипуляциях с компонентами транспортных механизмов. TGN46, например, обычно используется в качестве резидентного маркера Гольджи, несмотря на его функциональную роль в качестве грузового рецептора, опосредующего транспорт TGN к поверхности клеток определенных секреторных грузов 16,45. Аналогичным образом, гликозилтрансферазы, такие как β-1,4-галактозилтрансфераза, также были обнаружены на плазматической мембране41. Хотя эти белки могут циклически перемещаться на поверхность, их преобладающая стационарная локализация остается в пределах TGN. Маркировка таких маркеров спектрально отличным флуоресцентным белком или меткой, совместимой с красителем (например, SNAP, Halo и т.д.) и стабильная коэкспрессия их с помощью трансмембранного репортера, помеченного GFP, позволит получить количественную визуализацию прибытия TGN в живых клетках. Это можно измерить по аналогии с описанным выше рабочим процессом, с количественной оценкой на основе накопления сигнала mCherry в канале флуоресценции, соответствующем гибридному белку Гольджи. Современные стратегии исследования ретроградного транспорта в неподвижных или живых клетках часто опираются на конструкции химерных рецепторов в сочетании с антителами IgG (например, CD8)46,47. Тем не менее, неотъемлемый риск сшивки из-за бивалентности обычных IgG во время поверхностного мечения может значительно изменить внутриклеточную судьбу меченого белка, часто перенаправляя его в сторону лизосомальной деградации после эндоцитоза48,49. Напротив, нанотела, благодаря своей моновалентной природе и стехиометрии с связыванием 1:1, не индуцируют сшивку, тем самым сохраняя физиологические пути транспортировки белка-мишени. Это делает подходы, основанные на нанотелах, особенно ценными для изучения аутентичной динамики ретроградного транспорта без введения искусственных артефактов маршрутизации.

Оптимальная производительность этого протокола для визуализации живых клеток требует тщательного титрования концентрации нанотел, так как чрезмерное количество приводит к повышению фоновой флуоресценции от несвязанного нанотела в среде. Кроме того, различия в уровнях экспрессии репортерных клеточных линий GFP должны быть учтены во время титрования для обеспечения точного количественного сравнения. Для производства нанотел низкотемпературная индукция в E. coli имеет решающее значение для обеспечения правильного сворачивания домена mCherry. Более высокие температуры индукции обычно приводят к неправильному сворачиванию или разложению белка и поэтому не рекомендуются.

Успех этого протокола в решающей степени зависит от трех ключевых аспектов: во-первых, высокой экспрессии и чистоты функциональных конструкций нанотел для обеспечения последовательной маркировки и минимального фона; во-вторых, использование хорошо охарактеризованных клеточных линий, стабильно экспрессирующих GFP-меченые репортерные белки с локализацией на клеточной поверхности для повторения физиологических путей транспортировки; и, в-третьих, оптимальное обращение и конфигурация установки флуоресцентной микроскопии, включая параметры визуализации и спектральное разделение, для обеспечения точного количественного и качественного анализа динамики грузовых перевозок.

Представленный здесь метод и протокол, основанные на использовании меченых mCherry нанотел анти-GFP, позволяют как количественно, так и качественно отслеживать грузовые белки от поверхности клетки до эндоцитарных компартментов в культивируемых клетках млекопитающих. При совместной экспрессии с флуоресцентно меченным резидентным маркером Гольджи этот подход позволяет в дальнейшем анализировать пути ретроградного переноса. Таким образом, этот инструмент обеспечивает мощную стратегию мониторинга внутриклеточного трафика трансмембранных белков и рецепторов клеточной поверхности, которые ранее были недоступны для мечения из-за отсутствия специфических лигандов или совместимых мономерных связывающих реагентов.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана Базельским университетом. Мы благодарим их профессора. Д-ру Мартину Шписсу за создание и верстку рисунков, Imaging Core Facility (IMCF) биоцентра за поддержку и PNAS за разрешение на перепечатку.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Антитела к GFP Сигма-Олдрич118144600001Продукция распространяется компанией Sigma-Aldrich, но производит Roche
100-мм антенны для культивирования клетокTPPTPP93100
Антиактиновый антителоEMD Millipore MAB1501
Антиантитела к HAиз лабораторииизготовлен из гибридомы 12CA5
Антитело Anti-His6Bethyl Laboratories A190-114A
Антитела к Т7 Bethyl Laboratories A190-117A
BL21(DE3) Компетентный E. coliКЛЮВC2527H
Хлорид кальция дигидратМерк Миллипор102382растворённый в стерильной воде, запас 1 м
Соль карбенициллина динатрияАппликацияA1491растворённый в стерильной воде, бульон — 100 мг/мл
Coomassie-R (Блестящий синий)Сигма-ОлдричB-0149
D-биотинСигма-ОлдричB4501растворяется в стерильных 500 мМ2PO4 или DMSO.
