Методическая статья

Экономически эффективный и минимально инвазивный протокол регистрации хронической многоцентровой электроэнцефалографии у свободно движущихся мышей

DOI:

10.3791/69314

⸱

10 октября 2025 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cellular Biology and Anatomy, Medical College of Georgia at Augusta University, 2National Institute of Biotechnology, 3Department of Neuroscience and Regenerative Medicine, Medical College of Georgia at Augusta University, 4Department of Neurology, Medical College of Georgia at Augusta University

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол был разработан для создания надежной и легкодоступной системы регистрации свободно движущейся ЭЭГ грызунов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электроэнцефалография (ЭЭГ) служит фундаментальным инструментом для отслеживания электрической активности в мозге и приобретает все большее значение как в клинической диагностике, так и в доклинических исследованиях на животных. В то время как ЭЭГ грызунов предлагает мощную платформу для моделирования неврологических расстройств человека, долгосрочная запись часто ограничена высокой стоимостью, инвазивностью или технической сложностью существующих систем. В данной статье мы представляем надежный, доступный, экономически целесообразный и минимально интрузивный протокол для хронической регистрации корковой ЭЭГ с несколькими участками у свободно движущихся мышей. Метод включает в себя изготовление платино-иридиевых проводов с винтовыми электродами, подключенными к интерфейсу типа универсальной последовательной шины (USB), которые закрепляются эпидурально с помощью костных винтов и фиксируются клеем и стоматологическим цементом. Система обеспечивает стабильный захват сигнала в течение нескольких месяцев, что было продемонстрировано на мышах дикого типа C57BL/6J с 85% послеоперационной выживаемостью (n = 20). ЭЭГ дискретизировали с частотой 1000 Гц и фильтровали в диапазоне от 1 Гц до 500 Гц с использованием дифференциального усилителя. Для валидации системы вводили пентилентретразол (20 мг/кг) для индуцирования судорожной активности, что приводило к заметному увеличению межприступных разрядов - с 2-5 на исходном уровне до 20-51 события после инъекции, что сопровождалось увеличением амплитуды сигнала. Разряды были идентифицированы на основе морфологии формы волны и характеристик сигнала, соответствующих признанным электрофизиологическим критериям. Настройка совместима с поведенческим видеоотслеживанием и конвейерами анализа с открытым исходным кодом, а также поддерживает интеграцию с фармакологическими, генетическими или нейромодуляционными исследованиями. Этот метод обеспечивает стабильную и адаптируемую платформу для исследования динамики сети мозга на моделях грызунов с приложениями в исследованиях эпилепсии и за их пределами.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электроэнцефалография (ЭЭГ) обеспечивает прямое измерение электрической активности мозга и широко используется в диагностике эпилепсии1. В последние годы методы ЭЭГ все чаще адаптируются для использования на моделях мелких животных для изучения неврологических расстройств, физиологии сна и динамики сети мозга 2,3,4. С появлением генетически модифицированных мышиных моделей и значительным прогрессом в технологиях регистрации, ЭЭГ грызунов стала важным инструментом для доклинических исследований, предлагая ценную информацию о трансляционных механизмах, имеющих отношениек здоровью мозга человека.

Одновременный захват и манипулирование нейронной активностью имеет решающее значение для изучения динамики мозга как на макро-, так и на микросхемном уровнях. Этот двойной подход позволяет в режиме реального времени отслеживать нейронные сети, участвующие в инициации и прогрессировании припадков. Эпилепсия, характеризующаяся повторяющимися и часто непредсказуемыми припадками, возникает из-за сбоев в сложных цепях мозга4. Несмотря на обширные исследования, механизмы, регулирующие распространение и возникновение припадков, остаются до конца неизученными, отчасти из-за ограниченного использования технологий, позволяющих проводить одновременную запись внескольких областях мозга.

Запись ЭЭГ на животных моделях, которые повторяют неврологические расстройства человека, выявила межприступные всплески, спайково-волновые разряды и паттерны начала судорог, которые близко отражают те, которые наблюдаются у людей,тем самым улучшая наше понимание электрофизиологических изменений, происходящих в человеческом мозге. Аналогичным образом, аномалии ЭЭГ, обнаруженные в моделях болезни Альцгеймера, расстройств аутистического спектра и шизофрении, дают важное представление о нарушенной нейронной колебательной активности и выделяют потенциальные терапевтические мишени.

