Методическая статья

Пробуждение: электрофизиологическое профилирование вентромедиальной префронтальной коры в мышиной модели депрессии и болезни Паркинсона

DOI:

10.3791/69366

⸱

30 декабря 2025 г.

 ,  ,  , 
1Institute of Biomedical Research of Barcelona (IIBB), Spanish National Research Council (CSIC), 2August Pi i Sunyer Biomedical Research Institute (IDIBAPS), 3Biomedical Research Networking Center for Mental Health (CIBERSAM), ISCIII, 4Human Anatomy and Embryology Department, Faculty of Medicine, University of Valencia

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Используя модель мышей, похожую на болезнь Паркинсона (PD), которая чрезмерно экспрессирует мутантную форму A53T человеческого альфа-синуклеина (h-α-Syn) в дорсальном ядре рафе (DR), мы разработали электрофизиологический метод записи для изучения роли вентромедиальной префронтальной коры (vmPFC)-DR цепи при депрессивных/тревожных расстройствах при БП.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Хотя болезнь Паркинсона (БП) в первую очередь известна как моторное расстройство, немоторные симптомы часто проявляются до появления моторных дефицитов и значительно влияют на прогрессирование болезни, играя важную роль на всех стадиях заболевания. Среди них депрессия и тревожность являются наиболее распространёнными симптомами и вызывают более высокую нагрузку на симптомы у женщин, чем у мужчин. Изменения в серотонинергической (5-HT) системе часто связаны с расстройствами настроения, а накопления α-синуклеина (α-Syn) наблюдались в ядрах 5-HT рафе (RN) у пациентов с болезнью Паркинсона (ПД) и депрессией. Поэтому важно понять нейронные цепи, лежащие в основе этих немоторных симптомов.

Здесь мы представляем усовершенствованный протокол для изучения роли вентромедиальной префронтальной коры (vmPFC) — дорсального ядра рафеа (DR) при расстройствах настроения, ассоциированных с PD, используя модель самок мыши, переэкспрессирующую мутантную форму A53T человеческого α-syn (h-α-Syn) в DR. Наш метод позволяет высокоразрешающую оценку нейронной активности в инфралимбической (IL) и прелимбической (PL) коре как при базальных условиях, так и во время аверсивного кондиционирования и вымирания. Используя парадигму тонально-светового сенсорного обусловливания у бодрствующих мышей с фиксированной головой, мы применяем многоканальные электрофизиологические зонды для записи нейронных ответов. Эксперименты проводились в коридорах виртуальной реальности, сочетая цилиндрическую беговую дорожку с двухэкранным визуальным дисплеем для поддержания поведенческой активности, при этом обеспечивая точный контроль сенсорных стимулов и стабильность записи.

Этот протокол основывается на установленном участии коры ИЛ и ПЛ в формировании страха и вымирании и предоставляет надёжную основу для изучения динамической нейронной активности в цепях, связанных с депрессивными и тревожными поведением при БП. Позволяя одновременно проводить поведенческие и электрофизиологические измерения в контролируемых условиях, этот подход предоставляет мощный инструмент для прояснения нейробиологических механизмов немоторных симптомов при БП и для тестирования возможных вмешательств.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Болезнь Паркинсона (БП) — это моторное расстройство, но известно, что немоторные симптомы предшествуют моторным проявлениям и критически важны на всех стадиях заболевания1, 2, 3, 4. Среди них депрессия и тревожность являются наиболее распространёнными нейропсихиатрическими симптомами, которые серьёзно влияют на качество жизни пациентов с БП и вызывают большую нагрузку симптомов у женщин, чем у мужчин. Несмотря на это, их часто недостаточно диагностируют и недостаточнолечат 6. По всем этим причинам крайне важно понимать нейробиологию и цепи, связанные с нейропсихиатрическими симптомами БД, чтобы стратификация пациентов и предоставление им более персонализированного ухода.

Хотя этиология БП остаётся частично неясной, были выявлены несколько ключевых нейропатологических признаков. Заболевание характеризуется прогрессирующей дегенерацией и потерей дофаминергических (DA) нейронов и волокон в нигростриатальной системе, что приводит к прототипическим моторным дефицитам, связанным сPD 7,8. Ещё одной отличительной чертой ПД является наличие тел Леви (LB) и нейритов Леви — внутриклеточных включений, образованных фибриллярными белковыми агрегатами, состоящих преимущественно из белка α-синуклеина (α-Syn)9,10. Исследования нейровизуализации также показывают, что другие нейромедиаторные системы страдают — даже до появления ДА — среди них серотонинергическая (5-HT)система 11,12,13. Изменения в серотонинергической (5-HT) системе часто связаны с расстройствами настроения, а отложения α-синуклеина (α-Syn) были обнаружены в ядрах рафе (RN) 5-HT у людей с диагнозом болезнь Паркинсона (ПД) идепрессией 14.

Дорсальные ядра рафе (ДР) являются крупнейшим ядром 5-HT вRN 15, играя критическую роль в эмоциональной регуляции, восприятии, вознаграждении, агрессии и социальных взаимодействиях. В результате дисфункция в ДР связана с нейропсихиатрическими расстройствами, такими как стресс, тревожность идепрессия 15,16. На этом этапе важно подчеркнуть сильную, двунаправленную функциональную и анатомическую связь между ДР и префронтальной корой (ПФК) — областью мозга, необходимой для функций высшего порядка. В то время как более дорсальные области PFC связаны с когнитивными функциями, более вентромедиальные области (vmPFC) играют фундаментальную роль в эмоциональной регуляции, контроле действий, памяти и принятиирешений 17,18. Таким образом, vmPFC и DR вместе существенно влияют на настроение, а изменённая активность в этом цепи связана с депрессивнымисимптомами 18. Кроме того, накопление агрегированных форм α-Syn в нейронах 5-HT в RN вызывает тревожность и депрессивныефенотипы 19,20,21.

Используя модель самок мыши с БД и депрессивным фенотипом, который переэкспрессирует мутантную форму A53T человеческого α-syn (h-α-Syn) в DR через аденоассоциированный вирусный (AAV) вектор, мы разработали метод электрофизиологической записи. Этот метод направлен на изучение роли цепи vmPFC-DR при депрессивных/тревожных расстройствах при БП. Этот подход включает оценку нейронной активности инфралимбической (IL) и прелимбической (PL) коры у бодрствующих мышей с помощью записи одиночных и локальных полевых потенциалов (LFP). Это достигается с помощью многоканального датчика в сочетании с бегущей системой виртуальной реальности. Учитывая участие коры PL и IL в аверсивном кондиционировании, мы также измеряем их активность в такой парадигме, чтобы оценить их функцию в стрессовых ситуациях. Важно понимать, что PL в первую очередь стимулирует условные ответы, а кора IL играет ключевую роль в ихвымирании 22,23.

Следующий протокол описывает этапы имплантации головной планки и точного записи электрической активности коры PL и IL in vivo. Мы достигаем этого с помощью коридора виртуальной реальности, который сочетает цилиндрическую беговую дорожку для мышей с фиксированной головой с двойным визуальным дисплеем. Протокол структурирован на четыре основных этапа: (1) операция по имплантации головной планки, (2) привыкание, (3) запись и получение сигналов, и (4) анализ данных: сортировка шипов и предварительная обработка данных.

Через три недели после индуцирования гиперэкспрессии h-α-Syn в системе 5-HT мозга мыши проходят операцию по имплантации головной планки, которая обеспечивает последующую фиксацию головы. После недельного периода восстановления мышей привыкают на 4 дня как к экспериментатору, так и к беговой дорожке и системе фиксации головы. В день записи эта система используется для записи нейронной активности коры PL и IL при базовых условиях и во время аверсивного обусловливания. Необработанные нейронные данные обрабатываются с помощью автоматической сортировки спайков с помощью Kilosort4, а затем ручной кураторской обработки в Phy2, чтобы извлечь высококачественные одноблоковые кластеры для дальнейшего анализа (см. рисунок 1).

Предлагаемый многоканальный протокол записи vmPFC в бодрствующем состоянии, фиксированный на голове, обладает рядом преимуществ по сравнению с классическими альтернативами, такими как анестезированные или ex vivo препараты и беспроводные записи у свободно движущихся животных. В отличие от анестезируемых или ex vivo подходов, этот метод позволяет оценивать активность vmPFC при контролируемой визуальной и слуховой стимуляции в среде виртуальной реальности, что необходимо для реализации парадигм аверсивногообусловленного (24,25). В отличие от свободно движущихся записей, конфигурация с фиксированной головой обеспечивает точный экспериментальный контроль над сенсорными входами и контингентностями задач, что снижает вариабельность и позволяет создавать последовательные структуры испытаний. Кроме того, фиксация на голове снижает риск отключения задачи, наблюдаемого в свободно движущихся парадигмах, особенно при аверсивной стимуляции, при этом позволяя при этом проводить высокоэффективные и стабильные многоканальныезаписи 26.

С практической точки зрения этот протокол требует, чтобы животные привыкли к фиксации головы и бегу на беговой дорожке, но он выигрывает благодаря коммерчески доступным, относительно доступным системам фиксации головы с цилиндрическими беговыми дорожками. Это делает подход доступным для небольших лабораторий, так как зонды можно использовать многократно (до ~10 вставок), что значительно снижает затраты по сравнению с хронически свободно движущимися имплантами. Таким образом, этот метод обеспечивает баланс между экспериментальным контролем, поведенческой релевантностью и экономической эффективностью. Ещё одним фактором, который стоит учитывать, является реализация парадигмы аверсивного обусловливого формирования. В этом исследовании мы применили экспериментальную схему, основанную на естественной неприязни грызунов к свету: 10 слуховых тонов (условных стимулов) каждый сопровождался кратким воздействием интенсивного света (безусловный стимул). Хотя этот паттерн менее стрессовый, чем другие классические методы обусловливания, например, с электрическими разрядами, он представляет собой более похожий реальный стрессор.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все эксперименты проводились с участием контрольных групп, соответствующих возрасту, а процедуры на животных были разработаны в соответствии с правилами 3R; осуществляется в соответствии с этическими нормами, изложенными в Директиве ЕС 2010/63 (22 сентября 2010 года), законодательством Испании (RD 1201/2005, L.32/2007 и L.6/2013) и утверждённым Generalitat Valenciana (ES462500001003; ссылка 2023-VSC-PA-0073), а также местным Комитетом по биоэтике Университета Валенсии (ссылка A20230214153605).

ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения безопасности и предотвращения заражения на протяжении всей процедуры носите средства индивидуальной защиты, включая одноразовые перчатки и ботинки, лабораторный халат, маску и сетку для волос. Использовать системы возврата ветеринарных препаратов для утилизации остатков, образующихся в результате их использования, в соответствии с местными нормативами и применимыми национальными программами возврата.

1. Генерация моделей мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Взрослые самки мышей C57BL/6J (9 недель) содержались в контролируемых условиях окружающей среды (22 ± 1 °C; 12-часовой цикл света/тьма) с импровированным доступом к еде и воде.

  1. Под анестезией изофлурана (4% для индукции, 2% для поддержания) в камере анестезии мышей случайным образом назначают мыши для получения стереотаксичных микроинъекций в DR (координаты относительно брегмы: антерозадний [AP] −4,5 мм, среднелатеральный [ML] −1,0 мм, дорсовентральный [DV] −3,2 мм; угол впрыскивания: 20°) с помощью автоматизированного микроинжектора при расходе 0,4 мкл/мин, Как было описаноранее: 19,27,28.
  2. Убедитесь, что каждая мышь получает общий объём 0,6 мкл либо рекомбинантного адено-ассоциированного вируса серотипа 1/2 (AAV1/2; концентрация: 5,16 × 1012 гп/мл), кодирующего мутантную форму A53T человеческого h-α-Syn, для индуцирования гиперэкспрессии в 5-HT-нейронах DR (n = 4), либо пустого вектора AAV1/2 с некодирающим ДНК-наполнением (AAV-EV), используется как контрольная группа (n=5).
  3. Чтобы предотвратить рефлюкс, держите иглу на месте ещё 8 минут, прежде чем медленно убирать её со скоростью 320-400 мкм/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для безопасности убедитесь, что системы отбора корректно работают для захвата анестетических паров до любой стереотаксической операции (разделы 1 и 2). В случае разлива изофлурана при заправке вапорайзера немедленно очистите его с помощью инертного, впитывающего материала, например, опилок. Использовать системы обратного отбора ветеринарных лекарств для утилизации изофлурановых фильтров и любых остатков, образующихся в результате его использования, в соответствии с местными нормативами.

2. Операция по имплантации головной перекладины

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите операцию по имплантации головной планки согласно приведённым ниже шагам, через 3 недели после создания модели мыши.

  1. Предоперационная подготовка и анестезия
    1. Анестезируйте животное изофлураном (4% для индукции, 1,5-2% для поддержания), введённым через изофлуран-вапорайзер.
    2. Поместите мышь в стереотаксичный аппарат на подогревающую площадку, чтобы поддерживать температуру тела на протяжении всей процедуры.
    3. Аккуратно откройте рот мыши, чтобы положить её зубы на штангу для укуса, и прикрепить маску, подключённую к стереотаксичному аппарату, чтобы обеспечить непрерывную доставку изофлурана для поддержания анестезии.
    4. Наносите глазные капли, чтобы предотвратить язвы глаза.
    5. Вводите обезболивание не менее чем за 10 минут до разреза скальпелем с помощью подкожной инъекции буторфанола (5 мг/кг в физиологическом растворе).
    6. Наносите региональный лидокаин (0,03 мл в каждое ухо, 4 мг/кг, не превышайте максимальную дозу 7 мг/кг или крем с лидокаином/прилокаином [25 мг/г лидокаина и 25 мг/г прилокаина]) на внутреннее ухо, чтобы уменьшить дискомфорт от баров.
  2. Стереотаксичное позиционирование и подготовка черепа
    1. Расположите ушные планки так, чтобы надёжно удерживать голову, обеспечивая симметрию и минимальное движение.
    2. Отрегулируйте режцовую планку так, чтобы bregma и lambda были на одном горизонтальном уровне, убедившись, что они находятся на средней линии.
    3. Подтвердите введение анестезии, проверив потерю отмены педалей, пальпебральные рефлексы, снижение частоты дыхания и отсутствие движения усов.
    4. Убедитесь, что мышь правильно расположена в стереотаксичной рамке, а наушники аккуратно настроены.
    5. Сбрийте хирургическую область и продезинфицируйте её антисептическим раствором (повидон-йод с добавлением 70% этанола), чтобы минимизировать риск инфекции.
    6. Сделайте разрез по средней линии кожи головы и аккуратно оттяните подлежащие ткани, чтобы открыть череп при сохранении гемостаза. Убедитесь, что кожа достаточно открыта, чтобы визуализировать парието-височные гребни. Для этого установите четыре тонких зажима в виде бульдога на фасцию под кожей, чтобы максимально увеличить обнажение.
    7. Очистите и тщательно высушите обнажённый череп для чёткого обзора анатомических ориентиров (брегма и лямбда).
    8. Выровняйте череп по переднезадней оси, выровняя брегму и лямбду в одной горизонтальной плоскости.
    9. Выровняйте череп по среднелатеральной оси, сопоставив глубину обоих теменных гребней.
  3. Сверление и установка имплантов
    1. Просверлите отверстие диаметром 1 мм над vmPFC по координатам AP: +1,75; ML: −0,4; DV: +3,1 (рисунок 2). Используйте стереотаксический рычаг, чтобы отметить четыре вершины чернилами, чтобы направлять вставку кремниевого датчика в день записи. Кроме того, нарисуйте крест, соединив ранее описанные точки скальпелем и нанеся обилие чернил, чтобы они проникали в разрезы, обеспечивая стабильность следов. Удалите лишние чернила ватной палочкой, смоченной 70% спиртом.
    2. Просверлите два дополнительных отверстия в задней части черепа над мозжечком. Вставьте по одному проводу вручную в каждое отверстие для дальнейшего использования и заземления (рисунок 2) соответственно.
      1. В качестве альтернативы используйте винты из нержавеющей стали (A2 нержавеющая сталь, размер M1 × 2, или 18-8 нержавеющей стали, диаметром 0,061" × длиной 3/16") или мужские перемычки из нержавеющей стали. Независимо от выбора, убедитесь, что элемент, обеспечивающий электрический контакт, оставался в прямом контакте с поверхностью мозга без давления, чтобы избежать повреждения тканей, нарушить благополучие животных или негативно повлиять на качество записи.
    3. Сделайте неглубокие бороздки на открытом черепе скальпелем, чтобы увеличить площадь поверхности и улучшить сцепление импланта.
    4. Нанесите промежуточную зубную клеевую смолу на очищенный и высушенный череп двумя последовательными слоями: сначала смесью базового катализатора, чтобы она полностью высохла, а затем порошкосодержащей смесью, обеспечивая покрытие всей поверхности и краёв черепа. Проверьте с помощью пинцета, что клеевая связь между черепом и будущим имплантатом полностью затвердела, прежде чем приступить к работе.
    5. Между отверстием для записи ПФК и отверстиями для отверстия для отверстия (рисунок 2) разместите головку из нержавеющей стали. Выровнять головную планку со стереотаксическим рычагом, чтобы она была полностью на уровне черепа, тем самым сохраняя точные стереотаксичные координаты при фиксации головы и последующего вставления кремниевого зонда.
    6. Соедините все металлические компоненты с черепом с помощью зубного цемента, аккуратно избегая попадания цемента в отверстие для записи.
    7. Закройте краниотомию бикомпонентным хирургическим силиконом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если все этапы будут тщательно выполнены, имплантация и последующая работа головной планки пройдут без осложнений, с оценочным уровнем успеха более 95%.
  4. Послеоперационный уход
    1. Внимательно следите за восстановлением мыши после операции на мозге, чтобы животное пришло в сознание, поддерживало температуру тела и чувствовало облегчение боли.
    2. Содержать мышей по отдельности в клетках и наблюдать за ними до полного выздоровления.
    3. Вводите подкожный буторфанол (5 мг/кг в физиологическом растворе) каждые 12 часов в течение 3 дней после операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (КРИТИЧНО) В течение операции непрерывно контролируйте жизненно важные показатели (частота сердца и дыхания, насыщение кислородом и артериальное давление). Наносите капли для глаз по необходимости, чтобы предотвратить сухость или повреждение роговицы.

3. Привычка

ПРИМЕЧАНИЕ: После восстановления дооперационного веса мыши (примерно через 5–7 дней после операции) начните 4-дневный протокол привыкания, чтобы постепенно привыкнуть к экспериментальной установке.

  1. День 1: Проведите две сессии по 10 минут работы с интервалом отдыха между сессиями, чтобы познакомить мышей с экспериментатором. Аккуратно прикоснитесь к мыши, пока она находится на предплечье, чтобы познакомить её с экспериментатором.
  2. День 2: Проведите две сессии по 5 минут. После каждой сессии аккуратно держите мышей за голову с интервалом в 10 секунд в общей сложности 5 минут.
  3. День 3: После короткой тренировки позвольте мышам свободно бегать на беговой дорожке в течение 7 минут. Затем закрепите голову и удержите мышей в положении «голова» в течение 5 минут.
  4. День 4: Проведите 15-минутный тренировочный тренировочный тренировку на беговой дорожке с фиксированной головой.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (КРИТИЧНО) Животные с чрезмерной потерей веса, парикмахерством, снижением исследовательского поведения или сниженной подвижностью в соответствии с установленными рекомендациями по благополучию животных должны быть исключены из исследования. Имплант должен оставаться полностью стабильным. Любое смещение требует исключения животного из исследования, так как оно может повредить многоканальный зонд во время записи и/или привести к нестабильным, шумным сигналам.

4. Подготовка зонда

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы подключить датчик к адаптерам (рисунок 3A), следуйте следующим шагам:

  1. Подключите адаптер/разъём датчика к стереотаксичному рычагу.
  2. Соедините два головных адаптера (каждый Om32) с адаптером для зонда (рисунок 3A), чтобы ориентация совпадала и избегала чрезмерной нагрузки.
  3. Подключите датчик к адаптеру (рисунок 3B). Для обеспечения одновременной записи из IL и PL областей на 64 различных глубинах используйте одношковый, 64-канальный кремниевый зонд (длина хвоста: 8 мм; Толщина хвоста: 15 мкм) (рисунок 4A).
  4. Для облегчения последующего локализации зонда покройте зонд гистологически совместимым флуоресцентным красителем или ферромагнитными частицами, что позволит провести постфактическую проверку места записи.
  5. Наносите краску одним из следующих методов:
    1. Окуньте весь нож в раствор.
    2. Выпустите небольшую каплю раствора из микропипетки на зонд и распределите её вдоль хвоста.
    3. Используйте тонкую кисть, окунутую в раствор, чтобы покрасить заднюю часть зонда.
    4. Для шагов 4.5.2 и 4.5.3 нанесите не менее трёх ударов, чтобы обеспечить правильное покрытие шанка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 4.1–4.3 требуются только при первом использовании зонда, так как его можно использовать в нескольких сессиях записи. После записи отсоедините кабели последовательного периферийного интерфейса (SPI), при этом зонд будет подключен к адаптеру, а адаптеры — на стереотаксичном рычаге.

5. Запись и получение сигналов

  1. Контролировать эструозный цикл, используя неинвазивный протокол, основанный на клеточной типологии в вагинальных мазках, чтобы убедиться, что самки находятся в фазедиестра 29,30.
  2. Закрепите животное в положении, фиксированном на голове, на цилиндрической беговой дорожке, интегрированной со стереотаксичной рамой (рисунок 4B). Убедитесь, что беговая дорожка и рама правильно выровнены для обеспечения стабильности и сопоставимости между участниками.
  3. Для записи и получения сигналов следуйте шагам 5.3.1-5.3.15.
    1. Используйте увеличительную линзу, чтобы имплантат оставался полностью неподвижным.
    2. Закрепите узел зонда — включающий зонд, адаптеры и адаптеры для головной сцены — на рычаг стереотаксичного корпуса.
    3. Подключите кабели SPI, ранее подключённые к плате захвата, к головным ступеням (рисунок 3B). Ведите учет, какой SPI-кабель подключён к каждой головной сцене, так как это соответствие необходимо для сохранения расположения электродов при последующей автоматической сортировке спайков.
    4. Подключите заземляющий провод от пробного адаптера к мужскому ипсилатеральному мосту к записанной полусфере, а опорный провод — к противоположной стороне. Приложите небольшое количество паяльной банки к проводу, встроенному в мозг, затем кратковременно нагрейте, чтобы закрепить соединение. Избегайте чрезмерного нагрева, чтобы предотвратить повреждение подлежащей ткани или адаптерной электроники.
    5. Разместите увеличительную линзу, чтобы визуализировать отверстие для введения зонда в коры PL и IL. Убедитесь, что чернильные ориентиры всегда хорошо видны, чтобы поддерживать точные стереотаксичные координаты во время процедуры.
    6. Направляйте зонд к центру отверстия vmPFC с помощью стереотаксического рычага и заранее отмеченных ориентиров.
    7. Аккуратно разместите зонд в центре краниотомии и аккуратно коснитесь поверхности мозга. Нанесите тёплый физиологический раствор на открытую ткань, чтобы предотвратить высыхание.
    8. Начинайте опускать зонд со скоростью 50 мкм/мин на 4-5 минут, чтобы минимизировать воспаление тканей. Убедитесь, что стойка зонда не согнётся во время первоначального вставки.
    9. Измерьте импеданс сайтов записи и сравните значения с предоставленными производителем. Эта первичная оценка гарантирует, что первые каналы, выходящие в мозг, не были повреждены или заблокированы во время установки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (КРИТИЧНО) Импедансы электродов следует сравнивать с базовыми значениями производителя. Отклонения до ~30% обычно допустимы и не наносят ущерба записи. Увеличение от 30 до 100% всё ещё можно использовать, но требует осторожности и более тщательного контроля. Изменения, превышающие 100%, часто указывают на повреждения или закупорку, и поражённые участки следует считать ненадёжными. В таких случаях зонд следует очищать, чтобы снизить импеданс, как было описано ранее. Если импедансы не удаётся восстановить до приемлемого диапазона, зонд должен быть отброшен. Однако в конечном итоге экспериментатор решает, сколько ненадёжных каналов можно терпеть, прежде чем отбросить зонд; Распространённый стандарт заключается в том, что не более ~10% каналов должны быть скомпрометированы.
    10. Продолжайте опускать зонд со скоростью 50 мкм/мин, одновременно контролируя живой сигнал от каналов, поступающих в мозг. Убедитесь, что эти сигналы похожи на ранее оценённые каналы, чтобы подтвердить правильное введение.
    11. Продвигайте зонд, пока он не достигнет глубины +3,1 мм DV, поддерживая краниотомию увлажнённой, нанося тёплый физиологический раствор во время опускания.
    12. Уберите увеличительную линзу и устраните любые другие источники электрического шума в комнате.
    13. Переизмерьте импеданс, чтобы убедиться, что ни один сайт записи не был заблокирован во время опускания зонда.
    14. Отслеживайте сигнал с 4-5 последовательных каналов в качестве ориентира и ждите 90-120 минут стабилизации сигнала зонда. После этого периода стабилизации убедитесь, что дрейф сигнала минимален, чтобы последующая автоматическая сортировка спайков могла надёжно изолировать кластеры из одного блока.
    15. Измерьте импеданс перед началом сбора данных, чтобы подтвердить правильные условия места записи и установить базовое измерение импеданса. Регулярно наносите тёплый физиологический раствор, чтобы предотвратить высыхание ткани. Сохраняйте запись в виде бинарного файла (например, .dat или .bin) для облегчения последующей предварительной обработки данных.
  4. После стабилизации следуйте шагам 5.4.1-5.4.6.
    1. Зафиксируйте исходную нейронную активность за 30 минут (рисунок 4C).
    2. Запустите протокол аверсивного обусловливания с помощью Arduino через 30 минут после базовой записи. Он состоит из 10 слуховых тонов (10 с/тон), которые звучат раз в минуту в течение 10 минут. За каждым тоном сразу следует 10-секундный световой стимул, представленный через экраны лабиринта виртуальной реальности (рисунок 4C).
    3. Записывайте нейронную активность в течение 10 минут без каких-либо стимулирующих стимулов.
    4. Зафиксировать активность коры PL и IL во время протокола вымирания, при котором представлено 10 слуховых тонов без последующего светового стимула.
    5. Записывайте нейронную активность ещё на 10 минут при отсутствии каких-либо стимулов.
    6. Остановите запись.
  5. Процедуры после записи: После завершения сессии следуйте шагу 5.5.1.
    1. Снятие зонда: Нанести тёплый физиологический раствор и аккуратно вывести зонд со скоростью 100–150 мкм/мин, постоянно контролируя сигналы электрода, чтобы избежать механических повреждений зонда и растяжения ткани, что может затруднить последующий гистологический реконструкцию.
    2. После удаления зонд из мозга немедленно замочите его в дистиллированной воде на 10 минут, чтобы предотвратить высыхание прикреплённой ткани.
    3. Анестезируйте животное пентобарбитал натрия (100 мг/кг). Затем, внутри химического вытяжки, пропустите мыши транссердечно 80 мл физиологического раствора (0,9%), затем 80 мл параформальдегида, 4% разбавленных в PB (0,1 м, pH 7,6).
      1. Чтобы избежать параформальдегида, контактного контакта и вдыхания используйте средства для защиты глаз и лица, химически защитные перчатки и маску от пыли. В конце перфузии оставшийся параформальдегид поместите в контейнер для негалогенированных растворителей.
      2. В случае пролива увлажните материал, чтобы предотвратить рассеивание пыли, и поместите его в герметичные контейнеры. Очистите загрязненные участки и рабочие поверхности отбеливателем для нейтрализации параформальдегида.
    4. Удалите мозг, сделайте постфикс на ночь при 4 °C и храните сахарозу 30% в PB (0,1 м, pH 7,6) при 4 °C для криозащиты. Получите корональные срезы диаметром 30 мкм с помощью замораживающего микротома и закрепите срезы на желатинизированные стеклянные стекла.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти разделы будут использованы для подтверждения гиперэкспрессии DR α-Syn с помощью иммуногистохимии как ранее 19,20,21 и местоположения зонда.
    5. Очистка зонда: Погрузите имплантируемую область зонда в ферментатический раствор 1% в дистиллированную воду на 1 час.
    6. Замочите зондовый шаток в дистиллированной воде ещё на 10 минут, чтобы удалить остатки моющего средства.
    7. Сушить 20-30 минут в вертикальном положении. После сушки осмотрите зонд под микроскопом, чтобы убедиться, что на местах записи не осталось тканей или мусора. Если зонд полностью чистый, окуните его в изопропиловый спирт высокого качества на 1 минуту и храните в оригинальной антистатической коробке.

6. Анализ данных: сортировка с шипами и предобработка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Для анализа внеклеточных нейронных записей и приписывания отдельных спайков конкретным нейронам используйте алгоритм сортировки спайков Kilosort431 .

  1. Выполните автоматическую сортировку спайков с помощью Kilosort431. В графическом интерфейсе Kilosort4 выберите бинарный файл записи и укажите расположение зонда согласно конфигурационному листу производителя. Запускайте сортировку спайков с использованием стандартных параметров, которые идеально подходят для захвата волн, записанных в корах IL и PL, без дополнительных корректировок.
  2. Проверьте результаты Kilosort с помощью Phy2 (kwikteam/phy) для дополнительной ручной курации. Включайте плагины, разработанные сообществом (petersenpeter/phy2-plugins; jiumao2/PhyWaveformPlugin), чтобы добавить дополнительные функции в Phy2 и улучшить качество курируемых данных.
  3. Помечайте как шум и убирайте любые кластеры с частотой <0,05 Гц или содержащими менее 500 всплесков.
  4. Также отметьте следующие кластеры как шум:
    1. Отмечайте те, что автокоррелограммы треугольной формы, как шум.
    2. Отмечайте те, у кого форма волны, не похожие на шипы, как шум.
    3. Отмечайте обнаруженные на одном канале записи или на всех каналах с разной амплитудой как шум.
    4. Отмечайте те, кто проявляет выраженную периодичность в автокоррелограммах, как шум.
  5. Выбирайте только скопления с физиологически соответствующими волновым формами, доказательствами рефрактерной долины в автокоррелограмме, правдоподобными амплитудными вариациями и чётко разделёнными главными компонентами.
  6. Вручную очищайте каждый кластер, применяя удаление выбросов на основе расстояния Mahalanobis.
  7. Продолжайте анализировать формы волн и изменения амплитуды как ключевые показатели достоверности ручной очистки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения сортировки спайков паттерны нейронной активности vmPFC можно проанализировать с помощью процедур, реализованных в Python.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Недавние записи кортикальной активности PL и IL с использованием детального экспериментального протокола показывают значимые результаты: гиперэкспрессия h-α-Syn в DR, вызывающая тревожный фенотип у самок мышей, также изменяет вентромедиальную активность vmPFC. С помощью анализа на основе Python мы показали, что гиперэкспрессия α-Syn в нейронах 5-HT ядра DR изменяет динамику возбуждения и функциональную организацию цепи vmPFC-DR, уменьшая электрофизиологическое различие между подтипами нейронов. У контрольных животных под...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предлагает надёжную методологию для электрофизиологической оценки коры PL и IL in vivo у бодрствующих, фиксированных на голове мышей, с использованием системы виртуальной реальности. Значимость этого метода заключается в его способности непосредственно исследовать цепь vmPFC-DR в бодрствующем состоянии, ведя себя как мыши внутри модели PD. Даже если фиксация головы ограничивает движения животных и может быть стрессовой, она обеспечивает точный контроль стимулов, фи...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была профинансирована грантом BBRF Young Investigator Grant 31547 (MSA) 2023 года, грантом MCIU/AEI/Feder EU PID2022-141700OB-I00, MCIN/AEI/10. 13039/501100011033 (AB), AGAUR 2021-SGR-01358, Правительство Каталонии (AB), и PID2022-141733NB-I00 (VT). Мы также хотели бы поблагодарить Испанскую сеть по исследованию стресса, MCIN/AEI/10.13039/501100011033 и CB/07/09/0034 Центр биомедицинских исследований в области психического здоровья (CIBERSAM). MSA имеет стипендию Маргариты Салас (MS21-132) от Университета Валенсии (переклассификация Испанской университетской системы Министерства университетов правительства Испании, финансируемая Европейским союзом, Next Generation EU).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
AAV1/2-CMV/CBA-Human A53T aSyn-WPRE-BGH-polyAРека ЧарльзGD1001-RVЧеловек A53T aSyn
AAV1/2-CMV/CBA-Null/Empty-WPRE-BGH-polyAРека ЧарльзGD1004-RVУправление пустым вектором
ADPT A64-Om32x2Кембриджский нейротехнический институтOmnetics 2228Адаптер
бикомпонентный хирургический силикон и bbsp;World Precision InstrumentsKWIK-SIL
Butorphanol Torbugesic vet / cymit quí Мика67753-31-5
DuraLayReliance Dental Manufacturing / Калма43640стоматологический цемент и НСП;
Многоканальный зонд H9Кембриджский нейротехнический институтASSY-77 H9
крем EMLA (лидокаин / приколайн) Лириос Вантильде; и остро; Аптека Семпере679290
микроинжектор World Precision InstrumentKDS-310-PLUS
MSS Изофлуран Вапорайзер  Медицинские принадлежности и услуги, ВеликобританияMSSVAP02 
Открытый совет по приобретению EphysOpen EphysOEPS-9029Совет по приобретениям; Open Ephys Acquisition Board может передавать до 512 каналов нейронных данных на компьютер через USB
C& B MetaBond ПаркеллS380-RDБыстроклеящийся цемент
Пентобарбитал Долеталь Ветохинол / Merck Life Science, S.L.U.P-010-1MLБарбитурат
RHD 32-канальный  HeadstageIntan Technologies#C3314адаптер для головной сцены и nbsp;
СиккафлюидЛаборатория Thea S.A. / Lirios Vañ и остро; Аптека Семпере6515167Офтальмологический гель  
стереотаксический аппарат и nbsp;Штёльтинг51730U
Стереотаксическая рамкаНарисигэSR-6N/SM-15R
Терг-а-зимСигма ОлдричZ273287Раствор для очистки зонда

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooney, J. W., Stacy, M. Neuropsychiatric issues in Parkinson's disease. Curr Neurol Neurosci Rep. 16 (5), 49(2016).
  2. Schapira, A. H. V., Chaudhuri, K. R., Jenner, P. Non-motor features of Parkinson disease. Nat Rev Neurosci. 18 (7), 435-450 (2017).
  3. Ahmad, M. H., Rizvi, M. A., Ali, M., Mondal, A. C. Neurobiology of depression in Parkinson's disease: Insights into epidemiology, molecular mechanisms and treatment strategies. Ageing Res Rev. 85 (1), 101840(2023).
  4. Absalyamova, M., Traktirov, D., Burdinskaya, V., Artemova, V., Muruzheva, Z., Karpenko, M. Molecular basis of the development of Parkinson's disease. Neuroscience. 565 (1), 292-300 (2024).
  5. Crispino, P., et al. Gender differences and quality of life in Parkinson's disease. Int J Environ Res Public Health. 18 (1), 198(2020).
  6. Chuquilín-Arista, F., Álvarez-Avellón, T., Menéndez-González, M. Prevalence of depression and anxiety in Parkinson's disease and impact on quality of life:A community-based study in Spain. J Geriatr Psychiatry Neurol. 33 (1), 207-213 (2020).
  7. Greffard, S., et al. Motor score of the Unified Parkinson Disease Rating Scale as a good predictor of Lewy body-associated neuronal loss in the substantia nigra. Arch Neurol. 63 (1), 584-588 (2006).
  8. Mamelak, M. Parkinson's disease, the dopaminergic neuron and gammahydroxybutyrate. Neurol Ther. 7 (1), 5-11 (2018).
  9. Wakabayashi, K., Tanji, K., Mori, F., Takahashi, H. The Lewy body in Parkinson's disease:Molecules implicated in the formation and degradation of alpha-synuclein aggregates. Neuropathology. 27 (5), 494-506 (2007).
  10. Sezgin, M., Bilgic, B., Tinaz, S., Emre, M. Parkinson's disease dementia and Lewy body disease. Semin Neurol. 39 (2), 274-282 (2019).
  11. Jellinger, K. A. The pathobiological basis of depression in Parkinson disease:Challenges and outlooks. J Neural Transm. 129 (12), 1397-1418 (2022).
  12. Wang, J., Sun, J., Gao, L., Zhang, D., Chen, L., Wu, T. Common and unique dysconnectivity profiles of dorsal and median raphe in Parkinson's disease. Hum Brain Mapp. 44 (1), 1070-1078 (2023).
  13. Miquel-Rio, L., Sarriés-Serrano, U., Pavia-Collado, R., Meana, J. J., Bortolozzi, A. The role of α-synuclein in the regulation of serotonin system: Physiological and pathological features. Biomedicines. 11 (2), 541(2023).
  14. Halliday, G. M., Blumbergs, P. C., Cotton, R. G., Blessing, W. W., Geffen, L. B. Loss of brainstem serotonin- and substance P-containing neurons in Parkinson's disease. Brain Res. 510 (1), 104-107 (1990).
  15. Ren, J., et al. Single-cell transcriptomes and whole-brain projections of serotonin neurons in the mouse dorsal and median raphe nuclei. Elife. 8 (1), e49424(2019).
  16. Huang, K. W., et al. Molecular and anatomical organization of the dorsal raphe nucleus. Elife. 8 (1), e46464(2018).
  17. Hiser, J., Koenigs, M. The multifaceted role of the ventromedial prefrontal cortex in emotion, decision making, social cognition, and psychopathology. Biol Psychiatry. 83 (1), 638-647 (2018).
  18. Alexander, L., Wood, C. M., Roberts, A. C. The ventromedial prefrontal cortex and emotion regulation: Lost in translation. J Physiol. 601 (1), 37-50 (2023).
  19. Miquel-Rio, L., et al. Human α-synuclein overexpression in mouse serotonin neurons triggers a depressive-like phenotype. Rescue by oligonucleotide therapy. Transl Psychiatry. 12 (1), 79(2022).
  20. Sarries-Serrano, U., Miquel-Rio, L., Surroca-Lopez, A., Paz, V., Meana, J. J., Bortolozzi, A. Sex-based modulation of endoplasmic reticulum stress and antidepressant response in a mouse model of α-synucleinopathy. Neuroscience Appl. 2 (1), 101028(2023).
  21. Miquel-Rio, L., et al. Early synaptic changes and reduced brain connectivity in PD-like mice with depressive phenotype. NPJ Parkinsons Dis. 11 (1), 242(2025).
  22. Vidal-Gonzalez, I., Vidal-Gonzalez, B., Rauch, S. L., Quirk, G. J. Microstimulation reveals opposing influences of prelimbic and infralimbic cortex on the expression of conditioned fear. Learn Mem. 13 (6), 728-733 (2006).
  23. Giustino, T. F., Maren, S. The role of the medial prefrontal cortex in the conditioning and extinction of fear. Front Behav Neurosci. 9 (1), 298(2015).
  24. Guo, Z. V., et al. Procedures for behavioral experiments in head-fixed mice. PLoS One. 9 (2), e88678(2014).
  25. Nasr, A., Dominiak, S. E., Sehara, K., Nashaat, M. A., Sachdev, R. N. S., Larkum, M. E. Efficient training approaches for optimizing behavioral performance and reducing head fixation time. PLoS One. 17 (11), e0276531(2022).
  26. Bjerre, A. S., Palmer, L. M. Probing cortical activity during head-fixed behavior. Front Mol Neurosci. 13 (1), 30(2020).
  27. Alarcón-Arís, D., et al. Anti-α-synuclein ASO delivered to monoamine neurons prevents α-synuclein accumulation in a Parkinson's disease-like mouse model and in monkeys. EBioMedicine. 59 (1), 102944(2020).
  28. Pavia-Collado, R., et al. Intracerebral administration of a ligand-ASO conjugate selectively reduces α-synuclein accumulation in monoamine neurons of double mutant human A30PA53Tα-synuclein transgenic mice. Int J Mol Sci. 22 (6), 2939(2021).
  29. McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389(2012).
  30. Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. PLoS One. 7 (4), e35538(2012).
  31. Pachitariu, M., Sridhar, S., Pennington, J., Stringer, C. Spike sorting with Kilosort4. Nat Methods. 21 (5), 914-921 (2024).
  32. Opitz, A., Falchier, A., Linn, G. S., Milham, M. P., Schroeder, C. E. Limitations of ex vivo measurements for in vivo neuroscience. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (20), 5243-5246 (2017).
  33. Sorrenti, V., Cecchetto, C., Maschietto, M., Fortinguerra, S., Buriani, A., Vassanelli, S. Understanding the effects of anesthesia on cortical electrophysiological recordings: A scoping review. Int J Mol Sci. 22 (3), 1286(2021).
  34. Brown, E. N., Purdon, P. L., Van Dort, C. J. General anesthesia and altered states of arousal :A systems neuroscience analysis. Annu Rev Neurosci. 34 (1), 601-628 (2011).
  35. Sellers, K. K., Bennett, D. V., Hutt, A., Williams, J. H., Fröhlich, F. Awake vs. anesthetized: Layer-specific sensory processing in visual cortex and functional connectivity between cortical areas. J Neurophysiol. 113 (10), 3798-3815 (2015).
  36. Qiu, J., et al. The volatile anesthetic isoflurane differentially inhibits voltage-gated sodium channel currents between pyramidal and parvalbumin neurons in the prefrontal cortex. Front Neural Circuits. 17 (1), 1185095(2023).
  37. Windels, F. Neuronal activity: From in vitro preparation to behaving animals. Mol Neurobiol. 34 (1), 1-26 (2006).
  38. Belle, A. M., et al. Evaluation of in vitro neuronal platforms as surrogates for in vivo whole brain systems. Sci Rep. 8 (1), 10820(2018).
  39. Juczewski, K., et al. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method:Stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Sci Rep. 10 (1), 12245(2020).
  40. Chen, P. C., Young, C. G., Schaffer, C. B., Lal, A. Ultrasonically actuated neural probes for reduced trauma and inflammation in mouse brain. Microsyst Nanoeng. 8 (1), 117(2022).
  41. Wang, S., et al. Mechanically adaptive and deployable intracortical probes enable long-term neural electrophysiological recordings. Proc Natl Acad Sci U S A. 121 (40), e2403380121(2024).
  42. Andermann, M. L., et al. Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms. Neuron. 80 (4), 900-913 (2013).
  43. Kondo, M., Kobayashi, K., Ohkura, M., Nakai, J., Matsuzaki, M. Two-photon calcium imaging of the medial prefrontal cortex and hippocampus without cortical invasion. Elife. 6 (1), e26839(2017).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Ventromedial Prefrontal CortexElectrophysiological ProfilingMouse Model DepressionParkinson s DiseaseDorsal Raphe NucleusSerotonergic SystemAversive ConditioningFear ExtinctionMultichannel ElectrophysiologyVirtual Reality Mice

Похожие статьи