Методическая статья

Тканьно-специфическая высококачественная изоляция протопласта для одноклеточного анализа при арабидопсисе

DOI:

10.3791/69330

⸱

6 февраля 2026 г.

 ,  , 
1Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании представлен расширенный протокол изоляции протопласта для корней, листьев, стеблей и тканей цветов Arabidopsis thaliana. Он использует оптимизированные этапы переваривания и очистки ферментов для минимизации повреждений клеток и мусора, тем самым увеличивая выход и получая высококачественные протопласты для одноклеточных методов, таких как секвенирование одноклеточной РНК.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Секвенирование одноклеточной РНК (scRNAseq) стало важным инструментом в биологии растений для получения высококачественной информации о экспрессии генов, специфичных для типа клеток, динамике развития и специфических для тканей реакциях на факторы окружающей среды. Одной из главных технических задач при применении scRNAseq к растениям является эффективная и воспроизводимая изоляция жизнеспособных отдельных клеток без клеточных стенок, отражающих гетерогенность растительных тканей. Изоляция протопласта, которая ферментативно удаляет клеточную стенку для получения одиночных живых растительных клеток, является широко используемым подходом для этой цели. Однако успешная изоляция протопласта требует тщательной оптимизации для поддержания жизнеспособности клетки и сохранения специфических профилей транскриптома, специфичных к типу клеток. Здесь мы представляем надёжный и воспроизводимый протокол для выделения высококачественных протопластов из множества тканей Arabidopsis thaliana , включая наземные (листья, стебли, цветы) и корневые ткани. Этот протокол учитывает уникальные физиологические свойства типов тканей, оптимизируя условия ферментативного пищеварения и этапы очистки для обеспечения высокого удержания и широкого представления различных типов клеток. Полученные протопласты подходят для применений, таких как scRNAseq, проточная цитометрия (FACS) и анализ экспрессии временных генов. Она позволяет создавать одноклеточные суспензии из различных типов тканей. Представленный метод способствует изучению клеточной гетерогенности и повышает надёжность одноклеточных подходов в исследованиях растений.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Секвенирование одноклеточной РНК (scRNAseq) произвело революцию в биологии растений, позволив анализировать экспрессию генов с беспрецедентным разрешением. scRNAseq предоставляет транскриптомную информацию о клеточной гетерогенности, траекториях развития и реакциях на стимулы окружающей среды с клеточно-специфическимразрешением 1,2,3.

В отличие от животных систем, жёсткая клеточная стенка растения и структурная сложность тканей представляют значительные препятствия для эффективной изоляции отдельных клеток для транскриптомического анализа. Среди доступных методов ферментативное удаление клеточной стенки для получения протопластов стало широко используемым методом, разработанным более 60 летназад, 4,5,6. Несмотря на широкое применение, выделение протопласта остаётся технически сложной процедурой, требующей тканоспецифической оптимизации для баланса выхода клеток, жизнеспособности и стабильного транскриптома. Альтернативные методы, такие как секвенирование одноядерной РНК (snRNA-seq), избегают необходимости расщепления клеточной стенки, изолируяядра 7. Однако это происходит ценой потери информации о зрелых транскриптах, присутствующих в цитоплазме. Другие методы физической диссоциации, такие как механическая и лазерно-ассистированная микродиссекция, избегают переваривания ферментных клеточных стенок, но часто подвержены перекрёстному загрязнению и могут привести к снижению жизнеспособности клеток и ограниченной пропускной способности 8,9,10.

В последние годы было разработано множество атласов растительных клеток, особенно для Arabidopsis, что даёт важные данные о транскриптомных ландшафтах различныхтканей 2,11,12,13,14,15,16,17,18 . Однако эти атласы в основном основаны на растениях на ювенильной или саженской стадии, с акцентом на корневые или лиственные ткани. Протоколы, используемые в этих исследованиях, требуют оптимизации для более старых тканей Arabidopsis, таких как зрелые листья, цветы и стебли. Кроме того, до использования исследований секвенирования, специфичных для типа клеток, таких как scRNAseq или Флуоресцентно-активированное сортирование клеток (FACS), в сочетании с секвенированием РНК, изменения транскриптома, вызванные изоляцией протопласта, не были полностью учтены19.

