Методическая статья

Эпигенетическая инженерия клеток K562: двухвекторная эписомальная стратегия для стабильного целевого метилирования ДНК с использованием гибридных белков dCas9-DNMT3A и -HDAC1

DOI:

10.3791/69328

⸱

31 октября 2025 г.

 ,  ,  , 
1Biology Laboratory, School of Science and Technology, Hellenic Open University, 2Division of Pharmacology and Biosciences, Department of Pharmacy, School of Health Sciences, University of Patras

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает неинтегративную эписомальную систему на основе CRISPR/dCas9 для целевого эпигенетического редактирования в клетках K562, сочетающую эффекторы dCas9-DNMT3A и dCas9-HDAC1 со специфическими sgРНК для индуцирования локус-специфичного метилирования ДНК с точностью и уменьшением побочных эффектов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследование точной роли метилирования ДНК в регуляции транскрипции генов и разработка методов лечения, нацеленных на конкретные паттерны метилирования генов, представляет собой серьезную проблему из-за нехватки универсальных инструментов, способных индуцировать сайт-специфичные и долгосрочные эпигенетические модификации для модуляции экспрессии генов. Исследование было направлено на разработку и валидацию инновационной системы на основе эпизодов для содействия стабильному метилированию ДНК в целевом локусе гена, потенциально полезной как для фундаментальных эпигенетических исследований, так и для терапевтических приложений. Для достижения этой цели клеточную линию K562 ко-трансфицировали двумя различными эписомальными векторами. Оба типа векторов были сконструированы для экспрессии направляющих РНК (гРНК), нацеленных на неметилированную область размером 367.о. в пределах острова CpG 326, расположенного выше по течению от гена ZBTB7A . Каждый вектор кодировал деактивированную форму эндонуклеазы Cas9 (мертвую или dCas9), слитую либо с каталитическим доменом ДНК-метилтрансферазы DNMT3A (dCas-DNMT3A-CD), либо с полноразмерной гистондеацетилазой HDAC1 (dCas-HDAC1). Последовательность dCas включала два сигнала ядерной локализации (NLS) для обеспечения ядерного импорта белка. Эта кассета с двойной экспрессией системы поддерживает состояние хроматина, потенциально способствующее долгосрочному эпигенетическому подавлению, обещая надежные и долговечные эпигенетические результаты. Такой промежуточный подход к эпигеному хозяина с использованием самореплицирующихся эписомальных векторов дает ряд преимуществ: поддержание и экспрессия векторов с низким числом копий на протяжении нескольких делений клеток без интеграции в геном хозяина, что сводит к минимуму побочные эффекты и сохраняет целостность генома. Мы сообщаем о точном и значительном увеличении метилирования ДНК на целевом острове ZBTB7A CpG 326. Полученные данные подтверждают, что сконструированные эписомальные системы CRISPR/dCas могут вызывать долгосрочное, сайт-специфичное метилирование ДНК. Таким образом, эта система является ценным исследовательским инструментом для оценки функциональных эффектов изменений направленного метилирования и перспективной платформой для разработки будущих эпигенетических методов лечения.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эпигенетическая регуляция, включая метилирование ДНК и модификации гистонов, играет ключевую роль в контроле экспрессии генов, дифференцировке клеток и стабильности генома. Нарушение регуляции этих механизмов часто участвует - либо как причина, либо следствие - при различных патологических состояниях, особенно при раке, неврологических расстройствах и синдромах импринтинга 1,2,3. Примечательно, что путем точного вмешательства в эпигенетический ландшафт в конкретных геномных локусах с использованием технологии редактирования эпигенома Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) можно достичь уровней репрессии генов, сопоставимых с теми, которые наблюдаются в моделях нокаута генов, без изменения основной последовательностиДНК. В результате, целенаправленное эпигенетическое редактирование стало многообещающей стратегией для анализа механизмов регуляции генов и разработки прецизионной терапии.

Ингибиторы ДНК-метилтрансферазы (DNMT) и ингибиторы гистондеацетилазы (HDAC) являются эпигенетическими препаратами, одобренными в настоящее время для клинического использования. Тем не менее, эти агенты неизбирательно нацелены на эпигенетические маркеры по всему геному, изменяя глобальные состояния хроматина, вызывая побочные эффекты и токсичность у пациентов5. Для устранения ограничений традиционных эпигенетических агентов были разработаны программируемые эпигенетические редакторы на основе каталитически мертвого Cas9 (dCas9), слитого с эффекторными доменами, такими как ДНК-метилтрансферазы (например, DNMT3A), деметилазы (например, TET1), гистонацетилтрансферазы (например, p300) или деацетилазы (например, HDAC3) 6,7,8,9 . Эффекторная система dCas9 позволяет осуществлять локус-специфичную модификацию эпигенома, управляемую небольшой молекулой РНК, известной как однонаправляющая РНК (sgRNA), без введения двухцепочечных разрывов в целевой последовательности. Недавние исследования продемонстрировали их использование в модификации экспрессии генов, ремоделировании доступности хроматина и даже перепрограммировании клеточных фенотипов 10,11,12.

Несмотря на быстрый прогресс, системы эпигеномной инженерии на основе dCas9 продолжают сталкиваться с некоторыми ограничениями. Наиболее распространенной проблемой являются побочные эффекты из-за неспецифичности эпигенетических эффекторных доменов, особенно при сильной или длительной экспрессии инструментов слияния dCas913,14. Кроме того, большой размер сплавов dCas9 создает значительные проблемы с доставкой. Размер последовательности Streptococcus pyogenes Cas9 (SpCas9) составляет примерно 4,2kb15, что сопоставимо с максимальным размером емкости векторов аденоассоциированного вируса (AAV). В то время как лентивирусные векторы обладают относительно большой емкостью (~12-1 kb), позволяющей доставлять полноразмерный SpCas9, слитый с эпигенетическими эффекторами, они все еще сохраняют возможность случайной геномной интеграции, что создает риск инсерционного мутагенеза и ограничивает их клиническоеприменение. С другой стороны, невирусные подходы, такие как трансфекция плазмид, страдают от плохого удержания в делящихся клетках. Переходные подходы или подходы к доставке «бей и беги» исключают возможность геномной интеграции, но часто не могут поддерживать изменения метилирования между клеточными делениями, если только они не сочетаются с ремоделлерами хроматина или кооперативными эффекторами 17,18,19.

