Method Article

Визуализация пространственно-временной динамики соматосенсорных нейронов коры во время электроакупунктуры с использованием двухфотонной in vivo визуализации

DOI:

10.3791/69340

⸱

January 16th, 2026

 ,  ,  , 
1Traditional Chinese Medicine, School of Medicine, Acupuncture Research Institute, Jianghan University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол интегрирует краниальные окна у трансгенных мышей Thy1-GCaMP6f, стандартизированную электроакупунктуру и двухфотонную визуализацию для визуализации динамики коркового ансамбля в миллисекундном масштабе во время стимуляции, выявляя пластичность, специфическую для слоя.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол устанавливает комплексную экспериментальную основу для изучения динамики корковых цепей во время электроакупунктурной стимуляции. Методология включает три ключевых компонента: хроническую имплантацию черепного окна у трансгенных мышей Thy1-GCaMP6f, стандартизированную стимуляцию ЭА в акупунктурной точке ST36 с использованием бифазных импульсов 2/100 Гц и высокоразрешающую двухфотонную кальциевую визуализацию. Этот интегрированный подход позволяет в реальном времени визуализировать активность нейронного ансамбля в первичной соматосенсорной коре (S1) с миллисекундной временной точностью, фиксируя ранее недоступные детали сетевых реакций на нейромодуляцию. Метод успешно выявляет различные специфические для слоя паттерны активации и продольные изменения пластичности, предоставляя критическое понимание корковых механизмов, лежащих в основе эффектов ЭА. Преодолевая фундаментальные пространственно-временные ограничения, присущие традиционным fMRI и электрофизиологическим методам, эта высокоразрешающая платформа предлагает беспрецедентные аналитические возможности для картирования динамических нейронных цепей. Надёжная конструкция протокола и воспроизводимые результаты делают его особенно ценным для оптимизации таргетных нейромодуляционных терапий и расширения понимания пластичности на уровне цепи в ответ на периферическую стимуляцию.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Электроакупунктура, современная адаптация традиционной акупунктуры, включающая контролируемые электрические токи, подаваемые иглами в определённых точках акупунктуры, известна тем, что модулирует нейронные цепи, участвующие в обработке боли, моторном контроле и автономной функции. Считается, что его эффекты включают сложные сигнальные каскады, инициируемые активацией периферических сенсорных нервов (преимущественно волокна Aδ и C), что приводит к высвобождению нейромедиаторов (например, опиоидов, серотонин, ГАМК) и последующей модуляции на уровнях спинного, стволового мозга и коры 1,2. Ключевые структуры включают соматосенсорные кортики. В коре S1, которая обрабатывает тактильную и ноцицептивную информацию, ЭА, вероятно, влияет как на локальный ингибиторно-возбуждающий баланс, так и на дальнююсвязность 3,4. Однако точная временная последовательность активации/торможения между различными нейронными популяциями (например, пирамидальные нейроны, интернейроны) и слоями внутри S1 во время и сразу после стимуляции ЭА остаётся в значительной степени невыявленной из-за методологических ограничений, упомянутыхвыше 5,6. Понимание этих динамик в реальном времени крайне важно для оптимизации параметров EA и прогнозирования терапевтических результатов.

Традиционные методы изучения нейромодуляторных эффектов электроакупунктуры (ЭА) на кортикальные цепи, такие как поведенческие исследования и посмертный анализ, дают ценные инсайты, но не способны фиксировать нейронную активность в реальном времени с высоким пространственно-временнымразрешением 7,8. Для преодоления этих ограничений в качестве мощной альтернативы появляется in vivo двухфотонная кальциевая визуализация, позволяющая напрямую визуализировать динамику нейронного ансамбля во времястимуляции 8,9. Эта техника обеспечивает беспрецедентные преимущества для хронических продольных исследований, позволяя исследователям наблюдать — с клеточным разрешением — быструю и распределённую активность по корковым слоям у бодрствующих, ведущих себя животных. В отличие от острой электрофизиологии, которая обеспечивает высокое временное разрешение, но ограниченное пространственное покрытие, двухфотонная визуализация способствует масштабному мониторингу сотен до тысяч нейронов одновременно в определённом полезрения 9,10. Кроме того, по сравнению с функциональной магнитно-резонансной томографией (фМРТ), которая превосходно охватывает весь мозг, но работает на более медленных временных масштабах и не обладает клеточной специфичностью, двухфотонная кальциевая томография обеспечивает тонко обнаружение активности определённых нейронных популяций на временном масштабе, релевантном для синаптических и цепевыхпроцессов 11,12. Таким образом, двухфотонная визуализация уникально подходит для преодоления критического разрыва в нашем понимании того, как периферические стимулы ЭА превращаются в пространственно-точные кортикальные активационные паттерны, особенно в таких областях, как первичная соматосенсорная кора (S1). Будучи основным узлом соматосенсорной обработки (включая сигналы от акупунктурных точек), и учитывая, что EA эффективно модулирует свою активность, S1 представляет собой стратегический путь для изучения динамики корковых цепей, индуцируемой электроакупунктурой.

