ML385 ослабляет злокачественную прогрессию клеток аденокарциномы легкого, индуцированной диоксидом кремния, через путь оси аутофагии ROS/NRF2

Аденокарцинома легких является основной причиной смертности от рака во всем мире: по оценкам, ежегодно регистрируется 2 миллиона новых случаев заболевания и 1,76 миллиона случаев^{смерти1}. В последние годы заболеваемость аденокарциномой легких среди людей, которые никогда не курили, возросла, что может быть связано с такими факторами окружающей среды, как загрязнение^{воздуха.} Диоксид кремния является распространенным загрязнителем окружающей среды и был идентифицирован как потенциальный патогенный фактор аденокарциномы легкого человека³. Диоксид кремния может вызывать стойкое хроническое воспаление, приводящее к инфильтрации макрофагов, лимфоцитов и нейтрофилов, а также к высвобождению активных форм кислорода и факторов воспаления⁴. Это длительное воспалительное микроокружение способствует возникновению аденокарциномы легкого ^5,6. Хотя связь между воздействием диоксида кремния и аденокарциномой легких была подтверждена, ее специфический молекулярный механизм не был полностью выяснен.

Транскрипционный фактор NRF2, кодируемый геном NFE2L2, играет решающую роль в качестве главного регулятора в поддержании клеточного окислительно-восстановительного гомеостаза в ответ на окислительный стресс ^7,8. В нормальных условиях NRF2 мечется и разрушается комплексом убиквитинлигазы KEAP1-CUL3. При стимуляции окислительным стрессом или электрофильными веществами активность KEAP1 ингибируется, что позволяет NRF2 стабильно накапливаться и проникать в ядро, тем самым оказывая защитную и регуляторную роль ядра⁹. Тем не менее, чрезмерная активация NRF2 в опухолевом микроокружении может усиливать гликолиз и выживаемость опухолевых клеток за счет остановки накопления АФК и повышения апоптотической резистентности ^10,11. Исследования доказали, что воздействие диоксида кремния может привести к аномальной активации сигнального пути NRF2 ^12,13. Таким образом, нацеливание на NRF2 может быть эффективной стратегией вмешательства в злокачественное прогрессирование аденокарциномы легкого, индуцированной диоксидом кремния¹⁴.

Данное исследование направлено на выяснение того, ингибитор NRF2 ML385 ингибирует вызванное диоксидом кремния злокачественное прогрессирование аденокарциномы легкого путем регуляции оси АФК/NRF2-аутофагии. Мы создали мышиную модель, индуцированную диоксидом кремния, для воспроизведения ключевых особенностей заболевания и использовали экспериментальные методы in vitro для изучения взаимодействия между макрофагами и опухолевыми клетками. Мы обнаружили, что диоксид кремния индуцировал экспрессию воспалительных и иммунных молекул и способствовал образованию опухоли через путь оси АФК/NRF2-аутофагии. При использовании ингибитора NRF2 (ML385) стимулирующее действие диоксида кремния на образование опухолей замедлилось, что позволяет предположить, что ингибитор NRF2 может играть роль в лечении опухолей легких, индуцированных диоксидом кремния.

Все донорские блоки были получены из архивных патологических образцов, собранных в период с 2016 по 2018 год в Аффилированной Хуайаньской народной больнице No1 Нанкинского медицинского университета. Образцы были обезличены перед использованием и обработаны в соответствии с утвержденными протоколами. Комитет по этике Аффилированной народной больницы Хуайань No 1 Нанкинского медицинского университета, KY-2024-250-01. Разведение, утилизация и применение экспериментальных мышей строго соответствуют Правилам обращения с лабораторными животными и международным рекомендациям.

Построение модели мыши, индуцированной диоксидом кремния
Приготовление мышей и суспензии диоксида кремния: Вырастите самцов мышей C57BL/6 в возрасте 6-8 недель в помещении для животных с комнатной температурой 20-25 °C и циклом 12 ч света / 12 ч темноты. Для приготовления суспензии кремниевой пыли 300 мг порошка кремниевой пыли точно взвешивали и суспензировали в 10 мл стерильного 1-кратного фосфатно-солевого буфера. Затем смесь энергично переворачивали и колебали в течение 5 мин, а затем подвергали ультразвуковой обработке на водяной бане в ультразвуковой машине в течение 30 мин для обеспечения равномерного диспергирования частиц и предотвращения агрегации. Конечная концентрация этой резервной суспензии составляет 30 мг/мл. Стерилизовать путем автоклавирования при 121 °C в течение 30 минут. Перед каждым использованием необходимо сделать вихрь и снова встряхнуть в течение 2-3 минут, чтобы снова взвесить любые осевшие частицы.

