Оптимизированная количественная оценка стабильности энхансерной РНК в эмбриональных стволовых клетках мышей

Summary

Этот протокол количественно измеряет стабильность и период полураспада интергенных и интрагенных энхансерных РНК в эмбриональных стволовых клетках мышей с помощью терапии актиномицином D, RT-qPCR и нелинейного регрессионного анализа. Стратегии нормализации, специфичные для позиции, применяются для точного моделирования динамики распада eRNA в контекстно-зависимом виде.

Abstract

Энхансерные РНК (eRNA) — это некодирующие транскрипты, образующиеся из транскрипционно активных энхансерных областей, которые всё чаще признаются ключевыми регуляторами экспрессии генов. Несмотря на их функциональную важность, стабильность и динамика деградации eRNA остаются плохо охарактеризованными, особенно в эмбриональных стволовых клетках (ESC), где транскрипционные программы очень динамичны и зависят от контекста. Этот протокол представляет количественный метод оценки кинетики распада и периода полураспада межгенных и интрагенных eRNA в мышиных ЭСК. Транскрипция ингибируется с помощью актиномицина D, а общая РНК собирается в несколько определённых временных точек. cДНК синтезируется с использованием случайных праймеров гексамеров и олиго(dT) для обнаружения как полиаденилированных, так и неполиаденилированных транскриптов. Для межгенных эРНК нормализация проводится либо с помощью гена, который ведёт хозяйство, либо с помощью значения Ct на момент времени 0 мин. Для внутригенных eRNA используется двойной подход нормализации для минимизации помех от перекрывающихся пре-мРНК. Кривые распада анализируются с помощью однофазной экспоненциальной модели распада, что позволяет точно оценить период полураспада. Протокол показывает, что eRNA в mESC демонстрируют быструю смену с периодом полураспада примерно 2-3 минуты. Эта методология предоставляет надёжную и воспроизводимую основу для изучения стабильности eRNA, предоставляя представление о активности энхансера и динамике РНК в контекстах плюрипотентных стволовых клеток.

Introduction

Энхансеры — это цис-регуляторные элементы (CRE), которые регулируют экспрессию генов, специфичных для тканей и стимулов, служа платформами связывания транскрипционных факторов и ко-регуляторов 1,2,3,4,5,6. Хотя энхансеры могут находиться удаленно от целевых генов на уровне линейного генома, механизмы петли хроматина обеспечивают пространственную близость к промоторам, что способствует регуляции транскрипции. Активные энхансеры транскрибируются двунаправленно РНК-полимеразой II (Pol II), образуя длинные некодируемые РНК, известные как энхансерные РНК (eRNA), которые обычно имеют медианную длину примерно 1^кб 1,2,7,8,9. Экспрессия eRNA тесно коррелирует с активацией близлежащих целевых^генов 10,11,12, и функциональные исследования последовательно показывают, что истощение eRNA снижает транскрипцию их целевых генов, что свидетельствует о деятельности eRNA как функциональные регуляторы, а не в качестве транскрипционных побочных ^{продуктов} 13,14,15,16,17 . Несмотря на их функциональную значимость, экспериментальные протоколы для надёжного обнаружения и количественной оценки eRNA остаются ограниченными.

В стволовых клетках активность энхансера играет ключевую роль в поддержании плюрипотентности и стимулировании переходов в^{развитие 18,19}. Энхансеры могут находиться в межгенных областях (интергенные или экстрагенные энхансеры) или быть встроены в генные тела как интрагенные^{энхансеры 8}. Хотя интергенные энхансеры были широко изучены в различных типах клеток, интрагенные энхансеры остаются относительно недоизученными из-за технических проблем, таких как перекрытие транскрипции с пре-мРНК гена хозяина и наличие модификаций гистонов, связанных с транскрипционным^{удлинением 20,21}. Тем не менее, недавние исследования показали, что как интергенные, так и интрагенные энхансеры вносят вклад в регуляторные сети генов, участвующих в плюрипотентности^22,23 и ранней дифференцировке²⁴ в ЭСК. Примечательно, что почти половина всех аннотированных энхансеров имеют интрагенные^20,25, а их активность варьируется на разных этапах развития, часто увеличиваясь в дифференцированных^{тканях 8,26,27,28}. Однако распространённость и функциональная роль интрагенных энхансеров в ЭСК остаются неполностью изученными. В частности, в то время как интергенные eRNA транскрибуются между генами, внутригенные eRNA транскрибуются внутри тел генов и могут перекрываться с пре-мРНК-транскрипциями. Это позиционное различие требует различных аналитических подходов при интерпретации и количественной оценке межгенных и интрагенных eRNA.

