Методическая статья

Количественная флуоресцентная визуализация инфекции альфавирусами для противовирусного скрининга

44 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69384

⸱

14 августа 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1LOEWE Centre for Translational Biodiversity Genomics (LOEWE-TBG), 2Department of Pest and Vector Insect Control, Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources, 3Institute for Insect Biotechnology, Justus-Liebig University, 4BMFTR Junior Research Group in Infection Research "ASCRIBE", Fraunhofer Institute for Molecular Biology and Applied Ecology IME, Branch of Bioresources

* These authors contributed equally

В этой статье

Краткое содержание

В данном материале представлен надежный и адаптируемый протокол для непрерывной визуализации инфекций, вызванных альфавирусами. Этот протокол предлагает метод исследования репликации альфавирусов и оценки эффективности противовирусных соединений на клеточном уровне с помощью флуоресцентной визуализации.

Аннотация

Флуоресцентная микроскопия представляет собой высокочувствительный и универсальный подход к исследованию инфекции альфавирусов на клеточном уровне. Сочетание флуоресцентно меченных вирусов с количественным анализом изображений позволяет детально охарактеризовать пространственную и временную динамику инфекции, включая выявление незначительных различий в кинетике репликации и распространении вируса от клетки к клетке. Основная цель данного протокола заключается в его применении в анализах для скрининга противовирусных препаратов. Количественная оценка интенсивности флуоресценции на основе изображений обеспечивает надежный и воспроизводимый способ оценки эффективности противовирусных соединений, позволяя рано и чувствительно обнаруживать ингибирующие эффекты в инфицированных клетках. Это способствует идентификации перспективных противовирусных соединений и позволяет оценивать дозозависимые ответы. Данный подход также хорошо подходит для сравнительных исследований различных штаммов или мутантов альфавирусов, поскольку различия в поведении репликации и паттернах распространения становятся легко заметными. Гибкость метода, совместимость с различными клеточными линиями и простота интеграции в автоматизированные платформы визуализации делают его масштабируемым и подходящим для кампаний высокопроизводительного скрининга. В целом, данный протокол способствует поиску и оценке противовирусных стратегий. Учитывая, что несколько альфавирусов вызывают серьезные заболевания у людей и животных, не имеют одобренных методов противовирусной терапии и продолжают географически распространяться с возникновением новых вспышек, поиск новых противовирусных средств остается актуальной приоритетной задачей. Таким образом, данный рабочий процесс на основе флуоресценции является ценным и своевременным вкладом в современные исследования альфавирусов.

Введение

Альфавирусы представляют собой имеющие оболочку одноцепочечные РНК-вирусы с положительной полярностью, принадлежащие к семейству Togaviridae1,2,3. Они переносятся преимущественно комарами и являются возбудителями ряда заболеваний у людей и животных. Род альфавирусов включает несколько клинически значимых вирусов, таких как вирус Чикунгунья (CHIKV), вирус Синдбис, вирус восточного equine-энцефалита и вирус венесуэльского equine-энцефалита4,5. Эти патогены вызывают симптомы, варьирующиеся от лихорадочных состояний и сыпи до тяжелых неврологических осложнений6. Особую обеспокоенность вызывает повторное распространение CHIKV как серьезной проблемы общественного здравоохранения. Только с начала 2025 года в 14 странах было зарегистрировано более 220 000 случаев заболевания, что привело к как минимум 80 летальным исходам7. Несмотря на низкий уровень смертности, у значительной части инфицированных людей развиваются хронические боли в суставах, что может привести к долгосрочной инвалидности и ограничению подвижности8. Для разработки стратегий таргетной противовирусной терапии необходимо более глубокое понимание репликации альфавирусов и взаимодействий между патогеном и хозяином. В то же время некоторые альфавирусы, такие как вирус леса Семлики (SFV), обладают низкой патогенностью для человека, несмотря на высокую генетическую и структурную схожесть с более вирулентными представителями рода. Это делает SFV идеальной моделью для изучения альфавирусов, не представляющей высокого риска для здоровья человека9,10,11.

Традиционные методы анализа, такие как метод определения количества бляшек, определение 50% инфекционной дозы для культур тканей (TCID50) и количественная полимеразная цепная реакция (qPCR), представляют собой ценные инструменты для количественной оценки вирусных титров и экспрессии генов, однако они ограничены конечными измерениями и требуют лизиса или фиксации клеток. В результате с их помощью невозможно напрямую отследить динамику инфекции в одних и тех же клетках с течением времени12,13. Чтобы преодолеть эти ограничения, для мониторинга кинетики инфекции в нескольких временных точках применяется флуоресцентная визуализация в режиме реального времени — мощный неразрушающий метод исследования. Использование вирусов с флуоресцентными метками, таких как SFV, меченый mCherry, позволяет напрямую визуализировать и количественно оценивать сигнал репортерного вируса и его распространение в живых клетках14,15. Для описанных здесь экспериментов использовались клеточные линии, широко применяемые в исследованиях арбовирусов. Клетки U4.4, полученные из личинок Aedes albopictus, являются клетками комара, которые поддерживают эффективную репликацию многих арбовирусов и облегчают изучение взаимодействий между вектором и вирусом16,17. Параллельно использовались клетки BHK-21 — фибробластоподобная линия клеток млекопитающих, полученная из ткани почек детеныша хомяка, которая представляет собой пермиссивную систему хозяина-позвоночного, часто применяемую для размножения вирусов и проведения анализов в области молекулярной вирусологии18.