Несмотря на различия в анатомии и масштабах мозга, мышиная и человеческая ЭЭГ демонстрирует поразительное сходство 2,11. Оба демонстрируют характерные колебательные полосы частот — дельта, тета, альфа, бета и гамма — со спектрами мощности, как правило, следующими распределению 1/f 2,11. Переходы между состояниями мозга, такие как возникновение дельта-активности во время сна с небыстрым движением глаз (NREM) или повышенная синхронизация гамма во время задач на внимание и память, сохраняются у разных видов. Кроме того, эпилептиформная активность, включая высокочастотные колебания (HFO) и иктальные паттерны, демонстрирует сопоставимые временные и спектральные профили как у мышей, так и у человека7.

Сохраненные особенности ЭЭГ грызунов и человека делают мышиные модели в высшей степени трансляционными для изучения расстройств мозга. ЭЭГ мыши позволяет проводить инвазивные записи с высоким разрешением, что позволяет проводить детальный анализ на уровне схем12. Он также поддерживает тестирование нейромодулирующих стратегий, включая фармакологические агенты, оптогенетический контроль и стимуляцию замкнутого цикла13,14, которые могут быть объединены с поведенческими и молекулярными инструментами для точного исследования нейронной дисфункции.

Тем не менее, следует проявлять осторожность при экстраполяции полученных результатов. Меньший размер и более простая корковая структура мозга мыши могут влиять на распространение сигнала, а когнитивные потенциалы, связанные с событиями (ERP), могут быть менее заметными по сравнению с людьми. Обеспечение согласованности в размещении электродов, эталонных сигналах и аналитических трубопроводах имеет решающее значение для повышения воспроизводимости и межлабораторной валидности16.

Запись ЭЭГ у мелких животных представляет как возможности, так и проблемы. ЭЭГ у мышей обычно регистрируется с помощью хронически имплантированных электродов, расположенных либо эпидурально на поверхности черепа, либо в виде глубинных электродов, вводимых в подкорковые структуры17,18. Поверхностные электроды, такие как винтовые или проволочные электроды, размещаемые на твердой мозговой оболочке, являются минимально инвазивными и подходят для длительной продольной записи. Такие электроды находятся ниже кости, что обеспечивает высокий импедансный барьер для записи. Соответственно, дуральные электроды у грызунов можно считать более сопоставимыми с электрокортикографией (eCoG), чем с ЭЭГ. Глубинные электроды, напротив, обеспечивают более высокое пространственное разрешение и обеспечивают доступ к глубоким областям мозга, таким как гиппокамп, таламус или миндалевидное тело, облегчая изучение судорожных сетей и колебательной связи по распределению областей 2,11.

Современные системы ЭЭГ для грызунов поддерживают многоканальную запись с высоким временным разрешением и часто сочетаются с видеомониторингом для поведенческойкорреляции18. Кроме того, беспроводные системы ЭЭГ позволяют получать информацию о свободно ведущих животных в режиме реального времени, сводя к минимуму ограничения движенийи стресс. Хотя со временем эти модернизации стали коммерчески доступными, они либо очень дороги, либо слишком инвазивны для изучения модели грызунов в течение длительного периода времени.

Чтобы восполнить этот пробел, мы представляем универсальный и экономически эффективный протокол для многосайтовой регистрации ЭЭГ на моделях грызунов, подходящий для долгосрочных исследований с минимальной инвазивностью. Этот подход к записи ЭЭГ особенно подходит для исследований, требующих оценки активности коры головного мозга у мышей с высоким разрешением в контролируемых экспериментальных условиях. Его лучше всего применять, когда (i) животное может выдержать кратковременную анестезию во время имплантации электродов и полностью восстановиться, (ii) обеспечивается стабильное положение головы или минимальное движение во время записи, (iii) желателен долгосрочный или повторный мониторинг нейронной активности, и (iv) экспериментальный дизайн может обеспечить запись с одним или ограниченным участием нескольких животных в зависимости от мощности усилителя. Исследователи должны учитывать эти ограничения, чтобы определить, соответствует ли этот метод их экспериментальным целям.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол получил одобрение Комитета по уходу за животными и их использованию Университета Огасты. На каждом этапе эксперимента следовало руководству Национального института здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. Были приняты все возможные меры для минимизации количества животных, используемых в данном исследовании. Мыши, использованные для этого исследования, являются 2-месячными мышами дикого типа C57Bl6J. Время, необходимое для выполнения каждого этапа, включено в соответствующие этапы.