Двухфотонная лазерная сканирующая микроскопия (2PLSM) в сочетании с генетически закодированными кальциевыми индикаторами (GECI), такими как GCaMP6, представляет собой революционный инструмент для нейронауки. Он позволяет хроническим, высокоразрешающим визуализировать нейронную активность in vivo с клеточной и субклеточнойспецифичностью 13. GECI флуоресценцируют пропорционально внутриклеточным кальциевым транзиентам, служа надёжным индикатором нейронноговозбуждения 14. Ключевым является то, что использование 2PLSM ближнего инфракрасного возбуждающего света обеспечивает превосходное проникновение в глубину (сотни микрон) по сравнению с традиционной микроскопией, позволяя визуализировать активность в поверхностных и даже более глубоких корковых слоях (например, L2/3, L4, L5). Его внутреннее оптическое сечение минимизирует размытую флуоресценцию и фотоповреждения, что делает его идеальным для продольных исследований в течение недель или месяцев 15,16,17. Эта технология представляет собой революционный прогресс в исследованиях ЭА, обладающий потенциалом фундаментально изменить наше понимание этой технологии, предоставляя возможность отслеживать миллисекундную динамику сотен и тысяч отдельных нейронов одновременно в пределах определённого кортикального объёма во время стимуляции.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во всех экспериментах использовались трансгенные мыши Thy1-GCaMP6fвозрастом 8-12 недель. Все экспериментальные процедуры и протоколы ухода за животными проводились в соответствии с Руководством Национального института здравоохранения (NIH) по уходу и использованию лабораторных животных и были утверждены Комитетом по уходу и использованию животных Университета науки и технологий Хуачжун (IACUC; Номер утверждения протокола: 3603). Были предприняты все усилия, чтобы минимизировать количество используемых животных и их страдания. Схема экспериментальной установки показана на рисунке 1.