В данном протоколе подробно описываются мониторинг экспрессии вирусных репортеров и характеристика противовирусных соединений на примере ингибиторов фурина. Фурин представляет собой пробелковая конвертаза, которая встречается у многих эукариот и играет ключевую роль в активации предшественников факторов роста, гормонов, матриксных металлопротеиназ, белков плазмы и рецепторов19,20. Многие альфавирусы используют фурин для расщепления и активации своих поверхностных белков, что является критическим этапом для успешной репликации20. Ингибиторы фурина — это синтетически разработанные соединения, которые блокируют активность фурина, тем самым снижая репликацию вируса21,22,23. Ввиду ограниченного наличия стандартизированных протоколов автоматизированного анализа инфекций альфавирусов с помощью флуоресцентной микроскопии на мультимодовом ридере для визуализации клеток, здесь представлен подробный рабочий процесс характеристики противовирусных соединений в клетках aedine. Протокол описывает этапы культивирования клеток, получения вируса, инфицирования, обработки противовирусным соединением (ингибитором фурина), флуоресцентной визуализации и анализа изображений. Тем не менее, описанные здесь методы могут быть легко адаптированы для других вирусов и альтернативных флуоресцентных меток.

Протокол

1. Биологическая безопасность

ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомбинантный вирус леса Семлики с меткой mCherry (SFV-mCherry), используемый в данном протоколе, является генетически модифицированным24,25,26. Внедрение гена флуоресцентного репортера классифицирует его как генетически модифицированный организм, что накладывает дополнительные требования к условиям содержания и нормативному регулированию. Работа с другими альфавирусами, особенно с более патогенными вирусами, такими как CHIKV, может потребовать дополнительных мер изоляции и специальных разрешений.

  1. Очистите бокс биологической безопасности подходящим дезинфицирующим средством и подвергните воздействию УФ-излучения в течение не менее 30 мин до и после проведения вирусных анализов.
  2. Утилизируйте все контаминированные материалы в соответствии с местными правилами биобезопасности. Собирайте твердые и жидкие отходы раздельно в автоклавируемые контейнеры и подвергайте их автоклавированию перед окончательной утилизацией.

2. Приготовление противовирусных соединений

ПРИМЕЧАНИЕ: Ингибиторы фурина MI-113027 (trans-4-(aminomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide), MI-113127 (trans-4-(guanidinomethyl) cyclohexanecarboxyl-arginine-valine-arginine-4-amidinobenzylamide) и MI-114822,23 (4-(guanidinomethyl) phenylacetyl-arginine-tert.-leucine-arginine-4-amidinobenzylamide), использованные в данном исследовании, являются примерами противовирусных соединений, выбранных для тестирования. Ингибитор фурина MI-1148 использовался в качестве отрицательного контроля в анализе цитотоксичности и в качестве положительного контроля в противовирусном анализе.

  1. Растворите противовирусные соединения в подходящем растворителе. По возможности используйте стерильную воду, чтобы избежать цитотоксического эффекта. Диметилсульфоксид или метанол могут быть использованы в концентрации не более 2% (v/v). Рекомендуется использовать стоковые растворы с концентрацией 10 mM в стерильной воде.
  2. Храните стоковые растворы при -20 °C, в зависимости от их стабильности и растворимости, если производителем не указано иное.

3. Культивирование клеток

  1. Культивируйте клетки U4.4 в среде Leibovitz's L-15 с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), 1% незаменимых аминокислот MEM, 1% триптозо-фосфатного бульона, 1% глутамина и 1% пенициллина/стрептомицина (Pen/Strep) (плотность посева: прибл. 1 × 106 клеток/флакон T25, объем культуры: 5 mL). Поддерживайте температуру культивирования 28 °C. Пересевайте клетки U4.4 в соотношении 1:6 один раз в неделю, корректируя плотность посева в соответствии с требованиями эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Другие клеточные линии, такие как клетки C6/36, также совместимы с данным протоколом. При необходимости могут быть использованы альтернативные среды и добавки. Добавление антибиотиков не является обязательным.
  2. Культивируйте клетки почки baby hamster (BHK-21) в модифицированной среде Игла в модификации Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% FBS, 1% глутамина или Статическое равновесие, ΣFx=0, график, анализ баланса сил, диаграмма механической устойчивости.‑аланил‑Статическое равновесие, ΣFx=0, график, анализ баланса сил, диаграмма механической устойчивости.‑глутамина и 1% Pen/Strep (плотность посева: прибл. 1 × 106 клеток/флакон T75, объем культуры: 10 mL). Поддерживайте клетки при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO2. Пересевайте клетки в соотношении 1:12 каждые 4-5 дней, при необходимости корректируя плотность посева.
  3. Убедитесь, что клетки остаются жизнеспособными и активно пролиферируют.

4. Получение вируса

  1. Приготовление стоков SFV-mCherry (SFV6-2SG-mCherry) в клетках BHK-21.
    1. Культивируйте клетки BHK-21 (плотность посева: прибл. 1 × 105 клеток/лунку, объем культуры: 500 µL) в прозрачном 24-луночном планшете для культивирования клеток в условиях, описанных выше.
    2. При достижении примерно 90% конфлюэнтности (целевая конфлюэнтность: прибл. 2 × 105 клеток) трансфицируйте клетки BHK-21 плазмидой SFV6-2SG-mCherry с использованием реагента для трансфекции в инфекционной среде (DMEM с добавлением 1% Pen/Strep и 0,2% бычьего сывороточного альбумина). Для этого разведите 1 µL реагента для трансфекции в 25 µL среды с пониженным содержанием сыворотки.
    3. В отдельной пробирке разведите 0,5 µg плазмидной ДНК и 1 µL запатентованной добавки в 25 µL среды с пониженным содержанием сыворотки. Добавьте разведенный раствор ДНК к раствору с разведенным реагентом для трансфекции и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре. Затем добавьте 50 µL полученного комплекса к клеткам.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Могут быть использованы другие реагенты для трансфекции, при условии их совместимости с данной клеточной линией; инструкции могут меняться в зависимости от используемого реагента.
    4. Через 48 ч после трансфекции соберите супернатант, содержащий вирус, с помощью пипетки, разлейте по 250 µL в пробирки, не содержащие ДНК/РНК, и храните при -80 °C.
  2. Титрование методом определения TCID50.
    1. Культивируйте клетки BHK-21 (плотность посева: прибл. 2 × 104 клеток/лунку, объем культуры: 100 µL) в черном 96-луночном планшете для имиджинга в условиях, описанных выше.
    2. Разморозьте аликвоту вируса, приготовьте десятикратные серийные разведения образца вируса в инфекционной среде (15 µL образца вируса + 135 µL инфекционной среды), удалите старую среду и добавьте по 100 µL разведений к клеткам.
    3. Инкубируйте клетки в течение 1 ч при 37 °C в увлажненном инкубаторе с содержанием 5% CO₂, после чего замените инокулят 100 µL свежей инфекционной среды.
    4. Через 48 ч после инфицирования (hpi) оцените репликацию вируса путем измерения флуоресценции с помощью мультимодального планшетного ридера для имиджинга (подробное описание в разделе 7) и определите цитопатический эффект, вызванный вирусной инфекцией. Рассчитайте значение TCID50 по методу Рида-Мюнча28 и переведите в расчетные вирусные титры (PFU/mL), используя стандартное приближение на основе распределения Пуассона, согласно которому 1 TCID50 соответствует 0,7 PFU.