Мыши вдыхали суспензию диоксида кремния через нос. С помощью микропипетки раствор медленно и по каплям вводился в носовую полость мышей. Мыши были разделены на 6 групп по 20 мышей в каждой. Объем ингаляции каждой группы составлял 10 мкл, 30 мкл, 50 мкл, 70 мкл, 90 мкл и 200 мкл, с концентрацией 30 мг/мл, один раз в сутки в течение 40 дней подряд. При перфуции обхватывайте кожу за ухом мыши большим и указательным пальцами левой руки, а остальными пальцами фиксируйте корпус и хвост мыши. Убедитесь, что мышь находится в лежачем положении на спине, слегка наклонив голову назад, чтобы суспензия могла естественным образом вдыхаться в дыхательные пути. Мы обнаружили, что после второго дня ингаляции суспензии диоксида кремния 10 мкл, 30 мкл, 50 мкл и 70 мкл суспензии диоксида кремния у мышей не было случая смерти, в то время как после второго дня ингаляции суспензии диоксида кремния 90 мкл и 200 мкл у мышей наблюдался смертельный исход. Таким образом, максимальный объем ингаляции диоксида кремния у мышей составлял 70 мкл в сутки.

При работе с кристаллическим диоксидом кремния его необходимо проводить в шкафу биобезопасности или вытяжном шкафу, а на протяжении всего процесса необходимо носить маски N95, пылезащитные очки, нитриловые перчатки и защитную одежду. При приготовлении суспензии движения должны быть мягкими, а во избежание образования аэрозолей следует использовать камеру для взвешивания. Все отходы, контактирующие с диоксидом кремния, должны собираться в герметичные контейнеры с устойчивостью к проколам и утилизироваться в соответствии с правилами для опасных химических отходов. Категорически запрещается смешивать его с обычным мусором или выливать в канализацию. Биологические отходы, такие как клеточная культуральная среда, должны быть собраны в специальные мусорные баки, содержащие дезинфицирующие средства, и стерилизованы под высоким давлением. Туши и ткани животных должны быть помещены в пакеты для биологических отходов и стерилизованы под высоким давлением для безвредной обработки.

Оцените успешность мышиной модели, вызванной диоксидом кремния. Оценивайте животных в разные моменты времени после вдыхания диоксида кремния, а именно на 3-й, 14-й и 40-й дни. Мышей помещали в профессиональные устройства для эвтаназии животных, а углекислый газ вводили со скоростью наполнения 30%-50% объема/мин. Они постоянно подвергались воздействию до тех пор, пока не переставали дышать. После подтверждения смерти были проведены последующие операции. Легочная ткань была удалена. Легочную ткань фиксировали в 4% растворе параформальдегида при комнатной температуре в течение 48 ч. После фиксации ткань обезвоживали градиентным спиртом, делали прозрачной с помощью ксилола, а затем погружали в парафин. Непрерывные срезы изготавливали с помощью парафиносекционной машины толщиной 4-5 мкм для последующего гистологического окрашивания и иммуногистохимического анализа. Легочная ткань не требует лечения декальциноза. Для оценки успешности создания модели было проведено патологоанатомическое исследование легочной ткани. Критерии успешности построения модели силикоза были следующими: значительное воспаление легких, фиброз и возникновение узелков силикоза.