1. Хроническая имплантация черепных окон

  1. Индукция анестезией и стереотаксическая стабилизация
    1. Начните анестезию, поместив мышь Thy1-GCaMP6f возрастом 8-12 недель в индукционную камеру с 4-5% изофлураном (об/об) в 100% медицинском кислороде с расходом 1 л/мин.
    2. При потере рефлекса выпрямления (обычно в течение 2-3 минут) переносите животное на термостатически управляемую грелку (поддерживаемую при 37 °C), встроенную в цифровую стереотаксичную раму.
    3. Зафиксируйте мышь носовым конусом, подающим 1,5-2,0% изофлурана для хирургического обслуживания. Нанесите офтальмологическую мазь (например, ветеринарную мазь Puralube) на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
    4. Аккуратно вставьте нетравматические ушные планки во внешний слуховой проход, обеспечивая симметричное положение без чрезмерного давления, которое может привести к повреждению тканей или разрыву барабаннойперепонки 19.
    5. Закрепите верхнечелюстное небо с помощью носового зажима, избегая обструкции дыхательных путей.
    6. Подтвердите глубокую анестезию при отсутствии рефлектора отмены педалей при сильном сжатии пальца ноги и стабильной, медленной частоте дыхания (80-120 вдохов в минуту). Постоянно контролируйте температуру тела с помощью ректального датчика и регулируйте грелку соответственно.
    7. Назначают подкожную (s.c.) превентивную анальгезию (например, Карпрофен, 5 мг/кг) и поддержку жидкости (стерильный физиологический раствор, 0,5-1 мл с.с.). Проверьте стабильные физиологические параметры (SpO₂ > 95%, регулярное дыхание) на протяжении всего процесса.
  2. Хирургическое обнажение черепа
    1. Тщательно сбрийте спинную часть головы с помощью электрических машинок, затем наносите химический депиляционный крем для полного удаления волос. Тщательно прополосните стерильным физиологическим раствором.
    2. Проведите последовательный антисепсис: трижды откребайте открытую кожу, чередуя мазки с повидон-йод (10%) и 70% изопропилового спирта, завершая раствором хлоргексидина глюконата (2%).
    3. Используя стерильные микродисектирующие ножницы и тонкие щипцы (Дюмон #5), сделайте разрез по средней линии сагиттального разреза (~15-20 мм длиной) через кожу и подлежащую соединительную ткань, начиная с расстояния ~2 мм позади глаз и продолжаясь до межпариетально-затылочного соединения.
    4. Используйте микрогемостатические щипцы или биполярную коагуляторную обработку (с низкой температурой) для контроля кровотечения из капилляров вдоль краёв разреза. Аккуратно оттяните кожные лоскутки в стороны, используя изогнутые микроретракторы или шелковые швы 5-0, закреплённые на окружающей драпировке.
    5. Обнажите весь спинной кальвариум, включая лобную, теменную и межтеменную кости. С помощью микро-кюрета (#00) тщательно соскребли надственность — волокнистую сосудистую мембрану, прилипшую к поверхности кости — под большим увеличением (хирургический микроскоп).
    6. Наносите мягкие, касательные движения, чтобы не повредить череп и не повредить швы (брегма, лямбда, сагиттальная, корональная). Достичь гладкой, аваскулярной поверхности кости, необходимой для точной краниотомии и последующего клеевого соединения.
    7. Регулярно поливайте поле стерильным, тёплым (37 °C) солёным раствором 0,9% для удаления костной пыли и поддержания гидратации тканей.
  3. Стереотаксическое наведення на область задней конечности S1
    1. Используя высокоточную стереотаксичную манипуляторную руку, разместите кончик тонкой хирургической маркера или микросверла непосредственно над анатомической точкой отсчёта (пересечением корональных и сагиттальных швов). Подтвердите координаты под микроскопом (10 раз).
    2. Отрегулировать манипулятор так, чтобы маркер точно смещался в переднезаднее (AP) -1,5 мм (сзади брегмы) и на среднелатеральное (ML) +2,0 мм (правое полушарие) относительно средней линии (сагиттальный шов).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это место соответствует первичной зоне представления задней конечности (S1) соматосенсорной коры (S1).
    3. Слегка вытравьте небольшой прицел (<0,5 мм) на обнажённой поверхности теменной кости в этой точке, обеспечивая видимость без проникновения в кость.
    4. Проверьте отсутствие крупных поверхностных сосудов, проходящих через отмеченный участок; если присутствуют значительные сосуды, минимально корректируйте ML-координаты (±0,1–0,2 мм), чтобы их избежать, так как дуральные сосуды могут сильно кровоточить при нарушении и ухудшать оптическую прозрачность.
    5. Задокументируйте окончательные скорректированные координаты.
  4. Точная краниотомия
    1. Центрируйте стерильный одноразовый биопсий диаметром 3 мм точно над отмеченной координатой S1HL. Прикладывайте твёрдое, устойчивое давление вниз, плавно вращая пунш, чтобы полностью обрезать внешний корковый костный слой по окружности. Убери пунш.