Для решения этих проблем мы использовали неинтегративную, самовоспроизводящуюся эписомальную векторную систему (pEPI-S/MAR) для доставки эпигенетических эффекторов, слитых с dCas9. Этот вектор экстрахромосомно персистирует в делящихся клетках при низком числе копий (~1-2 на клетку), обеспечивая устойчивую, но умеренную экспрессию, чтобы свести к минимуму нежелательные функции, связанные с гиперэкспрессией20,21. Элемент Scaffold/Matrix Attachment Area (S/MAR) эписомы взаимодействует с ядерным матриксом, способствуя стабильному поддержанию эписомы в ядре клетки во время деленияклетки 22,23. Кроме того, векторная система pEPI позволяет избежать рисков, связанных с интеграцией вируса, и позволяет создавать конструкты без превышения лимитов упаковки.

Недавние исследования показали, что промоторные области, отмеченные активными модификациями гистонов, в частности ацетилированием H3K27 (H3K27ac), часто устойчивы к модифицированному метилированию ДНК. Было показано, что комбинаторные подходы, которые либо удаляют, либо добавляют гистоновые метки с помощью пишущих или ластиков модификаций гистонов и одновременно вводят метилирование ДНК через DNMT3A, увеличивают стабильность и персистенцию подавления генов, даже при переходных подходах19,24. Основываясь на этих выводах, мы предположили, что совместная доставка dCas9-HDAC1 и dCas9-DNMT3A и нацеливание на соседние генетические области будет способствовать ремоделированию хроматина и способствовать более эффективному и долговечному метилированию в целевых регуляторных элементах.

В этом исследовании мы стремились спроектировать и сконструировать систему, способную доставлять целевое и стабильное метилирование ДНК на CpG-остров 326 ZBTB7A, область, характеризующуюся низким эндогенным метилированием и аберрантными метками H3K27ac в клетках K562. Цель данного исследования состояла в том, чтобы доставить две эписомальные конструкции, кодирующие dCas9, слитые с каждым из различных эпигенетических эффекторов, вместе с sgРНК, нацеленными на богатую CpG регуляторную область выше гена ZBTB7A с использованием низкоэкспрессивной, стабильной, неинтегративной системы pEPI. Как показано на рисунке 1, котрансфекция клеток K562 с этими эписомами позволяет осуществлять двойное рекрутирование редакционных комплексов в интересующий остров CpG, где HDAC1 удаляет локальное ацетилирование гистонов для облегчения последующего метилирования ДНК DNMT3A, что приводит к скоординированной и сайт-специфической эпигенетической модификации.

Описанная здесь система подходит для приложений, в которых доставка вируса невозможна из-за размера конструкции, проблем с безопасностью или ограничений по стоимости. Он поддерживает модульное клонирование различных sgРНК и эффекторных слияний, что делает его адаптируемым к целому ряду целевых локусов. В настоящее время он лучше всего подходит для in vitro или доклинических исследований на клеточных линиях, которые переносят трансфекцию плазмид и выбор антибиотиков. В нашей реализации эписомальная доставка в клетки K562 достигалась с помощью реагентов на основе липофектамина и поддерживалась при селекции G-418.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Дизайн sgРНК

  1. Определите желаемый островок CpG или регуляторные сайты CpG в промоторной области интересующего гена с помощью браузера генома (например, браузера генома UCSC). В данном случае дизайн был применен на острове CpG 326 (GRCh38) гена ZBTB7A .
  2. Проектирование однонаправляющих РНК (sgRNAs) с помощью онлайн-платформы для проектирования sgRNA CRISPR [например, веб-инструмента CHOPCHOP (версия 3)]. При проектировании sgРНК следуйте приведенным ниже рекомендациям, чтобы обеспечить высокую целевую активность и минимальные побочные эффекты:
    1. Выберите белок SpCas9 в качестве эндонуклеазы, используя 5'-NGG-3' в качестве протоспейсерного соседнего мотива на 3'-конце (PAM-3').
    2. Выберите длину sgРНК равной 20.о. (помимо последовательности PAM). Разрешить нецелевые совпадения только с тремя несоответствиями в последовательности протоспейсера.
    3. При выборе целевой области гена выберите опцию «Промотор» и определите диапазон вверх по течению (например, от 1500.о. до 3000.о. вверх по течению для острова CpG 326), чтобы расположить sgРНК в регуляторной области.
    4. Используйте целевые показатели эффективности, такие как разработанные Doench et al.25, для оценки активности sgRNA.
  3. При выборе sgРНК для экспериментального использования учитывайте следующие критерии:
    1. Ранжируйте все потенциальные sgРНК по эффективности для целевого региона. Выбирайте sgРНК в верхних 10-20% прогнозируемой эффективности. При выборе следует избегать sgРНК с несоответствиями (MM0, MM1, MM2, MM3) на потенциальных нецелевых сайтах.
    2. Выбирайте sgРНК, которые нацелены на изначально неметилированные или слабо метилированные участки для репрессии транскрипции с помощью dCas9-DNMT. Для репрессии транскрипции с использованием dCas9-HDACs нацельтесь на высокоацетилированные участки для повышения эффективности. Используйте онлайн-базы данных (например, ChIP-Atlas) для подтверждения метилирования ДНК и меток ацетилирования гистонов в клетках K562 в целевых локусах.
    3. Используйте несколько sgРНК для покрытия целевых областей размером более 100-200.о.26.
      Эпигенетические модификации (метилирование и деацетилирование) влияют на области вверх и вниз по течению от сайта связывания sgРНК, и эти эффекты могут быть ограничены короткими геномными промежутками.
    4. Выбирайте sgРНК с содержанием GC от 40% до 80%.
      Примечание: Содержание GC в sgРНК имеет важное значение, так как более высокое содержание GC улучшает стабильность РНК и связывание dCas.
    5. Избегайте sgРНК, содержащих участки из четырех или более тимидинов (Ts), и выбирайте sgРНК с нуклеотидами аденина или тимина, расположенными на четыре основания выше сайта PAM.
      Примечание: Четыре или более T могут привести к преждевременному прекращению транскрипции. sgРНК с A или T, расположенными на четыре основания выше по течению от сайта PAM, могут демонстрировать более сильное связывание dCas.
    6. Проверяйте и избегайте sgРНК с высокой самокомплементарностью, чтобы свести к минимуму риск образования вторичной структуры.
    7. Завершите выбор нескольких последовательностей sgRNA.
      Примечание: Четыре sgРНК были разработаны, охватывающие остров CpG 326. Последовательности-мишени sgRNA1-4 и целевые позиции на CpG-острове 326 показаны в дополнительной таблице 1.
  4. Преобразуйте выбранную последовательность sgRNA (за исключением триплета PAM) в ее обратный комплемент. Добавьте GATCG к 5'-концу прямой последовательности, G — к ее 3'-концу, AAAAC — к 5'-концу обратной комплементарной последовательности, а C — к ее 3'-концу. Закажите два окончательных олигопласта для каждой sgRNA у коммерческого поставщика олиго.