Анализ инфильтрации иммунных клеток в мышиной модели, индуцированной диоксидом кремния
Легочные ткани мышей на 14-й день после ингаляции диоксида кремния окрашивали флуоресцентными маркерами, содержащими CD3e (коэффициент разведения 1:200), CD8a (коэффициент разведения 1:200), CD86 (коэффициент разведения 1:200), F4/80 (коэффициент разведения 1:200) и Nk1.1 (коэффициент разведения 1:200) для визуализации иммунных клеток. Зафиксируйте срезы клеток или тканей и заблокируйте 5% бычьим сывороточным альбумином (БСА) на 1 ч для уменьшения неспецифического связывания. Используйте обычную сыворотку того же видового происхождения, что и блокирующее антитело, разведите сыворотку с PBS в соотношении 1:10 и добавьте в образец 100 μл разведенной сыворотки. Затем заблокируйте при комнатной температуре на 30 минут, чтобы сыворотка могла блокировать эндогенные антитела. После запечатывания аккуратно промойте 2 раза PBS. Первичные антитела, содержащие CD3e (коэффициент разведения 1:200), CD8a (коэффициент разведения 1:200), CD86 (коэффициент разведения 1:200), F4/80 (коэффициент разведения 1:200) и Nk1.1 (коэффициент разведения 1:200), инкубировали в течение ночи при 4°C или при комнатной температуре в течение 1-2 ч. После промывки PBS флуоресцентное вторичное антитело добавляли и инкубировали в темноте в течение 1 ч.

Окрашивание Массона и иммуногистохимический анализ
Парафиновые срезы депарафинизировали ксилолом и гидратировали градиентным спиртом, а затем проводили забор антигена в буфере цитрата натрия с pH 6,0 методом термообработки под высоким давлением. Для термической коррекции под высоким давлением поместите срезы ткани, смоченные в ремонтном буфере, в микроволновую печь на среднем огне на 8-12 минут. Активность эндогенной пероксидазы блокировали 3% раствором перекиси водорода на 20 мин, а затем неспецифический сайт связывания блокировали 5% БСА при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавьте первичные антитела NRF2 (1:200), CDK1 (1:400) и VDAC1 (1:500) и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. После 3-кратной промывки PBS добавьте меченое HRP козье вторичное антитело против кролика (1:500) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 часа. Парафиновые срезы подвергали окрашиванию DAB, противоокрашиванию гематоксилином, прозрачности дегидратации и герметизации нейтральным гелем для получения соответствующих результатов молекулярной иммуногистохимии. Когда DAB используется для разработки цвета, умеренное развитие цвета должно быть от коричневато-желтого до коричневато-коричневого, а фон должен быть четким. Как чрезмерное (темно-коричневый), так и недостаточное (светло-желтый) развитие цвета требуют оптимизации времени проявления цвета.

Степень фиброза легких полуколичественно анализировали с использованием метода оценки Эшкрофта¹⁵: окрашенные Массоном срезы наблюдали под микроскопом со 100-кратным увеличением, а легочную ткань случайным образом делили на 8 областей. Каждая область оценивалась в соответствии со степенью фиброза (0-8 баллов), при этом итоговый балл представлял собой среднее значение по всем регионам: 0 баллов (нормальная легочная ткань), 1-2 балла (легкий фиброз), 3-4 балла (умеренный фиброз), 5-8 баллов (тяжелый фиброз).

Иммуногистохимические результаты были количественно проанализированы с помощью программного обеспечения Image. Случайным образом были выбраны пять полей с высоким увеличением, и среднее значение оптической плотности (MOD) каждого поля измерялось как показатель уровня экспрессии белка.

Изучение влияния диоксида кремния и ML385 на аутофагию и АФК в клетках RAW264.7
Клетки RAW264.7 и A549 (предоставленные Аньхойским университетом науки и технологии) культивировали с использованием среды DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% раствора биспецифических антител пенициллин-стрептомицин. Клетки 1 x 10⁷ равномерно культивировали в инкубаторе с постоянной температурой при 37 °C и 5%_CO2. 5 мкл 30 мг/мл суспензии диоксида кремния добавляли к 1 x 10⁵ клеток/мл клеток RAW264.7. После инкубации в течение 24 ч клетки промывали PBS 3x, а аутофагия и окислительный стресс обнаруживались с помощью зондов АФК, LC3 и лизосом. В то же время ML385¹⁶, ингибитор NRF2, использовался для ингибирования экспрессии NRF2 (конечная концентрация ML385: 5 мМоль/л). Аутофагия и окислительный стресс были обнаружены в соответствии с вышеуказанными экспериментальными стадиями. Был проведен статистический анализ окислительного стресса и течения аутофагии в обеих группах.