    2. Используя высокоскоростное микрохирургическое сверло (например, с карбидным жорном диаметром 0,5–0,8 мм), прикреплённое к стереотаксичному рычагу под постоянным орошением с 0,9% физиологическим раствором (охлаждение и удаление мусора), аккуратно протоньте кость внутри отмеченного круга.
    3. Сверлите короткими всплесками, используя лёгкое, касающееся фрезерное движение, систематически двигаясь от края к центру. Внимательно следите за прозрачностью костей при увеличении.
    4. Прекратите бурение сразу после обнаружения лёгкого «румянца» на подлежащей твердой мозговой оболочке, что указывает на минимальную толщину кости (<50 мкм). Переходите на тонкие микрощипцы (Dumont #5/45) и микроножницы, чтобы тщательно поднять и отклеить оставшиеся тонкие костные фрагменты, радиально двигаясь наружу от центра.
    5. Сохраняйте твердую орудость целой — убедитесь, что она выглядит прозрачной и блестящей, без разрывов и значительных кровотечений. Немедленно контролируйте небольшое дюральное кровотечение, мягко давя стерильным сжатым пенопластом, пропитанным 0,9% физиологическим раствором или тромбином.
    6. Обильно промывайте обнажённую твердую мозговую жидкость теплой, стерильной искусственной спинномозговой жидкостью (aCSF) или 0,9% физиологическим раствором, чтобы удалить все костные остатки. Избегайтевысыхания 17, 20.
  5. Хроническая имплантация окна черепа и фиксация головной планки
    1. Подготовьте стерильную стеклянную форму диаметром 3 мм и толщиной #1 (примерно 150 мкм). По желанию покройте внутреннюю поверхность тонким слоем силиконового эластомера для оптической чистоты и снижения адгезии.
    2. Точно разместите ковер над краниотомией с помощью тонких щипцов. Подготовьте зубной цемент с быстро затвердевающим светом (например, Metabond или Charisma) согласно инструкциям производителя.
    3. Работая быстро (<90 секунд), нанесите тонкий шарик цемента по периметру покрытия прямо на сухую, чистую поверхность черепа. Убедитесь, что цемент полностью герметизирует край ковельного скольжения, но не забирается снизу на твердую оболочку.
    4. Немедленно затвердеть цемент с помощью стоматологического светильника (синий свет, 450 нм) на 20-30 секунд на квадрант. Укрепите уплотнение несколькими слоями более медленно затвердевающего акрилового зубного цемента объемом 5 мл (например, акрила или паладура Jet Repair Acry), создавая прочный, низкопрофильный (<2 мм высотой) цементный колпак, который выходит на несколько миллиметров за краниотомический край на окружающий череп.
    5. В цементную крышку на начальном этапе затвердевания встраивают лёгкую, изготовленную на заказ нержавеющую сталь или титан (например, длиной 15–20 мм с центральным отверстием).
    6. Убедитесь, что головная перекладина расположена параллельно сагиттальному шву и по центру над окном, обеспечивая жёсткие, сбалансированные точки фиксации для будущей подголовники под микроскопом, не мешая оптическому доступу.
    7. Дайте цементу полностью затвердеть (≥15 минут). Проверьте полный гемостаз и прозрачностьокна 21.
  6. Послеоперационное восстановление и мониторинг
    1. После затвердевания цемента аккуратно освободите мышь от ушных перекладин и носового зажима. Прекратите приём изофлурана и введите 100% кислород до полного возобновления самопроизвольного дыхания.
    2. Сразу после операции введите бупренорфин HCl (0,05-0,1 мг/кг с с.к.) при обезболивании. Переместите животное в предварительно нагретую (30-32 °C) камеру с кислородом и выстлать чистой бумажной подстилкой.
    3. Проводите непрерывный мониторинг до восстановления грудинального лежания и полной ходьбы (обычно 30-60 минут). Введите вторую дозу карпрофена (5 мг/кг с интервалом) через 24 часа после операции. При необходимости для поддержания гидратации предоставьте подогретый лактатный раствор Рингера (1 мл с.с.) для поддержания гидратации.
    4. Мышь помещают по отдельности в стандартную клетку, обогащённую материалом для гнезда, чтобы предотвратить повреждение головного импланта сожителями. Поддерживайте условия окружающей среды (22-24 °C, влажность 40-60%, цикл свет/темнота 12:12 часа) с доступом к продуктам пищи и гидрогелю по умолчанию.
    5. Следите за мышью минимум два раза в день в течение 7 дней после операции на предмет признаков боли/дискомфорта (сутулость, пилоэрекция, снижение активности, потеря веса >15%), инфекции (гнойные выделения, отёк, покраснение), неврологический дефицит или ослабление головной перекладины.
    6. Выделите минимальный период восстановления ≥7 дней перед началом любых экспериментальных процедур (визуализации или ЭА) для обеспечения устранения острого хирургического воспаления, восстановления нормального поведения и глимфатического клиренса, а также стабилизации исходной активности коры. Взвешивайте животное ежедневно, чтобы отслеживатьвосстановление 22.