Одноразовые колонки для обезсоли PD10GE HealthcareGE17-0851-01
DMEM GlutaMAX-IТермо Фишер Сайентифик61965026
DMEM, высокий уровень глюкозы, нет глутамина, нет фенол-красногоТермо Фишер Сайентифик31053028
DNase IАппликацияA3778растворённые в стерильной воде
Дульбекко Фосфорный буферный физиологический раствор (DPBS) без Ca2+/Mg2+Сигма-ОлдричD8537
Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS)Термо Фишер СайентификA5256701
Filtropur S, PES, Porengrö ß e: 0,45 и микро; mСарштедт83.1826
Трансфекционный реагент FuGENE HDPromega E2311
Стеклянные накладки (No 1.5H)VWR631-0153
Козла против мышей HRPСигма-ОлдричA-0168
Козлая противокроличья HRPСигма-ОлдричA-0545
Его буферный наборCytvia11003400
Его колонки GraviTrapCytvia11003399
ibidi µ-Slide 4 well, ibiTreat80426-IBIibidi
Изопропил-&бета;-D-тиогалактопиранозид (IPTG)АппликацияA1008растворённый в стерильной воде, запас 1 м
КанамицинсульфатАппликацияA1493растворённый в стерильной воде, бульон — 100 мг/мл
L-глутаминАппликацияA3704
Лизозим Сигма-Олдрич18037059001Продукция распространяется компанией Sigma-Aldrich, но производит Roche
Гексагидрат хлорида магнияМерк Миллипор105833растворённый в стерильной воде, запас 1 м
Гели Mini-Protean TGX, 4-20%, 15-колодцыБио-Рад4561096
Модифицированный HeLa Kyotoиз лаборатории
NEB5-alpha Competent E. coliКЛЮВC2987U
NucleoBond Xtra Midi Plus, 10 подготовокMacherey-Nagel 740412.1
Пенициллин/стрептомицинBioconcept 4-01F00-H
Фенилметилсульфонилфторид (ПМСФ)АппликацияA0999.0025растворён в 40% ДМСО 60% изопропанола, запас в 500 мМ
Амфоклеточная линия ФениксаЛаборатория Нолана
Полибрен (гексадиметриновый бромид)Сигма-ОлдричH9268
ПуромицинInvivogenant-pr-1
Хлорид натрия  Мерк Миллипор106404растворённый в стерильной воде, запас — 5 м
Пируват натрия Термо Фишер Сайентифик11360039
Trans-Blot Turbo Pack, миниБио-Рад1704158
ТриптонАппликацияA1553
Экстракт дрожжей АппликацияA1552

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Johannes, L., Popoff, V. Tracing the retrograde route in protein trafficking. Cell. 135 (7), 1175-1187 (2008).
  2. Bonifacino, J. S., Rojas, R. Retrograde transport from endosomes to the trans-Golgi network. Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (8), 568-579 (2006).
  3. Boucrot, E., et al. Endophilin marks and controls a clathrin-independent endocytic pathway. Nature. 517 (7535), 460-465 (2015).
  4. Renard, H. F., et al. Endophilin-A2 functions in membrane scission in clathrin-independent endocytosis. Nature. 517 (7535), 493-496 (2015).
  5. Rioux, D. J., Prosser, D. C. A CIE change in our understanding of endocytic mechanisms. Front Cell Dev Biol. 11, 1334798(2023).
  6. Duncan, J. R., Kornfeld, S. Intracellular movement of two mannose 6-phosphate receptors: return to the Golgi apparatus. J Cell Biol. 106 (3), 617-628 (1988).
  7. Ghosh, P., Dahms, N. M., Kornfeld, S. Mannose 6-phosphate receptors: new twists in the tale. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (3), 202-212 (2003).