2. Клонирование

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом разделе описывается адаптация плазмиды pEPI-1 для генерации эписомальных векторов, несущих как dCas-эпигенетическое слияние эффекторов, так и кассеты экспрессии sgРНК. На рисунке 2 представлен полный обзор рабочего процесса клонирования и векторной архитектуры. Все описанные ниже реакции рестрикционного расщепления и лигирования проводились в соответствии с рекомендованными производителем протоколами для каждого используемого фермента и реагента, а спецификации реакции подробно перечислены в дополнительной таблице 2.

  1. Расщепляют плазмиду pEPI-1 с помощью AgeI и BspEI, которые фланкируют кодирующую последовательность eGFP (усиленный зеленый флуоресцентный белок). После рестрикционного расщепления притупляют образовавшиеся выступы с помощью фрагмента Кленоу ДНК-полимеразы I. Лигируют плазмидный остов с тупым концом с помощью Т4 ДНК-лигазы для генерации вектора, удаленного eGFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Делеция гена eGFP выполняется для уменьшения общего размера вектора. Больший размер вектора может ограничить последующие этапы клонирования и трансфекции.
  2. Получите кодирующие последовательности для каталитического домена (CD) гена DNMT3A и полной длины гена HDAC1 . Добавьте стоп-кодон на 3' (нисходящем) конце каждой кодирующей последовательности. Добавьте сайты рестрикции BglII (5') и AseI (3'), фланкирующие последовательности.
  3. Расщепляйте удаленный eGFP вектор pEPI-1 с помощью BglII и AseI. Отдельно расщепляют подготовленные кодирующие последовательности DNMT3A(CD) и HDAC1 с помощью тех же ферментов. Проводят две независимые реакции лигирования:
    1. Лигируйте фрагмент DNMT3A(CD) в расщепленный вектор для генерации конструкции pEPI-1-DNMT3A.
    2. Лигируйте фрагмент HDAC1 в расщепленный вектор для генерации конструкции pEPI-1-HDAC1.
      Примечание: Сайты BglII и AseI размещают вставки ниже промотора pCMV и перед элементом S/MAR для оптимальной экспрессии.
  4. Трансформируйте химически компетентные Escherichia coli (например, NEB 5-alpha Competent E. coli, High Efficiency) продуктами лигирования от каждого вектора отдельно. Трансформированные клетки помещают на LB агар, содержащий канамицин (50 мкг/мл), и инкубируют в течение ночи при 37 °C. Отбирают положительные колонии и выделяют плазмидную ДНК с помощью метода быстрого кипячения miniprep27,28.
  5. Получить последовательность, кодирующую каталитически мертвый SpCas9 (dCas9). Введите следующие элементы в указанном порядке:
    1. На 5'-конце: сайт рестрикции AscI, консенсусная последовательность Козака и стартовый кодон (ATG).
    2. На 3'-конце: NLS, опционально HA-tag, за которым следует сайт ограничения BamHI.
  6. Расщепляйте векторы pEPI-1-DNMT3A и pEPI-1-HDAC1 с помощью AscI и BamHI. Выполните такую же обработку на вставке dCas9. Лиговать фрагмент dCas9 в каждый соответствующий вектор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сайты AscI/BamHI гарантируют, что dCas9 вставляется перед DNMT3A или HDAC1, непосредственно после промотора pCMV. Убедитесь, что между dCas9 и эпигенетическим эффектором присутствует короткий линкер или несколько нуклеотидов для поддержания правильной рамки считывания.
  7. Преобразуйте конечные продукты лигирования в высокоэффективные компетентные штаммы E. coli с жестким контролем экспрессии плазмид (например, NEB 5-alpha F'Iq Competent E. coli, High Efficiency). Подбираем трансформаторы на пластинах с канамицином. Получите высококачественную плазмидную ДНК из положительных клонов методом быстрого кипячения miniprep.
  8. Секвенирование окончательных плазмидных конструкций (pEPI-1-dCas9-DNMT3A и pEPI-1-dCas9-HDAC1) с использованием нанопорового секвенирования для подтверждения правильной сборки всех компонентов, проверка рамки считывания с помощью онлайн-инструмента трансляции (например, Expasy translate tool 3.0) и проверка на наличие потенциальных мутаций или рекомбинационных событий с помощью онлайн-инструмента выравнивания (например, инструмента выравнивания BLAST).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крупные векторы более склонны к рекомбинации и могут накапливать мутации. Поэтому тщательная проверка последовательности имеет важное значение.
  9. Фосфорилирование 5'-гидроксильных групп олигонуклеотидов прямой и обратной sgRNA с использованием полинуклеотидкиназы T4. Гибридизуйте две комплементарные цепи, нагревая смесь до 90 °C в течение нескольких минут, чтобы денатурировать вторичные структуры, затем дайте им возможность постепенно остыть до комнатной температуры в течение ночи для полного отжига в двухцепочечную ДНК.
  10. Расщепите выбранный вектор экспрессии sgРНК pGuide с помощью BamHI и Esp3I. Лигируйте отожженный двухцепочечный фрагмент sgРНК в линеаризованный вектор с помощью ДНК-лигазы Т4.
  11. Используя специфические праймеры ПЦР (Дополнительная таблица 3), амплифицируйте полную кассету экспрессии гРНК, содержащую (1) промотор U6, (2) клонированную последовательность sgRNA и (3) скаффолд sgРНК. Используйте высокоточную ДНК-полимеразу, которая не образует 3'-выступов (т.е. корректурную полимеразу), чтобы получить чистые, тупые ПЦР-продукты, пригодные для последующего клонирования.
  12. Повторите шаги 2.9-2.11 для каждой отдельной гРНК, разработанной в разделе 1. Убедитесь, что каждая кассета с гРНК подготовлена и амплифицирована отдельно, чтобы сохранить целевую специфичность.
  13. Расщепляйте векторы pEPI-1-dCas9-DNMT3A и pEPI-1-dCas9-HDAC1 с SacII. Притупите липкие концы с помощью фрагмента Кленоу ДНК-полимеразы I. Клонируйте ранее амплифицированные кассеты промотор-sgRNA-скаффолд U6 в эти векторы с помощью Т4-лигазы.
    Примечание: Несколько комбинаций гРНК-эпигенетических эффекторов (например, sgRNA1-dCas9-DNMT3A, sgRNA2-dCas9-HDAC1 и т.д.) были сконструированы в ходе экспериментальной фазы. Тем не менее, только две выбранные комбинации были перенесены в эксперименты, представленные в последующих разделах.
  14. Преобразуйте конечные продукты лигирования в высокоэффективные компетентные штаммы E. coli с жестким контролем экспрессии плазмид. Подбираем трансформаторы на пластинах с канамицином. Получите высококачественную плазмидную ДНК из положительных клонов методом быстрого кипячения miniprep.
  15. Секвенирование окончательных плазмидных конструкций с помощью нанопорового секвенирования, проверка рамки считывания и проверка на потенциальные мутации или события рекомбинации.