Иммуногистохимический анализ экспрессии VDAC1, CDK1, p62 и NRF2 в тканях аденокарциномы легкого
Экспрессия VDAC1, CDK1, p62 и NRF2 была проверена у 30 пациентов. Ткани с аденокарциномой легкого и прилегающие здоровые ткани были получены из Аффилированной Хуайаньской народной больницы No1 Нанкинского медицинского университета и проанализированы с помощью иммуногистохимии (ИГХ). Статистически проанализированы результаты ИГХ и фиброза легких. Собирайте данные о пациентах в соответствии с информацией о пациенте в больничной системе. Конкретные этапы эксперимента заключаются в следующем: парафиновые срезы депарафинизировали ксилолом и гидратировали градиентным спиртом, а затем проводили ремедиацию антигена в буфере цитрата натрия с pH 6,0 методом термической ремедиации под высоким давлением. Активность эндогенной пероксидазы блокировали 3% раствором перекиси водорода на 20 мин, а затем неспецифический сайт связывания блокировали 5% БСА при комнатной температуре в течение 30 мин. Добавьте первичные антитела NRF2 (1:200), CDK1 (1:400), p62 (1:500) и VDAC1 (1:500) и инкубируйте в течение ночи при 4 °C. После 3-кратной промывки PBS добавьте меченое HRP козье вторичное антитело против кролика (1:500) и инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 ч. Развитие цвета DAB, противоокрашивание гематоксилином, обезвоженное прозрачное, нейтральное герметизация десен. Когда DAB используется для разработки цвета, умеренное развитие цвета должно быть от коричневато-желтого до коричневато-коричневого, а фон должен быть четким. Как чрезмерное (темно-коричневый), так и недостаточное (светло-желтый) развитие цвета требуют оптимизации времени проявления цвета.

Анализ миграции и инвазии клеток
Изучено влияние ML385 и надосадочной жидкости от совместной инкубации диоксида кремния с клетками RAW264.7 на миграцию и инвазию клеток после инкубации с клеточной линией аденокарциномы легкого A549. К клеткам А549 добавляли надосадочную жидкость клеток RAW264.7, совместно культивируемых с диоксидом кремния в течение 24 ч. Ячейки были разделены на группу кремнезема, группу диоксида кремния + ML385 и группу PBS. Группа диоксида кремния: 5 мкл 30 мг/мл суспензии диоксида кремния добавляли к 1 x 10⁵ клеток/мл клеток RAW264.7. После инкубации в течение 24 ч удалите надосадочную жидкость для последующего использования. Группа диоксида кремния+ML385: 5 мкл суспензии диоксида кремния 30 мг/мл и конечная концентрация 5 мМ/л ML385 добавляли к 1 x 10⁵ клеток/мл клеток RAW264.7. После инкубации в течение 24 ч удалите надосадочную жидкость для последующего использования. Группа PBS: 5 мкл PBS добавляли к 1 x 10⁵ клеток/мл клеток RAW264.7. После инкубации в течение 24 ч удалите надосадочную жидкость для последующего использования. Во время скретч-анализа клетки А549 сначала засеивали в 12-луночные планшеты с плотностью 5 х 10⁵ на лунку. После того, как клетки выросли до 95%-100% слияния, на монослойных клетках были сделаны царапины с помощью кончика стерильной пипетки объемом 200 мкл. Отслоившиеся клетки были аккуратно смыты PBS. Впоследствии условия культивирования были изменены для включения 1% основной среды FBS и надосадочной жидкости каждой группы лечения для поддержания жизнеспособности клеток в течение 7-дневного экспериментального периода. Изображения с одинаковым положением были собраны под инвертированным микроскопом через 0 ч (день 0) и на 7-й день (день 7) после царапины соответственно. Наконец, площадь царапины была количественно проанализирована, и скорость закрытия царапин была рассчитана с помощью программного обеспечения ImageJ для оценки влияния надосадочной жидкости из различных групп обработки на миграционную способность клеток A549.

Для инвазионного анализа клеток, проходящих через поры определенного размера, использовалась мембранная камера из поликарбоната размером 8 мкм, при этом мембрана верхней камеры была предварительно покрыта гелем, имитирующим внеклеточную среду, разбавленным в соотношении 1:8 для создания барьера базальной мембраны. Клетки А549 ресуспендировали в суспензии, полученной путем смешивания бессывороточной среды с надосадочной жидкостью каждой группы лечения в соотношении 1:1, а затем инокулировали в верхней камере (2 х 10,⁴ клетки на камеру). В нижней камере в качестве химического аттрактанта добавляли раствор, полученный путем смешивания среды, содержащей 20% FBS, с надосадочной жидкостью соответствующих групп обработки (группа Silica+ML385, группа Silica и группа PBS). Надосадочную жидкость соответствующих групп лечения собирали путем отсасывания через дозатор в RAW264.7 Клеточный фагоцитоз диоксида кремния. После непрерывной инкубации клеток при 37 °C и 5%_CO2 в течение 7 дней неинвазивные клетки в верхней камере удаляли ватными тампонами, а клетки, проникшие через мембрану и достигавшие нижней камеры, фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали 0,1% кристаллического фиолета. Наконец, количество инвазивных клеток было случайным образом выбрано из 5 полей зрения с помощью оптического микроскопа.

