Методическая статья

Интерферометрия биослоя для исследования связывания мембранных белков и ингибиторов: мутант TACAN и GsMTx4 как модельная система

234 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69348

⸱

8 мая 2026 г.

 ,  , 
1Department of Biochemistry and Pharmacology, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 2ARC Centre for Cryo-electron Microscopy of Membrane Proteins, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne, 3Melbourne Protein Characterization, Bio21 Molecular Science and Biotechnology Institute, University of Melbourne

В этой статье

Краткое содержание

В данной рукописи представлен подробный протокол оптимизации и проведения экспериментов по биослойной интерферометрии (BLI) для изучения взаимодействия мембранных белков и лигандов для мембранных белков, растворимых детергентом. Используя взаимодействие между мутантом TMEM120A M207A и ингибитором пептида GsMTx4 в качестве модели, этот рабочий процесс описывает подготовку белков, загрузку биосенсора и сбор кинетических данных.

Аннотация

Биослойная интерферометрия (BLI) — это эффективная биофизическая методика, позволяющая проводить количественный анализ биомолекулярных взаимодействий в реальном времени. Хотя они часто используются для растворимых белков, их применение к мембранным белкам остаётся сложным из-за гидрофобности и зависимости от детергентных средств. В данном исследовании представлен оптимизированный протокол BLI для характеристики взаимодействий между мембранным белком, растворимым в детергенте, и ингибитором пептидов.

В качестве модельной системы был протестирован пептид-модификатор гейтинга Grammostola механотоксин 4 (GsMTx4) против многофункционального мембранного мутанта TMEM120A M207A. Вариант TMEM120A с маркировкой FLAG иммобилизировался на анти-FLAG биосенсорах — представляющих систему на основе меток, но без флуоресцентных и ферментных меток — и подвергался серийным разбавлениям GsMTx4 для измерения частот ассоциаций и диссоциации.

Протокол интегрирует оптимизацию детергента с использованием неоппентилгликоля Лаурил-Мальтоза (LMNG) и комплементарную характеристику с помощью массовой фотометрии и дифференциальной сканирующей флюориметрии (DSF). Этот рабочий процесс обеспечивает надёжные кинетические измерения и совместим с среднепроизводительным скринингом. Этот подход может быть применим и к другим мембранным системам с белковыми лигандами, где сохраняется стабильность моющего средства. В целом исследование выделяет ключевые параметры, влияющие на эффективность иммобилизации и доставку анализа, что подтверждает потенциальную полезность BLI в профилировании ингибиторов и механистических исследованиях взаимодействия мембранных белков.

Введение

Мембранные белки играют центральную роль в жизненно важных физиологических процессах, включая передачу сигналов, транспорт ионов и метаболитов, а также организацию мембран. Учитывая их участие в клеточной коммуникации и гомеостазе, они составляют значительную долю мишеней лекарств в клинической разработке. Понимание взаимодействий мембранных белков и лиганд критически важно для прояснения функции и направления терапевтического дизайна. Однако амфипатический характер этих белков и их зависимость от липидных сред создают значительные трудности для очистки, стабилизации и биофизической характеристики.

Поверхностный плазмонный резонанс (SPR) и изотермическая титрорационная калориметрия (ITC) широко используются для изучения кинетики и термодинамики взаимодействий мембраны между белками илигандыми 1,2. При соответствующей оптимизации оба метода могут дать подробные количественные данные, даже для белков, растворимых в детергенте или восстановленных мембранных белках. Микромасштабный термофорез (MST) также успешно применялся для оценки аффинности связывания в близких к нативных условиях, особенно для мембранных белков³. Тем не менее, эти подходы могут быть ограничены значительным потреблением образцов, трудностями в поддержании стабильности мембранного белка или ограниченной совместимостью с определёнными моющими средствами.

Биослоевая интерферометрия (BLI) — это оптическая техника в реальном времени, позволяющая количественно измерять биомолекулярные взаимодействия, включая те, что включают мембранные белки, растворимые в детергенте или амфиполе. Вместе с вышеупомянутыми биофизическими методами BLI предлагает эффективную платформу, позволяющую напрямую измерять кинетику связывания, включая ассоциацию (k on), диссоциацию (koff) и константы диссоциации равновесия (KD), при снижении концентрации образца и простой адаптации к мембранным белкам, растворимым на детергенте или нанодисках. Также стоит отметить, что, как и все биофизические технологии, BLI имеет свои ограничения, о которых будет упомянуто в разделе обсуждения.

BLI фиксирует сдвиги интерференционной картины белого света, отражённого от наконечника биосенсора, при этом изменения оптической толщины соответствуют событиям биомолекулярного связывания. Эти сдвиги (Δλ, в нм) фиксируются в виде сенсорграмм и пропорциональны массе, ограниченной на поверхности датчика. BLI широко применяется к взаимодействиям белок-белок и белок-лиганд (включая пептиды и малые молекулы) и подходит для диапазонов аффинности от наномолярных домикромоляров 4. Его гибкость, низкая потребление образцов и относительно простая настройка делают его потенциально выгодным инструментом для изучения мембранных белков, растворимых вдетергенте 5,6,7.

В этом исследовании представлен протокол BLI для характеристики взаимодействия между TMEM120A M207A, мембранным белком, и Grammostola механотоксином 4 (GsMTx4), ингибитором пептидов. TMEM120A был предложен как механочувствительный ионный канал, используемый в механическом обнаруженииболи 8; Однако активность ионного канала остаётся спорной. Многочисленные исследования сообщили об отсутствии механочувствительных токов при экспрессии TMEM120A в гетерологичных системах, таких как HEK293 или CHOклетки 1,9,10,11. На сегодняшний день более четырёх крио-ЭМ исследований выявили структуру TMEM120A в закрытом состоянии, и открытой конформации ненаблюдалось 1,9,10,11.

Молекулярно-динамические симуляции и электрофизиологические анализы показывают, что метионин 207 (M207) в дикой TMEM120A человека может служить барьером внутри ионного проводящегопути 11. Мутация этого остатка в аланин (M207A) показала повышение ионопроницаемости, вероятно, за счёт изменения упаковки спирали и вытеснения гидрофобных боковых цепей, таких как Phe223. В результате мутант M207A был выбран для исследований связывания с GsMTx4.

GsMTx4 — это пептид-модификатор гейтинга, полученный из паучьего яда, который ингибирует механочувствительные катионные каналы. Он состоит из последовательности из 32 аминокислот и имеет молекулярную массу от 4 до 5 кДа, включая пьезо- и TRP-каналы, главным образом за счёт взаимодействия с липидным бислоем, а не прямого блокированияпоры 12,13. Предыдущие исследования показали, что GsMTx4 снижает активность TMEM120A в искусственных двухслойныхсистемах 8. В анализах BLI мутант TMEM120A M207A был иммобилизован на анти-FLAG биосенсорах и подвергся воздействию растущих концентраций GsMTx4, что позволило измерять частоты ассоциаций (kon) и диссоциации (koff).

В данной работе представлен подробный протокол оптимизации детергента и кинетического анализа с использованием биослоевой интерферометрии (BLI). Хотя BLI имеет некоторые ограничения, такие как возможные артефакты из-за перегрузки сенсоров или эффектов массового транспорта, а также сниженная пригодность к взаимодействиям с быстрой частотой ассоциации (kon), это полезный метод для изучения взаимодействия мембранных белков и лиганд в контролируемых детергентно-растворимых условиях. Протокол подходит для систем со средней или низкой аффинностью связывания (обычно в диапазоне наномоляров и микромоляров) и может адаптироваться к другим гидрофобным целям при применении соответствующих контролей и буферных условий.