3. Культивирование и трансфекция клеток

  1. Клетки K562 поддерживаются в колбах с культуральными культурами T-75 при температуре 37 °C, ниже 5%CO2 и влажности. Используйте модифицированную среду Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (FBS), 1× раствора пенициллина/стрептомицина (Pen/Strep).
  2. Подготавливают плазмиды к трансфекции:
    1. Используйте 8 г общей плазмидной ДНК на одну трансфекцию, следовательно, 4 мкг каждой плазмиды для совместной трансфекции двух плазмид. Количественно определите ДНК с помощью абсорбции при длине волны 260 нм, а затем разведите необходимое количество в 90 мкл сверхчистой воды.
    2. Добавьте 10 мкл 3 М раствора ацетата натрия и 2,5 объема 100% этанола в разбавленную ДНК.
    3. Тщательно перемешайте и инкубируйте при температуре -20 °C в течение ночи, чтобы ДНК выпала в осадок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При совместной трансфекции двух плазмид с различными комбинациями гРНК-эпигенетических эффекторов (например, gRNA1-dCas9-DNMT3A и gRNA2-dCas9-HDAC1) рекомендуется объединить обе плазмиды в одну пробирку для осаждения для упрощения работы с последующими процедурами.
    4. На следующий день центрифугируйте пробирки для осаждения ДНК при давлении 11 000 × г в течение 15 минут при 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте все последующие шаги в стерильных условиях в шкафу биобезопасности, так как этот этап также включает в себя работу с живыми клетками.
    5. Аккуратно выбросьте надосадочную жидкость. Добавьте 500 мкл 70 % этанола для промывки гранул. Центрифугируйте при 11 000 × г в течение 5 минут при 4 °C.
    6. Полностью удалите надосадочную жидкость из этанола. Дайте грануле высохнуть на воздухе до тех пор, пока не останется видимого этанола.
    7. Тщательно суспендируйте высушенную гранулу ДНК в 50 μл DMEM. Держите раствор плазмид-DMEM при температуре 4 °C до использования.
    8. Пропустите 400 нг подготовленной эписомальной ДНК (примерно 2,5 мкл ресуспендированного раствора) на 1% агарозный гель, чтобы проверить успешность очистки и целостности ДНК перед трансфекцией.
  3. Подготовьте клетки:
    1. Соберите клетки K562 из колбы T-75, когда культуры достигнут 50-60% конфлюенции, чтобы обеспечить эффективность трансфекции.
    2. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Перенесите объем, содержащий 2 × 105 клеток, в 35-миллиметровую культуральную чашку, содержащую 900 мкл DMEM без FBS или антибиотиков.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте DMEM без сыворотки на всех этапах процедуры трансфекции. К полному среднему режиму культивирования следует приступать только после завершения инкубационного периода трансфекции.
    3. Поместите чашку в инкубатор (37 °C, 5%CO2), чтобы клетки были готовы к трансфекции.
  4. Используйте набор для трансфекции на основе липофектамина для доставки плазмид. Следуйте инструкциям производителя для конкретного используемого комплекта, при необходимости регулируя объемы.
    1. Добавьте 3 мкл реагента Р3000 (входит в комплект для трансфекции) в приготовленный раствор плазмиды-DMEM. Аккуратно перемешать и инкубировать смесь реагентов Plasmid-P3000 при комнатной температуре в течение 5 минут.
    2. Добавьте 5 μL реагента Lipofectamine 3000 (входит в комплект для трансфекции) вместе с достаточным количеством DMEM для достижения общего объема реакции 100 μL. Инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут.
    3. Добавьте полную трансфекционную смесь объемом 100 мкл в 35-миллиметровую чашку, содержащую клетки. Аккуратно встряхните тарелку, чтобы разогнать смесь, затем верните чашку в инкубатор.
  5. Через 24 ч после трансфекции добавьте 3 мл полной среды (DMEM с добавлением 10% FBS и 1× Pen/Strep) в каждую 35-миллиметровую чашку, чтобы инициировать пролиферацию трансфицированных клеток. Через 72 часа после трансфекции начните процедуру выбора с добавления антибиотика G-418 до конечной концентрации 1 мг/мл.
  6. После того, как отбор будет адекватно установлен и общее количество клеток превысит 1 × 106, приступайте к выделению одиночных клонов (рисунок 3A) с использованием флуоресцентно-активируемой сортировки клеток (FACS):
    1. Соберите клетки центрифугированием при 300 × г в течение 6 мин при 25 °C. Промойте один раз 1× стерильным фосфатно-солевым буфером (PBS, pH ~7,4) и снова центрифугируйте в тех же условиях.
    2. Ресуспендируйте клеточную гранулу в 1× PBS и определите концентрацию клеток с помощью гемоцитометра. Разбавляют суспензию до 1 ×10 6 клеток/мл, обеспечивая тщательную ресуспендию.
    3. Настройте более короткий режим FCS на одноклеточный (обеспечивает 1 клетку на каплю), используя 96-луночный планшет, обработанный культурой тканей, в качестве устройства для сбора. При необходимости отрегулируйте настройки программного обеспечения в зависимости от используемого прибора (Рисунок 3B).
    4. Зарегистрируйте первичную популяцию на основе ожидаемого размера (FSC) и гранулярности (SSC). Исключите мусор (низкий FSC/SSC) и высокозернистый или мертвый материал (высокий SSC). Используйте точечные графики FSC-A против FSC-H или SSC-A против SSC-H для синглетов вентилей.
    5. Предварительно заполните 96-луночный планшет 100 мкл полной среды, содержащей 1 мг/мл G-418 на лунку. Прогрейте тарелку в инкубаторе перед сортировкой.
    6. Выполняйте сортировку в режиме по одной ячейке, поддерживая скорость сортировки ниже 300 событий в секунду для повышения точности сортировки.
    7. После сортировки осмотрите лунки под микроскопом, чтобы подтвердить по одной ячейке на лунку. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C и содержаниемCO2 5%.
  7. Позвольте клонам одиночных клеток расширяться по отдельности в 96-луночном планшете. Как только клональный рост будет установлен, уменьшите концентрацию G-418 до 400 мкг/мл для поддержания отбора.
  8. Хорошо растущие клоны последовательно перекладывайте в 12-луночные планшеты, затем в колбы Т-25 и, наконец, в колбы Т-75 по мере необходимости, пока каждый клон не достигнет ~1 × 106 клеток.
  9. Собирайте гранулы с двойными ячейками через равные промежутки времени. Храните гранулу при температуре -20 °C для экстракции геномной ДНК. Кроме того, храните гранулу, гомогенизированную в 500 мкл реагента Тризол при -20 °C для экстракции РНК и синтеза кДНК.
    ВНИМАНИЕ: С реагентом Тризол следует обращаться с осторожностью из-за его токсичности и коррозионной природы в вытяжном шкафу для химических веществ при ношении средств индивидуальной защиты, а загрязненные материалы должны иметь маркировку для утилизации опасных отходов.
  10. Экстрагируйте геномную ДНК из выбранных клонов с помощью традиционной фенол-хлороформной экстракции с последующим осаждением этанола.
    ВНИМАНИЕ: Фенол: хлороформ токсичен и вызывает коррозию, и его следует использовать в вытяжном шкафу для химических веществ при ношении средств индивидуальной защиты. Утилизируйте фенол- и хлороформсодержащие отходы как опасные химические отходы.
  11. Убедитесь, что ДНК полностью ресуспендирована в воде без нуклеаз или буфере TE. Измерьте концентрацию и чистоту ДНК с помощью спектрофотометра перед тем, как приступить к последующим применениям.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта ДНК будет использоваться в последующих экспериментах, таких как ПЦР и пиросеквенирование, для оценки эффективности эпигенетического редактирования.
  12. Извлечь общую РНК из клеточных гранул с помощью реагента Тризол с последующим осаждением изопропанола29. Обращайтесь с образцами РНК с осторожностью, не содержа реагентов и одноразовых материалов, а также поддерживая температуру в образцах при температуре 4 °C во время процедуры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Общая РНК будет использоваться для синтеза кДНК с использованием набора для обратной транскрипции.