Анализ влияния диоксида кремния и ML385 на апоптоз клеток А549 с помощью проточной цитометрии
Препарирование и группировка клеток: Были собраны клетки А549, обработанные надосадочной жидкостью каждой группы лечения (группа PBS, группа диоксида кремния, группа диоксида кремния + группа ML385). Клетки осторожно промывали 2 раза с помощью предварительно охлажденного PBS, затем ресуспендировали в 1x связывающем буфере, и плотность клеток регулировали до 1 x 10⁶ клеток на пробирку/100 мкл. Затем в клеточную суспензию добавляли 5 мкл аннексина V-FITC и 5 мкл окрашивающего раствора PI, осторожно перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут. После инкубации в каждую пробирку добавляли 400 мкл связывающего буфера 1x и сразу же тестировали на машине. Детектирование проводилось с помощью проточного цитометра. Возбуждаемый лазером с длиной волны 488 нм, флуоресцентный сигнал Annexin V-FITC собирался по каналу FITC, а флуоресцентный сигнал PI — по каналу PE. Перед экспериментом для корректировки компенсации флуоресценции с целью устранения спектрального перекрытия использовались образцы с одиночным окрашиванием. При проведении анализа данных сначала определите популяцию клеток-мишеней на диаграмме рассеяния FSC-A/SSC-A и исключите фрагменты. Впоследствии клеточные спайки были исключены с помощью диаграммы рассеяния FSC-H/FSC-A; Наконец, были установлены ворота для различения живых клеток, ранних апоптотических клеток, поздних апоптотических/некротических клеток и механически поврежденных клеток. Данные были получены и проанализированы с помощью программного обеспечения FlowJo V10.

Модель мыши из диоксида кремния
На рисунке 1 мышам вводили диоксид кремния интраназально в дозировке 30 мг/мл и 70 мкл в течение 40 дней подряд, что гарантировало, что у мышей не произошло никаких смертельных случаев и можно было успешно установить мышиную модель с диоксидом кремния. Между тем, мышиный зонд с PBS использовался в качестве отрицательного контроля. Цель состояла в том, чтобы устранить влияние операции и самого растворителя и гарантировать, что фенотип специфически индуцируется диоксидом кремния. Успешная репликация этой модели индуцированного диоксидом кремния повреждения легких обеспечивает необходимую основу in vivo для последующих исследований механизма злокачественного прогрессирования и медикаментозного вмешательства.

Анализ инфильтрации иммунных клеток в узелках мышей, индуцированных диоксидом кремния
На рисунке 2, обнаружив инфильтрацию иммунных клеток в узелках мышей с кремнеземом, было обнаружено, что в узелках наблюдается большое количество инфильтрации иммунных клеток (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ и Nk1.1+), которые участвуют в формировании и развитии болезни легких с кремнеземом. Это указывает на то, что диоксид кремния индуцирует стойкое воспалительное микроокружение опухоли, что является ключевым фактором, способствующим возникновению и развитию опухолей, а также патофизиологической основой для участия пути АФК/NRF2.

Взаимосвязь между фиброзом легких, индуцированным диоксидом кремния, и NRF2, CDK1 и VDAC1 у мышей
При обнаружении экспрессии иммунных молекул в узелках было обнаружено, что NRF2 (ингибирующая мишень ML385), CDK1 (связанная с клеточным циклом) и VDAC1 (участвующая в митохондриальном окислительном стрессе) были высоко экспрессированы вокруг и внутри узелков и были связаны с легочным фиброзом (рис. 3).