5. Определение цитотоксичности

  1. Культивируйте клетки U4.4 (плотность посева: прибл. 3 × 104 клеток/лунку, объем культуры: 100 µL) в прозрачном 96-луночном планшете для культивирования клеток в условиях, описанных выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внешние лунки (ряды A и H; столбцы 1 и 12) также засевали клетками, но исключали из экспериментального анализа во избежание краевых эффектов, включая повышенное испарение.
  2. При достижении 90% конфлюэнтности (целевая конфлюэнтность: прибл. 6 × 104 клеток) обработайте клетки ингибиторами фурина MI-1130 и MI-1131 в концентрациях 100, 50, 25 и 12,5 µM в общем объеме 100 µL. В качестве отрицательного контроля используйте MI-1148 (в тех же концентрациях, что и MI-1130 и MI-1131), необработанные клетки и клетки, обработанные водой; в качестве положительного контроля цитотоксичности используйте иономицин (100 µM в анализе).
  3. Через 48 ч после обработки (hpt) оцените жизнеспособность клеток с помощью люминесцентного анализа, основанного на количественном определении ATP. Добавьте в каждую лунку равный объем реагента для люминесцентного анализа (1:1 по отношению к культуральной среде), встряхивайте планшет в течение 2 мин для обеспечения лизиса клеток и инкубируйте в течение 10 мин в темноте перед измерением люминесценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Также могут быть использованы другие методы анализа жизнеспособности клеток, основанные на иных принципах детекции.
  4. Зафиксируйте показатели люминесценции в черном или белом 96-луночном планшете с помощью мультимодального ридера.

6. Вирусное заражение и обработка противовирусным соединением

  1. Культивируйте клетки U4.4 (плотность посева: прибл. 3 × 104 клеток/лунку, объем среды: 100 µL) в черном 96-луночном планшете для имиджинга в условиях, описанных выше.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Внешние лунки (ряды A и H; столбцы 1 и 12) засеивались клетками, но исключались из экспериментального анализа во избежание краевых эффектов, включая повышенное испарение.
  2. Инфицируйте клетки (целевая плотность: прибл. 6 × 104 клеток) вирусом SFV-mCherry с множественностью заражения (MOI) 0,01 в среде L-15 без добавок, используя объем инокулята 100 µL, и инкубируйте в течение 1 ч при 28 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следует использовать только стоки репортерного вируса с низким числом пассажей, особенно при работе с очень низкими значениями MOI и многодневным инфицированием.
  3. Разведите ингибиторы фурина MI-1130, MI-1131 и MI-1148 до конечных концентраций 100, 50, 25 и 12,5 µM в отдельном 96-луночном V-образном планшете, используя среду L-15 с добавками. Приготовьте по 110 µL на лунку (с учетом 10% избытка) и перенесите 100 µL (конечный объем) на клетки. В качестве контролей используйте инфицированные клетки, обработанные растворителем противовирусных соединений, и инфицированные клетки, содержащие только вирус, в качестве отрицательного контроля. Также необходимо добавить неинфицированные необработанные клетки для измерения фоновой флуоресценции.
  4. По истечении 1 ч периода инфицирования удалите инокулят и перенесите 100 µL разведенных ингибиторов фурина из V-образных планшетов в черные планшеты для имиджинга.
  5. Инкубируйте клетки при 28 °C.

7. Флуоресцентная визуализация живых клеток, количественный анализ изображений и представление данных