В отличие от мРНК, eRNA обычно не имеют 3′-поли(A) хвоста, что приводит к низкой стабильности и быстрому^{разложению} 1,2,7,8,9. Эта внутренняя нестабильность затрудняет анализ экспрессии eRNA, особенно в экспериментах с временным ходом. В нейронах сообщалось, что eRNA имеют период полураспада всего 7,5 минут¹⁷. Однако остаётся неясным, является ли эта нестабильность устойчивой для разных типов клеток, особенно в ЭСК, где и активность энхансера, и транскрипция eRNA являются высокоспецифическими для типа^клеток 7,17,29,30. ESC полагаются на динамические регуляторные программы генов для поддержания плюрипотентности или инициации дифференцировки, что делает их уникальной системой для изучения оборота^{eRNA 31,32}. Учитывая быстрые транскрипционные сдвиги в ЭСК, понимание распада eRNA в этом контексте может показать, как активность энхансеров регулируется^{временно 17}. Кроме того, различия между межгенными и интрагенными eRNA, такие как перекрытие с транскриптами генов хозяина, требуют отдельных аналитических^{подходов 20}. Несмотря на важность этих вопросов, существует мало стандартизированных методов для измерения времени полураспада eRNA в ESC или для сравнения динамики распада различных типов eRNA.

В данном исследовании представлен количественный протокол для оценки стабильности и периода полураспада eRNA, транскрипцируемых из интергенных и интрагенных энхансеров в mESC. Ингибирование транскрипции достигается с помощью актиномицина D (ActD) на определённых временных интервалах, затем проводится количественное ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) и нелинейный регрессионный анализ для количественной оценки распада eRNA. Для устранения позиционных различий между интергенными и интрагенными энхансерами метод включает различные стратегии нормализации, позволяющие систематически и точно сравнивать динамику деградации eRNA. Эта структурированная аналитическая основа предоставляет ценные данные о обороте eRNA в плюрипотентных стволовых клетках.

Protocol

Все эксперименты в этом исследовании проводились с использованием эмбриональных стволовых клеток мышей (mESC; E14Tg2A), которые не были получены напрямую в нашей лаборатории, а получены из установленной клеточной линии, которая также коммерчески доступна от ATCC (CRL-1821). Таким образом, работа, описанная в этой статье, не требует рассмотрения Институционального комитета по уходу и использованию животных (IACUC) в Национальном университете Чуннам. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Культура клеток mESC

1. Предварительное покрытие 6-колодцевых клеточных культивных пластин с добавлением 0,1% желатина (2 мл на колодцу). Инкубировать тарелки при 37 °C в течение 10 минут.
2. Аспирируйте желатин и по одному разу промывайте каждую глину 1 мл PBS. Стерилизуйте пластины ультрафиолетовым облучением не менее 15 минут.
3. Семена mESC на покрытые желатином пластины с использованием целых 2 мл среды клеточной культуры (Таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте LIF свежей в посевную среду в необходимой концентрации непосредственно перед использованием, исходя из общего объёма среды, необходимого для эксперимента.

Компоненты	Итоговая концентрация	Используемый объем
Минимально необходимая среда Глазго (GMEM)	-	500 мл
Замена сыворотки KnockOut™ (KOSR)	10%	50 мл
Пенициллин-стрептомицин	0.50%	2,5 мл
Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS)	1%	5 мл
Пируват натрия	0,1 мМ / 1 %	5 мл
Раствор незаменительных аминокислот MEM (MnEA)	0,1 мМ/1 %	5 мл
2-меркаптоэтанол	0,1 мМ	910 мкЛ
Ингибиторный фактор лейкемии (LIF)	1000 U/mL	-

Таблица 1: Состав культурной среды mESC. Компоненты и их конечные концентрации, используемые для подготовки среды для культуры mESC. Типичные объёмы указаны на 500 мл общей среды.