Представленный здесь метод основан на предыдущих исследованиях и вносит ряд важных улучшений: он учитывает физиологическую и анатомическую вариабельность в тканях растений, оптимизируя концентрацию буфера как для корней, так и для поверхностных тканей (листья, стебли, цветы) и включает мягкие методы очистки для минимизации повреждения клеток и повышения чистоты протопластов. По сравнению с подходами на основе ядер, этот метод обладает потенциалом сохранять транскриптом целой клетки, обеспечивая более высокое разрешение получать информацию о зрелых молекулах мРНК, присутствующих в цитозоле. Важно отметить, что процедура обеспечивает высокую жизнеспособность протопластов, гетерогенность и воспроизводимые концентрации в тканях — от примерно 9,8 ×10 3 клеток/мг в цветках до 2,2 ×10 2 клеток/мг в листьях.

Общая цель представленного метода — представить надёжный и воспроизводимый протокол изоляции протопластов, адаптированный для множества тканей Arabidopsis thaliana, что устраняет критическую потребность в высококачественной информации для различных типов клеток для исследований на отдельных клетках растений.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реагенты и оборудование, использованные для этого исследования, перечислены в Таблице материалов.

1. Подготовка буфера

  1. Подготовьте соответствующий протопластный изоляционный буфер17,18 согласно таблице 1 в центрифугной трубке на 15 мл; Буфер для изоляции корневых протопластов для корневой ткани или буфер для цветков/стебель/листьев для поверхностных тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительное количество изоляционного буфера протопласта требуется для пяти собранных цветковых растений Arabidopsis thaliana (стадия 11-12 с закрытыми почками): корень (~ 375 мг): 7 мл, лист (~930 мг): 5 мл, стебель (~215 мг): 3 мл, цветок (~10 мг): 2 мл.
  2. Добавьте 2% (с в/в) целлюлазы RS и 1% (с в/в) свежей мацерозы R10 перед использованием буфера изоляции корней и листьев протопласта. Хорошо перемешайте, положив изоляционный буфер протопласта на ротатор, пока порошок полностью не растворится (около 10 минут при 25 °C). Избегайте образования пузырьков воздуха и убедитесь, что внутри буфера не осталось комков порошка.

2. Переваривание тканей

  1. Перед использованием фильтруйте соответствующий протопластовый изоляционный буфер через фильтр 0,2 мкм. Используйте стандартную чашку Петри (100 мм x 15 мм) для листьев и корней, а небольшую чашку Петри (30 мм x 15 мм) для небольших объёмов тканей, таких как цветы. Добавьте несколько капель изоляционного буфера протопласта в чашку Петри перед перемещением тканей.
  2. Переместите соответствующую ткань в чашку Петри и нарезьте её на более мелкие кусочки вертикальными мазками лезвием бритвы как можно более мелко и быстро (рисунок 1A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда используйте разные лезвия и пинцет для каждого образца, чтобы избежать перекрёстного загрязнения. При работе с лезвием надевайте защитные перчатки.
  3. Добавьте оставшийся буфер изоляции протопласта в соответствующую чашку Петри, чтобы окунуть нарезанную ткань и инкубировать при 25 °C в течение 1 часа. Оставьте поверхностные ткани на скамейке (без тряски) и перенесите корневые ткани на орбитальную шейкерную платформу (60 об/мин).

3. Фильтрация

  1. Корневой образец после инкубации:
    1. С помощью пипетки Пастера перенесите протопласты из чашки Петри в сито для ячейки объемом 40 мкм, установленное поверх предварительно охлаждённой открытой центрифугной трубки объемом 50 мл.
    2. Чтобы собрать оставшиеся протопласты, добавьте точно такой же объём раствора W5 (2 мМ МЭС pH 5,7, 154 мМ NaCl, 125 мМ CaCl2, 5 мМ KCl) в ту же чашку Петри, чтобы собрать протопласты, приклеенные к основанию чашки Петри. Перенесите протопласты, вновь взвешенные в растворе W5, на тот же 40 мкм ячейный фильтр, установленный поверх предварительно охлаждённой открытой центрифугной трубки объемом 50 мл.
    3. Пропустите его второй раз через новое 40-мкм фильтр ячейки в новую предварительно охлаждённую 50-мл-центрифугную трубку. С этого момента держите образцы на льду и будьте очень аккуратны при обращении с протопластами.
  2. Надземные образцы после инкубации:
    1. С помощью пипетки Пастера переместите протопласты из чашки Петри на сито для ячейки диаметром 70 мкм, установленное поверх предварительно охлаждённой открытой центрифугной трубки объемом 50 мл.
    2. Чтобы собрать оставшиеся протопласты, добавьте точно такой же объём раствора W5 (2 мМ МЭС pH 5,7, 154 мМ NaCl, 125 мМ CaCl2, 5 мМ KCl) в ту же чашку Петри, чтобы собрать протопласты, прилипшие к основанию чашки Петри. Переложите протопласты, вновь взвешенные в растворе W5, на тот же 70 мкм Cell Strainer, установленный поверх предварительно охлаждённой открытой трубки центрифугы объемом 50 мл. С этого момента держите образцы на льду и будьте очень аккуратны с протопластами.