1. Подготовка штырьков с электродами (5 мин)

  1. Используйте гнездовые контакты USB типа B с 5 контактами для пайки платино-иридиевым проводом 0,003 дюйма. Снимите слой с провода перед его пайкой со штифтом. Четвертый штифт из пяти кеглей - это штифт заземления; не используйте его для подключения к электродам (рисунок 1A). Используйте остальные 4 контакта для подключения электродов.
  2. Согните контакты примерно на 45° и дважды оберните провода вокруг каждого контакта, чтобы убедиться, что провода остаются подключенными правильно и не оторвались (Рисунок 1A).
  3. Добавьте немного припоя канифольной флюсовой пасты на каждый штифт, чтобы очистить поверхность контакта и эффективно его можно было спаять.
  4. Добавьте небольшой кусочек проволоки для припоя к каждому контакту, используйте паяльник, чтобы расплавить проволоку для припоя, и навсегда прикрепите контакт к платино-иридиевому проводу (Рисунок 1B-D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте щипцы под углом 45°, чтобы удерживать провод, и используйте другой, чтобы обернуть вокруг штифта. Проделайте всю процедуру под светлопольным микроскопом. Отрежьте оставшийся провод после обмотки и пайки, а другой конец держите прикрепленным к электродам.

2. Имплантация электродов (30 мин)

  1. Обезболите мышь 0,5 мл ваты, пропитанной изофлураном, в закрытой камере и установите мышь на стереотаксический столик. Убедитесь, что мышь не получила недостаточной дозы, прежде чем устанавливать ее на сцену, ущипнув заднюю лапу и дождавшись, пока она не перестанет реагировать на щипки. Быстро запустите аппарат искусственной вентиляции легких с изофлураном/кислородом на носу со скоростью 1,5% v/v.
  2. Введите мышке карпрофен (5 мг/кг) для уменьшения воспалительных реакций и боли и дексаметазон (0,1 мг/кг внутримышечно) для уменьшения воспаления и отека мозга. Используйте глазную мазь, чтобы поддерживать глаза влажными, так как длительное воздействие анестетиков может высушить глаза и повредить их.
  3. Используйте средство для удаления волос или сбрейте верхнюю часть черепа, чтобы обнажить кожу. Следуйте асептической технике для очистки области разреза с использованием 70% этанола и йодных подушечек.
  4. Сделайте четкий разрез одним мазком посередине головы скальпелем. Разрежьте вокруг разреза, чтобы обнажить место имплантации электрода. Следите за тем, чтобы мышцы не обнажались (рисунок 2A).
  5. Промойте 0,9% раствором NaCl и высушите поверхность. Потрите поверхность ватными палочками, смоченными или смоченными в перекиси водорода. Сохраняющаяся соединительная ткань на кости может быть удалена с помощью скальпеля. Подождите не менее 1 минуты после чистки.
  6. Промойте 0,9% раствором NaCl и высушите поверхность перед началом сверления.
  7. Используйте бормашину, чтобы сделать поверхность черепа шероховатой, чтобы способствовать адгезии акрила.
  8. Измерьте и укажите места имплантации электродов (AP: +2, -4, ML: ±1,5)20 (рис. 2B).
  9. Просверлите поверхность с помощью сверл диаметром 1,4 мм и вставьте в отверстие 4 шурупа (1,5 мм) с помощью прецизионных отверток. Следите за тем, чтобы сверло не делало отверстий через кость. Винты не должны делать отверстие в мозге, а скорее касаться поверхности (рисунок 2В).
  10. Умойтесь 0,9% раствором NaCl, если есть кровь, и подождите, пока она высохнет. При необходимости используйте пылесос.
  11. Оберните провода, подключенные к USB-разъему, вокруг каждого из винтов по 2-4 раза и обрежьте оставшиеся провода (рисунок 2D).
  12. Нанесите небольшую каплю суперклея (Loctite) на верхнюю часть каждого винта и дайте ему высохнуть, чтобы соединение стало прочным. Убедитесь, что соединитель расположен в середине черепа и не касается черепа или электродов (рисунок 2E).
  13. Используйте цианоакрилат, чтобы медленно наращивать колпачок понемногу. Избегайте нанесения слишком толстого слоя, так как он может нагреть кость. Прикрепите большой винт к плоской поверхности разъема, который не соприкасается с костью или животным, используя стоматологический цемент для облегчения подключения USB-кабеля (Рисунок 2F).
  14. Дайте головному колпачку высохнуть не менее 2 минут, прежде чем отсоединить мышь от стереотаксического каскада. В течение следующих 24 часов наблюдайте за мышью на грелке.
  15. Обрабатывайте мышь карпрофеном в течение следующих 7 дней в дозировке 5 мг/кг каждые 12 ч. Мышь будет готова к записи ЭЭГ через 2 недели ожидания, чтобы стимулировать рост кости на акриловом интерфейсе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь, чтобы соединитель располагался как можно ближе к черепу. Убедитесь, что он не касается черепа или костяных винтов. Убедитесь, что провода не соединены друг с другом ни с одного конца. Будьте осторожны с попаданием цианоакрилата в USB-разъем и глаза.