Протокол

1. Очистка белка и оптимизация образцов

  1. Культивирование и трансфекция клеток
    1. Выращивайте суспензионные клетки HEK293T/SF17 в среде без сыворотки, дополненной 20 мМ L-глутамина, в встряхивающем инкубаторе, установленном при 120 об/мин, 37 °C, влажности 80% и 8% CO₂. Поддерживайте клетки, проходя до пятого прохода; позволяет клеткам достигать плотности примерно 5 × 10⁶ клеток/мл.
    2. Трансфектировать клетки плазмидой TMEM120A M207A (N-терминал FLAG-Linker-3C-Linker-TMEM120A M207A) в векторе pCDNA3.1 с использованием коммерческого трансфекционного реагента согласно инструкциям производителя (см. таблицу материалов).
    3. Пеллетные клетки трансфицировали центрифугой при 5 000 × г в течение 15 минут при 4 °C. Храните клеточную гранулу при -80 °C до очистки.
  2. Лизис и растворение клеток (Рисунок 1)
    1. Ресуспензировать 30-мл клеточную гранулу в растворительном буфере, содержащую 100 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновую кислоту (HEPES), pH 7,8; 300 мМ NaCl; 0,5% (w/v) или 4,98 мМ лаурилмальтоза неопентилгликоль (LMNG); 1 коктейль с ингибиторами протеаз; 50 мкг ДНКазы I; 10% (v/v) глицерина.
    2. Лизуйте клетки ультразвуковой обработкой с амплитудой 25% с импульсным циклом 20 с включённым/20 секундами отключения в течение 15 минут, при этом образец остаётся на льду для предотвращения перегрева.
    3. Очистить лизат центрифугированием при 25 800 × г в течение 45 минут при 4 °C.
  3. Аффинитная очистка с использованием анти-FLAG смолы
    1. Уравновесить смолу M2 против FLAG с буфером уравновесия, содержащим 25 мМ HEPES, pH 7,8; 200 мМ NaCl; 0,05% (w/v) или 0,4975 mM LMNG; 10% (v/v) глицерина.
    2. Инкубировать очищенный супернатант с уравновешенной смолой в течение 2 часов при 4 °C на коромысле.
    3. Промыйте смолу 2 раза с буфером с содержанием 25 мМ HEPES, pH 7,8; 150 мМ NaCl; 0,05% (w/v) или 0,4975 mM LMNG; 10% (v/v) глицерина.
    4. Элюировать связанный белок с помощью буфера элюирования, содержащего 25 мМ HEPES, pH 7,8; 400 мМ NaCl; 0,001% (w/v) или 0,00995 мМ LMNG; 10% (v/v) глицерина; Пептид FLAG 200 мкг/мл.
  4. Хроматография с концентрацией и исключением размера (SEC)
    1. Концентрируйте элюированный белок до ~500 мкл с помощью центробежного фильтра с отсечением 30 кДа.
    2. Выполните SEC с использованием столбца исключения ссылочного размера, уравновешенного с 25 мМ HEPES, pH 7,8; 200 мМ NaCl; 0,00015% (в/в) или 0,00149 мМ LMNG.
    3. Собирайте и объединяйте пиковые доли, соответствующие целевому белку.
    4. Концентрируйте объединённые части до ~3 мг/мл конечной концентрации. После очистки аффинности подтвердите, что белковый мономер TMEM120A M207A находится примерно в 43 кДа на SDS-PAGE (рисунок 2A). Для SEC убедитесь, что очищенный белок в LMNG элюирует в виде монодисперсного пика, соответствующего примерно 150 кДа, что представляет собой димер TMEM120A M207A вместе с детергентным мицеллой LMNG (рисунок 2B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Иногда мономерная белковая полоса может появляться около 50 кДа, что характерно для мембранных белков, растворимых детергентом, поскольку кипячение мембранных образцов белка обычно не встречается.

2. Анализ тепловой устойчивости с помощью нанодифференциальной сканирующей фториметрии (NanoDSF)

  1. Разбавить очищенный белок TMEM120A M207A до 0,15 мг/мл в буфере SEC (25 мМ HEPES, pH 7,8, 200 мМ NaCl, 0,00015% LMNG).
  2. Загрузить по 10 мкл каждого образца в высокочувствительные капилляры.
  3. Проведите тест термического смещения на приборе NanoDSF с температурным переходом от 25 °C до 90 °C.
  4. Используйте совместимое программное обеспечение для настройки анализа и автоматизированного анализа.
  5. Подтвердите, что видима одна кривая теплового перехода (Tm), указывающая на кооперативное разворачивающееся событие (рисунок 3).

3. Масс-фотометрия для определения олигомерного состояния

  1. Подготовьте образец, разведенный до 80 нМ в буфере SEC (25 мМ HEPES, pH 7,8, 200 мМ NaCl, 0,00015% LMNG).
  2. Поместите образец в предварительно очищенные слайды, совместимые с массовой фотометрией.
  3. Собирайте данные с помощью стандартных настроек и калибруйте с помощью белковых стандартов.
  4. Обработка данных с помощью программного обеспечения для анализа для создания гистограмм массового распределения (рисунок 4A-C).

4. Протокол биослоевой интерферометрии (BLI)

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол описывает кинетический анализ BLI, предназначенный для изучения взаимодействий между FLAG-метированными TMEM120A M207A и лигандами, такими как GsMTx4, с использованием формата микропластин с 384 яноми. Хотя процесс разработан для TMEM120A, его можно адаптировать и под другие мембранные белки. Все эксперименты проводились с использованием оптической интерферометрической платформы с биосенсорными зондами FLAG для обездвиживания FLAG-метки TMEM120A M207A. Была использована чёрная микропластина с 384 лунками и оптимизированным буфером хроматографии с исключением размера (SEC), содержащим 25 мМ HEPES, 200 мМ NaCl, 0,00015% (w/v) LMNG и 0,0005% Tween-20, pH 7,8. Tween-20 был включён для минимизации неспецифического связывания. Концентрация белка поддерживалась на уровне 250 нм, а все анализы проводились дублированно для обеспечения воспроизводимости.

  1. Особенности проектирования анализов
    1. Уравновесение температуры
      1. Перед началом BLI-анализа уравновесите все компоненты анализа — включая буферы, образцы и биосенсорные зонды — до комнатной температуры (примерно 20-25 °C). Во время сбора данных поддерживайте температуру анализа на уровне 30 °C, что рекомендуется для кинетического анализа с целью оптимизации стабильности белков, связывания лигандов и воспроизводимости.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап уравновешения обеспечивает единообразные кинетические профили и минимизирует артефакты, вызванные колебаниями температуры во время эксперимента. Дайте достаточно времени (не менее 10–15 минут), чтобы все реагенты и биосенсоры достигли теплового равновесия перед началом анализа.
    2. Гидратация и регенерация датчиков
      1. Гидратировать новые биосенсоры FLAG в 250 мкл совместимого с BLI буфером (буфер SEC с 25 мМ HEPES, 200 мМ NaCl, 0,00015% с LMNG и 0,0005% Tween-20, pH 7,8) в Max пластине минимум за 10 минут до использования.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно обращайтесь с биосенсорами с помощью чистого, безпыльного пинцета, чтобы избежать загрязнения, которое может мешать приёму сигнала и приводить к непоследовательным результатам. Для повторного использования датчика выполняйте регенерацию с помощью Q-буфера (0,3 М глицина, pH 3,8). Правильная гидратация и регенерация критически важны для поддержания работы и воспроизводимости сенсоров, особенно при работе с мембранными белками, растворяемыми в детергенте, чувствительными к условиям окружающей среды.
    3. Обработка буфера
      1. Избегайте воздушных пузырьков при подаче жидкости, так как они могут мешать приёму оптического сигнала.
    4. Состав буфера и согласованность
      1. Используйте буфер, который минимизирует неспецифические взаимодействия, сохраняя при этом функцию белка. Для TMEM120A M207A подготовьте буфер, содержащий 25 мМ HEPES, 200 мМ NaCl, 0,00015% (w/v) LMNG, 0,0005% (w/v) Tween 20, pH 7,8.
    5. Иммобилизация белков
      1. Оптимизируйте загрузку лигандов для достижения насыщенности датчика 50-80%. Используйте фиксированную концентрацию белка при 250 нм, с типичной длительностью загрузки примерно 120 с. Загрузите FLAG-метку TMEM120A M207A (250 нм) на биосенсор на 120 секунд, чтобы достичь 50-80% насыщенности.
      2. Убедитесь, что сигнал биосенсора достигает 50–80% максимальной ёмкости связи во время фазы загрузки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Сигналы ниже 50% могут указывать на недостаточную иммобилизацию белков, тогда как сигналы выше 80% могут создавать ограничения массового переноса или стерические препятствия, что потенциально нарушает кинетические измерения.
      3. Для оценки возможных эффектов массового транспорта проводите контрольный эксперимент, в котором концентрация анализируемого вещества (например, 100 нМ GsMTx4) остаётся постоянной при изменении уровней нагрузки TMEM120A-M207A на биосенсорах FLAG (дополнительный рисунок S1).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Последующие кинетические измерения — включая ассоциацию, диссоциацию, глобальные привязки и определение kon и k off — не отличались существенно от тех, что были получены в основном анализе. Этот результат показывает, что TMEM120A нагрузка в диапазоне 50-80% не приводит к значимым артефактам массового транспорта, что подтверждает, что уровень нагрузки биосенсора подходит для надёжного кинетического анализа.
    6. Оценка K D
      1. Определите связывающую аффинность (KD), проверяя концентрации анализируемых веществ (GsMTx4) 0 мкм, 5 мкм, 10 мкм, 20 мкм, 30 мкм, 50 мкм и 100 мкм.
    7. Управление фоновыми сигналами
      1. Включить соответствующие органы управления для точного вычитания фоновых сигналов и обеспечения надёжных кинетических измерений.
      2. Используйте эталонный зонд FLAG для учёта неспецифического связывания или дрейфа, которые могут возникнуть во время анализа.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Этот эталонный зонд не должен иммобилизовать целевой белок и служит базой для коррекции сигнала, полученного от зондов с образцом.
      3. Вычтите эталонный сигнал из сигнала выборки, чтобы проанализировать только специфические взаимодействия между FLAG-метированными TMEM120A M207A и аналитами.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте, что эталонный зонд FLAG показывает минимальный сигнал на протяжении всего теста. Стабильный, низкий базовый уровень означает незначительное неспецифическое связывание. Если эталонный сигнал колеблется или увеличивается, переоцените состав буфера, работу с зондом или подготовку образцов, чтобы уменьшить неспецифические взаимодействия перед кинетическим анализом.
  2. Конфигурация базовых параметров анализа для кинетики
    1. Установите частоту сбора данных на 5 Гц для сбора 5 точек данных в секунду (рекомендуется для всех кинетических анализов).
    2. Выберите пластину с 384 колодцями в качестве формата пластины.
    3. Установите скорость встряхивателя на 1000 об/ мин и температуру между окружающей средой и 30 °C (30 ° C используется в этом эксперименте для оптимального кинетики).
  3. Настройте схему пластин.
    1. Перейдите на вкладку «Настройка пластин » и определите назначение скважин как для пластины с 384 лунками, так и для пластины Max.
    2. Назначьте функции скважины на пластине с 384 лунками.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Символы и аннотации, используемые как для пластины с 384 лунками, так и для Max Plate, обобщены в дополнительной таблице S1.
      1. Маркируйте колодцы по роли: буфер, белок (загрузка), лиганд (образец).
      2. Аннотируйте белки, загружающие колодцы с концентрацией (например, 250 нМ) для кинетических анализов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Точная маркировка необходима для вычисления kon и kD (см. дополнительный рисунок S2A).
    3. Настройте карту максимальной пластины (пробную пластину).
      1. Назначьте биосенсорные зонды на соответствующие скважины.
      2. Если планируется регенерация зонда, назначьте скважины для буферов регенерации и нейтрализации. Чётко маркируйте эти скважины в программном обеспечении для обеспечения правильной автоматизации во время регенерации (см. дополнительную таблицу S2).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер анализа состоял из 25 мМ HEPES (pH 7,8), 200 мМ NaCl, 0,00015% (w/v) LMNG и 0,0005% (v/v) Tween-20. Этап регенерации биосенсорных зондов анти-FLAG проводился с использованием Q-буфера с содержанием 0,3% глицина (pH 3,8), после чего последовал этап нейтрализации с помощью буфера анализа (25 mM HEPES, 200 mM NaCl, 0,00015% LMNG и 0,0005% Tween-20, pH 7,8).
  4. Выберите вкладку «Шаги анализа ».
    1. Перейдите на вкладку «Шаги анализа», чтобы настроить рабочий процесс кинетического анализа. Укажите положения скважин для каждой фазы анализа, включая исходную точку, нагрузку белка, ассоциацию и диссоциацию (см. дополнительный рисунок S3).
    2. Выберите подходящий тип шага в выпадающем меню. Убедитесь, что шаги ассоциации и диссоциации правильно обозначены для точного кинетического анализа.
    3. Введите длительность каждого шага в секундах, чтобы определить время экспозиции для всех фаз взаимодействия.
      1. Установите базовую длительность шага, чтобы позволить уравновесить сенсор до загрузки белка (60 с).
      2. Установите длительность этапа загрузки белка для достижения желаемого уровня иммобилизации лиганда (60 с) (рисунок 5).
      3. Установите длительность ассоциативного шага так, чтобы обеспечить достаточное связывание с анализом (300 с) (рисунок 5).
      4. Установите длительность шага диссоциации для адекватного захвата кинетики развязывания анализа (600 с) (рисунок 5).
    4. Установите скорость встряхивателя (RPM) для каждого шага, чтобы поддерживать стабильное смешивание и оптимальное качество данных (1 000 об/мин).
  5. Шаг выравнивания и фильтрации (см. дополнительный рисунок S4 и дополнительный рисунок S5)
    1. Выполните коррекцию исходных данных, изменяя диапазон данных по необходимости, чтобы убрать артефакты из кинетических шагов.
    2. Чтобы выровнять ось Y, выровняйте данные в начале шага ассоциации, выбрав Ассоциация в разделе Align Step Type и активировав опцию Begin .
    3. Включите опцию коррекции между шагами для поддержания непрерывности между шагами во время стандартных кинетических анализов.
    4. Фильтрация: примените сглаживание данных для снижения шума сигнала без искажения тенденций. Выберите «Обработанно », чтобы сравнить сглаженные данные с исходными сигналами.
  6. Установите опорный шаг (см. дополнительный рисунок S6).
    1. Назначьте эталонный зонд, выбрав его и нажав кнопку Ref. Probe .
    2. Выберите образцы зондов, кликнув по соответствующим номерам столбцов для пробных зондов.
    3. Чтобы определить функцию вычитания, откройте редактор формул, нажмите Редактировать формулу и определите функцию вычитания, чтобы убрать фон.
    4. Просмотр таблицы , чтобы подтвердить, что вычитание ссылок было применено правильно.
  7. Этап крепления крепления
    1. Перейдите на вкладку «Подгонка» и определите параметры анализа (дополнительный рисунок S7).
    2. Выбор данных: включать как ассоциационные, так и диссоциационные фазы для локального кинетического приспособления. Исключайте выбросы вручную, если у них плохое подгонение кривых или непредсказуемый сигнал.
    3. Выбор модели связывания: выберите модель связывания 1:1, чтобы она соответствовала данным, если не наблюдается сложное поведение. Проверьте наложения кривой и остатки для проверки пригодности модели.
    4. Стратегия подгонки: Выберите одну из следующих стратегий подбора в зависимости от качества данных и целей эксперимента:
      1. Локальный: подходит под каждую концентрацию анализа индивидуально, позволяя самостоятельно оценивать кинетику ассоциаций и диссоциации.
      2. Глобальный: Подходит ко всем концентрациям анализируемых веществ одновременно, используя единый набор кинетических параметров, обеспечивая общую модель для набора данных.
      3. Full: Соответствует как фазам ассоциации, так и диссоциации во всех направлениях по всему миру.
      4. Частичная: подходит только к фазе ассоциации, игнорируя диссоциацию.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Данные BLI анализировались с использованием модели связывания Лангмюра в соотношении 1:1 с локальной полной подгонкой. Локальное подгонка обеспечивает независимую обработку каждой концентрации анализа, обеспечивая точное представление кинетики ассоциаций и минимизируя артефакты гетерогенности на фазе диссоциации. Этот подход избегает перенагонов в областях с переменными или нестабильными сигналами, что позволяет более надёжно оценивать кинетические параметры (k включены иk выключены) (Таблица 1 и Таблица 2).
  8. Кинетический анализ
    1. Обзор подгонных кривых и остатков: Изучить подгонные кривые и соответствующие остатки для оценки качества и достоверности модели. Подтвердите, что остатки случайным образом распределены вокруг нуля без систематических отклонений (см. рисунок 4E для репрезентативных остатков).
    2. Исключение плохо подходящих данных: удалять концентрации анализируемых веществ, которые демонстрируют плоские, шумные или иные ненадёжные сигналы, чтобы повысить общую точность модели.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Например, концентрация 10 мкм была исключена из подгонки из-за перекрытия с набором данных 5 мкм, что могло искажать оценку кинетических параметров (см. рисунок 6A,B).

Результаты

Мутант TMEM120 M207A экспрессировался в суспензионных клетках HEK293SF-17 с использованием вектора pCDNA3.1, кодирующего N-терминальную метку FLAG (рисунок 1). Транзитная трансфекция позволила экспрессию рекомбинантных белков. После сбора клеток мембранные белки растворялись в 0,5% лаурилмальтозном неопентилгликоле (LMNG) — неионном детергенте, подходящем для поддержания растворимости мембранных белков.

Растворённая фракция подвергалась аффинитной очистке с использованием смолы M2 против FLAG. Смола была промыта буфером с 0,01% LMNG для удаления неспецифических связанных белков, а TMEM120 M207A элюирован в буфере с 0,001% LMNG. Элюция концентрировалась с помощью центробежных фильтров с срогами молекулярной массы 30 кДа или 100 кДа, в зависимости от выхода образца. Дальнейшая очистка проводилась с помощью хроматографии с исключением размера (SEC). Последний этап SEC был проведён в буфере с 0,00015% LMNG, что позволило получить монодисперсный профиль элюирования, соответствующий однородному и стабильному белковому препарату, пригодному для последующих структурных и функциональных анализов (рисунок 2B).

Оптимизация и биофизическая характеристика FLAG-метированных TMEM120 M207A кратко изложены на рисунке 2. Экспрессия и очистка были подтверждены SDS-PAGE, который показал одну полосу примерно 50 кДа. Наблюдаемая миграция была немного выше ожидаемой молекулярной массы мономерной формы (рисунок 2A), вероятно, из-за неварящегося образца до электрофореза. Хроматограмма SEC показала один, симметричный пик элюирования в объёме, соответствующем видимой молекулярной массе примерно 150 кДа в 0,00015% (w/v) LMNG (рисунок 2B), что соответствует димеру TMEM120A M207A в мицеллах LMNG-детергентов. Такое поведение при элюировании демонстрирует однородную и монодисперсную популяцию белков, что делает его подходящим для биофизической характеристики на последующих этапах.

Свойства детергентных мицелл ЛМГ в условиях экспериментального буфера были проанализированы с помощью массовой фотометрии. Измерения проводились в буфере SEC с изменяющимися концентрациями ЛМНГ при отсутствии белка для оценки вклада детергентных мицелл в прозрачную молекулярную массу. При 0,001% (w/v) LMNG, концентрации выше критической концентрации мицелл (CMC), преобладающий пик был обнаружен примерно на уровне 69 кДа, что соответствует только LMNG мицеллам без связанного белка (см. рисунок 4A). Когда концентрация ЛМНГ снижалась до 0,0001% (w/v) ниже CMC, основной вид смещался до ~48 кДа, что указывает на наличие меньших остаточных агрегатов ЛМГ или субмицеллярных сборок без белка (рисунок 4B). Далее (рисунок 4C) TMEM120A M207A был разведён в буфере SEC с различными концентрациями LMNG для оценки его олигомерного состояния с помощью массовой фотометрии. При 0,00001% LMNG (~20 раз ниже CMC, маджента) был зафиксирован преобладающий пик примерно в 42 кДа, соответствующий мономеру TMEM120A M207A. При 0,00015% LMNG (~10x ниже CMC, синий), основная популяция на уровне ~86 кДа указывала на наличие димеров. Повышение концентрации ЛМГ до 0,001% (~2 раза выше CMC, оранжевое) привело к появлению основного вида с концентрацией ~150 кДа, что соответствует белокно-детергентным комплексам. При 0,002% LMNG (~4 раза выше CMC, зелёный) было обнаружено широкое распределение с центром около 180 кДа, представляющее более крупные мицелл-ассоциированные сборки или олигомеры высшего порядка. Эти результаты показывают, что концентрация LMNG в буфере SEC сильно влияет на чистое олигомерное состояние TMEM120A M207A, при этом мономерно-димерное равновесие наблюдается ниже CMC, а образование детергентно-белкового комплекса преобладает над CMC.

Термодинамическая устойчивость TMEM120A M207A, собранного с основного пика SEC и хранящегося в буфере SEC (25 мМ HEPES, 200 мМ NaCl, 0,00015% (w/v) LMNG, pH 7,8), была оценена методом термического денатурационного анализа. Белок демонстрировал точку перегиба примерно при 46 °C, что соответствует температуре плавления (Tm) в этих условиях, растворённых в детергенте. Это значение T m указывает на умеренную термическую стабильность, что говорит о том, что TMEM120A M207A сохраняет правильно сложенную форму внутри мицелл LMNG, но может начинать разворачиваться или агрегировать при более высоких температурах.

Биослоевая интерферометрия (BLI) показывает μM связывающую аффинность TMEM120A M207A к GsMTx4T. Следы на рисунке 5 иллюстрируют пять экспериментальных этапов: (1) базовая линия, (2) TMEM120A загрузка образца M207A, (3) базовая линия для удаления неспецифического связывания и избыточного TMEM120A M207A, (4) ассоциации и (5) диссоциация. Сдвиг длины волны (нм) отображается со временем для увеличения концентраций GsMTx4 (0, 5, 10, 20, 30, 50 и 100 мкм), взаимодействующих с обездвиженными TMEM120A M207A.

Во время начальной базовой линии (шаг 1) сигнал оставался стабильным, подтверждая уравновесление датчика в буфере. TMEM120A загрузка M207A (шаг 2) вызвала характерное увеличение сигнала, соответствующее ~50-80% насыщенности зонда между датчиками. Фаза нагрузки показала слегка изогнутый отклик, а не резкий плато, что, возможно, отражает ограничение частичного массового транспорта, при котором диффузия TMEM120A M207A на поверхность датчика медленнее скорости связывания — эффект, характерный для мембранных или детергентно-растворимых белков, который может влиять на видимое покрытие поверхности.

Следующий базовый этап (шаг 3) фактически удалил несвязанные или слабо прикреплённые TMEM120A M207A. Во время фазы ассоциации (шаг 4) увеличение концентрации GsMTx4 приводило к явным, зависящим от концентрации увеличению смещения длины волны. Во время диссоциации (шаг 5) биосенсор помещался в буфер SEC, содержащий LMNG, на уровне ~10x ниже CMC. Первые 5–10 секунд диссоциации показали быстрое снижение сигнала, вероятно, означающее быстрый выброс GsMTx4 из легко доступных участков, за которым следовал более медленный спад, который может отражать более стабильные TMEM120A комплексы M207A-GsMTx4 с медленной кинетикой диссоциации. Эталонные сигналы зонда оставались плоскими на протяжении всего эксперимента, что указывало на минимальное неспецифическое связывание. В целом эти данные демонстрируют специфические взаимодействия TMEM120A M207A-GsMTx4; Однако наблюдаемую кинетику следует интерпретировать осторожно из-за среды моющих средств и возможных эффектов массового транспорта.

Ассоциативные и диссоциационные сенсорные граммы обработанных данных после вычитания референсного зонда (рисунок 6A) показали концентрационно-зависимые реакции для GsMTx4 в диапазоне от 5 до 100 мкм. Увеличение концентрации лиганда приводило к постепенным увеличению сдвигов длины волны, за которыми следовало постепенное и медленное снижение в фазе диссоциации в 200 с. Набор данных размером 10 мкм был исключён из установки из-за пересечения с 5 мкм трассировкой, что улучшило общее качество модели.

Кинетический анализ проводился с использованием модели ассоциации-диссоциации Лангмюра 1:1 с локальной стратегией полного прилегания, при которой концентрации отдельных анализируемых веществ были независимо в общей кинетической структуре (рисунок 6B). Подгонные кривые (красные) хорошо совпадали с экспериментальными следами, давая оценочную константу диссоциации (KD) в низком микромолярном диапазоне. Остаточный анализ (рисунок 6C) не выявил значительных систематических отклонений, что указывает на соответствие применяемой модели для данного набора данных. Незначительные различия, наблюдаемые на ранней фазе ассоциации, могут отражать ограничения в массовом переносе или влияние среды детергентного мицелла. Дополнительные примеры кривых ассоциации и диссоциации по подгонке, остаточных графиков и статистики подгонки по множеству репликий и позиций зонда приведены в дополнительном рисунке S8.

В исходных данных (рисунок 5) первые 5–10 секунд диссоциации показали быстрое снижение сигнала, вероятно, отражающее быстрое высвобождение GsMTx4 из легко доступных участков, за которым следовало более медленное затухание, которое может отражать более стабильные TMEM120A комплексы M207A-GsMTx4 с медленной кинетикой диссоциации. Таким образом, в таблице 2 первые 100 секунд диссоциации были удалены из подгонки. Отсутствие систематического отклонения указывает на хорошее соответствие локальной полностью подходящей модели Лангмюра 1:1 для TMEM120A M207A во всех протестируемых концентрациях (рисунок 7).

Кинетический анализ связывания GsMTx4 с TMEM120A M207A выявил концентрационно-зависимые ассоциационные и диссоциационные поведения в диапазоне лигандов 5-100 мкм (Таблица 1). Наблюдаемые константы частоты ассоциаций (kon) умеренно увеличились с ростом концентрации GsMTx4, варьируясь примерно от 1,0 × 10⁻⁶ до 3,2 × 10-6 1/M·s, в то время как оценочные константы частоты диссоциации (k off) оставались близкими к нулю в пределах экспериментальной ошибки, что указывает на медленную или незначительную фазу диссоциации в исследуемых условиях. Рассчитанные константы диссоциации равновесия (Kd) находились в диапазоне низких и средних микромоляров (~0,8-3,3 мкм), что соответствует умеренному взаимодействию аффинности. Локальное полное подгонка с использованием модели связывания Langmuir 1:1 дало высококачественные совпадения для всех концентраций GsMTx4, с коэффициентами корреляции выше 0,99 и низкими относительными значениями χ2 для фаз ассоциации и диссоциации (Таблица 1). Рассчитанные равновесные диссоциационные константы были согласованы по концентрациям и реплицациям, при этом значения KD находились в низком микромолярном диапазоне (~1-2 мкм), что указывает на умеренное, но специфическое связывание между TMEM120A M207A и GsMTx4.

Реплицированные наборы данных при каждой концентрации показали воспроизводимость, что подтверждается высокими коэффициентами корреляции (R² > 0,99) как для ассоциативных, так и для диссоциационных совпадений. Полные и относительные значения χ² были низкими и сопоставимы между репликами, что дополнительно подтверждает устойчивость модели связывания Лангмюра 1:1, применённой в анализе. При более высоких концентрациях лиганда (≥50 мкм) наблюдались небольшиезначения k on и k D, что может отражать незначительные эффекты массового переноса или локальную гетерогенность поверхности, а не реальные изменения аффинности. Кинетическая согласованность в нескольких репликах и зондовых позициях дополнительно иллюстрируется в дополнительном рисунке S9.

Кинетические профили показывают, что GsMTx4 специфически и стабильно взаимодействует с TMEM120A M207A, образуя относительно стабильные комплексы, характеризующиеся медленной диссоциацией и аффинностью микромолярного связывания.

figure-results-1
Рисунок 1: Рабочий процесс очистки мутанта TMEM120A M207A, экспрессируемого в суспензионных клетках HEK293SF-17 . Схематический обзор процедуры очистки белка. TMEM120A M207A экспрессировался из плазмид pCDNA3.1 в клетках HEK293SF-17. Клетки растворялись в 0,5% ЛМНГ, после чего проводилась аффинитная очистка с использованием смолы M2 против FLAG. Смола была промыта буфером с 0,01% LMNG для удаления неспецифически связанных белков. TMEM120A M207A был элюирован в буфере, содержащем 0,001% LMNG. Элуат концентрировался с помощью фильтров среза молекулярной массы 100 кДа или 30 кДа, а затем очищался хроматографией с исключением размера в буфере с 0,00015% LMNG. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: Хроматография исключения размеров и SDS PAGE очищенного TMEM120A M207A в детергенте LMNG (A) SDS-PAGE FLAG-метичного TMEM120A M207A, очищенного хроматографией с исключением размера. Белковая полоса отображается на уровне ~50 кДа в полосе 1, что соответствует ожидаемому мономеру. (B) SEC-профиль очищенного TMEM120A M207A на колонке SEC в буфере SEC (25 мМ HEPES, 200 мМ NaCl, 0,00015% LMNG, pH 7,8). Элюция белка указывает на преобладающий монодисперсный вид, подходящий для биофизических анализов по следующему потоку. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Дифференциальная сканирующая флюориметрия очищенного TMEM120A M207A в LMNG .DSF показывает термодинамическую точку перегина при 46 °C, что свидетельствует о термической стабильности белка при испытанных буферных условиях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: характеристика очищенного TMEM120A M207A в детергенте LMNG с использованием техники массовой фотометрии. (A,B) Массовая фотометрия буфера SEC с изменяющейся концентрацией LMNG. При 0,001% LMNG (выше критической концентрации мицелл, CMC), видимая молекулярная масса составляет ~69 кДа, что в первую очередь соответствует ЛМНГ-мицеллам. При 0,0001% LMNG (в десять раз ниже CMC), пик достигает ~48 кДа. (C) Масс-фотометрический анализ концентрационно-зависимых эффектов на TMEM120A олигомеризацию. TMEM120A в 0,000001% LMNG (~20 раз ниже CMC, пурпурный) демонстрирует основную популяцию примерно 42 кДа (мономер). В 0,00015% LMNG (~10 раз ниже CMC, синий) наблюдается популяция на уровне ~86 кДа, что соответствует димеру. В 0,001% LMNG (~2 раза выше CMC, оранжевый) один из основных видов с объёмом ~150 кДа соответствует белоко-детергентным комплексам. В 0,002% LMNG (~4 раза выше CMC, зелёный) широкое распределение с центром в ~180 кДа указывает на более крупные сборки, связанные с мицеллой, или олигомеры высшего порядка. Эти результаты показывают, что концентрация ЛМНГ сильно влияет на видимое олигомерное состояние TMEM120A, при этом равновесие мономер-димер наблюдается ниже CMC, а образование белок-детергентного комплекса преобладает выше CMC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-5
Рисунок 5: Исходные данные программного обеспечения, показывающие TMEM120A взаимодействия M207A-GsMTx4. Биослойная интерферометрия показывает, что TMEM120A (M207A) связывает механочувствительный ингибитор каналов GsMTx4 с микромолярной аффинностью. На рисунке показаны исходные данные отклика BLI, полученные программным обеспечением Gator Prime, с выделением пяти ключевых фаз анализа: (1) Начальная базовая линия, в течение которой сигнал оставался стабильным; (2) Иммобилизация (нагрузка), приводящая к увеличению примерно на 1,5 нм смещения длины волны; (3) Вторая базовая линия, позволяющая удалять несвязанный или слабо связанный белок; (4) Фаза ассоциации (связывание лигандов), когда увеличение концентрации GsMTx4 приводило к повышению ответа до ~5,5 нм в течение 300 с; и (5) Фазу диссоциации (высвобождение лиганда), показывающую постепенное затухание сигнала на протяжении 600 секунд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-6
Рисунок 6: Кинетика связывания TMEM120A M207A с пептидом GsMTx4. (A) Ассоциации и диссоциационные сенсорные граммы TMEM120A M207A, взаимодействующие с GsMTx4 при пяти концентрациях: 5 мкм, 20 мкм, 30 мкм, 50 мкм и 100 мкм. Набор данных размером 10 мкм был исключён из подгонки из-за перекрытия с кривой 5 мкм, что улучшило общую подгонку модели. Вертикальные пунктирные красные линии обозначают начало и конец фазы диссоциации. (B) Подгонка сенсорграмм была выполнена с использованием локальной модели полного фитинга Langmuir 1:1 ассоциативно-диссоциационной системы. Красные кривые обозначают подогнанную модель, а экспериментальные следы соответствуют измеренным данным ассоциаций и диссоциации для каждой концентрации GsMTx4 (по две реплики на каждое условие). (C) Остаточные графики, показывающие отклонение между экспериментальными данными и приспособленной моделью для фаз ассоциации и диссоциации, подтверждающие правильность подхода. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-7
Рисунок 7: Остаточные графики, соответствующие прилагосмысленным кривым связывания. Каждый график показывает остаточные значения (разницу между экспериментальными данными и подгонной моделью) для одной концентрации GsMTx4: 5 мкм, 20 мкм, 30 мкм, 50 мкм и 100 мкм. Остатки отображаются как смещение смещения (нм) относительно времени (с), показывая случайное распределение около нуля по фазам ассоциации и диссоциации. Отсутствие систематического отклонения указывает на хорошее соответствие локальной модели Langmuir 1:1 для TMEM120A M207A во всех протестируемых концентрациях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Таблица 1: Сводка кинетических параметров для связывания TMEM120A M207A с GsMTx4. Кинетические параметры были получены из локального полного фитинга с использованием модели связывания Лангмюра 1:1. Ассоциация (k on), диссоциация (koff), наблюдаемые константы скорости (kobs) и равновесные диссоциационные константы (KD) указываются для каждой концентрации GsMTx4 и реплицируются. Качество соответствия оценивалось с использованием значений R² и χ² для полных, ассоциативных и диссоциационных фаз. По всем концентрациям фиты показали высокие коэффициенты корреляции (R² > 0,99) и низкие относительные значения χ², что свидетельствует о надёжной работе модели. Примечания: M Conc. указывает на концентрацию GsMTx4 (μM). KOBS представляет собой наблюдаемую константу скорости, отражающую комбинированные процессы ассоциаций и диссоциации. Ошибки, сообщаемые для kobs, kon и koff , отражают неопределённость подгонки. Значения R² указывают на приспособленность к полной, ассоциативной и диссоциационной фазе. Относительные значения χ² представляют собой нормированные метрики точности подгонки, а абсолютные значения χ² указывают на остаточное отклонение между наблюдаемыми и подборочными данными. Сокращения: kon = константа скорости ассоциаций (1/M·s); koff, = константа скорости диссоциации (1/с); kobs = наблюдаемая константа скорости (1/с); KD = константа диссоциации равновесия; Rmax = максимальный отклик; Req = равновесный ответ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Параметры обработки и остатки кинетического подхода. Параметры обработки: начало ассоциации, 0 с; Конец ассоциации — 300 с; начало диссоциации — 100 секунд; конец диссоциации, 300 ш. Минимальное значение R² — 0,9; максимальное χ² значение — 8. Шаг выравнивания: одноступенчатый конец (индекс = 1, среднее = 0). Коррекция между шагами применялась на фазе ассоциации. средний показатель по ассоциации — 50; Средняя диссоциация — 0. Сглаживание Савицкого-Голая было отключено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Дополнительный рисунок S1: Эксперимент по оптимизации для загрузки различных концентраций белка TMEM120A M207A на анти-FLAG зонды с фиксированной концентрацией (100 нМ) пептида GsMTx4 . (A) Исходные BLI-сенсорграммы, показывающие пять шагов кинетического измерения: (1) исходная линия в буфере SEC или анализном буфере (25 мМ HEPES, pH 7,8; 200 мМ NaCl; 0,00015% (w/v) LMNG; 0,0005% (v/v) Tween-20); (2) загрузка четырёх различных концентраций TMEM120A M207A на зонд FLAG, при этом опорный зонд (оранжевый) используется в качестве отрицательного контроля для подтверждения отсутствия неспецифического связывания; (3) на втором этапе линии базы; (4) фазу ассоциации и (5) фазу диссоциации. (B) Глобальная модель связывания 1:1 подходит для четырёх концентраций TMEM120A M207A, взаимодействующих с пептидом 100 нМ GsMTx4. (C) Остаточные графики для фаз ассоциации и диссоциации, показывающие минимальные отклонения от подогнанной модели (<0,05 нм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная рисунок S2: Установка пластины и конфигурация анализа. (A) Проектирование пластин для пластины с 384 лунками, где могут быть назначены различные параметры. Образцы соответствуют лиганду (GsMTx4) при различных концентрациях. Оранжевые колодцы указывают TMEM120 белок M207A при 250 нм. Колодцы представляют размножающиеся белки при 250 нМ, и тот же буфер использовался для начальных, ассоциативных и диссоциационных этапов. (B) Вид Max Plate с четырьмя биосенсорными зондами против FLAG: один эталонный зонд и три зонда для репликаций белков. Все зонды предварительно увлажнялись в пробиральном буфере, регенерировались в Q-буфере и нейтрализовались в анализном буфере. Один и тот же буфер использовался на всех этапах базовой, ассоциативной и диссоциационной стадии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок S3: Циклы установки анализа, включая исходный уровень, загрузку белка, второй базовый уровень, ассоциацию и диссоциацию. Сокращения: B = буфер; L = нагрузка; 0, 5, 10, 20, 30, 50 и 100 = концентрации GsMTx4 в мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок S4: Новый рабочий процесс анализа кинетики (K). Выберите иконку «Эксперимент », которая предоставляет обзор всех анализов, проведённых в рамках одного эксперимента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок S5: Новый рабочий процесс анализа кинетики (K).Иконка «Выравнивание и фильтр », где можно просматривать и анализировать исходные данные как по фазам ассоциации, так и для диссоциации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок S6: Новый рабочий процесс анализа кинетики (K).Иконка Set Reference , используемая для выбора подходящего эталонного датчика для фонового вычитания и точной интерпретации данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок S7: Шаги по подгонке связей в рабочем процессе кинетического анализа. Настройки параметров кинетической подгонки, используемые для анализа данных взаимодействия связы. Модель предполагает взаимодействие 1:1 с одним сайтом связывания лиганда. Тип подгонки установлен в Локальный, что подгоняет каждую кривую концентрации независимо, а не глобально. Опция Full Fitting с включённой полной стежкой включает все непрерывные кривые ассоциации и диссоциации. Временные окна для фаз ассоциации и диссоциации устанавливаются от 0 до 300 с и от 0 до 200 с соответственно. На заднем плане график подгонки связки, остаточный график и отдельные кривые анализа иллюстрируют качество подгонки и экспериментальную вариабельность. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок S8: Шаги по подгонке связей в рабочем процессе кинетического анализа. Граф связывающего подгонки, показывающий фазы ассоциаций и диссоциации в нескольких реплицах анализов и позициях зонда (C1 и D1). График остатков ниже оценивает качество соответствия, при этом остатки указывают на различия между экспериментальными данными и подгоненной моделью; Значения, близкие к нулю, отражают хорошее соответствие. В приложенной таблице приведены соответствующие статистические данные, включая полные значения R², ассоциации R², диссоциации R² и хи-квадрат (X²) для каждой реплики. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок S9: Шаги по подгонке связей в рабочем процессе кинетического анализа. Кинетический анализ связывающих взаимодействий от множественных репликат и зондовых позиций (C1 и D1). Сдвиг отклика датчика (нм) во времени отображает фазы ассоциации и диссоциации, каждая кривая цветно кодируется по анализу и позиции зонда. Вертикальная пунктирная красная линия отмечает переход между фазами ассоциации (0–300 с) и диссоциации. Ниже приведена таблица кинетических параметров, полученных из 1:1 модели связывания, включая концентрацию анализируемого вещества (M Conc.), константу скорости ассоциации (kon), константу скорости диссоциации (koff), ошибки и константу равновесной диссоциации (KD). Стабильное качество посадки поддерживает надёжность кинетических измерений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица S1: Таблица, иллюстрирующая символы, используемые как в пластине с 384 лунками, так и в пластине Max. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная таблица S2: Кинетические параметры, полученные для четырёх концентраций TMEM120A M207A, загруженного на биосенсоры FLAG, взаимодействующих с пептидом 100 нМ GsMTx4, с использованием фиксированных значений kon и koff. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Характеристика взаимодействий мембранных белков остаётся сложной из-за необходимости тщательной очистки белка, тщательной оптимизации концентрации детергента и точного проектирования анализа. В данном исследовании представлен подробный рабочий процесс для TMEM120A M207A, иллюстрирующий как очистку, так и кинетический анализ с использованием GsMTx4 с биослойной интерферометрией (BLI).

Критические шаги и оптимизация:
Одним из важных ключевых этапов была концентрация моющего средства, которая была определена как основной фактор стабильности белка. Процесс очистки включал растворение клеток буфером с 0,5% LMNG, затем последовательную промывку с 0,005% LMNG, элюирование с 0,001% LMNG и окончательную хроматографию с исключением размера (SEC) в буфере с 0,00015% LMNG. Эта стратегия детергента, основанная на низкой критической концентрации мицелл (CMC) LMNG и замедленной скорости выпадения, обеспечивала улучшенную стабильность белка в мицеллах во время очистки. Буфер SEC содержал моющее средство в концентрации в 10 раз ниже CMC LMNG (0,001%), что фактически минимизировало его влияние на биофизические анализы в последующих процессах. Однородность белков и отсутствие агрегации были подтверждены с помощью масс-спектрометрии и анализа термической устойчивости. Рисунок 2, Рисунок 3 и Рисунок 4 иллюстрируют успешную оптимизацию очистки и стабилизации белка в концентрациях детергентов ниже CMC.

Иммобилизация белка на биосенсоре тщательно контролировалась для достижения насыщения зонда 50-80%. Уровень нагрузки 50-80% может ввести определённые ограничения на массовый транспорт; однако этот диапазон был выбран для обеспечения достаточной силы сигнала в системе BLI, где зонды перемещались между скважинами во время анализа. Достижение такого уровня иммобилизации лиганда помогало поддерживать стабильное качество сигнала, хотя такие уровни нагрузки имеют как преимущества, так и потенциальные ограничения. Включение эталонного зонда было критически важным для экспериментов с BLI.

Дополнительный контрольный эксперимент, в котором были протестированы четыре разных уровня иммобилизованных TMEM120A с одной концентрацией пептида (100 нм). Эти данные теперь включены в переработанную рукопись (дополнительный рисунок S1). Увеличение количества иммобилизованного белка приводило к увеличению сигналов нагрузки, но во всех случаях сдвиг оставался ниже 1 нм от исходного уровня (дополнительный рисунок S1A). Мы опубликовали кривые ассоциации и диссоциации с помощью глобальной модели 1:1 связывания, а также включили остаточные графики, которые показывают небольшие незначительные различия между фитированными и экспериментальными данными.

В основных кинетических анализах (анализ 5-100 мкм) постоянные по скорости показали ожидаемые тенденции, зависящие от концентрации. Значенияk off варьировались примерно от 1,48 × 10⁻⁴ до 1,43× 10⁻³ с⁻¹, тогда как kна — от 1,12 × 10² до 1,26 × 10¹ M⁻¹s⁻¹. Эти постепенные изменения в концентрационной серии согласуются с нормальным аналит-зависимым ассоциационным и диссоциационным поведением.

В контрольном эксперименте, где разные уровни нагрузки на зонд тестировались при одной концентрации анализируемого вещества (100 нм), все четыре следа дали очень схожие кинетические константы. Значения koff стабильно составляли 1,42 × 10⁻¹ s⁻¹, а kна — стабильно 2,76 × 10³ M⁻¹s⁻¹ на всех уровнях нагрузки. Отсутствие вариаций указывает на то, что ни фазы ассоциации, ни диссоциации не подвергались влиянию плотности зонда, ограничений переноса массы или повторного связывания анализа.

Также ожидается, что диссоциация при 100 нМ проявляется быстрее в контрольном эксперименте. Концентрация анализируемого вещества 100 нМ примерно на порядок ниже KD, а при концентрациях значительно ниже KD комплекс менее стабилен, а эффективная заполненность низкая. При таких условиях диссоциация происходит быстрее, поскольку аффинность связывания слабее при низких концентрациях анализируемых веществ, а реассоциация в фазе диссоциации минимальна. Это поведение соответствует тому, что обычно наблюдается, когда концентрация анализируемого вещества значительно ниже KD.

В совокупности согласованность кинетических параметров при нагрузках зонда и ожидаемое поведение при низких концентрациях анализируемых веществ подтверждают идею, что наблюдаемые константы скорости отражают реальные свойства связывания, а не артефакты поверхностной нагрузки или эффектов массового переноса.

Кинетика связывания и интерпретация:
Кинетический анализ проводился с использованием модели ассоциации-диссоциации Лангмюра 1:1 с локальной стратегией полного прилегания, при которой концентрации отдельных анализируемых веществ были независимо в общей кинетической структуре (рисунок 6B). Этот подход был выбран вместо традиционного глобального подгонки, поскольку некоторые наборы данных, особенно при низких концентрациях лиганда, демонстрировали незначительные перекрытия или отклонения на ранних фазах, вероятно, вызванные ограничениями массового транспорта и эффектом мицелл детергентов на диффузию белков. Глобальная подгонка предполагает, что все следы строго следуют одинаковому кинетическому поведению, которое может быть нарушено при небольших различиях в доступности поверхности или локальной микросреде между концентрациями. Локальная полная подгонка позволила моделировать каждую анализируемую концентрацию независимо при сохранении единой кинетической структуры, обеспечивая точное отражание поведения производных параметров при каждой концентрации. Подгонные кривые (красные) близко совпадали с экспериментальными следами, давая оценочную константу диссоциации (KD) в низком микромолярном диапазоне. Остаточный анализ (рисунок 6C) не выявил значительных систематических отклонений, что подтверждает пригодность модели для этих взаимодействий мембранных белков, растворимых в детергенте.

TMEM120A M207A и GsMTx4 показали значения KD в низком микромолярном диапазоне (∼0,8-3,3 мкм). Частота ассоциаций (kon) немного увеличивалась с концентрацией лиганда, тогда как скорость диссоциации (k off) оставалась очень медленной, что указывает на стабильное формирование комплекса. Первоначальное быстрое затухание сигнала в первые 5–10 секунд диссоциации, вероятно, отражало легко доступные сайты связывания, тогда как медленная фаза представляла более стабильные взаимодействия (рисунок 6A). Эти наблюдения подчёркивают важность тщательного выбора окон диссоциации и учета ограничений массового транспорта при анализе мембранных белков, растворимых в детергенте (Таблица 2).

Ограничения и устранение неполадок:
Следует учитывать несколько ограничений для мембранных белков, растворимых в детергенте, таких как TMEM120A M207A. Эффекты массового транспорта могут возникать на ранней фазе ассоциации, так как белок может медленно диффундировать на поверхность биосенсора, что может немного искажать кинетические измерения. Перегрузка датчиков возможна, если насыщение зонда превышает рекомендуемый диапазон 50-80%, что потенциально ограничивает точность глобального кинетического анализа и влияет на значения кона и коффа. Детергентно-зависимые эффекты могут влиять на стабильность белка, олигомерное состояние или доступность поверхности, особенно при концентрациях выше или рядом с CMC. Дополнительные факторы включают незначительный базовый дрейф, неспецифическое связывание и трудности с фиксацией кинетики очень медленной диссоциации.