4. ПЦР для подтверждения наличия обоих эписом у клонов

  1. Соберите примерно 5 × 105 клеток от каждого клона культуры, предварительно тщательно подвергнув клетки. Центрифугируйте при 7 000 x g в течение 3 минут при 25 °C. Откажитесь от надосадочной жидкости.
  2. Промойте камеру путем повторной суспензии в 1× PBS. Снова центрифугируйте в тех же условиях.
  3. Выбросьте надосадочную жидкость, оставив небольшой объем, чуть выше уровня гранул. Используйте 1 мкл клеточной суспензии непосредственно в качестве матрицы для ПЦР.
  4. В качестве альтернативы можно использовать 200 нг очищенной геномной ДНК, извлеченной из трансфицированных клонов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прямая ПЦР из промытых клеток обеспечивает быстрый метод скрининга, но может давать переменные результаты. Для повышения специфичности и чувствительности используйте очищенную геномную ДНК в качестве матрицы.
  5. Приготовьте мастер-смесь для ПЦР в соответствии с таблицей 1.
  6. Используйте два набора праймеров, с общим прямым праймером, нацеленным на последовательность dCas9, и отдельными обратными праймерами, специфичными для каждого эпигенетического эффекторного вектора (дополнительная таблица 3).
  7. Следуйте условиям езды на велосипеде, представленным в таблице 2.
  8. Запустите ПЦР-препараты на агарозном геле или проанализируйте с помощью капиллярного электрофореза для проверки размеров продуктов: 230.о. для DNMT3A-содержащего вектора и 205.о. для HDAC1-содержащего вектора (рис. 3C). Включите положительный контроль (смесь обеих плазмид в концентрации 10-20 нг) для подтверждения ожидаемых размеров полос и валидации эффективности ПЦР. Включите элемент управления без шаблонов (NTC).
РеагентКонечная концентрация/количество
10× Буфер1×
Передний праймер1 μΜ
Обратные грунтовки0,5 мкМ
ДНК200 нг
Полимераза1.25 ед
dNTP200 мкМ каждый
Вода, без нуклеаздо 50 μл

Таблица 1: Реакционная смесь ПЦР для верификации эписом.

ШагТемпература, °СВремяКоличество циклов
Первичная денатурация953 мин1
Денатурация9530 с30
Отжиг5830 с
Расширение721 мин
Окончательное продление725 мин1

Таблица 2: Условия цикличности ПЦР для верификации эписом.