3. Запись ЭЭГ (65 мин)

  1. Запишите ЭЭГ каждой мыши в течение 1 ч, 30 мин до лечения пентилентразолом (PTZ) и 30 мин после лечения 20 мг/кг PTZ.
  2. Вставьте USB-кабель в разъем. Подключите USB-кабель к дифференциальному усилителю переменного тока (AC) с помощью зажимов типа «крокодил» с усилением, установленным на 10k и отфильтрованным в диапазоне от 0,1 Гц до 250 Гц21. Выборка сигнала ЭЭГ с частотой 1000 Гц (рис. 3).
  3. Записывайте выходы с усилителя одновременно на компьютере и выводите их на осциллограф для мониторинга в режиме реального времени. Подключите выходы усилителя к USB-устройству сбора и преобразования сигналов (например, NIDAQ), подключенному к компьютеру (рис. 3).
  4. Используйте код Python для записи сигнала ЭЭГ (доступен по адресу https://github.com/schrodi159/blakelabeeg). Код осуществляет цифровую фильтрацию сигнала на частотах 0,1 Гц и 250 Гц.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Запись ЭЭГ в помещении без электрических помех улучшает качество данных и записи.

4. Интерпретация данных

  1. Используйте код Python для визуализации данных (доступен по адресу https://github.com/schrodi159/blakelabeeg). Определите межприступные разряды из каждой записи (рисунок 4A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Интериктальный разряд рассматривался, если форма сигнала в два раза превышает исходную и имеет продолжительность менее 200мс22 и следует по крайней мере 4 из следующих 5 критериев - ди- или трехфазная волна с заостренным пиком, отличная продолжительность от фоновой, асимметрия формы волны, фоновая активность нарушается присутствием, а затем следует медленная волна8, 20,22.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электроды были имплантированы 20 мышам на фоне C57Bl6J, в том числе 5 мышам дикого типа C57Bl6J, с послеоперационной выживаемостью 85% в течение 6 месяцев после операции (рис. 4B). Через 6 месяцев головные уборы начали отделяться, и все мыши были усыплены в возрасте 8 месяцев. Средний вес крышек в сборе, включая разъем и винты, составил 1,13 г (n = 20). Мыши приходили в сознание в течение 30 минут после операции и возвращались к нормальному движению и взгляд...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании мы разработали и валидировали надежный, экономически эффективный и минимально инвазивный протокол для хронической записи ЭЭГ в нескольких местах у свободно движущихся мышей. Успешная имплантация винтовых электродов и изготовленных по индивидуальному заказу платино-иридиевых электродов, припаянных к USB-разъему, наряду с наблюдаемой выживаемостью и качеством записи, демонстрирует осуществимость и надежность метода при хронической записи. Примечательно, что этот протоко...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DTB является платным консультантом Фонда Альфреда Манна. Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или других конфликтов интересов в связи с этой работой.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DTB поддерживается грантами NEI R01EY036089 и грантами NIA RF1AG060754. XF был поддержан грантами от Фонда исследований болезни Альцгеймера имени Джеймса Фикеля, EY028158 и EY032488.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,003" платиновый иридиев проводAM-системы777000
1,5 мм костяные винтыФирменные изделия Antrin Miniature000-120X1/16 SL ПРИВЯЗКА MS SST
Усилитель переменного тока, nbsp;AM Systems
КарпрофенКоветрус11695-6935-1
Акриловая основа Coldpac DentureКомпания Yates Motloidhttps://www.yates-motloid.com/collections/coldpac/denture-base
Зубная дрель 1,4 ммVolvere GXН/Д
ДексаметазонVEDCO50989-437-12
Смазка для глазOptix Carehttps://theoptixcare.com/
Перекись водородаСигма Олдрич7722-84-1
NIDAQ USB Национальные инструментыhttps://www.ni.com/en/shop/data-acquisition/entry-level-usb-daq.htmlСбор данных и кондиционирование сигналов через USB 
ПентиленетразолCaymen Chemicals18682
Паяльная канифоль флюсовая паста Уэллерhttps://www.weller-tools.com/us/en/consumer/products/soldering-accessories/
Паяльный провод 0.32"Radio ShackН/Д
СуперклейЛоктайтН/Д
Гнездовые вилки USB типа BQM SellerX00292ABU9