Влияние диоксида кремния и ML385 на аутофагию и АФК в клетках RAW264.7
Благодаря совместному культивированию диоксида кремния и клеток RAW264.7 было обнаружено, что диоксид кремния может индуцировать производство аутофагосом. Через 24 ч культивирования ко-локализация аутофагосомы и лизосомы была снижена, поток аутофагии был ингибирован, а также снижена продукция АФК. При добавлении ML385 (ингибитора NRF2 ) усиливалась колокализация аутофагосомы и лизосомы, также усиливался поток аутофагии, и соответственно увеличивалось количество АФК (рис. 4).

Анализ экспрессии VDAC1, CDK1, p62 и NRF2 в ткани аденокарциномы легкого с помощью ИГХ
Как показано на рисунке 5, NRF2 (ингибирующая мишень ML385), CDK1 (связанная с клеточным циклом), VDAC1 (участвующая в митохондриальном окислительном стрессе) и p62 (участвующая в аутофагии) высоко экспрессируются в тканях аденокарциномы легкого и демонстрируют значительные различия по сравнению с соседними тканями.

Влияние ML385 и надосадочной жидкости от совместной инкубации диоксида кремния с клетками RAW264.7 на миграцию и инвазию клеток A549
Диоксид кремния и супернатант клеточных культур RAW264.7 могут способствовать миграции и пролиферации клеток A549, в то время как ML385 может значительно ингибировать эти процессы (как показано на рисунке 6). Этот результат указывает на то, что опухолевый эффект микроокружения макрофагов, индуцированный диоксидом кремния, зависит от пути NRF2 . Ингибирование NRF2 может эффективно блокировать этот опухолевый эффект, тем самым уменьшая злокачественное прогрессирование опухолевых клеток.

Влияние диоксида кремния и ML385 на апоптоз клеток A549
На рисунке 7 показано, что диоксид кремния и супернатант клеточных культур RAW264.7 оказывают определенное ингибирующее действие на апоптоз клеток A549, а ML385 может способствовать апоптозу клеток A549.

Это исследование выявило механистический путь, с помощью которого воздействие диоксида кремния способствует злокачественному прогрессированию аденокарциномы легкого по оси АФК/NRF2/аутофагия с использованием методов in vivo и in vitro . Эксперименты на животных подтвердили, что ключевые молекулы сигнального пути NRF2 значительно активируются в микроокружении легочного фиброза, индуцированного диоксидом кремния. Клеточные эксперименты показали, что диоксид кремния напрямую ингибирует аутофагический поток в макрофагах и снижает уровень АФК, и этот эффект может быть специфически обращен вспять с помощью ингибитора NRF2 ML385. Исследования механизмов показали, что обработанные диоксидом кремния макрофаги способствуют миграции, инвазии и ингибированию апоптоза клеток аденокарциномы легкого за счет секретирующих факторов, и этот опухолевый эффект полностью зависит от активации пути NRF2.

Доступность данных:
Наборы данных, подтверждающие вывод данной статьи, включены в статью.