5. Таргетный анализ пиросеквенирования

  1. Обработайте гДНК (1,5 мкг), извлеченную из трансфицированных клонов, с помощью набора для преобразования бисульфита в соответствии с инструкциями производителя.
  2. Грунтовки для проектирования, расположенные по бокам от участков CpG в пределах нормативной области, на которую нацелены конструкции. Используйте специальный инструмент для разработки бисульфитной грунтовки. Следуйте этим рекомендациям по проектированию:
    1. Преобразуйте остров CpG или область регулирования площадки CpG в версию, преобразованную из бисульфита.
    2. Разработка прямого и обратного праймера для ПЦР-амплификации бисульфит-преобразованной ДНК. Включите этикетку с биотином на один праймер (обычно на обратной стороне) для иммобилизации на бусинах, покрытых стрептавидином.
    3. Разработайте праймер для секвенирования (18-25.н.) внутри продукта ПЦР, перед первым интересующим CpG. В качестве целевой области выберите окно 100.о. вверх или ниже по течению от сайта связывания sgRNA для оценки потенциальных локальных эпигенетических модификаций.
    4. Избегайте сайтов CpG в последовательностях праймеров, чтобы обеспечить несмещенную амплификацию.
    5. Выберите пару праймеров с оценкой программного обеспечения Assay Design более 75 % и рейтингом качества «высокий» (синий), что указывает на то, что анализ программного обеспечения не выявил никаких проблем или опасений.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для последовательностей праймеров, предназначенных для нацеливания на CpG-остров 326, см. Дополнительную таблицу 3. Праймеры были разработаны для связывания в областях, фланкирующих сайты связывания sgRNA1 и sgRNA2, что позволяет секвенировать сайты CpG, окружающие целевые локусы.
  3. Настройте ПЦР-реакцию с использованием высокоточной ДНК-полимеразы с горячим запуском, оптимизированной для бисульфитных шаблонов.
  4. Процедура пиросеквенирования:
    1. Связывайте биотинилированные продукты ПЦР с покрытыми стрептавидином гранулами сефарозы и изолируйте одноцепочечную ДНК с помощью рабочей станции для пиросеквенирования.
    2. Добавьте праймер для секвенирования к одноцепочечной ДНК в буфере для отжига. Нагрейте смесь до 80 °C в течение 2 минут, затем дайте ей постепенно остыть до комнатной температуры.
    3. Выполнение реакций секвенирования с помощью прибора для пиросеквенирования и порядка дозирования, определенного во время разработки праймера.
  5. Анализ данных:
    1. Используйте специальное программное обеспечение для пиросеквенирования для количественной оценки процентного метилирования в каждом сайте CpG.
    2. Сравните уровни метилирования между трансфицированными и нетрансфицированными клонами. Оцените эффективность редактирования (Рисунок 3D). Рассмотрите возможность проведения двухстороннего непарного t-теста для сравнения уровней метилирования между необработанным контролем и каждым трансфицированным клоном в каждом отдельном сайте CpG.

6. Синтез кДНК и цифровая ПЦР для анализа экспрессии dCas

  1. Приготовьте общую РНК (1100 нг за реакцию), экстрагированную из трансфицированных клонов, в 12 мкл воды, не содержащей РНКазы. Храните образцы на льду.
  2. Соберите смесь для элиминации геномной ДНК на льду: смешайте 2 мкл буфера для уничтожения гДНК, образец РНК, содержащий 1100 нг общей РНК, и воду, не содержащую РНКазы, до конечного объема 14 мкл. Инкубируйте в течение 2 мин при 42 °C, затем положите на лед.
  3. Приготовьте мастер-смесь для обратной транскрипции на льду: смешайте 4 мкл RT Buffer с 1 мкл RT праймеров и добавьте 1 мкл обратной транскриптазы.
  4. Соедините 14 мкл смеси для элиминации геномной ДНК с 6 мкл мастер-смеси для обратной транскрипции до общего объема реакции 20 мкл. Осторожно перемешайте и инкубируйте при 42 °C в течение 15 мин. Инактивировать обратную транскриптазу путем нагревания при 95 °C в течение 3 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Храните кДНК при температуре -20 °C до дальнейшего использования.
  5. Разбавьте кДНК из всех образцов в соотношении 1:1 водой, не содержащей нуклеаз. Используйте разведенную кДНК для последующего цифрового ПЦР-анализа с использованием цифровой ПЦР-системы с dCas-специфичными праймерами (дополнительная таблица 3):
    1. Приготовьте смесь 4× Master и смесь для реакции в соответствии с таблицей 3. Добавьте в смесь разбавленную кДНК и аккуратно пипеткой, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройте реакции хотя бы в дубликатах для всех клонов. Включите отрицательный контроль (кДНК из необработанных клеток K562) и NTC.
    2. Загрузите по 9 мкл реакционной смеси в каждую лунку ПЦР-планшета. Настройте систему ПЦР с использованием условий цикличности, представленных в таблице 4.
    3. Выберите канал красителя FAM для обнаружения и начните прогон.
    4. После завершения извлеките образцы и проанализируйте данные.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цифровая ПЦР сообщает результаты в виде копий на мкл реакции.
    5. Умножьте указанное значение (копий/мкл) на объем реакции (10 мкл), чтобы получить общее количество копий за реакцию. Разделите это значение на количество кДНК в реакции, чтобы получить копии на нг кДНК (эквивалентно входу нг РНК).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если следовать точному протоколу, то каждый образец начинается с 1100 нг РНК в реакции RT объемом 20 мкл (55 нг/мкл). После разведения 1:1 рабочая концентрация составляет 27,5 нг/мкл, а поскольку в каждую реакцию ПЦР добавляется 1 мкл, это соответствует 27,5 нг кДНК (РНК-эквивалент) на одну реакцию.
Мастер-микс (4×)
РеагентКонечная концентрация/количество
25× SYBR Зеленый краситель2×
5× Цифровая ПЦР-смесь4×
Вода, без нуклеаздо 100 μл
Реакционная смесь
РеагентКонечная концентрация/количество
4× Мастер-микс1×
Передний праймер1 μΜ
Обратный праймер1 μΜ
кДНК (разбавленная)1 μл
Вода, без нуклеаздо 10 мкл

Таблица 3: 4× Мастер-смесь и реакционная смесь для цифрового ПЦР-анализа экспрессии dCas.