4. Промывка и очистка Фиколла

  1. Предварительно охладите центрифугу до 4 °C и собирайте (пеллеты) протопласт в течение 5 минут при 500 × g без настройки тормоза центрифуги.
  2. Образец корня после центрифугирования:
    1. Выбросьте супернатант, не нарушая протопластную гранулу.
    2. Протопласты очень аккуратно подвесят в предварительно охлаждённом (4 °C) буфере для ресуспензии корня объемом 600–700 мкл (равные части буфера для изолирования корня протопласта (без ферментов) и раствора W5) с использованием пипетки Пастера или пипетки Гильсона объёмом 1 мл с отрезанным кончиком, чтобы избежать сдвига.
    3. Перенесите подвеску на предохлаждённые (4 °C) лампы объёмом 1,5 мл.
  3. Надземные образцы после центрифугирования:
    1. Сбросьте супернатант, не трогая гранулу.
    2. Очень аккуратно суспензируйте гранулу в предварительно охлажденном (4 °C) буфере для восстановления суспензии цветков/стебель/листьев (равные части буфера для цветка/стебля/листа (без ферментов) и раствор W5) с использованием пипетки Пастера или пипетки Гильсона объемом 1 мл с наконечником, чтобы избежать срезов.
    3. Перенесите подвеску на предохлаждённые (4 °C) лампы объёмом 1,5 мл.
    4. Приготовьте 300 мкл раствора Ficoll PM 400 13,3 % (с в/в) в трубке на 1,5 мл. Перемешайте и держите на льду.
    5. Медленно добавляйте вновь взвешенный образец протопласта (600-700 мкл) поверх подготовленного раствора Фиколла, не прикасаясь и не смешивая слой Фиколла.
    6. Центрифуга при 4 °C в течение 5 минут при 700 × г с нулевой настройкой центрифуги.
    7. Соберите протопласты, находящиеся в среднем слое (интерфейсе) вместе с верхней фазой (первый слой) (рисунок 1B). Будьте осторожны, чтобы не собирать нижний третий слой, в котором содержатся Ficoll и отделённые мусоры. Храните при 4 °C до дальнейшего использования.

5. Подсчёт и проверка качества

  1. Используйте 10 мкл раствора протопласта, чтобы подсчитать количество изолированных протопластов с помощью гемоцитометра Нойбауэра.
    НЕОБЯЗАТЕЛЬНО: 1% (с в) красителем Evans Blue можно добавить для оценки жизнеспособности протопластов (рисунок 1C).
  2. Разведите раствор протопласта до необходимой концентрации протопластов/мл с помощью предварительно охлаждённого (4 °C) буфера реанимации (объясненного в шаге 4.2.2 для корня и шаге 4.3.2 для поверхностных тканей) соответствующей ткани.
  3. Проведите запланированный эксперимент как можно быстрее, например, секвенирование одноклеточной РНК и/или FACS15,19.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реализованные протоколы изоляции протопластов для поверхностных и корневых тканей успешно обеспечивают эффективное переваривание клеточной стенки и высвобождение целых отдельных клеток из всех тканей Arabidopsis thaliana. В всех исследуемых типах тканей, включавших цветы, стебли, листья и корни, ферментативный процесс пищеварения привёл к образованию хорошо разделённых протопластов с минимальным количеством непереваренных групп клеток (рисунок 2A-D). Анализы красителя Evans Blue подтвердили, что протопласты с сферической морфологией с гладкими границами плазматической мембраны являются жизнеспособными клетками (рисунок 1C). Для каждого типа ткани подсчитывались сферические протопласты. Цветки содержали в среднем 97 875 ± 7 531 (9 788 клеток/мг, n = 3), стебли 119 025 ± 22 508 (550 клеток/мг, n = 4), листья 210 483 ± 15 572 (225 клеток/мг, n = 3), а корни — 225 363 ± 52 561 (599 клеток/мг, n = 4).

