Мониторинг 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты в продуктах пчелиных препаратов с помощью флуоресценции твердой поверхности

Summary

В данной работе предлагается разработка новой альтернативной методологии традиционным методам контроля и мониторинга 2,4-дихлорфеноксикарбоновой кислоты в образцах пчелиных продуктов центральной и северной Аргентины.

Abstract

Здоровье пчёл жизненно важно для производства мёда и опыления культур. Использование гербицидов может негативно повлиять на производство мёда, так как пчёлы могут контактировать с этими химикатами при сборе нектара и пыльцы с обработанных растений, что может привести к загрязнению мёдом этими токсичными остатками. Хотя 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота (2,4-D) предназначена для борьбы с широколиственными сорняками, она может достигать цветов и заражать урожайность пчёл, что потенциально влияет на здоровье и качество жизни пчёл. По этим причинам важно периодически анализировать мёд для выявления остатков гербицида и, при необходимости, принимать корректирующие меры. В данной работе предлагается разработка новой альтернативной методологии традиционным методам контроля и мониторинга 2,4-D в образцах пчелиных продуктов центральной и северной Аргентины. Образцы были обработаны при pH = 7.0 в присутствии анионного поверхностно-активного сульфата натрия (SDS), фильтруя системы через бумагу с синей полосой как твёрдую опору перед определением с помощью флуоресценции в твердой фазе. При оптимальных условиях работы достигались пределы обнаружения и количественной оценки 0,33 нг/л и 0,90 нг/л соответственно, а также линейный диапазон от 0,90 x^{10 3} нг/л до 1,13 x 10³ нг/л. Среди преимуществ нового метода — использование недорогих приборов и экологичных растворителей, низкое образование отходов и, соответственно, сохранение некоторых принципов зелёной химии.

Introduction

Здоровье пчёл жизненно важно для производства мёда и опыления культур. Здоровая колония зависит от комплексного управления здоровьем, включающего правильное питание, гигиенические меры, а также профилактику и лечение заболеваний. Если производство мёда осуществляться ответственно, не вредит пчёлам, так как пчеловоды извлекают лишь небольшую часть всего мёда, оставляя резервы для^{колонии 1,2}.

Использование гербицидов может негативно повлиять на производство мёда, так как пчёлы могут контактировать с этими химикатами при сборе нектара и пыльцы с обработанных растений, что может привести к загрязнению мёда остатками пестицидов. Кроме того, некоторые гербициды, такие как глифосат, могут напрямую влиять на развитие и поведение пчёл, снижая их способность к поиску пищи и физиологическое^{развитие} 3,4,5,6. Хотя гербицид 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-D) разработан для борьбы с широколиственными сорняками, он может достигать цветов и загрязнять мёд, что потенциально влияет на здоровье пчёл и качество^{меда 7,8,9}.

Внутренняя и международная торговля мёдом и другими пчелиными продуктами показала значительный и устойчивый рост в последние годы, что отражено в увеличении производства^{10, 11, 12}. Согласно данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Организации Объединённых Наций (ФАО), в мире насчитывается пять крупнейших мёдовых стран: Китай, Аргентина, Турция, США и^{Украина — 13}. Производство пчеловодства имеет большое значение в Аргентине и постоянно растёт благодаря возможностям экспортного рынка, появившихся в последние годы. Климатические условия Аргентины (климат, флора и др.) и технологии, инвестируемые в производство, позволили стране занять важное место в мире. С другой стороны, наличие ксенобиотиков вызывает обеспокоенность и требует мониторинга, как и в других странах, поскольку оно влияет как на маркетинг мёда, так и на здоровье потребителей из-за своих токсичных^{эффектов 14,15}.

2,4-D — это широко используемый селективный системный гербицид, который эффективно контролирует сорняки, действуя как синтетический ауксин, вызывающий их неконтролируемый рост и гибель. Он используется в сельском хозяйстве, садоводстве и лесном хозяйстве, особенно полезен для борьбы с сорняками в таких культурах, как пшеница, кукуруза и рис, так как не вредит траве или^{зерновым культурам 16}. 2,4-D также может использоваться как регулятор роста растений и доступен в различных формулах, включая аминные и эфирные соли, для различных применений. Функции 2,4-D зависят от вводимой дозы и восприимчивости отдельных видов и типов^{тканей 17,18}. Например, контакт 2,4-D был связан с неблагоприятными репродуктивными последствиями и значительными генетическими изменениями у мышей, что указывает на заметный генотоксический^{эффект 19}.

Медоносные пчёлы, являющиеся ключевыми опылителями и модельными организмами для изучения эусоциальности, обучения и памяти, крайне уязвимы к прямому отравлению агрохимикатами, используемыми в^{полях 20}. Воздушное применение гербицидов и инсектицидов во время цветения может привести к значительной смертности медоносных пчёл и резко снизить производство меда. Смеси пестицидов, даже в сублетальных дозах, могут дезориентировать пчёл, ухудшающих их память и снижать эффективность поиска пищи. Это, в свою очередь, ослабляет колонии, снижая накопление пыльцы и нектара, что приводит к дефициту питательных веществ. Кроме того, в образцах мёда обнаружен 2,4-D, а заражённая пыльца и нектар могут распространяться среди товарищей^{улья 21}.

Важно периодически анализировать мёд на наличие остатков гербицида и, при необходимости, принимать корректирующие меры. Для обнаружения и количественной оценки пищевых загрязнителей, таких как гербициды, в данном случае 2,4-D, наиболее часто используемыми инструментальными методами являются хроматография, а именно высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC), жидкостная хроматография тандемная масс-спектрометрия (LC-MS/MS) и газовая хроматографическая тандемная масс-спектрометрия (GC-MS/^MS)22,23,24,25,26 . Однако исследователи периодически представляют новые методы мониторинга для 2,4-D с преимуществами по сравнению с традиционными методами количественной^{оценки 27, 28, 29}, например: использование более дешёвых приборов, простота эксплуатации, уменьшение количества растворителей, применение к более сложным образцам и другие.

Флуоресценция в твердой фазе — это универсальный метод, который, сочетая молекулярную флуоресценцию с методами экстракции в твердой фазе, повышает и без того высокую чувствительность, присущуюся флуоресцентному приборам. Он также улучшает диапазон линейности и селективность за счёт уменьшения или устранения эффектов^{матрицы 30,31}.

В этом исследовании предложена новая аналитическая методология мониторинга и количественной оценки 2,4-D и применяется к образцам мёда и других пчёл из центральной и северной Аргентины. Образцы содержат неизвестные количества 2,4-D. Известно только о концентрациях сверхдобавленных уровней, которые представляют собой концентрацию, предоставляемую образцом, плюс концентрацию 2,4-D, которую мы добавили. Это последнее значение известно и позволяет рассчитать восстановление. Новая методология основана на прямом определении анализируемого вещества с использованием твердофазной флуоресценции, демонстрируя множество преимуществ в плане экономии приборов, снижения эксплуатационных затрат и повышения защиты окружающей среды.

Protocol

Эта рукопись не содержит исследований с участием людей или животных, проведённых авторами.

Используемое оборудование
Спектрофториметрические измерения проводились с помощью ПК-базирующегося спектрофторометра, оснащённого ксеноновой лампой мощностью 150 Вт. Держатель для образца использовался для измерения флуоресценции твердой поверхности (SSF). Параметры, используемые для 2,4-D количественной оценки, были следующими: λ_em= 580 нм, с использованием λ_ext = 555 нм (щели 3-3), с использованием твёрдого держателя для образца.

Отбор проб и обработка образцов
Это исследование производства образцов мёда, полученных в 2025 году, было проведено в провинциях Сан-Луис, Сан-Хуан, Хухуй и Сальта в северо-центральном регионе Аргентины. Проанализированные образцы были: четыре многоцветочных мёда, два мёда прополиса, чистые медовые конфеты и конфеты, изготовленные из смеси мёда, коки и прополиса, приобретённых у пчеловодов в этих регионах. Изучаемые мёды были свежими, извлечёнными из ульев менее чем через 1 неделю после производства, чтобы избежать возможного разложения 2,4-D различными механизмами. Все образцы были собраны в новые стерильные сосуды и немедленно доставлены в лабораторию. Они хранились при 4-8 °C в тёмном месте до анализа. Твёрдая карамель была гомогенизирована ступкой и пестиком; его содержимое разбавлялось в 5 мл ультрачистой воды, из которой брали 0,5 мкл.