  8. Doray, B., Ghosh, P., Griffith, J., Geuze, H. J., Kornfeld, S. Cooperation of GGAs and AP-1 in packaging MPRs at the trans-Golgi network. Science. 297 (5587), 1700-1703 (2002).
  9. Yu, J., et al. WLS retrograde transport to the endoplasmic reticulum during Wnt secretion. Dev Cell. 29 (3), 277-291 (2014).
  10. Harterink, M., et al. A SNX3-dependent retromer pathway mediates retrograde transport of the Wnt sorting receptor Wntless and is required for Wnt secretion. Nat Cell Biol. 13 (8), 914-923 (2011).
  11. Port, F., et al. Wingless secretion promotes and requires retromer-dependent cycling of Wntless. Nat Cell Biol. 10 (2), 178-185 (2008).
  12. McGough, I. J., et al. SNX3-retromer requires an evolutionary conserved MON2:DOPEY2:ATP9A complex to mediate Wntless sorting and Wnt secretion. Nat Commun. 9 (1), 3737(2018).
  13. Banting, G., Ponnambalam, S. TGN38 and its orthologues: roles in post-TGN vesicle formation and maintenance of TGN morphology. Biochim Biophys Acta. 1355 (3), 209-217 (1997).
  14. Banting, G., Maile, R., Roquemore, E. P. The steady state distribution of humTGN46 is not significantly altered in cells defective in clathrin-mediated endocytosis. J Cell Sci. 111 (Pt 23), 3451-3458 (1998).
  15. Ponnambalam, S., Rabouille, C., Luzio, J. P., Nilsson, T., Warren, G. The TGN38 glycoprotein contains two non-overlapping signals that mediate localization to the trans-Golgi network. J Cell Biol. 125 (2), 253-268 (1994).
  16. Lujan, P., et al. Sorting of secretory proteins at the trans-Golgi network by human TGN46. Elife. 12, 91708(2024).
  17. Buser, D. P., Schleicher, K. D., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. A versatile nanobody-based toolkit to analyze retrograde transport from the cell surface. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (27), E6227-E6236 (2018).
  18. Buser, D. P., Spang, A. Protein sorting from endosomes to the TGN. Front Cell Dev Biol. 11, 1140605(2023).
  19. Buser, D. P., Spiess, M. Analysis of Endocytic Uptake and Retrograde Transport to the Trans-Golgi Network Using Functionalized Nanobodies in Cultured Cells. J Vis Exp. (144), e59111(2019).
  20. Snider, M. D., Rogers, O. C. Intracellular movement of cell surface receptors after endocytosis: resialylation of asialo-transferrin receptor in human erythroleukemia cells. J Cell Biol. 100 (3), 826-834 (1985).
  21. Shi, G., et al. SNAP-tag based proteomics approach for the study of the retrograde route. Traffic. 13 (7), 914-925 (2012).
  22. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363 (6428), 446-448 (1993).
  23. Greenberg, A. S., et al. A new antigen receptor gene family that undergoes rearrangement and extensive somatic diversification in sharks. Nature. 374 (6518), 168-173 (1995).
  24. Schnider, S. T., Vigano, M. A., Affolter, M., Aguilar, G. Functionalized Protein Binders in Developmental Biology. Annu Rev Cell Dev Biol. 40 (1), 119-142 (2024).
  25. Huttner, W. B. Tyrosine sulfation and the secretory pathway. Annu Rev Physiol. 50, 363-376 (1988).
  26. Baeuerle, P. A., Huttner, W. B. Tyrosine sulfation is a trans-Golgi-specific protein modification. J Cell Biol. 105 (6 Pt 1), 2655-2664 (1987).
  27. Stone, M. J., Chuang, S., Hou, X., Shoham, M., Zhu, J. Z. Tyrosine sulfation: an increasingly recognised post-translational modification of secreted proteins. New Biotech. 25 (5), 299-317 (2009).
  28. Buser, D. P., Bader, G., Spiess, M. Retrograde transport of CDMPR depends on several machineries as analyzed by sulfatable nanobodies. Life Sci Allianc. 5 (7), 202101269(2022).
  29. Leitinger, B., Brown, J. L., Spiess, M. Tagging secretory and membrane proteins with a tyrosine sulfation site. Tyrosine sulfation precedes galactosylation and sialylation in COS-7 cells. J Biol Chem. 269 (11), 8115-8121 (1994).
