Этот протокол устанавливает объективное определение достаточности трансплантата на основе суточного выделения мочи и показателей панели функции почек в сыворотке, чтобы воспроизводимо и объективно определить, способен ли трансплантат самостоятельно поддерживать гомеостаз без зависимости от диализа в первые 7 дней после трансплантации.
Методическая статья
Стандартизированный протокол аутотрансплантации почки свинины для изучения задержки функции трансплантата
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Задержка функции трансплантата (ДГФ) обычно определяется как необходимость диализа в течение 7 дней после пересадки почки; Однако современные определения часто опираются на субъективное клиническое суждение и не имеют стандартизированных критериев, точно описывающих достаточность трансплантата. Это несоответствие мешает диагностике и сравнению исследований. Этот протокол устанавливает целевые пороги для DGF, используя количественные значения выхода мочи и функции почек в сыворотке для объективного описания достаточности трансплантата и самостоятельной способности поддерживать гомеостаз. Исследования на свиных моделях сложны из-за отсутствия единогласных диагностических точек для DGF и сложности длительного проведения диализа. Для решения этой проблемы мы вводим чётко определённый протокол для определения и индукции ДГФ при аутотрансплантации почки у свиной после 30 минут изолированной тёплой ишемии почек, имитируя донорство после кровооносной смерти (DCD), подобного забывания. Мы описываем неинвазивные методы катетеризации по методу Фолея, центрального венозного доступа и мониторинга артериальных линий у самок свиней, что позволяет точно измерять выделение мочи, проводить ежедневные анализы и проводить внутриоперационный мониторинг. Эти методы детализированы для обеспечения прозрачности и воспроизводимости, создавая стандартизированную конечную точку для исследований DGF у свиней, которая воспроизводит клинический фенотип.
Введение
Список ожидания на пересадку почки в США превышает 90 000 пациентов. Из-за нехватки трансплантата ежегодно проводится менее 30 000 пересадок почки, в то время как аналогичная группа новых пациентов добавила в списокожидания 1. Для решения этой усугубляющейся нехватки всё чаще выбирают почки с повреждением ДКД с неоптимальным ишемией. Фактически, с 2023 года 50% пересаженных почек в США поступают от доноров DCD. Почки DCD связаны с высокой частотой задержки функции трансплантата (DGF). DGF большинство определяет как требование диализа в течение 7 дней после пересадки почки. Хотя DGF является временной недостаточностью трансплантата, она связана с повышенной частотой раннего и позднего отторжения трансплантата, а также с более короткой медианной выживаемостью трансплантата — 8–12лет 2 года. Поскольку это в основном субъективное клиническое определение, DGF сложно изучать в моделях свиней из-за отсутствия объективного, стандартизированного определения и сложностей длительного диализа у свиней. В этой работе мы разработали объективный, стандартизированный протокол для определения достаточности трансплантата и индуцирования DGF при аутотрансплантации почки у свинины. Благодаря подтвержденным ксенотрансплантационным сходствам в функциях свиных и человеческих почек, этот протокол можно применить к пересадке почки. Для этой модели была выбрана аутотрансплантация почки свиньей с основной целью выделения эффекта ишемии-реперфузионного повреждения как переменного, контролирующего раннюю недостаточность трансплантата и нейтрализующего аллоиммунную или иммуносупрессионную токсичность как смешивающих факторы.
Определение функции отложенного транспланта: Чтобы преодолеть две основные задачи: 1) объективное определение достаточности трансплантата и 2) определение временного характера фенотипа при отсутствии поддержки диализа как мост к функциональному восстановлению трансплантата — мы использовали значения объективного выхода мочи и панели функции почек для определения заболевания. Стандартизация объемной реанимации, критериев аутотрансплантации, а также отсутствие анастомотического нарушения (артерии, вены или мочеточника) исключают постоянную анатомическую причину недостаточности трансплантата. Мы определили отсрочку функции трансплантата при аутотрансплантации свиней как: раннюю временную недостаточность трансплантата из-за продолжительной аурии (<100 мл/сутки) более 3 дней, приводящей к переменным уровням BUN, креатинина и калия до достижения гуманной конечной точки K≥ 8 мэкв/л (высокий риск сердечной аритмии и объективное признание для срочного/экстренного диализа) при отсутствии анастомотического нарушения .Исходя из этого определения, функциональный трансплантат производит достаточный выброс мочи для поддержания баланса электролитов и снижения BUN и креатинина. Напротив, недостаток трансплантата не производит достаточного количества мочи для выделения BUN и креатинина и вызывает угрожающую жизни гиперкалиемию, требующую диализа (или гуманной эвтаназии при её отсутствии) из-за обратимого повреждения паренхимальной ишемии-реперфузии, а не необратимого анастомотического нарушения или отторжения.