4. Поддерживайте клетки в стандартных условиях культуры при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%_CO2 (рисунок 1A).

Рисунок 1: Экспериментальный проект для анализа устойчивости eRNA. (A) Схема эксперимента по транскрипционной остановке. Клетки были покрыты на 6-колодцах, покрытых 0,1% желатином, и обработаны actD (итоговая концентрация: 5 мкг/мл) в указанные моменты времени (0 мин, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 20 и 30 минут) после сбора урожая. (B) Раскладка RT-qPCR анализа. Общая РНК была обратно транскрибирована с помощью случайных гексамерных или олиго(dT) праймеров. Образцы cДНК из каждой временной точки анализировались с помощью RT-qPCR для указанных целей: Tbp_mRNA, межгенная eRNA и внутригенная eRNA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

2. Лечение актиномицином D (ActD)

1. Растворите actD в DMSO, чтобы получить запасной раствор в концентрации 1 мг/^{мл 33}.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя актиномицин D используется здесь для краткосрочного ингибирования транскрипции, альтернативные ингибиторы, такие как триптолид, также могут применяться для блокировки инициации транскрипции в будущих исследованиях. Поскольку и актиномицин D, и ДМСО чувствительны к свету, готовьте стандартный раствор в янтарных микротрубках, защищайте его от света и храните при -20 °C до использования.
2. Через два дня после посева клетки (или в день сбора урожая) добавьте раствор actD в культивационную среду до конечной концентрации 5 мкг/^{мл 33}. Собрать образцы через 0, 5, 10, 15, 20 и 30 минут после обработки (рисунок 1A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя большинство eRNA демонстрируют быстрый распад в диапазоне 0-30 минут, некоторые eRNA могут демонстрировать более длительный период полураспада. В зависимости от характеристик целевого локуса может быть включен дополнительный отбор проб в продленных временных точках (например, 1, 3 часа или 6 ч) для более точного фиксирования кинетики распада. В этом исследовании актиномицин D использовался при концентрации 5 мкг/мл для краткосрочной (≤30 мин) транскрипционной блокады; однако для более длительных инкубаций (>1 ч) рекомендуется снижать концентрацию до 1-2 мкг/мл, чтобы минимизировать клеточные стрессовые реакции. Поскольку сам DMSO может влиять на транскрипционную активность, также следует включить контроль, предназначенный только для DMSO.

3. Экстракция РНК и синтез кДНК

1. Удалите клеточную культурную среду всасыванием и добавьте 1 мл реагента TRIzol в каждую яму. Инкубировать пластины на шейкере в течение 10 минут при комнатной температуре ^{(RT) 34,35}, затем перенесите лизат в новую трубку на 1,5 мл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После обработки TRIzol образцы могут храниться при -80 °C до недели перед извлечением РНК. Поскольку реагент TRIzol содержит фенол и изотиоцианат гуанидиния, которые очень токсичны и коррозионны, обращайтесь с ним с большим осторожностью. Все отходы TRIzol должны собираться в специально отведённом контейнере для органических растворителей для правильной утилизации.
2. Добавьте к каждому образцу 500 мкл хлороформа. Энергично встряхивайте трубки и инкубуйте на RT в течение 3 минут.
3. Центрифугуйте образцы при 13 500 × г в течение 10 минут при 4 °C.
4. Аккуратно перенесите водную фазу в новую трубку объёмом 1,5 мл с равным объёмом изопропанола. Инкубировать смесь в RT в течение 10 минут, чтобы усилить осадки РНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно переносите только прозрачную верхнюю водную фазу, чтобы избежать загрязнения с межфазой. Для повышения выхода РНК инкубировать образцы при -20 °C в течение 1 часа до ночи (O/N) после добавления изопропанола. Для образцов с низким уровнем входа добавьте гликоген (итоговые 10-20 мкг/мл) или GlycoBlue непосредственно перед добавлением изопропанола, чтобы улучшить видимость и эффективность восстановления РНК-гранул. Изопропанол высоковоспламеняющийся и потенциально вреден для здоровья человека; Вдыхание пара или контакт с кожей или глазами может вызвать раздражение, головную боль, головокружение или подавление центральной нервной системы. Обращайтесь с ними осторожно и собирайте все оставшиеся растворы в одобренный контейнер для органических растворителей для правильной утилизации.
5. Снова центрифугуйте образцы при 13 500 × г в течение 10 минут при 4 °C и сбросьте супернатант.
6. Промыйте полученную РНК-гранулу 1 мл 75% этанола. Центрифуга при 6 800 × г в течение 5 минут при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно переверните трубку после добавления этанола, чтобы поднять гранулу.
7. Аккуратно снимите супернатант и высушите гранулы на воздухе 10 минут при 42 °C. Заново суспензуйте высушенные гранулы в воде без РНаз и инкубуйте при 55 °C в течение 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При высокой чистоте РНК белая гранула может стать полупрозрачной в процессе сушки на воздухе. Избегайте пересушения гранулы дольше 10 минут, так как чрезмерное сушение может снизить эффективность подвески.
8. Измеряйте концентрацию и чистоту РНК с помощью спектрофотометра NanoDrop.
9. Синтезировать кДНК из мкг РНК с помощью набора для синтеза кДНК M-MLV, следуя инструкциям производителя (Таблица 2).