2. Электроакупунктурная стимуляция

  1. Точная анатомическая локализация акупунктурной точки ST36
    1. Нацельтесь на акупунктурную точку ST36 («Зусанлы») на основе установленных анатомических ориентиров на задней конечности мыши. Перед введением иглы пропальпуйте проксимальную переднюю большеберцовую кость, чтобы определить бугорестость большеберцовой кости — заметный костный выступ, расположенный чуть дистально от коленного сустава, где вставляется надколенная связка.
    2. Используя тонкие суппорты или стерильный маркер, измеряйте 2 мм латерально (к малоберцовой кости) и 2 мм хвостовой (задней) относительно центра бугоркости большеберцовой кости. Это расположение соответствует переднему животу большеберцовой мышцы, поверхностно глубокой ветви малокосткостного нерва и проксимально к бифуркации передней большеберцовой артерии.
    3. При необходимости подтвердите отсутствие крупных поверхностных кровеносных сосудов в этом месте с помощью трансилминации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Точность критически важна, так как небольшие отклонения (>0,5 мм) могут существенно изменить стимулируемые нейронные структуры и последующие кортикальные реакции при S1. Идентификация ориентиров должна выполняться последовательно обученным персоналом для минимизации изменчивости междуоператорами 23,24.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Методы обеспечения устойчивости иглы включают: (i) После введения и фиксации иглы мыши даётся период адаптации, чтобы она могла привыкнуть и уменьшить первоначальные трудности. (ii) Частота вибраций, создаваемая электроакупунктурным стимулятором (например, 2 Гц), по своей природе низкая по амплитуде. Кроме того, используемые тонкие иглы (например, Φ0,16 мм) обладают достаточной жёсткостью, чтобы эффективно противостоять этой минимальной вибрации. (iii) На протяжении всего эксперимента оператор постоянно контролирует положение кончика иглы. Данные испытаний будут исключены, если наблюдается значительное перемещение, вызванное движением животных.
  2. Стерильная техника введения иглы
    1. После дезинфекции кожи (чередуя скраб 70% этанола и хлоргексидина) вводите стерильную одноразовую иглу из нержавеющей стали (номинальный диаметр: 0,18 мм, эквивалент 36 калибра; длина: 13 мм) перпендикулярно в кожу по отмеченной ST36 координате.
    2. Постепенно продвигайте иглу через кожу, подкожную ткань и в подлежащую переднюю мышцу большеберцовой мышцы, используя плавные вращательные движения, чтобы минимизировать травму тканей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Целевой глубина введения составляет 3 мм от поверхности кожи. Эта глубина обеспечивает оптимальное зацепление мышечных афферентов типа II/III (волокон Aδ) и потенциально соматических волокон малого диаметра без риска контакта с подлежащей большеберцовой костью или глубокими нейроваскулярными пучками.
    3. Крепко закрепите ступицу иглой с помощью небольшой стерильной клеевой подушки или индивидуального зажима, чтобы предотвратить смещение при последующей электрической стимуляции и возможных небольших движений конечности.
    4. Проверьте стабильное положение иглы, наблюдая лёгкую, временную локальную фасцикуляцию мышц при введении — физиологический показатель правильного внутримышечного положения.
    5. Соблюдайте строгую асептическую технику на протяжении всего процесса для предотвращения инфекции, особенно при хронической стимуляции.
  3. Параметризация и доставка электроакупунктурной стимуляции
    1. Подключите изолированную ручку вставленной иглы к выходному каналу анодного (+) программируемого электроакупунктурного стимулятора (например, стимулятор нервов HANS Acupoint Ner Stimulator, модель LH202).
    2. Разместите опорный катодный (-) электрод, обычно небольшую пластину из нелегирующей стали или электрод, покрытый проводящим гелем, на ипсилатеральной задней лапе (например, подошвенную поверхность возле пятки).
    3. Обеспечьте надёжный контакт и низкое сопротивление (<5 кОм) на обоих точках. Запрограммировать стимулятор на передачу бифазных импульсов квадратной волны (сбалансированные положительные/отрицательные фазы) для минимизации поляризации электродов и повреждения тканей.
    4. Установите парадигму стимуляции в режим плотного дисперсирования: чередующиеся всплески 2 Гц (низкая частота) в течение 3 с, затем 100 Гц (высокая частота) 3 с.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот комбинированный частотный паттерн (часто обозначаемый как 2/100 Гц) эмпирически доказано эффективнее усиливает выброс эндогенных опиоидов (например, β-эндорфинов, энкефалин) и моноаминов (например, серотонин, норадренал) в ЦНС по сравнению с отдельными частотами.
    5. Регулируйте текущую интенсивность постепенно, начиная с 0,1 мА, пока визуально не появятся лёгкие, ритмичные подёргивания лапы (сгибание пальцев или голеностопа) — обычно достигается от 1,0 мА у взрослых мышей под лёгкой анестезией. Этот порог дергания указывает на достаточное привлечение моторных эфферентов и связанных с ними крупно-диаметрных афферентов (волокон Aβ), подтверждая физиологическую активацию без причинения стресса или интенсивной борьбы. Поддерживайте эту калиброванную интенсивность на протяжении 20-минутной сессиистимуляции 25,26.
  4. Критический процедурный контроль и физиологический мониторинг
    1. Смягчение артефактов стимуляции
      1. Физически отделяйте кабели EA от оборудования для съёмки изображений/головной сцены.
      2. Реализуйте надёжное заземление: подключите заземляющий терминал стимулятора к специальному заземлению и убедитесь, что рама микроскопа и грелка животных имеют общую точку заземления.
      3. Временно синхронизировать импульсы стимуляции с сигналом заглушания микроскопа, если он доступен, или использовать постфактическую обработку сигналов для удаления остаточных электрических артефактов из кальциевых следов.
    2. Физиологическая стабильность
      1. Постоянно контролируйте температуру тела тела (поддерживаемую на уровне 37,0 ± 0,5 °C с помощью грелки с обратной связью), частоту дыхания (80-120 вдохов в минуту) и SpO₂ (>95%) на протяжении 20-минутной сессии EA.
      2. Поддерживайте лёгкую анестезию изофлурана (1,0-1,5%) для обеспечения неподвижности во время комбинированной визуализации и стимуляции. Постоянно наблюдайте за вызванным подёргиванием лапы; Если он уменьшается или прекращается, проверьте контакт иглы и импеданс, а также немного скорректируйте интенсивность (≤на 0,1 мА) для поддержания стабильной и мягкой моторной активации.
      3. Немедленно прекращайте стимуляцию, если появляются признаки страдания (например, тахипноэ, интенсивная борьба).
    3. Воспроизводимость
      1. Используйте одинаковый тип иглы, глубину введения, модель стимулятора и метод калибровки (порог подёргивания лап) для всех животных и сеансов. Задокументируйте конечную интенсивность стимуляции для каждого предмета.
      2. Дайте минимум 5 минут восстановления после стимуляции перед прекращением анестезии или проведением дополнительных процедур27,28.

3. Двухфотонная визуализация во время ЭА

  1. Подготовка животных, фиксация головы и физиологическое поддержание
    1. После ≥7 дней восстановления после операции выполните фиксацию мыши Thy1-GCaMP6f с помощью имплантированной головной планки в специально разработанном аппарате фиксации с подавлением вибрации, установленном на моторизованной ступени XY.
    2. Удобно расположите животное на цилиндрическую беговую дорожку с низким трением и смазанной воздухом, позволяя неограниченно двигаться задними конечностями. Поддерживать лёгкую хирургическую анестезию с помощью носовой анестезии с добавлением 0,5-0,8% изофлурана в 100% O₂. Снижение уровня изофлурана минимизирует подавление нейронной активности, обеспечивая при этом достаточную неподвижность для высокоразрешающей визуализации.
    3. Постоянно отслеживайте и фиксируйте температуру тела тела (поддерживаемую на уровне 37,0 ± 0,2 °C с помощью грелки с обратной связью), частоту дыхания (100–140 вдохов/мин) и насыщение кислородом периферии (SpO₂ > 95%).
    4. Нанесите офтальмологический гель, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время длительной визуализации. Убедитесь, что ипсилатераль задней конечности к окну черепа S1HL доступен для введения иглы EA в ST36.
    5. Дайте 15-20 минут для физиологической стабилизации после фиксации головы перед началомвизуализации 29.
  2. Оптическое наведения и оптимизация для визуализации уровней II/III
    1. Точно определите фокальную плоскость для получения высококачественных нейронных сигналов. Следуйте этой процедуре проверки.
      1. Уменьшайте мощность лазера до низкого уровня (обычно 10-20% от мощности изображения, например, 5-10 мВт), чтобы избежать ненужного фотоотбеливания и фотоповреждения при размещении самолета.
      2. Используя привод по оси Z двухфотонного микроскопа, двигайте объектив медленно по микронным шагам. Начинайте с поверхности окна черепа и продвигайтесь глубже в ткани мозга.
      3. В режиме живого просмотра определите фокальную плоскость с помощью этих визуальных индикаторов, как описано в шагах 3.2.1.4 и 3.2.1.5.
      4. Для правильной фокальной плоскости на слое нейронной сомы: убедитесь, что изображение показывает чёткие, яркие, пунктирующие структуры (нейронные соматы), выглядящие круглыми или овальными с хорошим контрастом на фоне. Убедитесь, что границы клеток чёткие и имеют характерный «сольно-перцевый» вид.
      5. Для неправильной фокальной плоскости: если изображение кажется размытым или однородным без чётко определённых пунктированных структур, распознайте, что фокус находится в области без сомат. Если видны крупные, тёмные, неструктурированные сосудистые тени, определите это как слой кровеносных сосудов.
    2. Проверка соответствующего исходного уровня флуоресценции
      1. Перед применением экспериментальных стимулов подтвердите здоровую и стабильную базу флуоресценции для достоверной интерпретации последующих сигналов кальция (ΔF/F). Выполните шаги 3.2.2.2-3.2.2.4.
      2. Отрегулируйте мощность лазера до официального уровня визуализации (например, 30-50 мВт).
      3. Получите изображения в течение нескольких секунд в быстром режиме предварительного просмотра с низким разрешением.
      4. Наблюдайте за отражаемой средней интенсивностью флуоресценции в реальном времени (или непосредственно отслеживайте яркость изображения). Убедитесь, что сигнал остаётся стабильным и не показывает признаков быстрого фотоотбеливания, прежде чем приступить к экспериментальному сбору данных.
    3. Центрируйте поле зрения внутри окна черепа.
      1. Нанесите ультразвуковой гель или дистиллированную воду между объективом и накладным слоем для иммерсионного соединения. Используя инфракрасное градиентное контрастное или эпифлуоресцентное освещение, определите поверхностную сосудистую систему и выровняйте поле зрения (FOV), чтобы избежать попадания крупных поверхностных сосудов (диаметром >20 мкм).
      2. Переключитесь на двухфотонный режим возбуждения с помощью настраиваемого фемтосекундного импульсного лазера Ti:Sapphire. Установите длину волны возбуждения на 920 нм — оптимально для возбуждения GCaMP6f (пик ~920 нм), минимизируя зелёную автофлуоресценцию и фотоповреждение по сравнению с короткими длинами волн.
      3. Постепенно увеличивайте мощность лазера (обычно 20-50 мВт, измеряемых на образце), при этом фокусируясь через прозрачную твердую орудость на кортикальную поверхность (pia mater). Отрегулировать Z-положение объектива с помощью пьезоэлектрического нанофокусного устройства для достижения глубины 200 ± 10 мкм ниже поверхности пиала, что соответствует кортикальному слою II/III.
      4. Подтвердите глубину с помощью характерной плотности нейронов и морфологии: плотная популяция сомат малых и средних пирамидальных нейронов (диаметром 10-15 мкм) с видимыми апикальными дендритами.
      5. Оптимизировать мощность лазера и настройки усиления фотомультипликатора (PMT) для достижения сильной базовой флуоресценции GCaMP6f (F 0) без насыщения (интенсивность пикселей ~50-70% от максимума детектора) и минимальногофона 30,31.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Во время съёмки средняя мощность возбуждающего света 920 нм точно поддерживалась на уровне 30-50 мВт на объекте. Этот уровень мощности был подтвержден в ходе пилотных экспериментов на тканях животных, подвергшихся идентичным хирургическим процедурам, что обеспечило эффективное получение сигнала на длительности сканирования до 25 минут при минимизации фотоповреждений и флуоресцентного фотоотбеливания.
  3. Протокол высокоскоростной кальциевой визуализации
    1. Настройте резонансный сканер для высокоскоростного захвата кадров:
      Размер кадра: 512 × 512 пикселей (типичный FOV: ~450 × 450 мкм, пиксель ~0,88 мкм)
      Частота кадров: 7 кадров в секунду (fps), достигаемая с помощью двунаправленного сканирования (~14 кГц). Эта скорость адекватно дискретирует кинетику распада GCaMP6f (τ~500 мс), одновременно балансируя отношение сигнал/шум (SNR) и минимизируя фотоотбеливание.
      Время задержки пикселя: ~0,8 мкс. (оптимизировано для SNR при 7 Гц).
    2. Инициировать непрерывное таймлапс-получение с помощью программного обеспечения для приобретения (например, ScanImage, Prairie View). Запишите 5-минутный исходный период перед началом стимуляции ЭА, чтобы установить динамику нейронной активности до стимула (F₀).
    3. Точно при t = 5 минут начинайте стимуляцию ЭА на ST36, при этом съёмка продолжается без перерыва. Собирайте данные непрерывно в течение 20-минутного периода стимуляции EA. Общая продолжительность сканирования = 25 мин (1500 с, ~10 500 кадров).
    4. Сохраняйте данные в мульти-TIFF-стеке или проприетарном бинарном формате с встроенными временными метками, синхронизированными с триггерными импульсами EA через входной канал TTL.
    5. Отслеживать стабильность мощности лазера и дрейф фокуса (<2 мкм) в реальном времени; Сделайте краткую паузу для перефокусировки только при значительном дрейфе (например, >5 мкм), отмечаявременную точку 32,33.
  4. Строгая коррекция движения и пространственная регистрация
    1. После получения обработки необработанный стек изображения с помощью NoRMCorre (Нежёсткая коррекция движения) в MATLAB для устранения пространственных артефактов от остаточных микродвижений (например, дыхания, пульса).
    2. Сначала разделите стек на перекрывающиеся пространственные участки (например, 64 × 64 пикселя, 50% перекрытия). Для каждого патча вычислите эталонный шаблон, усредняя кадры с высоким SNR по базовому периоду.
    3. Используя кросс-корреляцию на основе Фурье, вычислите трансляционные сдвиги X-Y для каждого кадра относительно шаблона. Применяйте эти сдвиги с помощью субпиксельной интерполяции.
    4. Далее рассматриваем нежёсткие деформации: моделируем локальные искажения внутри участков с помощью кусочно-аффинных преобразований (сдвиг + сдвиг). Итеративно обновляйте шаблон для повышения точности регистрации. Ключевые параметры:
      max_shift: 20 пикселей (ограничение для перевода)
      max_dev: 3 пикселя (максимальное нежёсткое отклонение)
      bin_width: 50 кадров (временное бинирование для обновления шаблонов)
    5. Визуализируйте эффективность коррекции, проанализировав график корреляции между кадрами (должен стабилизироваться около 1.0 после коррекции) и сгенерируя карту средней проекции изображения (до и после коррекции). Сохраняйте стек с коррекцией движения для дальнейшего анализа. Этот этап критически важен для точного пиксельного анализа кальциевых транзиентов, особенно при тонких движениях конечностей, вызванных EA.

4. Анализ пространственно-временной динамики

Стек визуализации с коррекцией движения проходит автоматизированную сегментацию нейронов и извлечение сигналов с помощью конвейера Suite2p (v0.12.3) на Python. Ключевые этапы обработки включают:

  1. Идентификация пространственного следа
    1. Примените ограниченную неотрицательную матричную факторизацию (CNMF) для разложения стека на пространственные компоненты.
    2. Инициализация интересующих областей (ROI) с помощью корреляционного подхода: объединить пиксели с пространственной перекрестной корреляцией > 0.7 и локальным SNR > 4 в кандидатные ROI. Различать соматические ROI от дендритов/аксонов по размеру (диаметр 8–15 мкм) и круговому (порог компактности >0,6).
  2. Коррекция загрязнения нейропилом
    1. Для каждого ROI определите концентрический нейропильный аннулус (внутренний радиус: 1,5× радиус ROI, внешний радиус: 2,5× радиус ROI).
    2. Вычислите коэффициент нейропила (r_neuropil) с помощью регрессии наименьших квадратов:
      F_corrected(t) = F_raw(t) - 0,7 × F_neuropil(t)
      (Коэффициент эмпирически подтвержден для мышей Thy1-GCaMP6f).
  3. Деконволюция сигнала
    1. Вывод активности спайка с использованием OASIS (l₁-регуляризованная деконволюция) с моделью шума AR(2) для оценки вероятности всплесков S(t) по следам ΔF/F:
      ΔF/F(t) = k ⋅ S(t) + b + ε
      где 'k' — кратковременное ядро кальция, а ε — гауссов шум.
  4. Контроль качества
    1. Исключить ROI с SNR <3, пространственным перекрытием >30% или нейропильной корреляцией >0,3. Визуальная проверка осуществляется через Suite2p GUI34.
      Конкретные операции и элементы интерфейса приведены в Дополнительном файле 1. Вышесгенерированный выше TIFF-файл с корректировкой движения был напрямую введён в конвейер Suite2p. Хотя интегрированная среда Suite2p включает собственную коррекцию жестких движений, этот избыточный внутренний шаг был отключён, поскольку уже применялась более точная нежёсткая коррекция. Автоматически извлекаемые нейронные ROI можно найти в дополнительном файле 2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Структурная характеристика коры S1 и базовой нейронной активности
Мы начали с установления высокоточной структурной и функциональной базы для наших экспериментов с визуализацией. Анализ морфологии тканей выявил заметные структурные различия между неапликированными (рисунок 2A) и покрытыми (рисунок 2B) препаратами для черепных окн. Хотя применение накладного скользящего элемента ввело незначительные артефакты ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Чтобы преодолеть критический разрыв в наблюдении кортикальных эффектов электроакупунктуры (ЭА) в реальном времени, мы представляем комплексный интегрированный протокол, сочетающий хроническую имплантацию черепных окон для оптического доступа, стандартизированную стимуляцию ЭА и продольную двухфотонную кальциевую визуализацию, направленную на первичную соматосенсорную (S1) кору.

Этот интегрированный протокол обладает несколькими явными преимуществами по сравнен...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (No 82405550). Благодарим членов лаборатории Чжан за полезные обсуждения.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
КарпрофенMCEН/Д5 мг/кг от обезболивания
Цифровая стереотаксическая рамкаЗадний приводKopf Model 1900
Электроакупунктурный стимуляторHANS LH202 (бифазные импульсы 2/100 Гц)Н/ДHANS LH202 (бифазные импульсы 2/100 Гц)
ИзофлуранЗадний приводR510-22-10Медицинский класс, 100% носитель кислорода
Микробуровая системаЗадний приводКарбид 0,5 мм карбидный жерна, солевое охлаждение
Повидон-йодMCEHY-B223410% раствор
ScanImageScanImagehttps://scanimage.org/
Стерильный физиологический растворБэйюнтяньST341-500 мл0,9% NaCl
Хирургический микроскопZeisshttps://www.zeiss.com/meditec/en/products/surgical-microscopes.html10-40 и больше раз; увеличение
Трансгенные мыши Thy1-GCaMP6fCygen55239788-12 недель, самец/самка
Двухфотонный микроскопNikon A1MPNikon A1MPTi:Сапфировый лазер (возбуждение 920 нм)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Li, X., et al. A central and peripheral dual neuromodulation strategy in pain management of zoster-associated pain. Sci Rep. 14 (1), 24672(2024).
  2. Xia, R., et al. Autonomic nervous system in bone remodeling: From mechanisms to novel therapies in orthopedic diseases. Orthop Surg. 17 (6), 1561-1576 (2025).
  3. Arvanitidis, M., Falla, D., Sanderson, A., Martinez-Valdes, E. Does pain influence force steadiness? A protocol for a systematic review. BMJ Open. 11 (1), e042525(2021).
  4. Urits, I., et al. An evidence-based review of galcanezumab for the treatment of migraine. Neurol Ther. 9 (2), 403-417 (2020).
  5. Barbeau, E. J., Chauvel, P., Moulin, C. J., Regis, J., Liegeois-Chauvel, C. Hippocampus duality: Memory and novelty detection are subserved by distinct mechanisms. Hippocampus. 27 (4), 405-416 (2017).
  6. Dannenberg, H., Young, K., Hasselmo, M. Modulation of hippocampal circuits by muscarinic and nicotinic receptors. Front Neural Circuits. 11 (7), 102(2017).
  7. Shang, Q., et al. Erp evidence for consumer evaluation of copycat brands. PLoS One. 13 (2), e0191475(2018).
  8. Shariff, S., et al. Advances in understanding the pathogenesis of epilepsy: Unraveling the molecular mechanisms: A cross-sectional study. Health Sci Rep. 7 (2), e1896(2024).
  9. Wahl, A. S. State-of-the-art techniques to causally link neural plasticity to functional recovery in experimental stroke research. Neural Plast. 2018 (1), 3846593(2018).
  10. Zheng, X. S., Yang, Q., Vazquez, A. L., Tracy Cui, X. Imaging the efficiency of poly(3,4-ethylenedioxythiophene) doped with acid-functionalized carbon nanotube and iridium oxide electrode coatings for microstimulation. Adv Nanobiomed Res. 1 (7), 2000092(2021).
  11. De Pasquale, F., et al. A cortical core for dynamic integration of functional networks in the resting human brain. Neuron. 74 (4), 753-764 (2012).
  12. Stamatakis, A. M., et al. Miniature microscopes for manipulating and recording in vivo brain activity. Microscopy (Oxf). 70 (5), 399-414 (2021).
  13. Gu, Z., Jamison, K., Sabuncu, M. R., Kuceyeski, A. Human brain responses are modulated when exposed to optimized natural images or synthetically generated images. Commun Biol. 6 (1), 1076(2023).
  14. Li, J., et al. Pedot:Pss-based bioelectronics for brain monitoring and modulation. Microsyst Nanoeng. 11 (1), 87(2025).
  15. Lee, C. R., Najafizadeh, L., Margolis, D. J. Investigating learning-related neural circuitry with chronic in vivo optical imaging. Brain Struct Funct. 225 (2), 467-480 (2020).
  16. Kirwan, P., et al. Development and function of human cerebral cortex neural networks from pluripotent stem cells in vitro. Development. 142 (18), 3178-3187 (2015).
  17. Gomez, J., Neco, P., Difranco, M., Vergara, J. L. Calcium release domains in mammalian skeletal muscle studied with two-photon imaging and spot detection techniques. J Gen Physiol. 127 (6), 623-637 (2006).
  18. Sylte, O. C., Muysers, H., Chen, H. L., Bartos, M., Sauer, J. F. Neuronal tuning to threat exposure remains stable in the mouse prefrontal cortex over multiple days. PLoS Biol. 22 (1), e3002475(2024).
  19. Imori, T., Matsuda, H., Tohjo, M., Kamata, Y. An experimental production of suppurative otitis media in dog, and a trial to evaluate the therapeutic effect of cefmetazole on this otitis media. Jpn J Antibiot. 35 (9), 2277-2287 (1982).
  20. Holtmaat, A., et al. high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
  21. Bray, M. A., et al. Cell painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nat Protoc. 11 (9), 1757-1774 (2016).
  22. Jirkof, P., et al. Assessment of postsurgical distress and pain in laboratory mice by nest complexity scoring. Lab Anim. 47 (3), 153-161 (2013).
  23. Fang, K., Cheng, W., Yu, B. Effects of electroacupuncture at varied frequencies on analgesia and mechanisms in sciatic nerve cuffing-induced neuropathic pain mice. J Mol Neurosci. 74 (4), 98(2024).
  24. Hsiao, I. H., Liao, H. Y., Lin, Y. W. Optogenetic modulation of electroacupuncture analgesia in a mouse inflammatory pain model. Sci Rep. 12 (1), 9067(2022).
  25. Han, J. S. Acupuncture: Neuropeptide release produced by electrical stimulation of different frequencies. Trends Neurosci. 26 (1), 17-22 (2003).
  26. Zeng, L. T., et al. Study on optimization of image processing parameters of pneumoconiosis by DR. Zhonghua Lao Dong Wei Sheng Zhi Ye Bing Za Zhi. 41 (12), 897-900 (2023).
  27. Costa, F. F., et al. Identification of microRNAs as potential prognostic markers in ependymoma. PLoS One. 6 (10), e25114(2011).
  28. Gazerani, P., Aloisi, A. M., Ueda, H. Editorial: Differences in pain biology, perception, and coping strategies: Towards sex and gender specific treatments. Front Neurosci. 15, 697285(2021).
  29. Masamoto, K., Kanno, I. Anesthesia and the quantitative evaluation of neurovascular coupling. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (7), 1233-1247 (2012).
  30. Korsunsky, I., et al. sensitive and accurate integration of single-cell data with Harmony. Nat Methods. 16 (12), 1289-1296 (2019).
  31. Theer, P., Hasan, M. T., Denk, W. Two-photon imaging to a depth of 1000 microm in living brains by use of a Ti:Al2O3 regenerative amplifier. Opt Lett. 28 (12), 1022-1024 (2003).
  32. Grewe, B. F., Langer, D., Kasper, H., Kampa, B. M., Helmchen, F. High-speed in vivo calcium imaging reveals neuronal network activity with near-millisecond precision. Nat Methods. 7 (5), 399-405 (2010).
  33. Pologruto, T. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. ScanImage: Flexible software for operating laser scanning microscopes. Biomed Eng Online. 2 (1), 13(2003).
  34. Friedrich, J., et al. Multi-scale approaches for high-speed imaging and analysis of large neural populations. PLoS Comput Biol. 13 (8), e1005685(2017).
  35. Tidball, P., et al. Differential ability of the dorsal and ventral rat hippocampus to exhibit group I metabotropic glutamate receptor-dependent synaptic and intrinsic plasticity. Brain Neurosci Adv. 1 (1), 2398212816689792(2017).
  36. Yang, W., Yuste, R. Holographic imaging and photostimulation of neural activity. Curr Opin Neurobiol. 50 (1), 211-221 (2018).
  37. Reismann, D., et al. Longitudinal intravital imaging of the femoral bone marrow reveals plasticity within marrow vasculature. Nat Commun. 8 (1), 2153(2017).
  38. Pfeffer, C. K., Xue, M., He, M., Huang, Z. J., Scanziani, M. Inhibition of inhibition in visual cortex: The logic of connections between molecularly distinct interneurons. Nat Neurosci. 16 (8), 1068-1075 (2013).
  39. Zhou, P., et al. Efficient and accurate extraction of in vivo calcium signals from microendoscopic video data. Elife. 7, e28728(2018).
  40. Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
  41. Godenschweger, F., et al. Motion correction in MRI of the brain. Phys Med Biol. 61 (5), R32-R56 (2016).
  42. Hattori, R., Danskin, B., Babic, Z., Mlynaryk, N., Komiyama, T. Area-specificity and plasticity of history-dependent value coding during learning. Cell. 177 (7), 1858-1872.e15 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Somatosensory CortexTwo Photon ImagingElectroacupuncture StimulationNeural Circuit DynamicsCalcium ImagingCranial Window ImplantationThy1 GCaMP6f MiceSpatiotemporal DynamicsCortical PlasticityNeuromodulation

Related Articles