Суспензии протопластов показали широкое распределение размеров клеток и наличие зелёных или светлых пластидов, что отражает гетерогенный клеточный состав каждой собранной ткани (рисунок 3A-D). Для подтверждения этого была проведена изоляция протопласта с трансгенно-специфической YFP-репортерской линией YFP, и подвеска содержала жизнеспособные небольшие протопласты с сигналом YFP, представляющим клетки-компаньоны (рисунок 3E). Это подчёркивает, что используемый протокол изоляции протопластов подходит для трудноизолируемых сосудистых клеток с жёсткими клетковыми стенками.

С помощью представленного оптимизированного метода можно выделить большое количество жизнеспособных протопластов с минимальным количеством мусора из различных тканей взрослых растений. Для улучшения очистки надземных образцов мы включили этап очистки подушек Ficoll, чтобы удалить выпущенные органеллы и другие клеточные остатки из переваренных образцов, сохраняя при этом качество транскриптома (см. рисунок 4).

В библиотеках cDNA scRNAseq, полученных из протопластов, были обнаружены высокоэкспрессированные домашние транскрипты, такие как ACTIN2, а также редкие/низкоэкспрессированные транскрипты, такие как фактор транскрипции гомеодомена KNAT1 — маркер, специфичный для камбиальных и меристематических клеток, а также маркеры-компаньоны SUC2 и PARCL1, с помощью специфических ПЦР-тестов cDNA15 (Рисунок 5). Это указывает на широкое представление типа клеток и гетерогенность полученной популяции протопластов, что было дополнительно подтверждено анализом данных scRNAseq, полученных этимметодом 15.

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочий процесс этапов изоляции протопластов. Показаны шесть основных этапов: (1) подготовка буфера, (2) переваривание тканей, (3) фильтрация, (4) промывка и очистка Ficoll, (5) подсчёт и контроль качества, и (6) продолжение последующих экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Изображения этапов подготовки протопласта. (A) Репрезентативное изображение этапа нарезки образца листа (шаг 2.1). Верхнее изображение показывает собранную ткань с несколькими каплями буфера в стандартной чашке Петри и лезвием для резки. Изображение ниже, слева слева, показывает ткань после нескольких вертикальных движений лезвием бритвы (см. стрелку). Изображение ниже, справа — это нарезанный образец, готовый к следующему этапу. (B) Изображение подушки Фиколла после центрифугирования в трубке объёмом 1,5 мл (шаг 4.3.7). Белая стрелка указывает на средний слой, в котором содержатся протопласты. (C) Репрезентативное изображение протопластов листьев, инкубированных в краске Evans Blue. Шкала масштаба: 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Микроскопические изображения сгенерированных протопластов. Отображаются изображения протопластов каждого типа ткани. (A) цветок, (B) стебель, (C) лист, (D) корень. Шкала шкала: 250 мкм. (E) Изображения конфокального микроскопа линии репортёра YFP-специфической клеточной клетки. Первое изображение (слева) представляет собой экспрессию репортера YFP-компаньонов в сосудистой системе листа (зелёного цвета). Второе изображение (справа) представляет протопласты клеток, экспрессирующих репортер YFP (зелёный сигнал). Фиолетово-синий цвет символизирует автофлуоресценцию хлоропластов. Шкала 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Микроскопические изображения протопластов листьев до (A) и после (B) очистки подушек Ficoll .Шкалы: 250 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: Контроль качества ПЦР библиотек scRNAseq. Репрезентативные гелевые изображения ПЦР контроля качества корневых и поверхностных тканевых одноклеточных библиотек РНКseq. Тестировалигены SUC2, PARCL, KNAT1, ACT2 (от A до D, соответственно), а для каждой ткани: цветок, стебель, лист, корень слева направо соответственно. cДНК (+) используется как положительный контроль, а вода — как отрицательный контроль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Кореневой протопластёрный буферБуфер протопластинга цветков/стебель/листьев
600 мМ Маннитол400 мМ Маннитол
2 мМ MgCl2-
0,1% BSA0,1% BSA
2 мМ CaCl210 мМ CaCl2
2 мМ MES pH 5,720 мМ MES pH 5,7
10 мМ KCl20 мМ KCl
При необходимости отрегулируйте pH до 5,5 с базой Tris 1MПри необходимости отрегулируйте pH до 5,5 с базой Tris 1M