Компоненты	Используемый объем
10 X M-MLV RT буфера	2 uL
dNTP	2 uL
Праймер (Random / Olido dT)	1uL
M-MLV RT	1uL
Ингибитор рназы	0,5 мкЛ
Образец РНК	2 мкг (объём регулируется с учетом концентрации образца РНК)
DW	Объём корректируется в зависимости от концентрации образца РНК (чтобы составить итоговый объём)
Общий объём	20 мкЛ

Таблица 2: Состав реакции синтеза кДНК (M-MLV обратная транскриптаза ).Детализированные объемы и реагенты, используемые для обратной транскрипции 2 мкг общей РНК с помощью комплекта синтеза кДНК M-MLV. Объём образца РНК был скорректирован в зависимости от его концентрации, и был добавлен безнуклеазный DW, чтобы увеличить итоговый объём реакции до 20 мкл.

10. Инкубировать реакцию кДНК при 37 °C в течение 2 часов, затем инактивировать фермент при 85 °C в течение 5 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните синтезированную кДНК при -20 °C. Типичная концентрация кДНК составляет примерно 100 нг/мкл. Для обнаружения внутригенных eRNA синтезируйте кДНК из того же образца РНК, используя как случайные гексамерные праймеры, так и олиго(dT)-праймеры.

4. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени (RT-qPCR)

1. Приготовьте реакционную смесь объёмом 10 мкл, содержащую 15 нг кДНК, 5 мкл мастер-смеси Power SYBR Green PCR, 5 пмоль каждого праймера и дистиллированную воду (DW).
   ПРИМЕЧАНИЕ: локусы eRNA часто содержат или находятся рядом с повторяющимися последовательностями, что требует тщательного проектирования праймера. Используйте повторные последовательности с маскировкой для ограничения кандидатных областей и проверки специфичности пар праймеров по всему геному с помощью BLAST. По возможности включайте близлежащие контрольные области, чтобы исключить неспецифическое^{усиление 36}.
2. Выполнить амплификацию с использованием системы ПЦР в реальном времени при следующем условии термического циклирования: начальная активация и денатурация при 50 °C в течение 2 минут и 95 °C в течение 10 минут, затем 40 циклов денатурации при 95 °C в течение 15 секунд, и измерение отжига, расширения и флуоресценции при 60 °C в течение 1^{минуты 34 секунды, 37} (Таблица 3).

Сцена	Шаг	Температура (°C)	Время	Цикл
Удержание этапа	Обратная транскрипция	50	2 минуты	1
	Начальная денатурация	95	10 мин	1
Стадия ПЦР	Денатурация	95	15 с	40
	Отжиг/удлинение	60	1 минута	40
Стадия кривой расплава	Денатурация	95	15 с	1
	Отжиг	60	1 минута	1
	Диссоциация (кривая плавления)	95	15 с	1

Таблица 3: Условия термического цикла для RT-qPCR. Обобщённые температурные, временные и цикловые условия для обратной транскрипции, 40-тактовой qPCR (реакция 10 мкл) и стандартного анализа кривой расплава.