Протокол
Это исследование было одобрено Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Университета Дьюка (IACUC). В этой модели используются только для самок (для неинвазивного установки катетера Фолея) йоркширские свиньи весом 40-50 кг (для удобных диаметров почечных сосудов и уретрального остиального диаметра при канюляции). Этот протокол мог выполняться командой из четырёх сотрудников: хирургом, ассистентом, перфузиологом органов и руководителем исследования (для получения образцов, материалов и данных).
1. Послеоперационный день (POD) -1 (Выделение почки)
- Анестезия
- Предварительное лечение животных внутримышечными инъекциями кетамина (22 мг/кг) и мидазолама (0,5 мг/кг).
ПРИМЕЧАНИЕ: Начало с относительно более высокой дозы кетамина помогает безопасно снизить внутриоперационную потребность в изофуране. - Изофлуран сначала вводят через конус с мордой при температуре 1-1,5% (максимум 2,5%), пока челюсть и верхние дыхательные пути не расслабятся для интубации. Установите приливный объём на уровне 7-7,5 мл/кг и скорость вентиляции на 18-20 вдохов в минуту, чтобы поддерживать физиологический уровень насыщения кислородом и поддержаниеПКС 2. Аккуратно нанесите глазную мазь и/или заклейте веки скотчем для защиты от царапания или высыхания.
- Предварительное лечение животных внутримышечными инъекциями кетамина (22 мг/кг) и мидазолама (0,5 мг/кг).
- Прокладка центральной линии с туннелем
- Установите центральную трубку с единым просветом Хикмана, выходящую из кожи от спины свиньи, между лопатками, чтобы обеспечить безболезненное взятие проба крови по требованию, при этом позволяя им лежать на боку с минимальным стрессом и с низким риском повреждения катетера центральной линии (рисунок 1).
- После подготовки кожи с помощью скальпеля из 11 лопастей выполните три поверхностных кожных разреза через дерму к подкожному жировому слою, между лопатками, на затылке и в правой передней части шеи.
- Используйте тканевой туннель, чтобы создать подкожный туннель, соединяющий три разреза. Лежа на земле, продевайте катетер между лопатками к правой передней части шеи.
- Чтобы ввести центральный катетер в правую наружную яремную вену (EJ), поверните свинку в положение Тренделенбурга на лежачем и используйте иглу 18 G, чтобы аспирировать EJ с помощью техники анатомической триангуляции Флурни иМани 3. Протяните проволоку в просвет с помощью техникиСелдингера 4, используйте отслойной интродусер для расширения тракта, вставьте катетер Хикмана в люмен EJ и закрепите центральную катетерку на задней панели. После подтверждения возвращения крови заблокируйте линию гепарином и повторите послекаждого применения 5. Если доступ к правому ЭЖ затруднён, используйте тканевой туннель, чтобы удлинить подкожный туннель впереди трахеи и доставить катетер на левую сторону шеи для установки в левый EJ.
- Установите центральную трубку с единым просветом Хикмана, выходящую из кожи от спины свиньи, между лопатками, чтобы обеспечить безболезненное взятие проба крови по требованию, при этом позволяя им лежать на боку с минимальным стрессом и с низким риском повреждения катетера центральной линии (рисунок 1).
- Размещение фолея (три метода увеличения инвазивности при неудаче установки)
- Ручной подход
- Положите животное на операционный стол. Подготовьте кожу вокруг влагалищного свода бетадином и залийте вагинальный свод 10 мл бетадина (чтобы снизить микробную нагрузку и риск инфекций мочевыводящих путей).
ПРИМЕЧАНИЕ: Даже при полной надувании шары объёмом 5 мл обычно выскальзывают. - Введите катетер Фолея с смазанной формулой 12-14 Fr, который вручную ужесток проводом, нащупая отверстие уретры на глубине 4-5 см в отверстие на передней (вентральной) стенке влагалища.
- Положите животное на операционный стол. Подготовьте кожу вокруг влагалищного свода бетадином и залийте вагинальный свод 10 мл бетадина (чтобы снизить микробную нагрузку и риск инфекций мочевыводящих путей).
- Метод с зеркалом: Если ручной подход не помогает, используйте смазанное зеркало для визуализации уретрального отверстия внутри влагалища. Используйте длинные щипцы DeBakey со стерильной марлей, чтобы аккуратно высушить бетадин и ввести 12-14 Fr, 10 мл баллонного катетера Фолея с жёстким проводом или без неё под прямой визуализацией. Надувайте баллон только после проверки возврата мочи.