Таблица 1: Составы буфера изоляции протопласта. Рецепты буфера изоляции протопласта для корней и поверхностных тканей (цветок, стебель, лист) предоставляются.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот оптимизированный протокол для выделения протопластов из различных тканей арабидопсиса был адаптирован для применения scRNAseq, анализируя весь транскриптом, присутствующий в цитоплазме и ядрах. Оптимизация буферов, специфических для тканей, а также дополнительные этапы пищеварения и очистки привели к устойчивым и воспроизводимым результатам в разных тканях. В частности, протопласты цветов в среднем составляли ~98 000 клеток на образец (~9 788 клеток на мг), стволовые протопласты — ~119 000 клеток (~550 клеток на мг), листовые протопласты — ~210 500 клеток (~225 клеток на мг), а корневые протопласты — ~225 000 клеток (~599 клеток на мг), что отражает структурное и физиологическое разнообразие этих тканей.

Ключевым усовершенствованием в этом протоколе стало использование подушки на основе Фиколла вместо более распространённых градиентов/подушек на основе сахарозы для очистки. В отличие от сахарозы, которая поглощается клетками и оказывает значительное влияние натранскриптом 13,20,21, фиколл осмотически инертна и мембранопроницаема, что сохраняет целостность РНК во время изоляции 22. Этот этап также уменьшил количество свободных органелл, таких как хлоропласты, из поврежденных клеток и клеточных остатков в суспензии. Наличие такого мусора может мешать образованию капель, закупоривая каналы микрофлюидных устройств или приводя к наличию более одной клетки в образованных каплях, что способствует загрязнению окружающей среды РНК. Все эти факторы могут приводить к неправильным выводам или искажениям в анализе данных scRNA-seq.

Было показано, что выделение протопласта может изменять транскриптом растительныхклеток 2,15,16,19. Ключевой стратегией в этом протоколе для минимизации этого артефакта является поддержание протопластов при температуре 4 °C (на льду) после ферментативного переваривания, что замедляет метаболическую и транскрипционную активность и, следовательно, снижает транскрипционные изменения, известные как связанные с выделением протопластов. Кроме того, крайне важно поддерживать стабильность времени сбора ткани между репликами и согласовывать его с целью исследования, поскольку вариации времени влияют как на гены, индуцированные протопластами, так и на циркадно-регулируемые транскрипты, обнаруженные в наборах данныхscRNA-seq 15.

В этом методе, помимо производства отдельных клеток с минимальным количеством отходов, важным моментом было сохранение гетерогенности тканей для потенциального представления всех типов клеток. Разнообразие суспензии протопластов было подтверждено обнаружением различных морфологий протопластов, включая различные размеры и наличие сигналов от клеточно-специфических репортерных линий внутри полученной популяции (см. рисунок 2). Кроме того, популяция протопластов была оценена путём обнаружения редких и клеточно-специфичных транскриптов в библиотеках cDNA scRNA-seq с помощью ПЦР (см. рисунок 4). Среди них были редкие маркерные гены апикального меристемы побега и маркеры клеток-компаньонов15. Успешное получение этих транскриптов подтверждает, что представленный метод позволяет выделить различные типы клеток с высокой целостностью, что делает его ценным инструментом для продвижения исследований одноклеточных клеток на растениях. Помимо scRNAseq, этот метод также может использоваться для проточной цитометрии, анализа экспрессии временных генов и анализов регенерации растений.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявили о отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта статья является частью проекта, получившего финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 (Грантовое соглашение No 810131).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Целлюлаза RS Дюшефа БиохемиC8003
Модель центрифуга 5810RЭппендорф5810000010
Ficoll PM 400 Сигма-Олдрич26873-85-8
Мацерозим R10Дюшефа БиохемиM8002
Модель микроцентрифуги 5417RЭппендорфСнято с производства
Стерильный шприцовый фильтр Puradisc 30, 0.2 и микро; mЦитива10462200Обозначается как 0.2 и микро; m-фильтр в протоколе
Сито стерильных клеток 40 и микро; m Нейлоновая сетка Фишербранд22363547
Стерильный клеточный фильтр 70 и микро; m Нейлоновая сетка Фишербранд22363548