Рисунок 1: Построение модели кремнезема на мышах. (A) Лечите мышей с помощью назального ингаляции диоксида кремния (30 мг/мл) в различных объемах (10 μл, 30 μл, 50 μл, 70 μл, 90 μл и 200 μл). 20 мышей на одну ингаляционную дозу. (B) Кривая выживаемости мышей. Максимальное количество ингаляции составляет 70 μл/день. (C) Результаты наблюдения за гистопатологическим окрашиванием легких ПЭ у мышей группы диоксида кремния и группы PBS на 3-й день, 14-й день и 40-й день. (D) Статистические результаты по количеству легочных узелков, наблюдаемых у мышей при малом увеличении, t-критерий, ***p <0,001, p = 0,004, t = 10,61 (день 14), p = 0,0006, t = 10,02 (день 40). N = 9. На полосах погрешностей отображается стандартная ошибка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Наблюдение за инфильтрацией иммунных клеток в узловой ткани мышей с помощью флуоресцентного окрашивания. Высокая инфильтрация иммунных клеток (CD3e+, CD8a+, CD86+, F4/80+ и NK1.1+) в узелках легочных узелков, индуцированных диоксидом кремния, у мышей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Анализ взаимосвязи между экспрессиями NRF2, CDK1, VDAC1 и фиброзом, индуцированным диоксидом кремния, с помощью иммуногистохимии (ИГХ) и окрашивания по методу Массона. (A) Экспрессия NRF2, CDK1 и VDAC1, а также результаты окрашивания по методу Массона. (B) Результаты IHC. (C) Статистический анализ легочного фиброза был проведен между группой диоксида кремния и группой мышей PBS. t-критерий, ***p <0,001, p = 0,0002, t = 13,42 (NRF2), p = 0,0008, t = 9,247 (CDK1), p = 0,0009, t = 8,944 (VDAC1), p = 0,0003, t = 11,76 (фиброз легких). N = 9. На полосах погрешностей отображается стандартная ошибка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Влияние диоксида кремния на аутофагию в клетках RAW264.7 и регулирующее аутофагию действие ингибитора NRF2 ML385. (A) После совместной инкубации диоксида кремния с клетками RAW264.7 в течение 24 ч ко-локализация аутофагосом (LC3) и лизосом снизилась (Грин). Однако при добавлении ML385 ко-кализация аутофагосом и лизосом увеличилась (желтый цвет). (B) После совместной инкубации диоксида кремния с клетками RAW264.7 в течение 24 ч АФК, образующийся группой диоксида кремния, уменьшался, но увеличивался после добавления ML385. (C) Статистический анализ АФК и потока аутофагии двух групп, t-критерий, ***p <0,001, p =0,0005, t =10,59 (АФК), p <0,0001, t =17,08 (аутофаголизосома). N = 6. На полосах погрешностей отображается стандартная ошибка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Иммуногистохимический анализ экспрессий VDAC1, CDK1, p62 и NRF2 в тканях аденокарциномы легкого человека. (A) Дифференциальная экспрессия (VDAC1, CDK1, p62 и NRF2) между тканью аденокарциномы легкого человека и прилегающей нераковой тканью. (B) Статистический анализ дифференциальной экспрессии между 30 случаями рака и прилегающими нераковыми тканями из Аффилированной Народной больницы Хуайань No1 Медицинского университета Нанкина, t-критерий, ***p <0,001, p <0,0001, t =8,322 (CDK1), p <0,0001, t =16,4 (NRF2), p <0,0001, t =15,47 (p62), p <0,0001, t = 17,75 (VDAC1). N = 30. На полосах погрешностей отображается стандартная ошибка. (C) Статистический анализ фиброза в ткани аденокарциномы легкого и прилегающей нераковой ткани, t-критерий, ***p <0,001, p =0,0009, t =8,854 (фиброз). N = 30. На полосах погрешностей отображается стандартная ошибка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Влияние ML385 и надосадочной жидкости в результате совместной инкубации диоксида кремния с клетками RAW264.7 на миграцию и инвазию клеток после инкубации с клеточными линиями аденокарциномы легкого A549. (А) Результаты скретчинга клеток на 0-й и 7-й день после совместной инкубации надосадочной жидкости и ML385 с клетками А549. (B) Клеточно-инвазивные результаты на 7-й день после совместной инкубации надосадочной жидкости и ML385 с клетками A549. (В) Проведение статистического анализа по результатам анализа царапин клеток. *p <0,05, **p <0,01. t-критерий, p = 0,0020, t = 22,43 (диоксид кремния + ML385 в сравнении с диоксидом кремния), p = 0,0135, t = 8,510 (кремнезем + ML385 в сравнении с PBS), p = 0,0143, t = 8,281 (диоксид кремния в сравнении с PBS). N = 6. На полосах погрешностей отображается стандартная ошибка. (D) Проведение статистического анализа результатов клеточно-инвазивного анализа. *p <0,05, **p <0,01, t-критерий, p = 0,0097, t = 10,06 (диоксид кремния + ML385 в сравнении с диоксидом кремния), p = 0,0472, t = 4,437 (кремнезем + ML385 в сравнении с PBS), p = 0,0125, t = 8,857 (кремнезем в сравнении с PBS). N = 6. На полосах погрешностей отображается стандартная ошибка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7: Анализ влияния диоксида кремния и ML385 на апоптоз клеток A549 с помощью проточной цитометрии. (A) Определение результатов апоптоза клеток A549 с помощью проточной цитометрии. (Б) Провести статистический анализ процентного соотношения апоптотических клеток. *p <0,05, **p <0,01, t-критерий, p = 0,0013, t = 27,29 (Silica+ML385 против Silica), p =0,0022, t = 6,973 (Silica+ML385 против PBS), p = 0,0048, t = 5,649 (Silica против PBS). N = 6. На полосах погрешностей отображается стандартная ошибка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Авторам нечего раскрывать.