3. Для количественной оценки внутригенного eRNA проанализируйте как Tbp (или другой ген, управляющий/контролирующий), так и внутригенную область энхансера с использованием cДНК, синтезированной с олиго(dT)-праймерами. Для интергенных eRNA используйте только кДНК, синтезированную случайными гексамерными праймерами (Таблица 4 и Рисунок 1B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждую пробу проводите в технических дубликатах (две скважины) для усреднения при анализе данных.

Имя гена	Капсульный зонд	Последовательность (5'-3')	Размеры ампликонов
TBP	Вперёд	TGACTCCTGGAATTCCCATC	122.н.
	Обратный	TTGCTGCTGTCTCTTTTTTTTTTT
Nsun2_mRNA	Вперёд	GGATGAAGCAGTGATCGCAG	93 BP
	Обратный	ATCCACTTCAGTCCTGGCAA
Pou5f1_mRNA	Вперёд	TCCCTACAGCAGATCACTCAC	80 bp
	Обратный	CGCCGGTTACAGAACCATAC
Sox2_mRNA	Вперёд	ACAGATGCAACCGGCACC	105 bp
	Обратный	TGGAGTTGTACTGCAGGGCG
Nsun2_eRNA	Вперёд	CCTGAGAGGTGTTTTTTTTTTTTTTTTT	110 bp
	Обратный	AGGTTAACACATCAGCCCCA
Pou5f1_eRNA	Вперёд	CACTTCTCTGGGGGGGTCTCTGG	107 bp
	Обратный	CCAGGACAAGACAGCCATTG
Sox2_eRNA	Вперёд	AGTCAGCTACATGGGCAGAG	119 н.э.
	Обратный	CCCCTCTTCTCACCGTACAG
Nsun2_negative контроль	Вперёд	CCCCGTGTTTAAGAGGAATGA	88.н.
	Обратный	ACTGAGAACAACCCACCACTAGCA

Таблица 4: Праймерные последовательности для RT-qPCR-анализа. Прямые и обратные праймерные последовательности, используемые для специфической амплификации каждого целевого гена в экспериментах RT-qPCR. Эти праймеры были оптимизированы для точного количественного определения экспрессии мРНК и эРНК.

5. Анализ данных о стабильности ^{eRNA 22}

1. Проанализировать все данные с помощью метода ΔCt и нормализовать относительные уровни eRNA до Tbp_mRNA (Дополнительный файл 1 и рисунок 2A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если разница в значениях Ct между двумя техническими реплицами превышает 0,5, исключите данные из дальнейшего анализа. Рассчитайте относительные уровни экспрессии генов методом ΔCt, вычитая значение Ct контрольного гена (например, Tbp_mRNA) от значения целевого гена (ΔCt = Control_Ct - Target_Ct). Относительное выражение затем может быть вычислено как 2^-ΔCt (Дополнительный файл 2B).
2. Для квантогенной количественной оценки eRNA нормализуйте значения экспрессии, деля значения из cDNA, синтезированной с помощью случайных гексамеров, на значения из cDNA, синтезированной с помощью олиго(dT) праймеров.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите все qPCR-реакции с использованием трёх независимых биологических репликат (n = 3).
3. Нормализуйте уровень выражения каждой временной точки ( полученный методомΔCt) до 0 min и постройте график кривой затухания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя в этом протоколе используется кратковременное лечение актиномицином D, длительное воздействие ингибиторов транскрипции (например, ActD) также может снижать экспрессию генов в домашних условиях. Для более точной количественной оценки мы рекомендуем добавить экзогенную РНК с шипом (например, ERCC) на стадии лизиса клеток для коррекции изменений эффективности экстракции РНК, эффективности обратной транскрипции и точности пипетирования, что обеспечивает более последовательную нормализацию по^{образцам 38,39}.
4. Нормализовать уровни eRNA со временем и подгонять их с помощью нелинейной регрессионной модели (однофазный экспоненциальный спад) в GraphPad Prism (Дополнительный файл 3).
5. Оценить период полураспада eRNA по отдельным биологическим репликам.
   1. Откройте GraphPad Prism и выберите Create > XY (Опции: X = Числа; Y = Введите и постройте по одному значению Y для каждой точки).
   2. Введите точки времени (0, 5, 10, 15, 20 и 30 минут) как значения по оси X.
   3. Перечислите имена выборок по оси Y (группе) и введите соответствующее отдельное значение данных для каждой временной точки.
   4. Выберите Анализ > регрессии и кривые > нелинейной регрессии (подгонка кривой).
   5. Во вкладке Exponential выберите модель однофазного затухания .
   6. В листе «Таблица в результат » рассчитывайте среднее и стандартное отклонение значений полураспада для каждого образца с помощью Excel или аналогичного программного обеспечения. Постройте на графике полученные значения.
6. Кривые затухания с 95% доверительными интервалами
   1. Откройте GraphPad Prism и выберите Create > XY (Опции: X = Числа; Y = Введите 3 значения реплицирования в соседних подстолбцах).
   2. Введите точки времени (0, 5, 10, 15, 20 и 30 минут) как значения по оси X.
   3. Перечислите имена выборок по оси Y (группа) и введите три значения реплицирования для каждого образца eRNA в соответствующий технический лист.
   4. Выберите Анализ > регрессии и кривые > нелинейной регрессии (подгонка кривой).
   5. Во вкладке Exponential выберите модель однофазного распада для анализа.
   6. В таблице «Таблица к результатам» извлеките значения доверительного интервала 95% (CI), полученные в результате анализа тройных образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте следующее уравнение распада: Y = (Y₀ - Плато) • ^e-kt + Плато, где Y — относительный уровень eRNA в момент времени t, Y₀ — начальный уровень eRNA, а k — константа распада. Не фиксируйте плато на нули во время подгонки кривой eRNA, так как предыдущие исследования показывают, что eRNA может сохраняться и не полностью деградировать со^{временем 17,40}. Однако при анализе распада мРНК фиксировать плато на нуле, следуя предыдущим протоколам^{мРНК 41,42}. Позвольте GraphPad Prism автоматически вычислять период полураспада eRNA (t₁/₂) по формуле:_{t 1/2} = In(2)/ k. Введите время в минуте; Сообщайте о результативных значениях полураспада в минимуме.