Многие из этих проблем можно смягчить простыми корректировками: снижением нагрузки белка для предотвращения перенасыщения, оптимизацией буферного состава и включением эталонных зондов для коррекции базового дрейфа или неспецифических сигналов. В этом исследовании буфер SEC, содержащий 0,00015% LMNG и низкие концентрации Tween-20, эффективно минимизировал неспецифическое связывание, сохраняя при этом стабильность белка. Тщательный выбор окна диссоциации для кинетического подгонки, а также повторные измерения и остаточный анализ также был важен для подтверждения надёжности кинетических параметров. Эти стратегии обычно повышают воспроизводимость и помогают создавать более надёжные и интерпретируемые данные. Локальная полная подгонка применялась вместо глобальной подгонки для учёта незначительных различий между следами при концентрациях отдельных лигандов, что гарантирует, что кинетические параметры точно отражают поведение каждого набора данных.

BLI и другие биофизические методы:
По сравнению с поверхностным плазмонным резонансом (SPR) и изотермической титрирующей калориметрией (ITC), биослоевая интерферометрия (BLI) предлагает несколько практических преимуществ для анализа взаимодействий мембранных белков и лигандов. Как и SPR и ITC, BLI может предоставить подробные данные о взаимодействиях связывания, включая частоты ассоциаций (k on), частоты диссоциации (koff) и равновесные диссоциационные константы (KD), без необходимости сложных микрофлюидных систем или высокой концентрациибелка 14. Формат с открытой скважиной, dip-and-read позволяет быстро обмениваться буферами и параллельной обработке нескольких образцов, поддерживая более высокую экспериментальную пропускную способность. В отличие от ITC, который требует больших количества высокочистого белка и предоставляет термодинамические данные, BLI может измерять как скорости образования комплекса, так и диссоциации из минимальной концентрации образца в наномолярах. BLI также совместим с детергентными или липидными буферами, что делает его подходящим для низкопродуктивных или нестабильных мембранных белков, которые сложно изучать другими биофизическими методами. Несмотря на эти преимущества, комплементарные методы, такие как SPR или ITC, остаются полезными для подтверждения термодинамической консистенции и перекрёстной проверки параметров связывания в условиях без детергента и детергента, но требуют высокой концентрациибелка 3.

Дальнейшие направления:
Этот рабочий процесс можно расширить для изучения других мембранных белков, взаимодействий белков и липидов или скрининга модуляторов малых молекул. Сочетание BLI с ортогональными подходами, такими как массовая фотометрия, структурная характеристика или крио-ЭМ, может дать более подробные представления о олигомеризации, стехиометрии и механизмах связывания. Дальнейшая оптимизация также может позволить анализировать лиганды с высокой аффинностью, мультивалентные взаимодействия или комплексы в более нативных липидных средах.

В заключение, тщательный контроль иммобилизации белков, концентрации детергента и условий буфера позволяет BLI получать надёжные, воспроизводимые кинетические данные для TMEM120A M207A и аналогичных сложных мембранных белков. Хотя существуют внутренние ограничения, метод предоставляет надёжную платформу для изучения специфических взаимодействий белков и лиганда умеренной аффинности при хорошо определённых экспериментальных условиях.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов, которые можно было бы заявлять.

Благодарности

Мы искренне благодарим исследовательскую платформу Мельбурнского университета — Мельбурнский центр по характеристике белков (MPC) — за поддержку в области очистки и характеристики белков. Исследование было поддержано грантом Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Ideas Grant (2020/GNT2000934 для I.R.) и Австралийским исследовательским советом (Центры обучения по промышленной трансформации, IC200100052 в I.R. и M.M.).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
384-well black microplateGreiner Bio-One781906BLI
Amicon Ultra Centrifugal Filter, 30 kDa MWCOSigma-AldrichUFC903008Purification
Anti-FLAG probeGator Bio160036BLI
ANTI-FLAG M2 Affinity GelSigma-AldrichA2220-10MLPurification
BioRenderBioRenderhttps://biorender.comFigure 1 creation 
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich9048-46-8Mass photometry
CD 293 Medium (1x)Thermofisher11913019Cell culture
Centrifuge 5920 R: Large Capacity and High PerformanceEppendorfNAPurification
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor CocktailMerck11836170001Purification
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-Aldrich9003-98-9Purification
ExpiFectamine 293 Transfection KitThermofisherA14524Transfection
Gator Bio softwareGator BioNABLI
Gator PlusGator BioNABLI
GlutaMAX SupplementThermofisher35050061Cell culture
GsMTx4 trifluoroacetateSigma-AldrichSML3140-1MGBLI
HEK293T/SF17 cells adapted to suspension growthATCCATCC CRL11268Cell culture
LMNG (Lauryl maltose neopentyl glycol)ThermofisherA50940Purification
Max PlateGator Bio130062BLI
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Sigma-Aldrich11359061001Purification
Prometheus High Sensitivity CapillariesNano TemperPR-C006Thermodynamic stability
Prometheus PantaNano TemperNAThermodynamic stability
Q Buffer (0.3% Glycine pH 3.8)Gator Bio120010BLI
Qsonica Q500 Sonicator Ultrasonic Cell DisrupterQsonicaNAPurification
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytivaGE28-9909-44Purification
Synthesized TMEM120A (M207A) gene cloned into pCDNA 3.1 plasmid with FLAG-3C-LinkerGenScript BiotechNAPlasmid
TWEEN 20Sigma-AldrichP1379-25MLBLI
Two MPRefeynNAMass photometry

Ссылки

  1. Rong, Y., et al. TMEM120A contains a specific coenzyme A-binding site and might not mediate poking- or stretch-induced channel activities in cells. eLife. 10, e71474(2021).
  2. Livnat-Levanon, N., Vigonsky, E., Lewinson, O. Real-time measurements of membrane protein-receptor interactions using surface plasmon resonance (SPR). J Vis Exp. (93), e51937(2014).
  3. Kovachka, S., Soule, P., Mus-Veteau, I. Microscale thermophoresis to evaluate the functionality of heterologously overexpressed membrane proteins in membrane preparations. Methods Mol Biol. 2507, 445-461 (2022).
  4. Ciesielski, G. L., Hytönen, V. P., Kaguni, L. S. Biolayer interferometry: a novel method to elucidate protein-protein and protein-DNA interactions in the mitochondrial DNA replisome. Methods Mol Biol. 1351, 223-231 (2016).
  5. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using biolayer interferometry for kinetic characterization. Comb Chem High Throughput Screen. 12, 791-800 (2009).
  6. Apiyo, D. O. Biolayer interferometry (Octet) for label-free biomolecular interaction sensing. Handbook of Surface Plasmon Resonance. Schasfoort, R. B. N. , 2nd edn, Royal Society of Chemistry. 356-397 (2017).
  7. Egan, D., Slaybaugh, C., Wang, R. Getting started: kinetics assay using bio-layer interferometry. Gator Bio Technical Note. , (2023).
  8. Beaulieu-Laroche, L., et al. TACAN is an ion channel involved in sensing mechanical pain. Cell. 180 (5), 956-967.e17 (2020).
  9. Niu, Y., et al. Analysis of the mechanosensor channel functionality of TACAN. eLife. 10, (2021).
  10. Xue, J., et al. TMEM120A is a coenzyme A-binding membrane protein with structural similarities to ELOVL fatty acid elongase. eLife. 10, e71220(2021).
  11. Chen, X., et al. Cryo-EM structure of the human TACAN in a closed state. Cell Rep. 38, 110445(2022).
  12. Suchyna, T. M. Piezo channels and GsMTx4: two milestones in our understanding of excitatory mechanosensitive channels and their role in pathology. Prog Biophys Mol Biol. 130, 244-253 (2017).
  13. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J Pharm Biomed Anal. 72, 150-154 (2013).
  14. Wang, D. S., Fan, S. K. Microfluidic surface plasmon resonance sensors: from principles to point-of-care applications. Sensors (Basel). 16 (8), 1175(2016).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

GsMTx4TMEM120AFLAG
Видео скоро будет доступно

Похожие статьи