- Хирургический подход: если подход с зеркалом (шаг 1.3.2) тоже не сработает, хирургически введите катетер Фолея по проводу. После лапаротомии введите иглу 18 G в мочевой пузырь, введите проволоку длиной 0,035" примерно 1 м в уретру через мочевой пузырь, затем проведите катетер Фолея к мочевому пузырю и надуйте баллон. Вытяните провод через влагалище (чтобы избежать загрязнения брюшной полости) и закройте небольшое отверстие для иглы в мочевом пузыре с помощью однослойного 6-0 Prolene figure-of-8. Зашивайте тело Фолея и мешок для сбора мочи объемом 1 л к шкуре свиньи (рисунок 1).
- Ручной подход
- Препараты для преинцизии
- Введите первую из суточной дозы аспирина 81 мг внутрь в щечный мешок, затем антибиотик цефтиофура депо IM, 1 г цефазолина внутривенно через центральный катетер для профилактики SSI, IM бупренорфин (0,005-0,01 мг/кг) для контроля боли и начните в общей сложности 1 л сбалансированного электролитного раствора с постоянной скоростью инфузии 250 мл/ч.
2. Жизнеспособная аутотрансплантация почки у свиней DCD
- Закупка почек
- Подготовьте и накройте кожу живота. Проведите лапаротомию по средней линии от ксифа к лобковой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Есть 1-2 крупные вены, которые пересекают среднюю линию подкожно возле лобка, которые сильно кровоточат при разрезе, но легко контролируются электрокоагуляцией. - Установите ретрактор Bookwalter (или два ретрактора Balfour под углом 90°) с четырьмя лезвиями стенок тела, удерживающими обе стороны брюшной стенки вверх, чтобы предотвратить вытекание тонкой кишки из брюшной полости при последующем венозном и лимфатическом сжатии, а также отёке кишечника.
- Используя два тёплых хирургических полотенца, увлажнённых физиологическим раствором, чтобы убрать кишечник на левую сторону живота и заменить ретракторы над ними, чтобы аккуратно обнажить правую ретробрюшину, содержащую правую почку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторая степень положения Тренделенбурга (голова вниз) также может помочь при втягивании кишечника. - Откройте заднюю брюшину на латеральной стороне почки (чтобы не повредить правый мочеточник перед визуализацией). Рассеките правый мочеточник от задней брюшины и правой почечной артерии и разделите его между двумя шёлковыми связями 2-0 в нижнем полюсе правой почки. Оставьте более длинный шовный хвост на оставшем мочеточнике для удобства идентификации во время имплантации (через 24 часа). Оставьте оставшуюся часть мочеточника под его брюшной оболочкой, чтобы уменьшить рубцы и необходимость обширной вскрытия при второй операции по имплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не повредить две поясничные вены, которые соединяются с IVC непосредственно под отделением правой почечной артерии от аорты (специфическая для свиной анатомия, отличающаяся от человеческой ретробрюшинеальной анатомии). Перевязывание и разделение поясничных вен — тоже безопасный вариант. - Рассечьте почечную артерию от почечной вены и вдоль её движения под IVC до аортального происхождения, чтобы получить максимальную доступную длину артерии. Кратковременно сжать IVC и свернуть её к левому ретробрюшинуму, чтобы обнажить начало правой почечной артерии, проходящей под ней после её отхода от брюшной аорты.
ПРИМЕЧАНИЕ: У свиней обычно имеется 1-2 лимфатических узла, связанных с почечной артерией, которые её заслоняют; однако почечная артерия становится хорошо скелетизированной после вскрытия и удаления этих узлов. - Вскрытие правой почечной вены от правой надпочечницы краниально. Чтобы получить несколько миллиметров зазора между правой почечной веной и надпочечниковой железой, аккуратно поднимите заднюю брюшинную оболочку от правой почечной вены, пока не будут визуализированы более крупные вены, дренирующие надпочечники, входящие в ИВК.
- Для имитации процесса закупки DCD введите 500 U/кг гепарина через центральный катетер и дайте ему циркулировать 5 минут, затем дважды перевяжите почечную артерию и затем почечную вену в её месте начала (для максимальной длины) с помощью 2-0 шёлковых завязок или больше (3-0 шёлковых стяжк слишком тонкие и хрупкие для этой гибкой ткани и часто скользят) и запустите секундомер на 30 минут на месте Изолированное почечное тёплое ишемическое время. Во время тёплого ишемического периода используйте тенотомию, ножницы или электрокоагуляторию на месте разреза, чтобы скелетизировать и разделить почечную артерию и вену друг от друга для последующей облегчения имплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скелетизация сосудов in situ в тёплый ишемический период использует сосудистый контроль для предотвращения кровопотери при сосудистом повреждении, позволяя наполненным кровью сосуды выявлять мелкие сосудистые утечки, которые можно было бы восстановить через кровотечение из изолированного почечного кровообращения, привязанного для симуляции ишемического повреждения. - В конце тёплого ишемического периода разделите сосуды и мочеточник, канюлируйте почечную артерию прямой канюлей толщиной 3 мм и введите 250 мл ледяного раствора Университета Белзера в Висконсине через почечную артерию.