Results

Для оценки стабильности РНК после транскрипционной остановки mESC были обработаны с помощью actD, а общая РНК была собрана в определённые временные моменты (0 мин, 5 мин, 10 мин, 15 мин, 20 и 30 мин). После синтеза cDNA была проведена RT-qPCR для количественной оценки внутригенной eRNA Nsun2 и Sox2, межгенной eRNA Pou5f1 и соответствующих их мРНК. Эти данные использовались для генерации кривых деградации, зависящих от времени, (...

Discussion

Этот протокол определяет надёжный и воспроизводимый метод измерения устойчивости eRNA в mESC. Критически важные экспериментальные этапы, включая культивирование клеток, обработку актиномицином D, экстракцию РНК и количественную оценку RT-qPCR, ясно иллюстрированы на рисунках и дополнительных файлах, чтобы помочь пользователям пройти через рабочий процесс. Кроме того, подробные аналитические процедуры, такие как нелинейное регрессионное моделирование и интерпретация доверительных интервал...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-меркаптоэтанол	Gibco	21985023
Актиномицин D	Сигма-Олдрич	A9415
Хлороформ	Химикаты Тэджун	2548-4105
DMSO	GenDEPOT	D2680
Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS)	Сигма-Олдрич	F0392
Желатин	Сигма-Олдрич	G1890-100G
Глазго Минимальная необходимая среда (GMEM)	Gibco	11710035
GraphPad Prism (версия 9)	Программное обеспечение GraphPad
изопропанол	Химикаты Тэджун	5035-4105
Замена сыворотки KnockOut (KOSR)	Gibco,	10828028
Ингибиторный фактор лейкемии (LIF)	Merck	ESG1106
Раствор незаменительных аминокислот MEM (MnEA)	Welgene	LS005
M-MLV Набор для синтеза cDNA Kit	Энзимомика	EZ006S
OPTIZEN NanoQ Plus	KLAB	01-QI685-M-16-C
Пенициллин-стрептомицин	Welgene	LS202-02
Power SYBR-Green PCR мастер-микс	Прикладные биосистемы	4368708
QuanStudio1 Система ПЦР в реальном времени	Прикладные биосистемы	A40425
Пируват натрия	Welgene	LS013
TRIzol	Инвитроген	15596018