  1. Измерение экспрессии вирусного репортера с помощью флуоресцентной микроскопии (см. Supplementary Figure 1, Supplementary Figure 2, Supplementary Figure 3, Supplementary Figure 4, Supplementary Figure 5, Supplementary Figure 6 и Supplementary Figure 7 для настройки программы).
    1. Через 24 и 48 ч после инфицирования (hpi) окрасьте ядра клеток, добавив в каждую лунку 8 µL проникающего в клетку раствора ядерного контраст-красителя. Инкубируйте в течение 30 мин при 28 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мониторинг инфекции можно проводить в нескольких временных точках. Однако измерения через 48 ч после инфицирования обеспечивают наиболее сильный сигнал (см. Supplementary Figure 8) и позволяют наиболее надежно оценить противовирусные эффекты. Считывание данных через 24 ч или в промежуточные временные точки возможно, но продление инкубации свыше 48 ч повышает риск избыточного роста клеток. Выберите соответствующую степень конфлюэнтности клеток в начале эксперимента, чтобы клетки не переросли к выбранному моменту считывания. Это позволит избежать препятствий для точного подсчета клеток.
    2. После инкубации (в дополнение к прозрачной крышке) накройте верхнюю часть планшета прозрачной герметизирующей фольгой в целях безопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании устройства для получения изображений крайне важно выбрать правильный тип планшета. Параметры освещения, время интегрирования и усиления будут различаться в зависимости от репортерного гена. Настоятельно рекомендуется провести предварительные измерения для определения оптимальных параметров. Начальные настройки освещения, интегрирования и усиления, использованные для разработки протокола в данных условиях, приведены на Supplementary Figure 2, где подробно описана настройка программы.
    3. Получите изображения всей лунки, используя метод сшивания изображений (четыре поля на лунку при 4-кратном увеличении) с помощью мультимодального ридера.
    4. Измерьте интенсивность красной флуоресценции, используя фильтр-куб Texas Red (возбуждение: 586/15 nm; эмиссия: 647/57 nm).
    5. Определите общее количество клеток в канале DAPI со следующими настройками (возбуждение: 377/50 nm; эмиссия: 447/60 nm).
  2. Количественный анализ изображений (см. Supplementary Table 1 для получения исходных данных).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения флуоресценции использовался ридер для получения изображений микропланшетов. Подробные параметры, использованные в данном анализе, можно найти на Supplementary Figure 2.
    1. Обработайте изображения с помощью соответствующего программного обеспечения для анализа изображений.
    2. На панели сокращения данных выберите «Image Stitching» (сшивание изображений) для каналов DAPI и Texas Red, чтобы создать единое изображение лунок.
    3. Добавьте функцию «Image Statistics» (статистика изображений) и выберите «Total intensity» (общая интенсивность) для сшитого канала Texas Red. Примените функцию «Image Preprocessing» (предварительная обработка изображений) для удаления фонового шума в сшитом канале DAPI.
    4. Выполните «Cellular Analysis» (клеточный анализ) для предварительно обработанного сшитого канала DAPI.
    5. Рассчитайте среднюю интенсивность красной флуоресценции на одну клетку, вычтя среднюю флуоресценцию неинфицированных, необработанных контрольных лунок из значений каждой обработанной лунки, а затем разделив результат на общее количество клеток в соответствующей лунке.
  3. Поиск и устранение неисправностей
    1. Следите за стабильностью фокусировки во время измерения, особенно при длительном получении изображений или при использовании термочувствительных планшетов.
    2. Включите автофокус и увеличьте частоту его срабатывания при обнаружении дрейфа фокуса. Если дрейф сохраняется, снизьте скорость получения изображений или дайте планшетам уравновеситься по температуре с прибором перед началом съемки.
    3. Используйте планшеты для имиджинга, чтобы обеспечить стабильное качество сигнала при получении изображений. Предотвращайте перетекание сигнала (bleed-through) и переэкспозицию, избегая избыточного освещения и слишком длительного времени интегрирования.
    4. Снизьте интенсивность возбуждения, сократите время интегрирования или уменьшите усиление до тех пор, пока не будет исключено насыщение сигнала. Убедитесь, что каналы флуорофоров хорошо разделены, и при необходимости отрегулируйте настройки фильтров.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перетекание сигнала между DAPI и mCherry обычно низкое, но зависит от используемой репортерной конструкции (например, GFP).
    5. Избегайте чрезмерной конфлюэнтности клеток для поддержания правильной кинетики инфекции и чувствительности анализа. При возникновении избыточной конфлюэнтности сократите время инкубации перед измерением.
    6. Контролируйте влияние красителей на жизнеспособность клеток и качество сигнала, особенно при высоких концентрациях. Снизьте концентрацию красителя или сократите время инкубации при обнаружении токсичности красителя или перенасыщенного фона.
    7. Готовьте и храните красители в соответствии с рекомендациями производителя для поддержания стабильности сигнала.

Результаты

В данной работе представлен детальный протокол мониторинга распространения альфавирусов и оценки противовирусных соединений (например, ингибиторов фурина) с использованием флуоресцентной микроскопии в формате многолуночного планшета. Чтобы продемонстрировать визуализацию ингибирующего воздействия на экспрессию вирусного репортера, для тестирования в клеточной линии aedine U4.4 были выбраны три ранее синтезированных ингибитора фурина: MI-1148, MI-1130 и MI-1131. Обзор хода эксперимента представлен на рисунке 1.

Перед оценкой противовирусной эффективности крайне важно оценить цитотоксичность, чтобы убедиться, что любое снижение репликации вируса не является следствием гибели клеток под воздействием соединения. Следовательно, клетки U4.4 при 90% конфлюэнтности обрабатывали ингибиторами в концентрациях 100, 50, 25 или 12,5 µM. В качестве отрицательного контроля использовали необработанные клетки и клетки, обработанные водой (контроль растворителя), а в качестве положительного контроля — иономицин. Жизнеспособность клеток оценивали через 48 ч после обработки с помощью люминесцентного анализа, основанного на количественном определении ATP. Для протестированных ингибиторов фурина значимого снижения жизнеспособности клеток не наблюдалось (Рисунок 2).

Ввиду отсутствия цитотоксичности, соединения были впоследствии протестированы на противовирусную активность. Для этого клетки U4.4 заражали SFV-mCherry в течение 1 ч, после чего обрабатывали теми же ингибиторами фурина в тех же концентрациях. Инфицированные необработанные клетки и инфицированные клетки, обработанные водой, служили отрицательным контролем противовирусной активности, а неинфицированные необработанные клетки использовались для оценки фоновой флуоресценции. Через 48 ч после обработки экспрессию вирусного репортера количественно определяли с помощью флуоресцентной микроскопии. Перед визуализацией в каждую лунку добавляли 8 µL проникающего в клетку раствора ядерного контраст-красителя и инкубировали в течение 30 мин для окрашивания ядер клеток. Сигнал красной флуоресценции, соответствующий экспрессии вирусного репортера, и общее количество ядер подсчитывали по обработанным флуоресцентным изображениям. Среди протестированных ингибиторов MI-1148 продемонстрировал выраженную противовирусную активность, значительно снижая экспрессию вирусного репортера дозозависимым образом (Рисунок 3). Напротив, MI-1130 и MI-1131 не показали заметного ингибирования экспрессии вирусного репортера ни при одной из протестированных концентраций. Исходные данные и анализ противовирусного теста представлены в Дополнительной таблице 1.