ШагТемпература, °СВремяКоличество циклов
Первичная денатурация9610 мин1
Денатурация965 с40
Отжиг/удлинение6015 с

Таблица 4: Циклические условия для цифровой ПЦР.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы выяснить, могут ли наши инструменты целевого эпигенетического редактирования индуцировать сайт-специфические изменения метилирования ДНК на CpG-острове 326 ZBTB7A , мы сначала сгенерировали эписомальные векторы, кодирующие dCas9, слитые с DNMT3A(CD) или HDAC1, вместе с различными sgРНК, разработанными с сайтами-мишенями в пределах CpG-острова 326. Первоначально мы совместно трансфицировали клетки K562 с комбинациями этих плазмид, чтобы оценить, может ли одновременная доста...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Одним из наиболее важных этапов в этом протоколе является разработка высокоспецифичных sgРНК. Побочные эффекты являются известным ограничением эпигенетических систем редактирования на основе CRISPR, которое часто может возникать из-за неверности связывания dCas9, а также из-за неспецифической активности эффекторных доменов. Чтобы свести это к минимуму, sgРНК должны быть спроектированы с использованием биоинформационных инструментов, которые оптимизируют для обеспечения высокой целевой ак...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых или нефинансовых интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ирен Дереки и Василики Чондру получают трехлетнюю стипендию (грант No 80706) от Специального счета исследовательских фондов (ELKE) Греческого открытого университета.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Absolute Q DNA Digital PCR мастер-микс (5 раз)Прикладные биосистемыA52490
AgeI-HF NEBR3552
AscINEBR0558
AseINEBR0526
BamHI-HFNEBR3136
Сортировщик мелодийных ячеек BD FACSBD
БгллNEBR0144
BspEINEBR0540
Смесь раствора дезоксинуклеотида (dNTP) (по 10 мМ каждая)NEBN0447
DMEM с высоким содержанием глюкозы со стабильным глутамином, с средой на основе пирувата натрияBiowestL0103
ДНК-полимераза I, крупный (Кленов) фрагментNEBM0210
DNMT3A (CD), HDAC1 последовательностиIDT
DreamTaq ДНК-полимераза  Thermo ScientificEP0712
EpiTectЦягэн59104комплект для конвертации бисульфита;
Набор Epitect BisulfiteЦягэн59104
Esp3INEBR0734
Сыворотка плода для быкаGibcoA5256701
Селективный антибиотик генетицин (сульфат G418)Gibco11811031
Комплект для трансфекции липофектамина 3000ИнвитрогенL3000015
NEB®   5-альфа компетентный E. coli  (Высокая эффективность)NEBC2987I
NEB®   5-альфа F'Iq  Компетентный E. coli  (Высокая эффективность)NEBC2992H
Нуклеоспинная ткань Мачери-Нагель740952.50
PBS, pH 10x в растворе 7,4ЛонзаBE17-517Q
Раствор пенициллина-стрептомицина 100xBiowestL0022
Вектор pGuideOriGene TechnologiesGE100042
Фенол:хлороформ:изоамил-спирт 25:24:1 Насыщенный 10 мМ Трис, pH 8,0, 1 мМ ЭДТАСигма-ОлдричP2069
Праймеры, sgRNAs Eurofins
PyroMark Assay Design ЦягэнВерсия 2.0инструмент для проектирования бисульфитных грунтовок и bbsp;
Реагенты PyroMark Gold Q24Цягэн970802
ПЦР-набор PyroMark;Цягэн978703
PyroMark Q24 MDxЦягэнРабочая станция пиросеквенирования 
PyroMark Q24 Software Цягэнv2.0.8Программное обеспечение для пиросеквенирования 
Q5 и правила; Высокоточная ДНК-полимеразаNEBM0491
Набор для обратной транскрипции QuantiTectЦягэн205311
QuantStudio Absolute Q MAP16 Plate KitПрикладные биосистемыA52865Цифровая ПЦР-система 
SYBR Green I Nucleic Acid Gel Stain, концентрат 10 000x в DMSOИнвитрогенS7563
Лигаза ДНК T4NEBM0202
Т4-полинуклеотидкиназаNEBM0201
Реагент TRIzolИнвитроген15596026