Методология
Были добавлены аликвоты 0,5 мкл или 1 мкл 2,4-D (1,23 нг/л и 3,49 нг/л), 100 мкл образца, 250 мкл SDS (1 x ^10-4 моль/л) и 100 мкл фосфатного буфера (1 x ^10-4 моль/л, рН = 7), а объём смеси был увеличен до 3 мл путём добавления двойной дистиллированной воды. Смесь фильтровалась через твёрдую опору (бумажный фильтр; см. таблицу материалов для подробностей). Твёрдые опоры сушили при комнатной температуре, а затем измерялась флуоресценция твердой поверхности (SSF) при λ_em= 580 нм, используя λ_ext= 555 нм (щели 3-3) с твердым держателем для образца.

Выше описана общая процедура разработанной методологии, в которой каждый параметр был изучен и оптимизирован, как показано в разделе «Результаты».

Влияние pH и буфера
Оптимизация pH проводилась путём корректировки систем под изучаемый pH с использованием соляной кислоты или гидроксида натрия для достижения необходимого значения (диапазон тестируемого pH 5-7). Впоследствии, когда был достигнут наиболее подходящий диапазон pH для получения подходящего аналитического сигнала, выбирался используемый буфер.

Тестируемые буферы включали фосфат, трис и буру, которые были приготовлены в концентрации 1 x ^10-4 моль/л. Их громкость изменялась для получения наилучшего сигнала интенсивности флуоресценции. Показаны результаты для единственного буферного фосфата, улучшившего интенсивность флуоресценции, а также его оптимальная концентрация. Здесь выбранным буфером был фосфат, а pH = 7.

Концентрация поверхностно-активного вещества
Использование различных поверхностно-активных веществ в молекулярной флуоресценции даёт преимущества, улучшающие определение исследуемого анализируемого вещества. Мицеллярные среды используются для минимизации межмолекулярных взаимодействий между анализируемым веществом и компонентами матрицы образца. Кроме того, фотофизические свойства флуоресцентных растворённых веществ могут изменяться в мицеллярной среде, что повышает чувствительность к флуоресценции. Изучалось влияние различных поверхностно-активных веществ (SDS и HTAB) на количественную оценку 2,4-D с помощью флуоресценции твердой поверхности (SSF). Было установлено, что анионный поверхностно-активный агент SDS в концентрации 8,3 x 10⁻⁶ моль/л увеличивал флуоресцентную интенсивность изучаемого гербицида.

Надёжная поддержка
Поскольку планарная конфигурация энергетически предпочтительна в возбужденном флуоресцентном состоянии, изучалось удержание гербицида на твёрдых опорах. Системы фильтровались через различные типы мембран, включая нейлон, целлюлозный ацетат, смешанные эфиры и фильтрующую бумагу Blue-Ribbon. Фильтрованные растворы собирали в отдельные чистые контейнеры, а мембраны сушили при комнатной температуре. Впоследствии мембраны были помещены в твердый держатель образца, и была зафиксирована твердофазная флуоресценция (SSF). На фильтрующей бумаге наблюдалось достаточное и селективное удержание, поэтому эта поддержка была выбрана для определения флуоресценции в твердой фазе. Фильтрованные растворы также анализировались с помощью молекулярной флуоресценции. Отсутствие комплекса 2,4-D было очевидным, что свидетельствует о сохранении гербицида на фильтрующей бумаге.

Исследование восстановления
2,4-D добавлялся к соответствующему объёму каждого изучаемого образца (для образцов мёда использовалось 0,5 мкл, а для других анализируемых образцов — 1,4-мкл), постепенно увеличивая концентрацию до 1,23 нг/л и 3,49 нг/л. Концентрации аналита определялись с использованием этой методологии, как среднее значение шести репликат (n = 6).

Точное исследование
Повторяемость методов и точность в течение дня изучались путём повторного тестирования образцов (n = 6) с 1,23 нг/л и 3,49 нг/л 2,4-D и определения аналитического содержания с использованием методологии. Кроме того, воспроизводимость междневной точности оценивалась в течение 7 дней для тех же систем.

