Оптимизированная количественная оценка стабильности энхансерной РНК в эмбриональных стволовых клетках мышей

Summary

Этот протокол количественно измеряет стабильность и период полураспада интергенных и интрагенных энхансерных РНК в эмбриональных стволовых клетках мышей с помощью терапии актиномицином D, RT-qPCR и нелинейного регрессионного анализа. Стратегии нормализации, специфичные для позиции, применяются для точного моделирования динамики распада eRNA в контекстно-зависимом виде.

Abstract

Энхансерные РНК (eRNA) — это некодирующие транскрипты, образующиеся из транскрипционно активных энхансерных областей, которые всё чаще признаются ключевыми регуляторами экспрессии генов. Несмотря на их функциональную важность, стабильность и динамика деградации eRNA остаются плохо охарактеризованными, особенно в эмбриональных стволовых клетках (ESC), где транскрипционные программы очень динамичны и зависят от контекста. Этот протокол представляет количественный метод оценки кинетики распада и периода полураспада межгенных и интрагенных eRNA в мышиных ЭСК. Транскрипция ингибируется с помощью актиномицина D, а общая РНК собирается в несколько определённых временных точек. cДНК синтезируется с использованием случайных праймеров гексамеров и олиго(dT) для обнаружения как полиаденилированных, так и неполиаденилированных транскриптов. Для межгенных эРНК нормализация проводится либо с помощью гена, который ведёт хозяйство, либо с помощью значения Ct на момент времени 0 мин. Для внутригенных eRNA используется двойной подход нормализации для минимизации помех от перекрывающихся пре-мРНК. Кривые распада анализируются с помощью однофазной экспоненциальной модели распада, что позволяет точно оценить период полураспада. Протокол показывает, что eRNA в mESC демонстрируют быструю смену с периодом полураспада примерно 2-3 минуты. Эта методология предоставляет надёжную и воспроизводимую основу для изучения стабильности eRNA, предоставляя представление о активности энхансера и динамике РНК в контекстах плюрипотентных стволовых клеток.

Introduction

Энхансеры — это цис-регуляторные элементы (CRE), которые регулируют экспрессию генов, специфичных для тканей и стимулов, служа платформами связывания транскрипционных факторов и ко-регуляторов 1,2,3,4,5,6. Хотя энхансеры могут находиться удаленно от целевых генов на уровне линейного генома, механизмы петли хроматина обеспечивают пространственную близость к промоторам, что способствует регуляции транскрипции. Активные энхансеры тра....

Protocol

Все эксперименты в этом исследовании проводились с использованием эмбриональных стволовых клеток мышей (mESC; E14Tg2A), которые не были получены напрямую в нашей лаборатории, а получены из установленной клеточной линии, которая также коммерчески доступна от ATCC (CRL-1821). Таким образом, работа, описанная в этой статье, не требует рассмотрения Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в Национальном университете Чуннам. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Культура клеток mESC

1. Предварительное покрытие 6-колодцевых....

Results

Для оценки стабильности РНК после транскрипционной остановки mESC были обработаны с помощью actD, а общая РНК была собрана в определённые временные моменты (0 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 и 30 мин). После синтеза cDNA была проведена RT-qPCR для количественной оценки внутригенной eRNA Nsun2 и Sox2, межгенной eRNA Pou5f1 и соответствующих их мРНК. Эти данные использовались для генерации кривых деградации, зависящих от времени, (.......

Discussion

Этот протокол определяет надёжный и воспроизводимый метод измерения устойчивости eRNA в mESC. Критически важные экспериментальные этапы, включая культивирование клеток, обработку актиномицином D, экстракцию РНК и количественную оценку RT-qPCR, ясно иллюстрированы на рисунках и дополнительных файлах, чтобы помочь пользователям пройти через рабочий процесс. Кроме того, подробные аналитические процедуры, такие как нелинейное регрессионное моделирование и интерпретация доверительных интервал.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-меркаптоэтанол	Gibco	21985023
Актиномицин D	Сигма-Олдрич	A9415
Хлороформ	Химикаты Тэджун	2548-4105
DMSO	GenDEPOT	D2680
Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS)	Сигма-Олдрич	F0392
Желатин	Сигма-Олдрич	G1890-100G
Глазго Минимальная необходимая среда (GMEM)	Gibco	11710035
GraphPad Prism (версия 9)	Программное обеспечение GraphPad
изопропанол	Химикаты Тэджун	5035-4105
Замена сыворотки KnockOut (KOSR)	Gibco,	10828028
Ингибиторный фактор лейкемии (LIF)	Merck	ESG1106
Раствор незаменительных аминокислот MEM (MnEA)	Welgene	LS005
M-MLV Набор для синтеза cDNA Kit	Энзимомика	EZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus	KLAB	01-QI685-M-16-C
Пенициллин-стрептомицин	Welgene	LS202-02
Power SYBR-Green PCR мастер-микс	Прикладные биосистемы	4368708
QuanStudio1 Система ПЦР в реальном времени	Прикладные биосистемы	A40425
Пируват натрия	Welgene	LS013
TRIzol	Инвитроген	15596018