ПРИМЕЧАНИЕ: Прямая канюля диаметром 5 мм слишком большая и может привести к интимному повреждению и формированию закрылка. - Сохранять трансплантат с помощью гипотермической неоксигенной машинной перфузии в течение 24 часов. Промыть брюшную полость 1 литром сбалансированного электролита и закрыть фасцию непрерывными петлями 1-0 проленовыми петлями. Промыйте рану и закройте кожу скобами.
- Экстубировать свинку и вернуться в вольер, чтобы восстановиться после анестезии на 24 часа. Для контроля боли вводите Бупивакаин (дозировку по весу) подкожно в края раны и вводите внутривенно-интервентивный бупренорфин с продленным высвобождением (дозировка по весу).
ПРИМЕЧАНИЕ: Ацетаминофен также можно вводить без влияния на СКФ (в отличие от НПВС).
- Подготовьте и накройте кожу живота. Проведите лапаротомию по средней линии от ксифа к лобковой.
- Имплантация почки
ПРИМЕЧАНИЕ: Имплантация почки происходит внутрибрюшинно по модифицированному подходу Starzl: почечный имплантат непосредственно на брюшную аорту и IVC с анастомозом мочеточника-мочеточника6. Правая почка удаляется и вновь имплантируется в нижнем положении, перевернув правый ретробрюшиноум, по технике Симфоруша7. Время операции по установке имплантата составляет от 3 до 5 часов, а на шитьё — от 20 до 40 минут, в зависимости от уровня подготовки и сложности анатомии.- После 24 часов восстановления проведите предварительные лекарства, интубируйте, подготовьте и снова накройте живот свиньи в операционной (рисунок 2).
- Размещение артериальной линии (три метода в случае неудачи установки)
- Линия ушной артерии: Для контроля гемодинамики во время операции и управления реанимацией жидкости и прессора, особенно после реперфузии, чтобы поддержать животное при реперфузионном синдроме и не вызвать вторичную острую почечную травму (ОПП), разместите артериальную линию ангиокатов 22 G в ушной артерии через пальпацию пульса ушной артерии на задней стороне обоих ушей свиньи.
- Линия сонной артерии: если установка ушной артерии не удаётся, альтернативно создайте разрез в середине шеи до трахеи. Вскрытие соединительной ткани рядом с трахеей и втягивание с помощью Weitlaner или самоудерживающегося ретрактора Gelpi. После визуализации обведите сонную артерию шёлковой завязкой 2-0. Установите чрескожную линию 4 Fr Cordis с помощью техники Селдингера без необходимости расширения артерий. Завязывайте дистальный конец сонной артерии и оставляйте шёлковую завязку 2-0 для завязывания проксимального конца после удаления артериальной линии, после чего следует скобированное закрытие кожи.
- Линия бедренной артерии. В качестве альтернативы бедренную линию можно вставить чрекожно или срезать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бедренная линия временно выведет из строя во время зажатия аорты для артериального анастомоза во время имплантации.
- Размещение артериальной линии (три метода в случае неудачи установки)
- Препараты для преинцизии
- Введите вторую дозу суточной дозы антитромбоцитаров — аспирин 81 мг внутрь щечного мешочка, затем 1 г цефазолина внутривенно через центральный катетер для профилактики SSI, IM бупренорфин (0,005-0,01 мг/кг) для контроля боли, и начните в общей сложности 4 л сбалансированного электролитного раствора с постоянной скоростью инфузии 250 мл/ч.
- Начать постоянную нетитрируемую инфузию дофамина через центральный катетер при 2 мкг∙кг-1∙мин-1 и инфузию норадреналина, титрируемую до максимума 0,4 мкг∙кг-1∙мин-1 для целевого MAP 80-100 мм рт. ст.
ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость введения жидкости может быть временно увеличена до 1 л/ч или выше с помощью давления непосредственно перед реперфузией, чтобы обеспечить лучшую гемодинамическую поддержку, если гипотензия при синдроме реперфузии особенно сложна.
- Откройте брюшную полость, убрав кожные скобы и разрезав фасциальные швы, а затем снова введите ретрактор Bookwalter.
- Вскрытие нисходящего оболочья кишечной кишки с центральной линии, лежащей над аортой и IVC (у свиней нисходящая кишка прикрепляется через короткое брюшное покрытие к средней линии, лежащей над аортой, а IVC — от левых почечных сосудов к нижней брыжейной артерии, чтобы выявить аорту и IVC в ретробрюшитонеуме (место установки почечного трансплантата)8.
ПРИМЕЧАНИЕ: Тщательно разделяйте только перитонеальную прикреплённость толстой кишки непосредственно над большими сосудами и не дескуляризуйте нисходящую кишку, разделяя артерии артерии артериальной артерии, проходящие ближе к стенке толстой кишки.
При этом манёвре внутренней грыжи не наблюдалось, что подтверждают вскрытия, которые показали, что это пространство уже спонтанно закрылось и спонтанно закрылось к седьмому дню после операции. - Вскрытие аорты и IVC от их латерального брюшного прикрепления к мышцам поясничной мышцы с двусторонней стороны. После этого рассеките аорту и IVC друг от друга, пока не будут визуализированы поясничные артерии и вены. Опционально: обеспечить максимальное возвышение и обнажение просвета аорты в зажиме Сатинского во время шитья, вскрытие, перевязывание и разделение 1-2 позвоночных артерий и вен, которые обычно расположены в этом сегменте больших сосудов (от левых почечных сосудов до нижней мезентериальной артерии) в этом сегменте поясничной аорты между 2-0 шелковыми узами. Скелетизуйте поясничный отдел аорты от её тяжёлого адвентициального покрытия, чтобы подготовить её к имплантации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Осложнения позвоночника при этом манёвре не наблюдались. - Системно вводите 100 U/кг гепарина через центральный катетер и дайте ему циркулировать в течение 5 минут. Одновременно попросите команду анестезиологов временно увеличить скорость инфузии сбалансированного электролитного раствора с 250 мл/ч до 1 л/ч и начать титрирование норадреналина по мере необходимости до максимума 0,4 мкг∙кг-1∙мин-1 для достижения MAP 80-100 мм рт. ст. в подготовке к реперфузионному синдрому.
- Зажмите IVC боковым зажимом Satinsky, наклонённым по хвосту (чтобы не мешать рукам швейного хирурга, расположенных с левой стороны свиньи), создайте венотомию и отсосите/промыйте внутреннюю сторону IVC.
- Извлеките почку из льда или из аппаратной перфузии, промыйте её 250 мл ледяно-холодного электролитного раствора и подведите в операционное поле, отмечая начало второго тёплого ишемического (швейного) времени.
- Перевернуть аутотрансплантат правой почки вверх ногами (техника Симфороша) так, чтобы мочеточник был направлен вверх, артерия медиальна, а вена — латерально, и размещён с правой стороны живота, обращённой к инфраренальнойаорте 7,9.
- Венозный анастомоз: Используйте два двухруких шва 6-0 Prolene для проведения текущего венозного анастомоза. Поставьте зажим бульдога на почечную вену и снимите зажим Satinsky. Независимо от времени пришива вены, держите зажим Сатинского на вене в течение стандартных 25 минут, чтобы избежать стандартизированного ишемического повреждения трансплантата.
- Артериальный анастомоз: после 25 минут зажима внутривенного вену и 5 минут задержки между сосудами снова используйте зажим Сатинского для полного зажима аорты. Сделайте разрез и расширите его круглым пуансоном диаметром 4,0 мм, чтобы закрепить чистое отверстие. Используйте двухрукий шов 6-0 Prolene для проведения парашютного спуска или заживления артериального анастомоза пальцев ног. Аналогично, независимо от скорости завершения артериального анастомоза, держите зажим Satinksy на аорте на 25 минут, чтобы стандартизировать общее время шитья в 55 минут.
ПРИМЕЧАНИЕ: Общее тёплое ишемическое время (30 минут имитации донорства и 55 минут имитации манипуляции имплантами) привело к введению DGF. - Реперфузия трансплантата: После стандартизированных 55 минут тёплого ишемического времени сначала снять зажим бульдога с почечной вены, затем зажим Satinksy на аорте и проверить наличие реперфузии и гемостаза трансплантата. Поддерживайте агрессивную реанимацию жидкостью и норадреналином, чтобы достичь MAP 80-100 мм рт. ст. примерно в течение 1 часа после реперфузии, чтобы поддержать животное при реперфузионном синдроме.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте контролировать любые участки биопсии иглой с 18 G, если они проводятся — с помощью давления и высокосвертываемой поверхностной электрокоагуляции. - Анастомоз мочеточника: скелетизуйте оставшиеся и трансплантированные мочеточники, удаляя 1 см окружающей жировой ткани. Распределите 1 см мочеточника с пересадкой и остатками правого мочеточника. Используйте два двухруковых шва 6-0 Prolene (PDS при планировании долгосрочного выживания для снижения риска образования камней) для приближения их приближения. Прокрутите стент мочеточника размером 7F x 24 см с двойной J через свежий анастомоз и завершите анастомоз пробеговыми швами.
- Контралатеральная нефрэктомия
- Чтобы пересаженная почка стала жизнеспособной почкой, удалите контралатеральную (левую) почку.
- Закрытие брюшной полости
- После проверки гемостаза и подсчёта промывайте брюшную полост 1 л сбалансированного электролита и закройте фасцию 1-0 петленым проленом, затем промывайте кожу и закрывайте степлером. Введите 0,25% бупивакаина в шовную линию для местной анестезии и введите SQ с достаточным выбросом для контроля боли. Экстубировать свинку и вернуть её в отдельный террариум через стеклянные или пластиковые барьеры, чтобы они не кусали центральные линии и катетеры фолея друг друга.
- После 24 часов восстановления проведите предварительные лекарства, интубируйте, подготовьте и снова накройте живот свиньи в операционной (рисунок 2).
- Ежедневный послеоперационный уход
- Проверяйте свиней на обходах QID в основном для того, чтобы мешок для сбора мочи не переполнился, что привело к ятрогенной постпочечной обструкции и разрывам мочевого пузыря или мочеточника.
- Утром введите пероральный антитромбоцит 81 мг аспирина, возьмите образец крови из центрального катетера, проведите геп-лок, измерите выделение мочи в мешке и возьмите образцы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Дальнейшие внутривенные жидкости или лекарства не требуются, так как свиньи обычно восстанавливают аппетит и функцию кишечника с помощью POD1.
- Жертва
- В конце исследования по POD7 или на более раннем этапе для гуманной конечной точки поместите свинку под общий эндотрахеальный наркоз и осмотрите трансплантат с ультразвуком на анастомотическую целостность, после чего снова откройте брюшную полость, как было описано ранее.
- Осмотрите трансплантат на признаки перфузии и проверьте три анастомозы на полностью. Удалите трансплантат с тремя анастомозами целыми и распределите их вдоль длины, чтобы проверить их внутреннюю целостность и проходимость.
- Биопсия паренхимы почки с помощью биопсии 18 G.
Результаты
Мгновенная и замедленная функция трансплантата.Мы провели n = 5 аутотрансплантаций почки у свинины за 30 минут DCD после 24 часов гипотермического неоксигенированного оборудования с использованием (MAP = 40 мм рт. ст.) и отслеживали фенотип восстановления и функции трансплантата в первую неделю после трансплантации, используя ежедневные образцы крови и общий выброс мочи. Мы наблюдали два фенотипа восстановления после трансплантации. Первым фенотипом было немедленное/раннее восстановление трансплантата. Три из пяти свиней, имплантированных имитированными трансплантатами DCD (60%), имели возврат выработки мочи (суточный выброс мочи > 500 мл/день) по POD 2-3, что позволило обеспечить непрерывный гомеостаз электролитов без вмешательства (диализ, хелатирование калия или инсулино-опосредованное внутриклеточное сдвиг) (Рисунок 3). Второй фенотип — задержка функции трансплантата (DGF), характеризующаяся затяжной аурией после POD 3, связанной с накоплением сывороточного BUN, креатинина, а также развитием гипонатриемии и гиперкалиемии, что является объективным клиническим признаком для диализа. Аурия и гиперкалиемия прогрессировали и вызывали изменения ЭКГ (пиковые Т-волны) около K ≥ 8 мэкв/л. Это стало неотложным сигналом для диализа и рассматривалось как гуманная конечная точка. После достижения этой конечной точки эвтаназия проводилась под общей анестезией, чтобы исключить другие причины недостаточности/недостаточности трансплантата, вызванной нарушением анастомота или другими хирургическими осложнениями. Используя это определение DGF, свиные DCD почки с 30 минутами тёплой ишемии in situ , затем 24 часа гипотермического неоксигенированного хранения в машине и 55 минут тёплого ишемического времени для шитья, выработали DGF со скоростью 40% (две из пяти свиней). Этот показатель DGF повторяет зарегистрированный показатель при трансплантации почки DCD учеловека 1.
Рисунок 1: Туннельный центральный катетер и размещение катетера Фолея. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Жизнеспособная автотрансплантация почки DCD у свиньи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой рисунка.
Рисунок 3: Задержка функции трансплантата в модели свиньи. Разница в (A) выделении мочи между трансплантатами с немедленной и отсроченной функцией; (B) уровни калия между немедленным и отложенным трансплантатом; (C) ежедневные уровни креатинина в сыворотке между немедленными и отложенными трансплантатами. Все рисунки представлены как Среднее + SEM с значениями LOCF и анализированы с помощью смешанного моделя. Сокращение: LOCF = последнее наблюдение, перенесённое дальше. N=5 свиней на руку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.
Обсуждение
Задержка функции трансплантата негативно влияет на клинический ход после трансплантации почки. На ранних этапах после трансплантации это связано с длительной госпитализацией, более высоким уровнем инвазивных процедур и повышенным риском отторжения. В долгосрочной перспективе DGF также связан с более короткой выживаемостью трансплантата. DGF является проявлением тяжелой ишемии-реперфузионного повреждения (I/RI), что подтверждается её более высокой распространённостью при трансплантациях DCD по сравнению с DBD или трансплантациями почек от живого донора. Острая почечная травма (ОПП) является вторичной по отношению к острому канальчатому некрозу, вызванному И/РИ, и считается самой распространённой причиной, по которой аллотрансплантат сразу же перестаёт функционировать. Клинически DGF определяется необходимостью диализа в течение первой недели после трансплантации. В крупных животных моделях DGF сложно определить и изучить из-за отсутствия стандартизированного определения достаточности трансплантата и невозможности провести диализ для определения временного характера состояния с помощью диализа как моста для функционального восстановления трансплантата.
В этом протоколе была выбрана модель свинины, так как она широко признана близкой параллельной физиологией почек человека (что доказано недавней успешной ксенотрансплантацией)10,11. Автотрансплантация была выбрана для устранения аллоиммунного ответа, отторжения и необходимости в таксических эффектах ингибиторов кальциневрина. Определение DGF основано на длительной аурии (<100 мл мочи в сутки) после POD3, что приводит к тяжелым изменениям ЭКГ, связанным с гиперкалиемией. Катетеризация Фолея обеспечивает точный сбор мочи, что закрепляет определение задержки функции и достаточности трансплантата с функциональным результатом качества и количества мочи. Ежедневный забор крови позволяет ежедневно контролировать традиционные параметры панели функции почек, предоставляя полную картину гомеостаза электролитов.
Мы считаем, что создание надёжной и воспроизводимой животной модели задержки функции трансплантата ускорит изучение эффективных методов лечения отсроченной функции трансплантата и в конечном итоге приведёт к улучшению результатов пересадки почки. В заключение, этот протокол устанавливает воспроизводимую модель аутотрансплантации почек у свиней, позволяющую объективно охарактеризовать задержку функции трансплантата с использованием количественного выделения мочи и биохимических параметров сыворотки после контролируемого теплого ишемического повреждения. Включая стандартизированные хирургические условия, неинвазивный сбор мочи и серийный лабораторный мониторинг, этот подход предоставляет практическую основу для изучения DGF при отсутствии диализа и способствует сравнению с клинически значимыми фенотипами дисфункции посттрансплантационноготрансплантата 12,13,14,15.
Раскрытие информации
У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.
Благодарности
Благодарим лабораторию перфузии органов в Торонто (Top Lab) за то, что они поделились своим опытом во время обучения по трансплантации почек у свинины. Мы также благодарим Мишель Мендиолу Пла за то, что она поделилась своим опытом по неинвазивной установке Фолея у свиней.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| <Сильно>Положительное введение Фолея< сильно> | |||
| 12 Отец Фоли | Сбор мочи | ||
| Хирургическая смазка | Введение Фолея | ||
| 1 л мешок для мочи | Сбор мочи | ||
| 2-0 Нейлоновый шов | Фоли и Центральная линия безопасности | ||
| Speculum & Long Debakey & Свет | Введение Фолея | ||
| Трубки для анализа мочи (50 мл конические) | Анализ мочи | ||
| Патроны CG8 + Chem 8 + Piccolo | Ежедневные лаборатории | ||
| <Сильная>лежащая на спину центральная линия< и крепкая> | |||
| 9.6 Катетер Hickman Single lumen | Ежедневные лаборатории | ||
| 10-лопастное | Ножевые разрезы для установки CVC | ||
| Центральная линия с люэр-замком без колпачков | |||
| Мешок с физиологическим раствором (1 л физиологического раствора + 10 флаконов с гепарином) | heplock CVC | ||
| Explant | |||
| Набор лапаротомии | |||
| Бови | |||
| Стерильные ручки света | |||
| Губчатый рюкзак | |||
| Полотенца OR — белые 17X23 дюйма (4 в упаковке) | |||
| Ничья 2:0 Silk | Сосудистый контроль | ||
| 1 L плазмалит. | Сбалансированный электролитный раствор | ||
| Лоток для инструментов для стерильной общей лапаротомии | |||
| Теплый физиологический раствор для влажных полотенец | Обработка кишечника | ||
| Коробка управления иглами | |||
| Ретрактор Bookwalter | |||
| <сильный>Backtable | |||
| Стерильные органные мешки — по 2 на почку | |||
| 1 литр кристаллоидного пакета для слаши | |||
| Раствор UW — 250 мл на почку | |||
| Промывка труб | |||
| Ангиокат 14 калибра | |||
| <Сильный>Машинный драп | |||
| Вес органа (весы + чаша + стерильная сумка для органа) | |||
| Машинная перфузия | |||
| Перфузионная машина | Транспортер почек Lifeport | ||
| Одноразовая органная камера | Транспортер почек Lifeport | ||
| Перфузионный раствор | Решение KPS-1 | ||
| <Сильный>Имплант | |||
| Всасывающая трубка | |||
| Присосной наконечник Янкауэра | |||
| Всасывающий баллончик | |||
| Резиновые подковы | |||
| 4 мм аортальный пуанс | Артериальный анастомоз | ||
| Микрохирургические инструменты + зажим | |||
| Направляющий провод мочеточника | |||
| Стент мочеточника — 4,8 fr X 12 мм | анастомоз мочеточника | ||
| <Сильно>Абдоминальное закрытие | |||
| 1 петлевый пролен | |||
| Бупивакаин | |||
| Скоблеры для кожи | |||
| <сильный>сэмплы | |||
| Лоток для образцов | |||
| Биопсийный пистолет 14 G | |||
| Банки для биопсии NBF | |||
| Трубы Эппендорфа | |||
| Зелёные кровяные трубки | |||
| Конические 15 мл | |||
| <сильные>медикаменты | |||
| Флакон с норадреналином | |||
| Флакон дофамина | |||
| 1 L плазмалит | Сбалансированный электролитный раствор | ||
| Аспирин 81 мг таблетки по QD | |||
| Флакон с цефазолином | |||
| Exceed | |||
| Heparin 10K единицы |
Ссылки
- Lentine, K. L., et al. OPTN/SRTR 2023 annual data report: kidney. Am J Transplant. 25 (2 Suppl 1), S22-S137 (2025).
- Zwaini, Z., et al. Comparative analysis of risk factors in declined kidneys from donation after brain death and circulatory death. Medicina (Kaunas). 56, (2020).
- Flournoy, W. S., Mani, S. Percutaneous external jugular vein catheterization in piglets using a triangulation technique. Lab Anim. 43, 344-349 (2009).
- Seldinger, S. I. Catheter replacement of the needle in percutaneous arteriography: a new technique. Acta Radiol. 39, 368-376 (1953).
- Abraham, N., et al. Subnormothermic oxygenated machine perfusion (24 h) in DCD kidney transplantation. Transplant Direct. 10 (6), e1633(2024).
- Starzl, T. E., Marchioro, T. L., Morgan, W. W., Waddell, W. R. A technique for use of adult renal homografts in children. Surg Gynecol Obstet. 119, 106-108 (1964).
- Simforoosh, N., et al. Right laparoscopic donor nephrectomy and the use of inverted kidney transplantation: an alternative technique. BJU Int. 100, 1347-1350 (2007).
- Abraham, N., et al. Orthotopic transplantation of the full-length porcine intestine after normothermic machine perfusion. Transplant Direct. 8, e1390(2022).
- Kawamura, M., et al. Normothermic ex vivo kidney perfusion preserves mitochondrial and graft function after warm ischemia and is further enhanced by AP39. Nat Commun. 15, 8086(2024).
- Kawai, T., et al. Xenotransplantation of a porcine kidney for end-stage kidney disease. N Engl J Med. 392, 1933-1940 (2025).
- Montgomery, R. A., et al. Results of two cases of pig-to-human kidney xenotransplantation. N Engl J Med. 386, 1889-1898 (2022).
- Siedlecki, A., Irish, W., Brennan, D. C. Delayed graft function in the kidney transplant. Am J Transplant. 11, 2279-2296 (2011).
- Mannon, R. B. Delayed graft function: the AKI of kidney transplantation. Nephron. 140, 94-98 (2018).
- Kim, D. W., et al. Financial impact of delayed graft function in kidney transplantation. Clin Transplant. 34, e14022(2020).
- Schröppel, B., et al. Peritransplant eculizumab does not prevent delayed graft function in deceased donor kidney transplant recipients: results of two randomized controlled pilot trials. Am J Transplant. 20, 564-572 (2020).
Перепечатки и разрешения
Теги