Исследование интерференции
В тестовый раствор добавлялись разные количества общих ионов с 3,49 нг/л 2,4-D, и применялась эта методология. Были протестированы следующие возможные интерференции:

Концентрация интерференцирующего/2,4-D мольного соотношения = 1000:1:00 для Na⁺, K⁺, Cl^-, Fe³⁺,^{Cu 2+}, Cd²⁺,^{Sb 3+}, Mn²⁺, As³+_{, CO}^{3 2-}_{, SO}^{4 2-}, Ca²+, Mg²+,^{NO 3-}, Ni²+, фруктозы, глюкозы, сахарозы, мальтозы, 2,4,5-T, сульфометурон-метил, глифосата и атразина.

Концентрация интерференции/2,4-D моль = 500:1:00 для^{Zn 2+}, Co²⁺,^{Al 3+}, хлорсульфурона, бенсульфурона-метила и триасульфурона.

Расчёт аналитических параметров качества
Параметры аналитического качества — это предел обнаружения (LOD) и предел количественной оценки (LOQ). Они рассчитывались с помощью следующих шагов. Фоновый шум измерялся путём отклика 15 пустых образцов (образцов без анализа) для получения набора данных фонового шума. Рассчитывалось стандартное отклонение шума. Это считается значением LOD. Пределы обнаружения основаны на 3,3-кратных стандартных отклонениях заготовки (N = 15). Пределы количественной оценки основаны на 10-кратных стандартных отклонениях заготовки (N = 15).

Results

Приведённые ниже результаты показывают, как изучение каждой из переменных, влияющих на общую процедуру, её оптимизацию и достигнутые оптимальные условия труда было пошагово выполнено.

Характеристика спектра 2,4-D
Характеристика 2,4-D проводилась с помощью UV-Vis спектроскопии и молекулярной флуоресценции, наблюдая максимумы флуоресцентной интенсивности при λ_em= 580 нм, используя λ_ext= 555 нм (щели 3-3;

Discussion

Интенсивное использование гербицидов экспоненциально выросло в Аргентине и в остальном мире из-за необходимости удовлетворить потребности растущего населения в продовольствии. Если использование таких продуктов будет контролироваться должным образом, рационально и периодически, это не нарушит ожидаемую пользу и не окажет негативного влияния на окружающую среду в целом. 2,4-D широко используется по всему миру, и многие исследования показали, что этот гербицид вызывает изменения в нецелевы...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,4-D	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, США	49083
Уксусная кислота/ацетат	Mallinckrodt Chemical Works
Фильтрующие бумаги Blue Ribbon	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, США	WHA1001929	2-5 & Mu; размер пор м и диаметр 12,5 см
Мембрана целлюлозного ацетата	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, США		0,45 и мю; Размер пор м и 47 мм
Гексадецилтриметиламмоний бромид (HTAB)	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, США	H5882
соляная кислота	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, США	1.09063
Мембраны иммобилона (+)	Миллипор, Сан-Паулу, Бразилия	HATF04700	0,45 и мю; Размер пор м и 47 мм
Мембраны смешанных эфиров	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, США		0,45 и мю; Размер пор м и 47 мм
Нейлоновые мембраны	Миллипор, Сан-Паулу, Бразилия	Z290793	0,45 и мю; размер поры м и диаметр 47 мм
pHmeter (Orion Expandable Ion Analyzer, )	Orion Research, Кембридж, Массачусетс, США	Модель EA 94.
Калий дигидрофосфат	Biopack, Буэнос-Айрес, Аргентина и bbsp;	2000168900
Кислота фталат калия	Merk & Co., Inc
Сульфат натрия додецил	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, США	11667289001
Гидроксид натрия	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, США	S2770
Тетраборат натрия	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, США	221732
Спектрофторометрический	Shimadzu	RF-5301	оснащён ксеноновой лампой мощностью 150 Вт и кварцевыми элементами диаметром 1,00 см
Трис-(гидроксиметил)-аминометан	Сигма-Олдрич, Сент-Луис, США	77-86-1