  30. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Meth. 12 (1), 51-54 (2015).
  31. Waguri, S., et al. Visualization of TGN to endosome trafficking through fluorescently labeled MPR and AP-1 in living cells. Mol Biol Cell. 14 (1), 142-155 (2003).
  32. Anitei, M., et al. A high-throughput siRNA screen identifies genes that regulate mannose 6-phosphate receptor trafficking. J Cell Sci. 127 (Pt 23), 5079-5092 (2014).
  33. Hoflack, B., Kornfeld, S. Purification and characterization of a cation-dependent mannose 6-phosphate receptor from murine P388D1 macrophages and bovine liver. J Biol Chem. 260 (22), 12008-12014 (1985).
  34. Fridy, P. C., et al. A robust pipeline for rapid production of versatile nanobody repertoires. Nat Meth. 11 (12), 1253-1260 (2014).
  35. Götzke, H., et al. The ALFA-tag is a highly versatile tool for nanobody-based bioscience applications. Nat Commun. 10 (1), 4403(2019).
  36. Zeghal, M., et al. Development of a V5-tag-directed nanobody and its implementation as an intracellular biosensor of GPCR signaling. J Biol Chem. 299 (9), 105107(2023).
  37. Katoh, Y., et al. Overall Architecture of the Intraflagellar Transport (IFT)-B Complex Containing Cluap1/IFT38 as an Essential Component of the IFT-B Peripheral Subcomplex. J Biol Chem. 291 (21), 10962-10975 (2016).
  38. Hirschmann, D. T., Kasper, C. A., Spiess, M. Quantitative analysis of transferrin cycling by automated fluorescence microscopy. Methods Mol Biol. 1270, 365-378 (2015).
  39. Ciechanover, A., Schwartz, A. L., Dautry-Varsat, A., Lodish, H. F. Kinetics of internalization and recycling of transferrin and the transferrin receptor in a human hepatoma cell line. Effect of lysosomotropic agents. J Biol Chem. 258 (16), 9681-9689 (1983).
  40. Hirst, J., Futter, C. E., Hopkins, C. R. The kinetics of mannose 6-phosphate receptor trafficking in the endocytic pathway in HEp-2 cells: the receptor enters and rapidly leaves multivesicular endosomes without accumulating in a prelysosomal compartment. Mol Biol Cell. 9 (4), 809-816 (1998).
  41. Sun, X., Mahajan, D., Chen, B., Song, Z., Lu, L. A quantitative study of the Golgi retention of glycosyltransferases. J Cell Sci. 134 (20), 258564(2021).
  42. Pereira, C., et al. The exocyst complex is an essential component of the mammalian constitutive secretory pathway. J Cell Biol. 222 (5), 202205137(2023).
  43. Podinovskaia, M., Prescianotto-Baschong, C., Buser, D. P., Spang, A. A novel live-cell imaging assay reveals regulation of endosome maturation. Elife. 10, 70982(2021).
  44. Reck, J., Beuret, N., Demirci, E., Prescianotto-Baschong, C., Spiess, M. Small disulfide loops in peptide hormones mediate self-aggregation and secretory granule sorting. Life Sci Alliance. 5 (5), 202101279(2022).
  45. Wakana, Y., et al. A new class of carriers that transport selective cargo from the trans Golgi network to the cell surface. EMBO J. 31 (20), 3976-3990 (2012).
  46. Rawat, S., Sharma, M. CD8alpha-CI-M6PR Particle Motility Assay to Study the Retrograde Motion of CI-M6PR Receptors in Cultured Living Cells. Bio Protoc. 14 (9), e4979(2024).
  47. Breusegem, S. Y., Seaman, M. N. Image-based and biochemical assays to investigate endosomal protein sorting. Methods Enzymol. 534, 155-178 (2014).
  48. Niewoehner, J., et al. Increased brain penetration and potency of a therapeutic antibody using a monovalent molecular shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  49. Villasenor, R., Schilling, M., Sundaresan, J., Lutz, Y., Collin, L. Sorting Tubules Regulate Blood-Brain Barrier Transcytosis. Cell Rep. 21 (11), 3256-3270 (2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

EGFP

Похожие статьи