Представленные результаты демонстрируют, что данный протокол надежно выявляет соединения с противовирусной активностью, о чем свидетельствует значительное снижение сигнала репортера, наблюдаемое при использовании MI-1148. Напротив, ингибиторы MI-1130 и MI-1131 не снижали экспрессию репортера; это указывает на то, что их мощное ингибирование фурина, отраженное пикомолярными константами ингибирования, не привело к проявлению противовирусной активности в данных условиях (Рисунок 4). Эти данные подчеркивают способность анализа дифференцировать активные соединения от неактивных и поддерживать идентификацию эффективных и релевантных ведущих структур.

Процесс антивирусного скрининга; культура клеток, вирусное заражение, обработка соединениями; график анализа данных.
Рисунок 1: Схема экспериментального процесса. Схематический обзор процедуры эксперимента, использованной для оценки антивирусной активности ингибиторов фурина в клеточной линии U4.4 комаров рода Aedes. Рабочий процесс включает подготовку соединений, посев клеток, заражение вирусом Семелики-Форест с mCherry-меткой, обработку соединениями, флуоресцентную микроскопию для визуализации в реальном времени и количественное определение экспрессии вирусного репортера. Данная иллюстрация была создана с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Столбчатая диаграмма жизнеспособности клеток, сравнение концентраций препаратов; воздействие MI-1148, MI-1130, MI-1131.
Рисунок 2: Цитотоксическое действие ингибиторов фурина в клетках U4.4. При достижении примерно 90% конфлюэнтности клетки U4.4 подвергали воздействию MI-1148, MI-1130 и MI-1131 в концентрациях 100, 50, 25 и 12.5 µM. В качестве отрицательного контроля использовали необработанные клетки и клетки, обработанные водой, а в качестве положительного контроля — иономицин (100 µM). Через 48 ч после обработки жизнеспособность клеток оценивали путем количественного определения ATP. Данные были нормализованы относительно необработанного контроля и выражены в процентах (%). Представлена средняя жизнеспособность клеток (n=3), планки погрешностей соответствуют коэффициенту вариации. Пунктирная линия обозначает порог цитотоксичности, установленный на уровне 80%. n.d. = не определяется. Визуализация данных выполнена с помощью GraphPad Prism v9.5.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Столбчатая диаграмма интенсивности красного свечения клеток в зависимости от концентрации препарата; статистический анализ соединений серии MI.
Рисунок 3: Противовирусная активность ингибиторов фурина против вируса леса Семлики (SFV), меченого mCherry, в клеточной линии Aedes U4.4. При слиянии клеток примерно 90% их инфицировали SFV-mCherry в течение 1 ч, после чего обрабатывали MI-1148, MI-1130 и MI-1131 в концентрациях 100, 50, 25 и 12.5 µM. Через 48 ч после обработки экспрессию вирусного репортера количественно определяли с помощью флуоресцентной микроскопии. Перед визуализацией в каждую лунку добавляли 8 µL проникающего в клетку раствора ядерного контрастного красителя и инкубировали в течение 30 мин для окрашивания ядер клеток. Флуоресцентные изображения получали с использованием фильтра Texas Red для вирусного сигнала и фильтра DAPI для ядер. Был проведен анализ изображений для количественного определения общей интенсивности красной флуоресценции (указывающей на репликацию вируса) и общего количества клеток в лунке. Данные (n = 4) представлены как общая интенсивность красного свечения на клетку (общий вирусный сигнал / общее количество клеток). Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению. Статистическая значимость по сравнению с контролем, инфицированным SFV, определена с помощью однофакторного ANOVA и множественного теста Даннетта: **** = P<0.0001; ns = P>0.05. Представление данных и статистический анализ выполнялись с помощью GraphPad Prism v9.5.1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Микроскопические изображения культур клеток, инфицированных SFV, при различных концентрациях, демонстрирующие уровни инфицирования.
Рисунок 4: Репрезентативные флуоресцентные изображения, демонстрирующие противовирусную активность ингибиторов фурина против вируса Семилики-Форест (SFV) с mCherry-меткой в клеточной линии Aedes U4.4. Клетки при слиянии примерно 90% инфицировали SFV-mCherry в течение 1 ч, после чего обрабатывали MI-1148, MI-1130 и MI-1131 в концентрациях 100, 50, 25 и 12.5 µM. Инфицированные необработанные клетки и инфицированные клетки, обработанные водой, служили отрицательным контролем, а неинфицированные необработанные клетки использовались в качестве фонового контроля. Репортерный сигнал оценивали через 48 ч после обработки с помощью флуоресцентной микроскопии, используя фильтр Texas Red для захвата сигнала mCherry. Масштабная линейка = 2000 µm. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица 1: Необработанные данные общей интенсивности вирусного сигнала и количества клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 1: Этапы процедуры, использованные в системе считывания изображений для получения репрезентативных результатов. Сначала устанавливается температура (красный цвет), соответствующая условиям культивирования клеток U4.4. Затем следуют три независимых этапа действий с изображениями (оранжевый цвет) для измерений DAPI, Texas Red и в светлом поле. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная фигура 2: Настройки изображения в этапах процедуры, использованные на сканере для получения репрезентативных результатов. Первыми настраиваются следующие параметры: увеличение (4x) и размер изображения (Full WFOV). Необходимо выбрать измеряемый флуорофор, а также соответствующим образом изменить параметры освещения (Illumination), времени интеграции (Integration time) и усиления (Gain). В завершение необходимо выбрать монтаж изображения (2x2) и перекрытие (30 µm x 30 µm). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная фигура 3: Этапы редукции данных, использованные в программе для анализа изображений для получения репрезентативных результатов. Первым этапом является сшивка изображений (синий цвет) для каналов DAPI и Texas Red. Вторым этапом — расчет статистики изображений (фиолетовый цвет) для определения общей интенсивности. Затем необходим этап предварительной обработки изображений (зеленый цвет) для удаления фонового шума в канале DAPI. Наконец, проводится клеточный анализ (желтый цвет) сшитого предварительно обработанного изображения DAPI. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Сшивка изображений на этапах обработки данных, использованных в программном обеспечении для чтения изображений при получении репрезентативных результатов. Наиболее важным параметром является масштабирование конечного изображения (80%), так как более низкое значение влияет на разрешение изображения и, следовательно, на итоговое измерение параметров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 5: Статистика изображений на этапах редукции данных, использованных при считывании изображений для получения репрезентативных результатов. Важно выбрать правильный канал (Stitched: Fluorophore), установить минимальный порог (2500) и, наконец, параметр для измерения (Total Intensity). Для более точного измерения можно создать Image Plug. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 6: Предобработка изображений на этапах сокращения объема данных, использованных в считывателе изображений для получения репрезентативных результатов.Наиболее важным параметром является радиус «катящегося шара» (30 µm), что позволяет приоритетно выделить мелкие детали. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 7: Клеточный анализ на этапах редукции данных, использованных в программе для анализа изображений для получения репрезентативных результатов. Важно выбрать канал с предварительно обработанным изображением. Следует выбрать разделение соприкасающихся объектов и заполнение отверстий с помощью масок. Критически важно выбрать правильный диапазон размера объектов (5-50 µm). Наконец, для уточнения результатов можно применить плагин для обработки изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительная фигура 8: Противовирусная активность ингибиторов фурина против вируса леса Семилики (SFV) с меткой mCherry в клеточной линии комаров Aedes U4.4. При достижении примерно 90% конфлюэнтности клетки инфицировали SFV-mCherry в течение 1 ч, после чего обрабатывали MI-1148, MI-1130 и MI-1131 в концентрациях 100, 50, 25 и 12,5 µM. Через 24 ч (красные столбцы) и 48 ч (зеленые столбцы) после обработки количественно определяли экспрессию вирусного репортера с помощью флуоресцентной микроскопии. Планки погрешностей соответствуют стандартному отклонению (n = 4). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

Возможность наблюдения за репликацией альфавируса в режиме реального времени дает последовательную и накопительную перспективу по сравнению с традиционными тестами с конечной точкой. Данный протокол многократной визуализации живых клеток является полезной моделью для изучения альфавирусов, так как он предоставляет динамическую платформу для наблюдения за распространением вируса.

Успех данного протокола зависит от нескольких параметров. Во-первых, важно оценить цитотоксичность соединений перед проведением противовирусного анализа, чтобы исключить ложноположительные результаты, вызванные гибелью клеток. После оценки цитотоксических эффектов можно приступать к анализу противовирусной активности соединений. Для исследуемых соединений цитотоксичности не наблюдалось. MI-1130 и MI-1131 не оказали значительного влияния на экспрессию вирусного репортера, в то время как MI-1148, использованный в качестве положительного контроля, эффективно подавлял ее. Кроме того, решающее значение имеет время инфицирования относительно посева клеток. Клетки должны достичь достаточной конфлюэнтности для обеспечения воспроизводимого заражения без избыточного разрастания. Также важно оптимизировать множественность заражения в зависимости от клеточной линии, чтобы наблюдать постепенное инфицирование, не нарушая жизнеспособность клеток. Наконец, необходимо тщательно определить частоту получения изображений, чтобы визуализировать постепенную экспрессию вирусного репортера без резких скачков. Для большинства применений получение изображений, например, каждые восемь часов обеспечивает эффективный баланс между временной детализацией и целостностью образцов.

Главным преимуществом данного протокола является его адаптивность. В этом эксперименте мы использовали SFV-mCherry и клетки U4.4, чтобы продемонстрировать мониторинг экспрессии вирусного репортера и ее ингибирование после обработки ингибиторами фурина. Тем не менее, протокол может быть оптимизирован для флуоресцентного анализа других вирусов с иными репортерными маркерами, такими как GFP, а также других типов клеток-хозяев, включая первичные клетки и дифференцированные клеточные линии. Хотя данный протокол сосредоточен на воздействии соединений после инфицирования, рабочий процесс может быть легко адаптирован для экспериментов по времени добавления (time-of-addition), включая предварительную обработку, совместную обработку, обработку сразу после инфицирования или отложенную обработку, чтобы дополнительно изучить механизм противовирусного действия. Первоначально этот протокол использовался для сравнения функциональности аппарата РНК-интерференции в клетках C6/36 и U4.414. В дальнейшем он был расширен для изучения того, как дсРНК, напрямую нацеленная на вирус, подавляет экспрессию вирусного репортера15.

При использовании данного протокола могут возникнуть определенные сложности. Репортерные вирусы, несмотря на их высокую полезность для многочисленных применений in vivo29 и in vitro30, могут также демонстрировать пониженную вирулентность31 и генетическую нестабильность репортерных генов32. Отслоение клеток, вызванное чрезмерной конфлюэнтностью, может препятствовать четкой визуализации и получению изображений, что повлияет на подсчет клеток. Длительное воздействие красителей для живых клеток (например, Hoechst 33342 для ядер) может изменить поведение или жизнеспособность клеток15. Кроме того, эксперименты с высокопатогенными альфавирусами, такими как CHIKV, могут потребовать более строгих мер биобезопасности и соответствующей адаптации протокола. Кроме того, в некоторых случаях может наблюдаться дрейф фокуса из-за вариативности планшетов, а также вследствие использования планшетов разных типов. Например, флуоресцентные сигналы в прозрачных планшетах для культивирования клеток могут проникать из лунок в соседние, а белые планшеты могут вызвать переэкспозицию. В обоих случаях это повлияет на точность измерения флуоресцентного сигнала.