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Macosko, E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell. 161 (5), 1202-1214 (2015).
  2. Denyer, T., et al. Spatiotemporal developmental trajectories in the Arabidopsis root revealed using high-throughput single-cell RNA sequencing. Dev Cell. 48 (6), 840-852.e5 (2019).
  3. Tenorio Berrío, R., et al. Dual and spatially resolved drought responses in the Arabidopsis leaf mesophyll revealed by single-cell transcriptomics. New Phytol. 246 (3), 840-858 (2025).
  4. Cocking, E. C. A Method for the Isolation of Plant Protoplasts and Vacuoles. Nature. 187 (4741), 962-963 (1960).
  5. Zhai, Z., Jung, H., Vatamaniuk, O. K. Isolation of protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis thaliana. J Vis Exp. (30), e1149(2009).
  6. Adedeji, O. S., Naing, A. H., Kim, C. K. Protoplast isolation and shoot regeneration from protoplast-derived calli of Chrysanthemum cv. White ND. Plant Cell Tissue Organ Cult. 141 (3), 571-581 (2020).
  7. Wang, K., et al. An optimized FACS-free single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) method for plant science research. Plant Sci. 326, 111535(2023).
  8. Kerk, N. M., Ceserani, T., Tausta, S. L., Sussex, I. M., Nelson, T. M. Laser capture microdissection of cells from plant tissues. Plant Physiol. 132 (1), 27-35 (2003).
  9. Brandt, S., Walz, C., Schad, M., Pavlovic, N., Kehr, J. A simple, chisel-assisted mechanical microdissection system for harvesting homogenous plant tissue suitable for the analysis of nucleic acids and proteins. Plant Mol Biol Report. 21 (4), 417-427 (2003).
  10. Berkowitz, O., et al. RNA-seq analysis of laser microdissected Arabidopsis thaliana leaf epidermis, mesophyll and vasculature defines tissue-specific transcriptional responses to multiple stress treatments. Plant J. 107 (3), 938-955 (2021).
  11. Jean-Baptiste, K., et al. Dynamics of gene expression in single root cells of Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 31 (5), 993-1011 (2019).
  12. Ryu, K. H., Huang, L., Kang, H. M., Schiefelbein, J. Single-cell RNA sequencing resolves molecular relationships among individual plant cells. Plant Physiol. 179 (4), 1444-1456 (2019).
  13. Shulse, C. N., et al. High-throughput single-cell transcriptome profiling of plant cell types. Cell Rep. 27 (7), 2241-2247.e4 (2019).
  14. Wendrich, J. R., et al. Vascular transcription factors guide plant epidermal responses to limiting phosphate conditions. Science. 370 (6518), eaay4970(2020).
  15. Apelt, F., et al. Shoot and root single-cell sequencing reveals tissue- and daytime-specific transcriptome profiles. Plant Physiol. kiab537. , (2021).
  16. Kim, J. -Y., et al. Distinct identities of leaf phloem cells revealed by single-cell transcriptomics. Plant Cell. 33 (3), 511-530 (2021).
  17. Zhang, T. -Q., Chen, Y., Wang, J. -W. A single-cell analysis of the Arabidopsis vegetative shoot apex. Developmental Cell. 56 (7), 1056-1074.e8 (2021).
  18. Shahan, R., et al. A single-cell Arabidopsis root atlas reveals developmental trajectories in wild-type and cell identity mutants. Dev Cell. 57 (4), 543-560.e9 (2022).
  19. Birnbaum, K., et al. A gene expression map of the Arabidopsis root. Science. 302 (5652), 1956-1960 (2003).
  20. Aghdasi, M., Smeekens, S., Schluepman, H. Microarray analysis of gene expression patterns in Arabidopsis seedlings under trehalose, sucrose and sorbitol treatment. Int J Plant Prod. 2 (4), 309-320 (2008).
  21. Nakayama, Y., Kusano, M., Kobayashi, M., Manabe, R., Watanabe, M. Catabolic reprogramming of Brassica rapa leaf mesophyll protoplasts during the isolation procedure. Plant Growth Regul. 99 (2), 337-357 (2023).
  22. Grgac, R., Rozsypal, J., Des Marteaux, L., Štětina, T., Koštál, V. Stabilization of insect cell membranes and soluble enzymes by accumulated cryoprotectants during freezing stress. Proc Natl Acad Sci USA. 119 (41), e2211744119(2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Arabidopsis Thaliana

Похожие статьи