Методическая статья

Локализация плазматической мембраны и внутриклеточных нейронных никотиновых ацетилхолиновых рецепторов с помощью количественной визуализации в клетках млекопитающих

DOI:

10.3791/69371

⸱

19 декабря 2025 г.

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Alaska Fairbanks, 2Institute of Arctic Biology, University of Alaska Fairbanks

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает экспрессию и количественную оценку субъединиц нейронных никотиновых ацетилхолиновых рецепторов с помощью клеточной линии Neuro-2a у млекопитающих. pH-чувствительные флуоресцентные метки и конфокальная микроскопия позволяют точно оценить локализацию рецепторов на плазматической мембране по сравнению с теми, что экспрессируются в pH-нейтральных внутриклеточных компартментах, облегчая изучение трафика nAChR и фармакологической модуляции.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Количественная оценка нейронных никотиновых ацетилхолиновых рецепторов (nAChR), экспрессируемых на плазматической мембране клеток млекопитающих, важна для разработки новых целенаправленных селективных терапевтических средств и для изучения белков шаперонов, регулирующих трафик рецепторов. В данном исследовании представлен надёжный набор методологий для экспрессии как гомомерных, так и гетеромерных nAChR в клетках Neuro2a (N2a) млекопитающих и для количественной оценки их поверхностной и внутриклеточной локализации с помощью pH-чувствительных флуоресцентных меток. pHuji и суперэклиптический pHluorin (SEP) — это pH-чувствительные белки, которые можно инженерно разметить рекомбинантные белки, позволяя визуализировать пространственное распределение субъединиц nAChR. Эти флуоресцентные метки излучаются при нейтральном pH, но закалываются в кислых средах. Для отслеживания относительной локализации субъединиц α7, α4 и β2 nAChR между внутренними и плазматическими мембранами к C-концу каждой конструкции ДНК прикрепляется либо pHuji, либо SEP. Для экспрессии α7-pHuji вместе с его шапероном NACHO, или (α4-SEP; β2-pHuji) в клетках N2a используется липидный реагент для трансфекции ДНК. Трансфекционный реагент и плазмидная ДНК инкубируются отдельно в редуцированной сывороточной среде при комнатной температуре, затем объединяются для образования липидно-ДНК-комплексов, способствующих доставке плазмид в клетки. После инкубации клетки снимаются с помощью конфокальной микроскопии живых клеток как при условиях высокого, так и при низком pH или в присутствии подтип-селективного флуоресцентного лиганда. Изображения анализируются с использованием скорректированной полной флуоресценции клеток в соответствующих флуорофорных каналах, что даёт количественную информацию о распределении флуоресцентно маркированных субъединиц nAChR между плазматической мембраной и внутриклеточными компартментами. Конфокальная визуализация живых клеток позволяет отслеживать локализацию субъединиц nAChR, чтобы различать различия между внутренними и поверхностными популяциями рецепторов. Устойчивая экспрессия α7-pHuji или (α4-SEP; β2-pHuji) достигается в течение 24 часов при 37 °C. Этот метод может быть адаптирован для включения дополнительных шаперонов, вспомогательных субъединиц или флуоресцентных лигандов для изучения трафика nAChR, фармакологической модуляции и заболеваний изменений экспрессии nAChR.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейронные никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (nAChR) — это трансмембранные ионные каналы, экспрессируемые на плазматической мембране многих типов клеток, включая нейроны, глиальные клетки и иммунные клетки. Эти рецепторы состоят из α (α2-α10) или β (β2-β4) субъединиц, которые собираются в гомомерные или гетеромерные подтипы, при этом α7 и α4β2 nAChR являются наиболее распространёнными вмозге 1,2. Нарушение регуляции этих подтипов связано с болезнью Альцгеймера, расстройством употребления никотина, гипермоторной эпилепсии, связанной со сном, болезнью Паркинсона и тяжёлым депрессивным расстройством, а также с другими неврологическими и психиатрическимизаболеваниями 3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Быстрые и надёжные методы экспрессии и количественной оценки nAChR необходимы для понимания механизмов заболеваний и разработки целенаправленной селективной терапии. Однако достижение устойчивой экспрессии этих рецепторов в плазматической мембране часто бывает сложной и занимает много времени. Описанный здесь метод обеспечивает сильную поверхностную экспрессию nAChR примерно в течение 24 часов после трансфекции ДНК и может комбинироваться с лигандами или белками шаперонов, которые регулируют трафик рецепторов.

Существует несколько подходов к экспрессии nAChR, включая временную трансфекцию ДНК или создание стабильных клеточных линий, экспрессирующих желаемый подтип. Хотя создание стабильных клеточных линий полезно для долгосрочных исследований с одним и тем же подтипом рецептора, этот процесс трудоёмкий и может занять несколько месяцев. После установления такие клеточные линии могут демонстрировать переменную экспрессию рецепторов через проходы, потерю экспрессии со временем или смещение отбора клонов с неоптимальной функцией рецепторов или плотностью13. Снижение температуры инкубации с 37 °C до 30 °C, добавление молекулярных шаперонов, таких как никотин, или увеличение времени инкубации могут способствовать поверхностнойэкспрессии 13,14,15. Эти ограничения особенно заметны для гетеромерных nAChR, требующих правильной сборки и транспортировки субъединиц, а также для исследований, ориентированных на регуляцию рецепторов с помощью шаперонов. Поэтому при работе со стабильными клеточными линиями, экспрессирующими nAChR, необходимо регулярно проверять экспрессию подтипов рецепторов через проходы.

Часто исследователей интересуют варианты субъединиц nAChR, а также шаперонные или вспомогательные белковые субъединицы, поэтому им необходимо быстро экспрессировать различные ДНК для обеспечения быстрой гибкости в анализах. Кратковременная экспрессия nAChR в этом отношении выгодна, поскольку процесс может завершиться быстро, позволяя исследователю изучать несколько подтипов рецепторов или экспериментальных условий без месяцев ожидания формирования стабильных клеточных линий. Частое явление, даже при временной экспрессии, заключается в том, что многие nAChR остаются внутри клетки через 24 часа после индукции при 37 °C, требуя дополнительных инкубационных периодов > 48ч 16,17. Например, без белка шаперона, устойчивого к ингибиторам холинэстеразы (RIC)-3, только ~1% α7 nAChR экспрессируются на плазматической мембране клеток SHE-P умлекопитающих 18. При коэкспрессии RIC-3 на поверхности обнаруживается примерно 20% α7 nAChR. Хотя это улучшает, общее количество рецепторов остаётся низким. Коэкспрессия α7 nAChR с NACHO может дополнительно усилить поверхностную экспрессию, хотя всё равно менее 40% от общего трафика популяции рецепторов к плазматическоймембране 19. Другой подход включает инкубацию трансфекционных клеток при 30 °C для улучшения экспрессии плазматическоймембраны 20,21. Для α4β2 nAChR это снижение температуры приводит к пятикратному увеличению плотности поверхностных рецепторов без соответствующего увеличения общего субъединичногобелка 21. Однако для этого улучшения требуется как минимум один дополнительный день и более активное использование расходников, реагентов и инструментов.

Представленная работа предлагает набор оптимизированных методов экспрессии и количественной оценки специфических подтипов nAChR в течение 24 часов после трансфекции в клетках N2a млекопитающих, достигая примерно 83% для α7, 77% для α4 и 56% для β2-субъединиц, локализованных в плазматической мембране. В случае α7 nAChR экспрессию плазматической мембраны можно количественно измерить с помощью α7-селективного флуоресцентно маркированного α-бунгаротоксина (αBTX) или с помощью рекомбинантной флуоресцентной маркировки. Для маркировки каждой субъединицы чувствительные к pH флуоресцентные белки pHuji и суперэклиптические pHluorin (SEP)22,23,24 инженерно размещаются на C-конце отдельных субъединиц nAChR25,26. pHuji и SEP — это pH-чувствительные варианты красного и зелёного флуоресцентных белков соответственно, флуоресценцирующие при pH 7,4, но закалённые при более кислыхусловиях 27,28. Поскольку флуоресценция SEP и pHuji подавляется при pH < 6, любой наблюдаемый внутриклеточный сигнал отражает флуорофоры, расположенные в нейтральных компартментах, а не на плазматической мембране. Следует отметить, что некоторые органеллы, такие как аппарат Гольджи, имеют кислый просвет; таким образом, флуорофоры, прикреплённые к C-концевой области субъединиц nAChR, не обнаруживаются при прохождении субъединиц по секреторномупути 29. Разница между полной флуоресценцией при pH 7,5 и при pH < 6 отражает сигнал, генерируемый nAChR, расположенными на плазматической мембране. Захват изображений с помощью конфокальной микроскопии живых клеток обеспечивает высокое пространственное разрешение, позволяя точно определить локализацию субъединиц. Кроме того, проведение всех экспериментов на живых клетках позволяет каждой клетке выступать в роли собственного контроля, учитывая вариабельность экспрессии белков между клетками в каждойгруппе лечения 30. Этот метод может быть дополнительно адаптирован для включения дополнительных белков шаперонов, таких как NACHO или другие, для изучения трафика nAChR. Дополнительные применения включают фармакологическую модуляцию, включение вспомогательных субъединиц и анализ изменений экспрессии nAChR, связанных с заболеваниями.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура описывает методы, успешно использованные для временного трансфектирования линии ячеек N2a с помощью nAChR субъединиц (рисунок 1). Устойчивая экспрессия плазматической мембраны достигается в течение 24 часов, как это зафиксировано с помощью конфокальной микроскопии живых клеток.

figure-protocol-1
Рисунок 1: Схематическое представление отдельных методов, представленных в протоколе. Клетки выращивают до слияния 70%–80% в антеннах для визуализации. Затем клетки обрабатываются трансфекционным реагентом и комплексом ДНК. (Верх) Через 24 часа клетки можно обработать флуоресцентно маркированным лигандом для маркировки субъединиц, экспрессируемых на плазматической мембране, а затем сфотографировать с помощью конфокального микроскопа. (Внизу) Альтернативно, для субъединиц nAChR, модифицированных для маркировки pH-чувствительным белком через 24 часа после трансфекции, клетки можно сфотографировать живыми с помощью конфокального микроскопа для фиксации полной флуоресценции клеток. Буфер pH 7.4 затем заменяется на буфер затухания pH 5.5. Это остановит флуоресценцию белков, чувствительных к pH, помеченных к субъединицам nAChR, расположенным на плазматической мембране клетки, позволяя оставаться флуоресцентными только внутренние субъединицы. Те же клетки снова изображены. Анализ изображений проводится с помощью ImageJ для количественной оценки выражения внутренних и внешних субединиц. Эти процедуры могут быть модифицированы для включения шаперонов и вспомогательных белков. Создано в BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

1. Транзиентная трансфекция N2a nAChR

ПРИМЕЧАНИЕ: Клеточная линия N2a была выбрана из-за проявления нейронного фенотипа и низкой эндогенной экспрессии nAChR. Гены субъединиц α7-pHuji, α4-SEP и β2-pHuji размещаются индивидуально в экспрессионном векторе pcDNA3.1(+) млекопитающих. Белок шаперона NACHO экспрессируется из pREP9 (щедро подаренного доктором Р. Лорингом из Северо-Восточного университета). На всех этапах используйте стерильные методы и работайте внутри шкафа для биобезопасности. Наденьте чистый лабораторный халат, защитные очки и перчатки. Очистите все материалы, входящие или выходящие из биобезопасности, 70% этанола. Следующие шаги описывают трансфекцию в 35-мм поли-D покрытом стеклянной чаше с дном поли-D, которая подходит для визуализации. Объёмы могут регулироваться по мере необходимости для различных сосудов для культуры.

  1. Культивировать клетки N2a в колбасе T25 (или аналогичной) тканевой культуры, содержащей минимальную необходимую среду Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), дополненную 10% сывороткой плода бычьего скота (FBS) и, при необходимости, 100 U/mL пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Инкубировать при 37 °C, 5% CO₂, пока клетки не достигнут ~90% слияния. Визуализируйте с помощью объектива 4x светового микроскопа.
  2. Ежедневно контролируйте слияние с помощью светового микроскопа и заменяйте почву каждые 1-2 дня для поддержания оптимальных условий. Когда клетки достигают ~90% слияния, они готовы к передаче в изображения.
  3. Разогрейте все реагенты до 37 °C в водяной бане. Перед процедурой очистите шкаф для биобезопасности и все материалы 70% этанолом.
    ВНИМАНИЕ: 70% этанола — это высоковоспламеняющаяся жидкость и пар, которые могут вызывать сильное раздражение глаз. Избегайте тепла, искр, открытого огня и других источников возгорания. Храните в хорошо проветриваемом помещении с плотно закрытыми контейнерами. При обращении носите защитные перчатки и защиту для глаз/лица. В случае контакта с кожей или глазами немедленно смойте водой и обратитесь за медицинской помощью, если раздражение сохраняется. Вместо этого можно использовать альтернативное дезинфицирующее средство, например раствор отбеливателя 5%-10%.
  4. Аспирируйте старую среду из колбы и промывки с помощью 5 мл PBS. Добавьте 1 мл трипсина в колбу и аккуратно перемешайте. Инкубировать до тех пор, пока клетки не поднятся (<5 мин). Чтобы предотвратить чрезмерное переваривание, немедленно добавьте 4 мл среды для роста EMEM и аккуратно пипеткуйте для создания суспензии из одной клетки.
  5. С помощью гемоцитометра определите концентрацию клеток и рассчитывайте необходимый объём среды роста EMEM, чтобы скорректировать суспензию так, чтобы в 1 мл содержалось 0,5–2 x 10⁵ клетки.
  6. Поставьте 1 мл ячейки на 35 мм тарелку и добавьте достаточно среды для роста EMEM, чтобы увеличить общий объём до 2 мл. Инкубировать на ночь при 37 °C, 5% CO₂. Клетки готовы к трансфекции при слиянии 70%-80%.
  7. В день трансфекции предварительно разогрейте реагенты до 37 °C, полностью разморозите субъединицы nAChR и доведите реагент до комнатной температуры. Очистите все реагенты 70% этанолом перед тем, как положить их в шкаф для биобезопасности.
  8. Для экспрессии α7 nAChR: В микроцентрифуге разведите 4 мкг α7 (1 мкг/мкл) и 1 мкг плазмидных ДНК NACHO (1 мкг/мкл) по капле в редуцированную сывороточную среду (без антибиотика) до конечного объёма 250 мкл. Аккуратно перемешайте пипетированием после добавления ДНК.
    1. Для экспрессии α4β2 nAChR: разбавить 4 мкг каждой субъединицы ДНК в общей сложности 250 мкл восстановленной сывороточной среды. Аккуратно перемешивайте, пипетируйте. Скорректируйте отношение каждой субъединицы для оптимизации экспрессии определённых изоформ рецепторов.
    2. Чтобы экспрессировать α4β2 nAChR с помощью дополнительной плазмиды, добавьте равные количества ДНК каждой плазмиды. Синий флуоресцентный белок mTagBFP2³¹ в pcDNA3.1(+) служит контрольной плазмидой и может быть заменён любым шапероном α4β2.
  9. Аккуратно перемешайте реагент для трансфекции ДНК перед использованием. В отдельной микроцентрифуге разведите 8 мкл трансфекционного реагента по капле в 250 мкл восстановленной сывороточной среды. Инкубировать 5 минут при комнатной температуре. Переходите к следующему этапу в течение 25 минут.
  10. Через 5 минут комбинируйте разбавленные ДНК с разбавлённым трансфекционным реагентом (всего = 500 мкл) по каплям. Аккуратно перемешайте пипеткой и инкубуйте 20 минут при комнатной температуре. ДНК-липидные комплексы остаются стабильными до 6 часов.
  11. Пока комплексы формируются, изнимите посевные чаши из инкубатора и замените среду на 1 мл безсывороточного EMEM (без антибиотиков).
  12. Добавьте 500 мкл комплекса реагентов ДНК-трансфекции по каплям в каждую антенну (конечный объём = 1,5 мл). Аккуратно перемешивайте, покачивая тарелку, чтобы равномерно распределять её по блюду, особенно по стеклянной поверхности. Инкубировать при 37 °C в течение 24 часов, затем заменить среду через 4-6 часов для укрепления здоровья клеток.

2. Маркировка живых клеток плазматической мембраны α7 nAChR с помощью αBTX Alexa Fluor 647

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура обычно проводится через 24 часа после трансфекции. Защитите αBTX Alexa Fluor 647 (αBTX-AF647) от света, чтобы предотвратить фоторазрушение фторофора.

  1. Предварительно прогрейте все реагенты до 37 °C и разморозьте раствор αBTX-AF647 (2,3 мкм). Очистите этанолом 70% и положите в шкаф для биобезопасности.
  2. Возьмите из инкубатора тарелку с клетками, трансфицированными ДНК α7 и NACHO, очистите её снаружи 70% этанолом и поместите её в шкаф для биобезопасности.
  3. Сбросьте старую среду вакуумным вакуумом. Для промывки клеток добавьте 2 мл свежей среды для роста EMEM.
  4. Снимите стирочный материал вакуумным вакуумом. Добавьте 2 мл среды для роста EMEM в блюда.
  5. Замените соответствующее количество среды на αBTX-AF647, чтобы достичь конечной концентрации 80 нм. Инкубировать ночь при 37 °C.
  6. Утром разогрейте PBS или предпочитаемый материал для визуализации и очистите 70% этанола. Переведите в шкаф биобезопасности.
  7. Удалите трансфектированные клетки из инкубатора, очистите их и поместите в шкаф с биобезопасностью.
  8. Удалите старую среду с αBTX-AF647 и поместите его в соответствующий контейнер для отходов.
  9. Промывайте ячейки 2 мл PBS по 3 раза по 10 минут при комнатной температуре. Промывания удаляют незавязанный лиганд и мусор, а время можно адаптировать под потребности исследователя. Снимайте PBS после каждой стирки.
  10. Добавьте 2 мл PBS или предпочитаемой среды для визуализации и приступайте к изображению клеток с помощью конфокального микроскопа.

3. Живоклеточная визуализация общего и внутреннего α7-pHuji nAChR

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующая процедура использует собственную плазмиду α7-pHuji pcDNA3.1, котрансфекционную с шапероном NACHO. Похожий протокол использовался для экспрессии α4-SEP и β2-pHuji в pcDNA3.1 с контрольной плазмидой mTagBFP2 pcDNA3.1, как описано в разделе «Результаты». Защищайте образцы от света на протяжении всей процедуры, чтобы предотвратить фоторазрушение фторофора.

  1. Подготовьте буфер изображения pH 7,4 (Таблица 1) и буфер для затушения pH 5,5 (Таблица 2), какописано 23.
  2. Предварительно разогрейте реагенты до 37 °C, очистите с помощью 70% этанола и передайте в шкаф для биобезопасности. Извлечь трансфектированные клетки из инкубатора, очистить 70% этанолом и положить их в шкаф для биобезопасности.
  3. Удалите старую среду с помощью всасывания. Промойте блюдо 2 мл PBS 3 раза по 10 минут при комнатной температуре. Добавьте 2 мл буфера pH 7.4.
  4. Поднесите тарелку к конфокальному микроскопу. Вставьте тарелку с буфером pH 7.4 в держатель затвора и поместите её в предварительно нагретую камеру на конфокальном микроскопе.
  5. Подключите трубку перистальтического насоса к держателю для съёмочной антенны и закройте камеру.
  6. Откройте программное обеспечение визуализации и выберите лазеры для интересующих флуорофоров (pHuji 566/598 нм, α4-SEP 499/520 нм, β2-pHuji 568/603 нм и mTagBFP2 359/461 нм).
  7. Просканируйте антенну, чтобы найти ячейки для съёмки с помощью объектива 10x-60x. Увеличьте увеличение при желании и регулируйте глубину фокусировки по мере необходимости.
  8. Отрегулируйте интенсивность лазера и чувствительность детектора, чтобы визуализировать флуоресценцию без фонового сигнала. При необходимости отрегулировать диафрагму для увеличения флуоресцентного сигнала.
  9. Выберите желаемое разрешение и захватите одно изображение с помощью нужного объектива (например, 60x).
  10. Запишите местоположение на карте тарелки, чтобы переместить те же ячейки после смены буфера на pH 5.5.
  11. Повторите процесс изображения для нескольких участков тарелки, записывая каждое новое место. Используйте одинаковые настройки захвата для всех изображений (экспериментальных и контрольных групп), чтобы обеспечить правильные сравнения.
  12. Держа только выходную трубу подключённой к перистальтическому насосу, медленно отсасывайте буфер pH 7.4 из антенны в контейнер для отходов.
  13. Когда большая часть буфера удалена (без высыхающих ячеек), перенесите впускную линию в буфер с pH 5,5.
  14. Включите перистальтический насос, чтобы постепенно добавить буфер pH 5,5 (1,5 мл/мин) в тарелку, чтобы клетки оставались прикреплёнными.
  15. Запустите насос 20 минут, следя за тем, что буфер правильно поступает в тарелку и обратно.
  16. Выключите насос и инкубуйте клетки с буфером закалки pH 5.5 ещё на 20 минут для уравновесия.
  17. Чтобы повторить изображение, загрузите сохранённые локации из предыдущей сессии, чтобы вернуться в те же регионы.
  18. Убедитесь, что глубина и положение фокуса правильны, так как они могут смещаться после замены буферов.
  19. Повторяйте визуализацию во всех сохранённых местах с использованием pH-закалённого состояния.
РеагентКонцентрация (мМ)
NaCl135
KCl5
MgCl21.8
HEPES20
d-глюкоза1
Скорректируйте решение до pH 7,4

Таблица 1: Рецепт буфера для визуализации. Были добавлены следующие реагенты, и раствор был скорректирован до pH 7,4.

РеагентКонцентрация (мМ)
NaCl135
KCl5
MgCl20.4
CaCl21.8
MES20
d-глюкоза1
Скорректируйте раствор до pH 5,5

Таблица 2: Рецепт буфера для закалки. Следующие реагенты были смешаны, и полученный раствор был скорректирован до pH 5,5.

4. Количественная оценка изображений

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура объясняет, как анализировать изображения клеток с помощью ImageJ (Национальные институты здравоохранения, Бетесда, Мэриленд) и метода скорректированной полной флуоресценции клеток (CTCF) 32.

  1. Откройте ImageJ и откройте изображение для анализа. Изображение будет выглядеть как стек, каждый захваченный канал разделён в одном кадре.
  2. Перейдите к каналу Phase . Если изображение слишком яркое (обычно для пустых или фоновых областей), выберите Process > Enhance Contrast, затем нажмите OK.
  3. С помощью лупы увеличите (+) одну ячейку. С помощью инструмента выбора от руки обведите контур ячейки в канале Phase.
  4. Переключитесь на люминесцентный канал, соответствующий интересуемому флуорофору. Настройте нужные измерения, выбрав Анализ > Измерения множества. Проверьте площадь, среднее значение серого и интегрированную плотность .
  5. Чтобы измерить выбранный регион, выберите Analyze > Measure или нажмите Command + M (Mac) / Ctrl + M (Windows).
  6. Сделайте три фоновых измерения, обведя пустые участки рядом с ячейкой. Повторяйте шаги для нужного количества ячеек.
  7. Данные измерений будут отображаться в отдельном окне Results в ImageJ. Скопируйте и вставьте эти данные в Excel для анализа.
  8. Рассчитайте среднее значение по трём фоновым измерениям.
  9. Вычислите значение CTCF для каждой ячейки по следующей формуле:
    CTCF=Интегрированная плотность−(площадь ячейки x Средняя фоновая флуоресценция)
  10. Повторите этот процесс для нескольких клеток и изображений для каждой экспериментальной группы (и при условии pH, если применимо). Экспортировать все результаты в программное обеспечение для анализа данных для статистической обработки.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Следуя вышеуказанным процедурам трансфекции, α7 nAChR и белок шаперона NACHO были коэкспрессированы в клетках N2a. Как нетрансфектированные, так и трансфектированные клетки были маркированы αBTX-AF647 через 24 часа после трансфекции ДНК. Поскольку αBTX не является мембранопроницаемым, вся обнаруженная флуоресценция исходит от рецепторов, присутствующих на плазматической мембране. На рисунке 2A,A′ было обнаружено слабое окрашивание αBTX-AF647...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Методы, представленные для экспрессии и количественной оценки субъединиц nAChR в клетках N2a млекопитающих, решают давние задачи по достижению быстрой (~24 часа) и обильной экспрессии мембраны nAChR (> 60%) для исследований по обнаружению, локализации и трафику лекарств. Ключевая сила этого набора протоколов — его адаптивность как к гомомерным (α7), так и к гетеромерным (α4β2) nAChR, и, вероятно, он применим к другим подтипам nAChR, а также к коэкспрессии белков шаперонов. Используя чувс...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают благодарность Джеймсу Джаносо за его экспертизу в области технической микроскопии и Центр трансформационных исследований метаболизма (Национальный институт общих медицинских наук Национального института здравоохранения под номером P20GM130443) за поддержку Микроскопического центра в Университете Аляски в Фэрбенксе. Усилия LW частично поддерживались финансированием Фонда инвестиций в высшее образование, предоставленного штатом Аляска через Университет Аляски. Усилия SMS были поддержаны премией Institutional Development Award (IDeA) от Национального института общих медицинских наук Национальных институтов здравоохранения по гранту номер P20GM103395. Исследования, представленные в этой публикации, были поддержаны Национальным институтом психического здоровья Национальных институтов здоровья (MMW по наградному номеру R03MH135358) и Национальным институтом общих медицинских наук (MMW по наградному номеру R16GM150455) Национальных институтов здравоохранения.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
0,25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco25200-056Реагент для отстранения клеток
Альфа-бунгаротоксин Alexa Fluor 647ИнвитрогенB35450Конъюгат альфа-бунгаротоксинов
Кабинет биобезопасности уровня BSL 1 и nbsp;NuaireNU-425-400Рабочая зона для стерильной клеточной культуры
Хлорид кальцияAventor/VWRBDH9224Компонент буфера
D-(+)-глюкозаMilliPore Sigma G8270Компонент буфера
EMEM с L-глутаминомATCC30-2003Клеточная среда
ДНК без эндотоксиновСделано на собственном месте с помощью наборов ZymoНе применимоnAChR-ДНК, используемые для переходных трансфекций клеток
Микроцентрифугальные трубки без эндотоксинов — 0,5 мл Aventor/VWR89000-010ДНК и подготовка трансфекции
Микроцентрифугные трубки без эндотоксинов — 1,5 мл Aventor/VWR20170-038ДНК и подготовка трансфекции
Сыворотка плода для быкаAventor/VWR97068-085Сывороточная добавка
Fluoview FV10iОлимпFV10iКонфокальный микроскоп
Посуды MatTek с стеклянным дномMatTekP35GC-0-10-CАнтенны для визуализации
GraphPad Prism v. 10GraphPad Prismhttps://www.graphpad.com/featuresПрограммное обеспечение для анализа данных
HEPESMilliPore Sigma H3375Компонент буфера
Липофектамин 2000Инвитроген11668019Трансфекционный реагент
Гексагидрат хлорида магнияThermo scientific413410025Компонент буфера
MES hydrateMilliPore Sigma M5287Компонент буфера
mTagBFP2-pBADAddGene 54572Контрольная ДНК, используемая для трансфекции клеток и нежность;
Клетки Neuro 2 a (N2a)Коллекция американской типографической культурыCCL-131Клетки, используемые для трансфекций ДНК и экспрессии nAChR
Opti-MEMGibco31985-070Восстановленная сывороточная среда
Пенициллин/стрептомицинAventor/VWRK952-100mLАнтибиотик
Перистальтический насосГилсонMiniPuls3Буфер меняется при изображении 
Фосфатно-буферный физиологический растворКачество биологических характеристик119-069-131Солевый буфер
Пипетная помощьDrummond 140084Точный перенос жидкости
Наконечники пипетов (стерильные и без эндотоксинов, 1000 мкл)Рейнин30389216Точный перенос жидкости
Наконечники пипетов (стерильные и без эндотоксинов, 20 мкл)Рейнин30389229Точный перенос жидкости
Наконечники пипеты (стерильные, без эндотоксинов, 250 мкл)Рейнин30389246Точный перенос жидкости
Пипеты, P10Rainin L-10XLSТочный перенос жидкости
Пипеты, P100Rainin L-100XLSТочный перенос жидкости
Пипеты, P1000Rainin L-1000XLSТочный перенос жидкости
Хлорид калияMilliPore Sigma P3911Компонент буфера
Серологические пипетки (стерильные и без эндотоксинов, 10 мл)Aventor/VWR89130-898Точный перенос жидкости
Серологические пипетки (стерильные и без эндотоксинов, 25 мл)Aventor/VWR89130-900Точный перенос жидкости
Серологические пипетки (стерильные и без эндотоксинов, 5 мл)Aventor/VWR76201-710Точный перенос жидкости
Серологические пипетки (стерильные и без эндотоксинов, 50 мл)Aventor/VWR75816-088Точный перенос жидкости
Хлорид натрияAventor/VWRBDH9286Компонент буфера
Колба для культуры тканейFalcon353109Выращивание блюд
ZymoPure II Plasmid Maxiprep KitZYMO RESEARCHD4203-A + D4203-BОбразование ДНК без эндотоксинов
α 4-СЕП&НБСП;ThermoFisher Scientific GeneArt Gene Synthesis Services   https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlСервисы по индивидуальному синтезу генов
α 7-pHujiТвист Биосайенсhttps://www.twistbioscience.com/Сервисы по индивидуальному синтезу генов
и бета; 2-pHujiThermoFisher Scientific GeneArt Gene Synthesis Services   https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cloning/c-misc/geneart.htmlСервисы по индивидуальному синтезу генов

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Whiting, P. J., et al. Expression of nicotinic acetylcholine receptor subtypes in brain and retina. Mol Brain Res. 10 (1), 61-70 (1991).
  2. Albuquerque, E. X., et al. Nicotinic Receptor Function in the Mammalian Central Nervous System. Ann New York Acad Sci. 757 (1), 48-72 (1995).
  3. Picard, F., et al. Alteration of the in vivo nicotinic receptor density in ADNFLE patients: a PET study. Brain. 129 (8), 2047-2060 (2006).
  4. Breese, C. Abnormal Regulation of High Affinity Nicotinic Receptors in Subjects with Schizophrenia. Neuropsychopharmacology. 23 (4), 351-364 (2000).
  5. De Luca, V., Voineskos, S., Wong, G., Kennedy, J. L. Genetic interaction between α4 and β2 subunits of high affinity nicotinic receptor: analysis in schizophrenia. Exp Brain Res. 174 (2), 292-296 (2006).
  6. Maskos, U., et al. Nicotine reinforcement and cognition restored by targeted expression of nicotinic receptors. Nature. 436 (7047), 103-107 (2005).
  7. Picciotto, M. R., et al. Acetylcholine receptors containing the β2 subunit are involved in the reinforcing properties of nicotine. Nature. 391 (6663), 173-177 (1998).
  8. Staley, J. K. Human Tobacco Smokers in Early Abstinence Have Higher Levels of β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors than Nonsmokers. J Neurosci. 26 (34), 8707-8714 (2006).
  9. Gotti, C., Zoli, M., Clementi, F. Brain nicotinic acetylcholine receptors: native subtypes and their relevance. Trends Pharmacol Sci. 27 (9), 482-491 (2006).
  10. Mineur, Y. S., Mose, T. N., Blakeman, S., Picciotto, M. R. Hippocampal α7 nicotinic ACh receptors contribute to modulation of depression-like behaviour in C57BL/6J mice. British J Pharmacol. 175 (11), 1903-1914 (2018).
  11. Fernandes, S. S., et al. Enhanced cholinergic-tone during the stress induce a depressive-like state in mice. Behav Brain Res. 347, 17-25 (2018).
  12. Ren, J. M., Zhang, S. L., Wang, X. L., Guan, Z. Z., Qi, X. L. Expression levels of the α7 nicotinic acetylcholine receptor in the brains of patients with Alzheimer's disease and their effect on synaptic proteins in SH-SY5Y cells. Mol Med Rep. 22 (3), 2063-2075 (2020).
  13. Letchworth, S. R., Whiteaker, P. Progress and Challenges in the Study of α6-Containing Nicotinic Acetylcholine Receptors. Biochem Pharmacol. 82 (8), 862-872 (2011).
  14. Nelson, M. E., et al. Functional Properties of Human Nicotinic Achrs Expressed by Imr-32 Neuroblastoma Cells Resemble Those of α3β4 Achrs Expressed in Permanently Transfected Hek Cells. J General Physiol. 118 (5), 563-582 (2001).
  15. Cooper, S. T., Harkness, P. C., Baker, E. R., Millar, N. S. Up-regulation of Cell-surface α4β2 Neuronal Nicotinic Receptors by Lower Temperature and Expression of Chimeric Subunits *. J Biol Chem. 274 (38), 27145-27152 (1999).
  16. Harkness, P. C., Millar, N. S. Inefficient cell-surface expression of hybrid complexes formed by the co-assembly of neuronal nicotinic acetylcholine receptor and serotonin receptor subunits. Neuropharmacology. 41 (1), 79-87 (2001).
  17. Dhara, M. Polyamine regulation of ion channel assembly and implications for nicotinic acetylcholine receptor pharmacology. Nat Commun. 11 (1), (2020).
  18. Vallés, A. S., Roccamo, A. M., Barrantes, F. J. Ric-3 chaperone-mediated stable cell-surface expression of the neuronal α7 nicotinic acetylcholine receptor in mammalian cells. Acta Pharmacol Sinica. 30 (6), 818-827 (2009).
  19. Dawe, G. B., et al. α7 nicotinic acetylcholine receptor upregulation by anti-apoptotic Bcl-2 proteins. Nat Comm. 10 (1), (2019).
  20. Peng, J. H., et al. Inducible, heterologous expression of human α7-nicotinic acetylcholine receptors in a native nicotinic receptor-null human clonal line. Brain Res. 825 (1-2), 172-179 (1999).
  21. Cooper, S. T., Harkness, P. C., Baker, E. R., Millar, N. S. Up-regulation of Cell-surface α4β2 Neuronal Nicotinic Receptors by Lower Temperature and Expression of Chimeric Subunits. J Biol Chem. 274 (38), 27145-27152 (1999).
  22. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  23. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  24. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  25. O'Brien, B. C. V., Weber, L., Hueffer, K., Weltzin, M. M. SARS-CoV-2 spike ectodomain targets α7 nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 299 (5), 104707(2023).
  26. O'Brien, B. C. V., et al. The human alpha7 nicotinic acetylcholine receptor is a host target for the rabies virus glycoprotein. Front Cell Infect Microbiol. 14, (2024).
  27. Shen, Y., Rosendale, M., Campbell, R. E., Perrais, D. pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis. J Cell Biol. 207 (3), 419-432 (2014).
  28. Sankaranarayanan, S., Angelis, D. D., Rothman, J. E., Ryan, T. A. The Use of pHluorins for Optical Measurements of Presynaptic Activity. Biophy J. 79 (4), 2199-2208 (2000).
  29. Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J General Physiol. 143 (1), 51-66 (2013).
  30. Nichols, W. A., et al. Lynx1 Shifts α4β2 Nicotinic Receptor Subunit Stoichiometry by Affecting Assembly in the Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem. 289 (45), 31423-31432 (2014).
  31. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An Enhanced Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the Chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).
  32. Fitzpatrick, M. Measuring cell fluorescence using ImageJ. , http://theolb.readthedocs.io/en/latest/imaging/measuring-cell-fluorescence-using-imagej.html#measuring-cell-fluorescence-using-imagej (2025).
  33. Srinivasan, R., et al. Nicotine up-regulates α4β2 nicotinic receptors and ER exit sites via stoichiometry-dependent chaperoning. J Gen Physiol. 137 (1), 59-79 (2011).
  34. Subach, O. M., Cranfill, P. J., Davidson, M. W., Verkhusha, V. V. An Enhanced Monomeric Blue Fluorescent Protein with the High Chemical Stability of the Chromophore. PLoS One. 6 (12), e28674(2011).
  35. Matta, J. A., et al. NACHO Mediates Nicotinic Acetylcholine Receptor Function throughout the Brain. Cell Rep. 19 (4), 688-696 (2017).
  36. Flores, C. M., Rogers, S. W., Pabreza, L. A., Wolfe, B. B., Kellar, K. J. A subtype of nicotinic cholinergic receptor in rat brain is composed of alpha 4 and beta 2 subunits and is up-regulated by chronic nicotine treatment. Mol Pharmacol. 41 (1), 31-37 (1992).
  37. Mazzaferro, S., Whiteman, S. T., Alcaino, C., Beyder, A., Sine, S. M. NACHO and 14-3-3 promote expression of distinct subunit stoichiometries of the α4β2 acetylcholine receptor. Cell Mol Life Sci. 78 (4), 1565-1575 (2021).
  38. Nichols, W. A., et al. Lynx1 Shifts α4β2 Nicotinic Receptor Subunit Stoichiometry by Affecting Assembly in the Endoplasmic Reticulum. J Biol Chem. 289 (45), 31423-31432 (2014).
  39. Fasoli, F., et al. In vivo chronic nicotine exposure differentially and reversibly affects upregulation and stoichiometry of α4β2 nicotinic receptors in cortex and thalamus. Neuropharmacology. 108, 324-331 (2016).
  40. Wada, E., et al. Distribution of alpha2, alpha3, alpha4, and beta2 neuronal nicotinic receptor subunit mRNAs in the central nervous system: A hybridization histochemical study in the rat. J Comparative Neurol. 284 (2), 314-335 (1989).
  41. Zoli, M., Léna, C., Picciotto, M. R., Changeux, J. P. Identification of Four Classes of Brain Nicotinic Receptors Using β2 Mutant Mice. J Neurosci. 18 (12), 4461-4472 (1998).
  42. Briggs, C. A., et al. and Low-Sensitivity Subforms of α4β2 and α3β2 nAChRs. J Mol Neurosci. 30 (1-2), 11-12 (2006).
  43. Weltzin, M. M., George, A. A., Lukas, R. J., Whiteaker, P. Distinctive single-channel properties of α4β2-nicotinic acetylcholine receptor isoforms. PLoS One. 14 (3), e0213143(2019).
  44. Moroni, M., Bermudez, I. Stoichiometry and Pharmacology of Two Human α4β2 Nicotinic Receptor Types. J Mol Neurosci. 30 (1-2), 95-96 (2006).
  45. Nelson, M. E., Kuryatov, A., Choi, C. H., Zhou, Y., Lindstrom, J. Alternate Stoichiometries of α4β2 Nicotinic Acetylcholine Receptors. Mol Pharmacol. 63 (2), 332-341 (2003).
  46. Tapia, L., Kuryatov, A., Lindstrom, J. Ca2+ Permeability of the (α4)3(β2)2 Stoichiometry Greatly Exceeds That of (α4)2(β2)3 Human Acetylcholine Receptors. Mol Pharmacol. 71 (3), 769-776 (2007).
  47. Eaton, J. B., et al. The Unique α4(+)/(−)α4 Agonist Binding Site in (α4)3(β2)2 Subtype Nicotinic Acetylcholine Receptors Permits Differential Agonist Desensitization Pharmacology versus the (α4)2(β2)3 Subtype. J Pharmacol Exp Ther. 348 (1), 46-58 (2014).
  48. Mazzaferro, S., et al. Additional Acetylcholine (ACh) Binding Site at α4/α4 Interface of (α4β2)2α4 Nicotinic Receptor Influences Agonist Sensitivity. J Biol Chem. 286 (42), 31043-31054 (2011).
  49. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Bio Chem. 286 (36), 31241-33124 (2011).
  50. Asokan, A., Cho, M. J. Exploitation of Intracellular pH Gradients in the Cellular Delivery of Macromolecules. J Pharma Sci. 91 (4), 903-913 (2002).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

pHNeuro2aImageJ

Похожие статьи