Данный протокол обладает несколькими преимуществами перед традиционными вирусологическими методами анализа. Например, метод определения количества бляшек и анализ TCID50 предоставляют конечные данные о титрах вируса12. Более того, qPCR обеспечивает чувствительное обнаружение вирусной РНК, однако этот метод не позволяет отличить репликационно-компетентные вирусы от неинфекционных вирусных частиц или остаточных нуклеиновых кислот. Напротив, подобная флуоресцентная визуализация живых объектов позволяет проводить непрерывную неинвазивную оценку прогрессирования вируса, его распространения и эффектов лечения в одной и той же популяции клеток с течением времени.

Помимо изучения ингибиторов фурина в качестве противовирусных соединений, наш протокол может быть адаптирован для других целей. Он особенно well-suited для скрининга противовирусных препаратов, позволяя количественно определить дозозависимые ответы на различные соединения. Он представляет собой платформу для изучения взаимодействий между хозяином и патогеном, включая время и локализацию проникновения, репликации и распространения вируса. Его можно использовать для сравнения репортерных вирусов, различных штаммов или разных альфавирусов. Кроме того, его можно сочетать с такими подходами, как нокдаун генов с использованием siRNA или dsRNA. Таким образом, эта система может помочь в идентификации и валидации критических мишеней и противовирусных соединений, влияющих на репликацию вируса. Однако данный флуоресцентный анализ представляет собой метод первичного скрининга, а не самостоятельный подтверждающий метод; для обоснования результатов скрининга потребуются дальнейшие исследования, включая анализы с вирусами дикого типа.

Раскрытие информации

Авторы не заявляют о наличии конфликта интересов.

Благодарности

Мы выражаем благодарность проф. др. Андресу Меритсу из Тартуского университета (Эстония) и проф. др. Андреасу Пихльмайеру из Мюнхенского технического университета (Германия) за предоставление pCMV-SFV6-2SG-mCherry. Мы благодарим проф. др. Стефани Беккер из Университета ветеринарной медицины в Ганновере (Германия) за клетки C6/36. Мы благодарим проф. др. Торстена Штайнметцера из Марбургского университета (Марбург, Германия) за предоставление ингибиторов фурина. Данная работа была поддержана программой Landes-Offensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz Министерства высшего образования, исследований и искусств Гессе через Центр трансляционной геномики биоразнообразия LOEWE (LOEWE-TBG) под кодом финансирования LOEWE/1/10/519/03/03.001(0014)/52, а также BMFTR (проект ASCRIBE, грант № 01KI2024).

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Альбумин бычий, фракция V, pH 7,0Электрофорез SERVA11930.03
DMEM BenchStableThermo Fisher ScientificA4192101
клетки BHK-21CLS Cell Lines Service GmbH, Эппельхайм, Германия603126
ФЛАКОН ДЛЯ КУЛЬТУРЫ КЛЕТОК, 50 МЛ, 25 см2ПС, крышка с красным фильтром, прозрачный, CELLSTAR, TC, стерильныйGreiner Bio-One690175
Микропланшет для культивирования клеток, 24 лунки, ПС, F-дно (с «дымоходом»), прозрачный, CELLSTAR, TC, крышка с конденсационными кольцами, стерильныйGreiner Bio-One662160
Микропланшет для культивирования клеток, 96 лунок, ПС, плоское дно (с «камином»), µПРОЗРАЧНЫЙ, черный, CELLSTAR, для культивирования клеток (TC), крышка с конденсационными кольцами, стерильнаяGreiner Bio-One655090
Микропланшет для культивирования клеток, 96-луночный, ПС, с F-дном (с высоким бортом лунки), прозрачный, CELLSTAR, TC, с крышкой с конденсационными кольцами, стерильныйGreiner Bio-One655180
Микропланшет для культивирования клеток, 96-луночный, ПС, с V-образным дном, прозрачныйGreiner Bio-One651101
Клеточный скребокVWR734-2602
Люминесцентный анализ жизнеспособности клеток CellTiter-GloPromegaG7573
Мультимодальный ридер для анализа изображений клеток Cytation 5Biotek
фильтр-куб DAPI 1225100Biotekвозб. 377/50 нм; ис. 447/60 нм
модифицированная среда Игла в модификации Дюльбекко (DMEM GlutaMAX)Thermo Fisher ScientificA4192102
Фетальная бычья сывороткаFisher Scientific11550356
Ингибитор фурина MI-1130Данное исследование
Ингибитор фурина MI-1131Данное исследование
Ингибитор фурина MI-1148Hardes et al. 2015.  К сожалению, вы предоставили только ссылку на статью (DOI). Для того чтобы я мог выполнить профессиональный перевод в соответствии с вашими требованиями, пожалуйста, пришлите текст статьи, который необходимо перевести. 
Программное обеспечение Gen5 PrimeBiotek
соль кальция иономицина, 99%Thermo Fisher ScientificJ60628
среда Лейбовица L-15, добавка GlutaMAX Thermo Fisher Scientific31415029
Реагент для трансфекции Lipofectamine 3000Thermo Fisher ScientificL3000001
неessential аминокислоты MEM (100x)Thermo Fisher Scientific11140050
Микропланшет, ПС, 96-луночный, с F-образным дном (с «колонками»), черный, Fluotrac, средняя адсорбцияGreiner Bio-One655076
Реагент NucBlue Live ReadyProbes (Hoechst 33342)Thermo Fisher ScientificR37605
Opti-MEMThermo Fisher Scientific31985062
Пенициллин-стрептомицин (10 000 Ед/мл)Thermo Fisher Scientific15140122
SFV6–2SG-mCherryПроф., др. Андрес Меритс (Тартуский университет, Эстония) и проф., др. Андреас Пихльмайр (Мюнхенский технический университет, Германия)
фильтр-куб Texas Red 1225102 Biotekвозб.: 586/15 нм; исп.: 647/57 нм
Триптозо-фосфатный бульон Thermo Fisher Scientific18050039
клетки U4.4Институт Фридриха Лёффлера, Федеральный научно-исследовательский институт здоровья животных, Грайфсвальд, Германия
Герметик Viewseal, прозрачныйGreiner Bio-One676070

Ссылки

  1. Powers, A. M. Togaviruses: Alphaviruses. eLS. , (2014).
  2. Shaw, A. R., Feinberg, M. B. Vaccines. Clinical Immunology. , Elsevier. (2008).
  3. Gould, E. A., et al. Understanding the alphaviruses: recent research on important emerging pathogens and progress towards their control. Antiviral Research. 87 (2), 111-124 (2010).
  4. Lim, E. X. Y., Lee, W. S., Madzokere, E. T., Herrero, L. J. Mosquitoes as suitable vectors for alphaviruses. Viruses. 10 (2), (2018).
  5. de Caluwé, L., Ariën, K. K., Bartholomeeusen, K. Host factors and pathways involved in the entry of mosquito-borne alphaviruses. Trends in Microbiology. 29 (7), 634-647 (2021).
  6. Adizie, T., Adebajo, A. O. Travel- and immigration-related problems in rheumatology. Best practice & research. Clinical Rheumatology. 28 (6), 973-985 (2014).
  7. ECDC Chikungunya virus disease worldwide overview: Situation update. , (2025).
  8. Paixão, E. S., et al. Chikungunya chronic disease: a systematic review and meta-analysis. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 112 (7), 301-316 (2018).
  9. Atkins, G. J., Sheahan, B. J., Liljeström, P. The molecular pathogenesis of Semliki Forest virus: a model virus made useful. The Journal of General Virology. 80 (Pt 9), 2287-2297 (1999).
  10. Contu, L., Balistreri, G., Domanski, M., Uldry, A. -C., Mühlemann, O. Characterisation of the Semliki Forest Virus-host cell interactome reveals the viral capsid protein as an inhibitor of nonsense-mediated mRNA decay. PLoS Pathogens. 17 (5), (2021).
  11. Teppor, M., et al. Semliki Forest virus chimeras with functional replicase modules from related alphaviruses survive by adaptive mutations in functionally Important Hot Spots. Journal of Virology. 95 (20), (2021).
  12. Smither, S. J., et al. Comparison of the plaque assay and 50% tissue culture infectious dose assay as methods for measuring filovirus infectivity. Journal of Virological Methods. 193 (2), 565-571 (2013).
  13. Shan, L., Yang, D., Wang, D., Tian, P. Comparison of cell-based and PCR-based assays as methods for measuring infectivity of Tulane virus. Journal of Virological Methods. 231, 1-7 (2016).
  14. Omokungbe, B., et al. Gene silencing in the aedine cell lines C6/36 and U4.4 using long double-stranded RNA. Parasites & Vectors. 17 (1), 255(2024).
  15. Centurión, A., Omokungbe, B., Stiehler, S., Vilcinskas, A., Hardes, K. Inhibition of Semliki Forest virus replication with long double-stranded RNA in Aedes albopictus cells. Virus Research. 357, 199584(1995).
  16. Weger-Lucarelli, J., et al. Adventitious viruses persistently infect three commonly used mosquito cell lines. Virology. 521, 175-180 (2018).
  17. Attarzadeh-Yazdi, G., et al. Cell-to-cell spread of the RNA interference response suppresses Semliki Forest virus (SFV) infection of mosquito cell cultures and cannot be antagonized by SFV. Journal of Virology. 83 (11), 5735-5748 (2009).
  18. Gahmberg, C. G., Simons, K. Isolation of plasma membrane fragments from BHK21 cells. Acta pathologica et microbiologica Scandinavica. Section B: Microbiology and immunology. 78 (2), 176-182 (1970).
  19. Thomas, G. Furin at the cutting edge: from protein traffic to embryogenesis and disease. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 3 (10), 753-766 (2002).
  20. Garten, W. Characterization of proprotein convertases and their involvement in virus propagation. Activation of Viruses by Host Proteases. , Springer. Cham. 205-248 (2018).
  21. Becker, G. L., Hardes, K., Steinmetzer, T. New substrate analogue furin inhibitors derived from 4-amidinobenzylamide. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 21 (16), 4695-4697 (2011).
  22. Hardes, K., et al. Novel furin inhibitors with potent anti-infectious activity. ChemMedChem. 10 (7), 1218-1231 (2015).
  23. Hardes, K., et al. Elongated and shortened peptidomimetic inhibitors of the proprotein convertase furin. ChemMedChem. 12 (8), 613-620 (2017).
  24. Pennemann, F. L., et al. Cross-species analysis of viral nucleic acid interacting proteins identifies TAOKs as innate immune regulators. Nature Communications. 12 (1), 7009(2021).
  25. Andersen, L. L., et al. Systematic P2Y receptor survey identifies P2Y11 as modulator of immune responses and virus replication in macrophages. The EMBO Journal. 42 (23), (2023).
  26. Huang, Y., Urban, C., Hubel, P., Stukalov, A., Pichlmair, A. Protein turnover regulation is critical for influenza A virus infection. Cell Systems. 15 (10), 911-929 (2024).
  27. Hardes, K. Synthese, Charakterisierung und Anwendung neuer Inhibitoren der Proproteinkonvertase Furin [Doctoral Dissertation]. , Philipps-Universität Marburg. (2014).
  28. Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Epidemiology. 27 (3), 493-497 (1938).
  29. Manicassamy, B., et al. Analysis of in vivo dynamics of influenza virus infection in mice using a GFP reporter virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (25), 11531-11536 (2010).
  30. Yang, P., et al. Imaging of viral replication in live cells by using split fluorescent protein-tagged reporter flaviviruses. Virology. 603, 110374(2025).
  31. Jose, J., Taylor, A. B., Kuhn, R. J. Spatial and temporal analysis of alphavirus replication and assembly in mammalian and mosquito cells. mBio. 8 (1), (2017).
  32. Eckert, N., et al. Influenza A virus encoding secreted Gaussia luciferase as useful tool to analyze viral replication and its inhibition by antiviral compounds and cellular proteins. PloS One. 9 (5), (2014).

Перепечатки и разрешения

Теги

Свяжитесь с нами
Рекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

Авторские права © 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.