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Firdaus, Z., Li, X. Epigenetic explorations of neurological disorders, the identification methods, and therapeutic avenues. Int J Mol Sci. 25 (21), 11658(2024).
  2. Yu, X., et al. Cancer epigenetics: from laboratory studies and clinical trials to precision medicine. Cell Death Discov. 10 (1), 1-12 (2024).
  3. Wang, S. E., Jiang, Y. -H. Novel epigenetic molecular therapies for imprinting disorders. Mol Psychiatry. 28 (8), 3182-3193 (2023).
  4. Gilbert, L. A., et al. Genome-scale CRISPR-mediated control of gene repression and activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  5. Ptak, C., Petronis, A. Epigenetics and complex disease: from etiology to new therapeutics. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 48 (1), 257-276 (2008).
  6. Stepper, P., et al. Efficient targeted DNA methylation with chimeric dCas9-Dnmt3a-Dnmt3L methyltransferase. Nucleic Acids Res. 45 (4), 1703-1713 (2017).
  7. Sapozhnikov, D. M., Szyf, M. Unraveling the functional role of DNA demethylation at specific promoters by targeted steric blockage of DNA methyltransferase with CRISPR/dCas9. Nat Commun. 12 (1), 5711(2021).
  8. Kwon, D. Y., Zhao, Y. -T., Lamonica, J. M., Zhou, Z. Locus-specific histone deacetylation using a synthetic CRISPR-Cas9-based HDAC. Nat Commun. 8 (1), 15315(2017).
  9. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Res. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  10. Giehrl-Schwab, J., et al. Parkinson's disease motor symptoms rescue by CRISPRa-reprogramming astrocytes into GABAergic neurons. EMBO Mol Med. 14 (5), e14797(2022).
  11. Moreno, A. M., et al. In situ gene therapy via AAV-CRISPR-Cas9-mediated targeted gene regulation. Mol Ther. 28 (8), 1931(2020).
  12. Sokka, J., et al. CRISPR activation enables high-fidelity reprogramming into human pluripotent stem cells. Stem Cell Rep. 17 (2), 413-426 (2022).
  13. Galonska, C., et al. Genome-wide tracking of dCas9-methyltransferase footprints. Nat Commun. 9 (1), 1-9 (2018).
  14. Lin, L., et al. Genome-wide determination of on-target and off-target characteristics for RNA-guided DNA methylation by dCas9 methyltransferases. GigaScience. 7 (3), 1-19 (2018).
  15. Kennedy, M. E., Cullen, R. B. Bacterial CRISPR/Cas DNA endonucleases: a revolutionary technology that could dramatically impact viral research and treatment. Virology. 479 - 480, 213-220 (2015).
  16. Rothe, M., Modlich, U., Schambach, A. Biosafety challenges for use of lentiviral vectors in gene therapy. Curr Gene Ther. 13 (6), 453-468 (2013).
  17. Cappelluti, M. A., et al. Durable and efficient gene silencing in vivo by hit-and-run epigenome editing. Nature. 627 (8003), 416-423 (2024).
  18. Hanzawa, N., et al. Targeted DNA demethylation of the Fgf21 promoter by CRISPR/dCas9-mediated epigenome editing. Sci Rep. 10 (1), 1-14 (2020).
  19. O'Geen, H., Tomkova, M., Combs, J. A., Tilley, E. K., Segal, D. J. Determinants of heritable gene silencing for KRAB-dCas9 + DNMT3 and Ezh2-dCas9 + DNMT3 hit-and-run epigenome editing. Nucleic Acids Res. 50 (6), 3239-3253 (2022).
  20. Sgourou, A., Routledge, S., Spathas, D., Athanassiadou, A., Antoniou, M. N. Physiological levels of HBB transgene expression from S/MAR element-based replicating episomal vectors. J Biotechnol. 143 (2), 85-94 (2009).
  21. Lazaris, V. M., et al. Non-viral episomal vector mediates efficient gene transfer of the β-globin gene into K562 and human haematopoietic progenitor cells. Genes. 14 (9), 1774(2023).
  22. Mulia, G. E., Picanço-Castro, V., Stavrou, E. F., Athanassiadou, A., Figueiredo, M. L. Advances in the development and the applications of nonviral, episomal vectors for gene therapy. Hum Gene Ther. 32 (19-20), 1076-1095 (2021).
  23. Piechaczek, C., Fetzer, C., Baiker, A., Bode, J., Lipps, H. J. A vector based on the SV40 origin of replication and chromosomal S/MARs replicates episomally in CHO cells. Nucleic Acids Res. 27 (2), 426-428 (1999).
  24. Nuñez, J. K., et al. Genome-wide programmable transcriptional memory by CRISPR-based epigenome editing. Cell. 184 (9), 2503-2519.e17 (2021).
  25. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  26. Brezgin, S., Kostyusheva, A., Kostyushev, D., Chulanov, V. Dead Cas systems: types, principles, and applications. Int J Mol Sci. 20 (23), 6041(2019).
  27. Holmes, D. S., Quigley, M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. Anal Biochem. 114 (1), 193-197 (1981).
  28. Harwood, A. J. The rapid boiling method for small-scale preparation of plasmid DNA. Methods Mol Biol. 58, 265-367 (1996).
  29. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harb Protoc. 2010 (6), (2010).
  30. Labuhn, M., et al. Refined sgRNA efficacy prediction improves large- and small-scale CRISPR-Cas9 applications. Nucleic Acids Res. 46 (3), 1375-1385 (2018).
  31. Hofacker, D., et al. Engineering of effector domains for targeted DNA methylation with reduced off-target effects. Int J Mol Sci. 21 (2), 502(2020).
  32. Yang, Q., et al. EpiCas-DL: predicting sgRNA activity for CRISPR-mediated epigenome editing by deep learning. Comput Struct Biotechnol J. 21, 202-211 (2023).
  33. Mu, W., et al. Machine learning methods for predicting guide RNA effects in CRISPR epigenome editing experiments. bioRxiv. , (2024).
  34. Batra, S. S., et al. Predicting the effect of CRISPR-Cas9-based epigenome editing. bioRxiv. , (2025).
  35. Stavrou, E. F., et al. Episomal vectors based on S/MAR and the β-globin replicator, encoding a synthetic transcriptional activator, mediate efficient γ-globin activation in haematopoietic cells. Sci Rep. 9 (1), 19765(2019).
  36. Stavrou, E. F., et al. The β-globin replicator greatly enhances the potential of S/MAR based episomal vectors for gene transfer into human haematopoietic progenitor cells. Sci Rep. 7 (1), 40673(2017).
  37. Hagedorn, C., Antoniou, M. N., Lipps, H. J. Genomic cis-acting sequences improve expression and establishment of a nonviral vector. Mol Ther Nucleic Acids. 2 (8), e118(2013).
  38. Stehle, I. M., Rupprecht, S., Cremer, T., Jackson, D. A., Lipps, H. J. Establishment and mitotic stability of an extra-chromosomal mammalian replicon. BMC Cell Biol. 8, 33(2007).
  39. Lufino, M. M. P., Manservigi, R., Wade-Martins, R. An S/MAR-based infectious episomal genomic DNA expression vector provides long-term regulated functional complementation of LDLR deficiency. Nucleic Acids Res. 35 (15), e98(2007).
  40. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  41. Fu, Y., et al. High-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR-Cas nucleases in human cells. Nat Biotechnol. 31 (9), 822-826 (2013).
  42. Ewaisha, R., Anderson, K. S. Immunogenicity of CRISPR therapeutics-critical considerations for clinical translation. Front Bioeng Biotechnol. 11, 1138596(2023).
  43. Raghavan, R., et al. Rational engineering of minimally immunogenic nucleases for gene therapy. Nat Commun. 16 (1), 105(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

dCas9 HDAC1CRISPR

Похожие статьи