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, S. J. EEG in the diagnosis, classification, and management of patients with epilepsy. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 76 (Suppl 2), ii2-ii7 (2005).
  2. Buzsaki, G., Draguhn, A. Neuronal oscillations in cortical networks. Science. 304 (5679), 1926-1929 (2004).
  3. Fisher, R. S., et al. ILAE official report: A practical clinical definition of epilepsy. Epilepsia. 55 (4), 475-482 (2014).
  4. Fisher, R. S., Scharfman, H. E., deCurtis, M. How can we identify ictal and interictal abnormal activity. Adv Exp Med Biol. 813, 3-23 (2014).
  5. Vyazovskiy, V. V., Harris, K. D. Sleep and the single neuron: The role of global slow oscillations in individual cell rest. Nat Rev Neurosci. 14 (6), 443-451 (2013).
  6. Wykes, R. C., et al. Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy. Sci Transl Med. 4 (161), 161ra152(2012).
  7. Lundt, A., et al. EEG radiotelemetry in small laboratory rodents: A powerful state-of-the-art approach in neuropsychiatric, neurodegenerative, and epilepsy research. Neural Plast. 2016, 8213878(2016).
  8. Kyle, J. J., Sharma, S., Tiarks, G., Rodriguez, S., Bassuk, A. G. Fast detection and quantification of interictal spikes and seizures in a rodent model of epilepsy using an automated algorithm. Bio Protoc. 13 (6), e4632(2023).
  9. Petrucci, A. N., et al. Post-ictal generalized EEG suppression is reduced by enhancing dorsal raphe serotonergic neurotransmission. Neuroscience. 453, 206-221 (2021).
  10. Colgin, L. L. Oscillations and hippocampal-prefrontal synchrony. Curr Opin Neurobiol. 21 (3), 467-474 (2011).
  11. Amat-Foraster, M., et al. Temporally dissociable effects of ketamine on neuronal discharge and gamma oscillations in rat thalamo-cortical networks. Neuropharmacology. 137, 13-23 (2018).
  12. Sun, G., et al. Closed-loop stimulation using a multiregion brain-machine interface has analgesic effects in rodents. Sci Transl Med. 14 (651), eabm5868(2022).
  13. Kang, W., et al. Closed-loop direct control of seizure focus in a rodent model of temporal lobe epilepsy via localized electric fields applied sequentially. Nat Commun. 13 (1), 7805(2022).
  14. Armstrong, C., Krook-Magnuson, E., Oijala, M., Soltesz, I. Closed-loop optogenetic intervention in mice. Nat Protoc. 8 (8), 1475-1493 (2013).
  15. Maheshwari, A. Rodent EEG: Expanding the spectrum of analysis. Epilepsy Curr. 20 (3), 149-153 (2020).
  16. Ahuis, T. P., et al. Evaluation of variation in preclinical electroencephalographic spectral power across multiple laboratories and experiments: An EQIPD study. PLoS One. 19 (10), e0309521(2024).
  17. Papazoglou, A., et al. Non-restraining EEG radiotelemetry: Epidural and deep intracerebral stereotaxic EEG electrode placement. J Vis Exp. (112), e54216(2016).
  18. Kadam, S. D., et al. Methodological standards and interpretation of video-electroencephalography in adult control rodents: A TASK1-WG1 report of the AES/ILAE Translational Task Force of the ILAE. Epilepsia. 58 (Suppl 4), 10-27 (2017).
  19. Zayachkivsky, A., Lehmkuhle, M. J., Dudek, F. E. Long-term continuous EEG monitoring in small rodent models of human disease using the Epoch wireless transmitter system. J Vis Exp. (101), e52554(2015).
  20. Kent, B. A., Strittmatter, S. M., Nygaard, H. B. Sleep and EEG power spectral analysis in three transgenic mouse models of Alzheimer's disease APP/PS1, 3xTgAD, and Tg2576. J Alzheimers Dis. 64 (4), 1325-1336 (2018).
  21. Luttjohann, A., Schoffelen, J. M., van Luijtelaar, G. Peri-ictal network dynamics of spike-wave discharges: Phase and spectral characteristics. Exp Neurol. 239, 235-247 (2013).
  22. Oblak, A. L., et al. Comprehensive evaluation of the 5XFAD mouse model for preclinical testing applications: A MODEL-AD study. Front Aging Neurosci. 13, 713726(2021).
  23. Osanai, H., Kitamura, T., Yamamoto, J. Hybrid microdrive system with recoverable opto-silicon probe and tetrode for dual-site high density recording in freely moving mice. J Vis Exp. (150), e60028(2019).
  24. Schroder, T., et al. The DREAM implant: A lightweight, modular, and cost-effective implant system for chronic electrophysiology in head-fixed and freely behaving mice. J Vis Exp. (209), e66867(2024).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи