Методическая статья

Создание модели на основе органоидов простаты мыши для изучения взаимодействий хозяина и патогена

DOI:

10.3791/69385

⸱

27 февраля 2026 г.

 ,  , 
1Host Pathways in Urinary Tract Infections Group, Institute of Molecular Infection Biology, University of Würzburg

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает формирование мышиной модели на основе органоидов простаты, выращенной в 2D. Он включает диссоциацию органоидов, клеточное сесенование, дифференциацию, оценку целостности эпителия и экстракорпоральную инфекцию уропатогенной Escherichia coli. Модель обеспечивает апикальную доступность и подходит для изучения взаимодействий хозяина и патогена, преодолевая ограничения традиционных трёхмерных органоидных систем.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Пожилые мужчины сильно страдают от заболеваний простаты, таких как доброкачественная гиперплазия предстательной железы, простатит и рак простаты. Вместе эти состояния значительно увеличивают глобальную нагрузку на здоровье и являются одной из ведущих причин заболеваний у мужчин. Органоидные модели изменили моделирование заболеваний, позволив воспроизводить ключевые особенности структуры и функции эпителия in vitro. Однако закрытая просветовая структура органоидов ограничивает экспериментальный доступ к апикальной поверхности, затрудняя изучение взаимодействий хозяина и патогена. Чтобы преодолеть эти трудности, мы создали физиологически значимую систему культуры, в которой клетки, полученные из органоидов простаты мышей, засеиваются в виде двумерной (2D) модели. Этот подход сохраняет основные эпителиальные характеристики, обеспечивая при этом прямой доступ к апикальной поверхности. Этот пошаговый протокол описывает диссоциацию зрелых органоидов простаты мышей и оптимальные условия посева для поддержки прикрепления, пролиферации и дифференцировки клеток. Иммунофлуоресцентная микроскопия подтвердила экспрессию специфических для простаты маркеров в органоидной модели и показала точное представление клеточной структуры ткани простаты. Измерения TEER вместе с F-актином и окрашиванием с плотными соединениями дополнительно подтвердили дифференцировку клеток и формирование барьеров. Заражение модели уропатогенной Escherichia coli (UPEC) продемонстрировало её полезность для изучения взаимодействий хозяина и патогена. Эта модель предоставляет ценную платформу для изучения эпителиальной биологии предстательной железы и механизмов заболеваний, особенно подходит для изучения взаимодействий хозяина и патогена и оценки возможных терапевтических стратегий.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Простата — это небольшой орган, расположенный ниже мочевого пузыря, окружающий уретру. Это важный орган мужского репродуктивного тракта, и его основная функция — вырабатывание простаточной жидкости. Эта жидкость составляет до 30% семенной плазмы и является ключом к питанию и защите сперматозоидов во время её прохождения через женский репродуктивный тракт1. Заболевания простаты, такие как простатит, доброкачественная гиперплазия предстательной железы и рак простаты, широко распространены и представляют значительную нагрузку на здравоохранение во всёммире 2,3,4,5. Хотя доброкачественная гиперплазия предстательной железы и рак простаты широко изучаются, простатит, особенно бактериальный простатит, остаются сравнительно недоизученными. Простатит поражает до 16% мужчин по всему миру(6,7), при этом бактериальные инфекции составляют примерно 10% случаев. Несмотря на распространённость, бактериальный простатит до сих пор плохо изучен. Штаммы Escherichia coli (E. coli), в частности уропатогенные E. coli (UPEC), являются ведущей причиной бактериального простатита 8,9.

Исследования молекулярных механизмов инфекции простаты остаются ограниченными отсутствием физиологически значимых моделей in vitro. Большинство исследований заболеваний простаты традиционно опирались на клеточные линии или животные модели. В частности, раковые или трансформированные клеточные линии, такие как LNCaP или RWPE-1, широко используются для моделирования заболеваний простаты и ответа на лечение 10,11,12,13. Однако в этих моделях отсутствует клеточный состав и сложность здорового или ракового эпителия простаты. Кроме того, многие другие исследования использовали животные модели (в основном мышиные) для изучения различных гипотез, связанных с инфекцией простаты, иммунным ответом, ростом опухолей предстательной железы и метастазированием 14,15,16,17. Хотя эти модели были самыми продвинутыми и информативными на сегодняшний день, они обычно поднимают этические вопросы, требуют значительного времени и ресурсов, а также могут быть дорогими. Альтернативно, экспланты тканей ex vivo и первичные клеточные культуры также использовались для краткосрочных исследований реакций тканей на лекарства или развития рака 18,19,20. Тем не менее, эти модели имеют ограниченный срок службы, а доступность свежих человеческих тканей часто ограничена.

Трёхмерные (3D) органоидные культуры, полученные из взрослых стволовых клеток, стали перспективной альтернативой для моделирования эпителиальных тканей in vitro. В отличие от традиционных клеточных линий, органоиды сохраняют ключевые особенности исходного эпителия, такие как клеточная гетерогенность, тканино-специфическая архитектура и функциональныехарактеристики 21,22,23. В отличие от первичных клеточных культур или эксплозантов ex vivo, органоидные культуры могут расширяться и передаваться в течение длительного времени без старения. Эти свойства делают органоидные системы особенно подходящими для изучения взаимодействия заболеваний и хозяина в физиологически значимом контексте. Органоиды предстательной железы были получены из здоровых и раковых человеческих тканей, а также из мышиных моделей и использовались преимущественно в исследованиях ракапростаты 24,25,26. Тем не менее, для исследований инфекций трёхмерная структура органоидов представляет серьёзную проблему, главным образом из-за ограниченного доступа к поверхности люминальных клеток. Традиционно целые 3D-органоиды заражались либо микроинъекцией патогенного агента, либо сначала диссоциировали органоид на фрагменты или отдельные клетки перед инкубацией спатогеном 23. Здесь вариабельность размера и 3D-структуры могут влиять на воспроизводимость и пропускную способность. В качестве альтернативы, апикальные органоиды помогают преодолеть ограничение недоступности просвета. Культивирование органоидов в суспензии, будь то в сверхслабых платах для культуры тканей или на поверхностях, покрытых неадгезивными поверхностно-активными веществами, вызывает обратное полярность органоидов. В результате апикальная поверхность обращена наружу, что обеспечивает прямой доступ для исследований инфекциипатогенов 27,28. Однако эти культуры нельзя поддерживать в долгосрочной перспективе, а вариабельность размера органоидов и количества клеток осложняет определение множественности инфекции (МОИ). Кроме того, механизмы, лежащие в основе обратного изменения полярности и её влияние на органоидные клетки, пока полностью не изучены. Для преодоления ограничений органоидов, как и моделей инфекций in vitro, были разработаны апикально доступные модели на основе органоидов с использованием органоидов из таких органов, как желудок, кишечник илилёгкие 29,30,31. Такие системы сохраняют основные эпителиальные особенности и позволяют облегчить манипуляцию, визуализацию и контролируемое воздействие патогенов и/или лекарств. Однако условия культуры, позволяющие дифференцировать клетки, не всегда переносятся из органоидных культур в двумерные моделикультуры 31,32.

Здесь мы описываем протокол для создания апиково доступной эпителиальной модели простаты с использованием органоидов простаты мышей. Эта модель была ранее разработана и подтверждена в нашей лаборатории, где мы продемонстрировали её сильное сходство с родной тканью простаты и значимость для исследований биологии инфекций с участием UPEC32. Система близко имитирует клеточный состав и полярность эпителия простаты, одновременно обеспечивая повышенную доступность для экспериментальных изменений. Кроме того, мы демонстрируем его применимость для изучения взаимодействий хозяина и патогена в простате, предоставляя более удобную альтернативу моделям in vivo и более физиологически значимую систему, чем традиционные клеточные линии или 3D-органоидные модели.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этическое заявление: Все процедуры для животных соответствовали требованиям по уходу и использованию животных Университета Вюрцбурга и были одобрены соответствующими институциональными и государственными нормативами. В этом исследовании использовались только мыши WT, которые были усыплены в нашем институте другими исследовательскими группами для независимых целей. В соответствии с принципами 3R (замена, уменьшение и совершенствование) не было приношено в жертву специально для этой работы.

ПРИМЕЧАНИЕ: Представленный здесь протокол основан на предыдущем исследовании, опубликованномавторами 32. Все описанные здесь этапы должны выполняться в стерильном шкафу для биобезопасности с использованием соответствующих асептических методов и соответствующего средства индивидуальной защиты. Органоиды простаты мышей были получены из мышей C57BL/6 и содержались в 3D-культуре, как описаноранее 25,26. Чтобы следовать принципам 3R, простаты мышей были пожертвованы животным центром из необработанных наивных мышей WT (не менее 6 месяцев), принесённых в жертву по другим причинам. Кратко, простаты мышей измельчали и переваривали в два этапа с помощью коллагеназы и фермента TrypLE Express. Клетки затем сеяли в каплях внеклеточного матрикса (ECM) для генерации трёхмерных органоидов. Культурная среда добавлялась в культуру и пополнялась каждые 3 дня. 3D-органоидные культуры проходили раз в неделю и использовались для 2D-посева с третьего отрывка. Органоиды простаты мышей, которым недельная возраст, были использованы для внедрения органоидной модели на двумерную поверхность согласно текущему протоколу. Покрытие пластин для культуры тканей белками ECM не требуется для этого протокола.

1. Генерация органоидной модели предстательной железы

  1. Трёхмерная органоидная изоляция
    1. Аспирируйте среду из нужного количества 3D-органоидов из 24-луночной пластины. Замените его на 500 мкл adDMEM/F12+/+ на одну скважину (см. Таблицу материалов).
    2. Используйте пипетку P1000, чтобы механически нарушить дроп РЭБ. Соберите подвеску в коническую трубку объёмом 15 мл. Собирайте максимум две скважины на одну трубу.
    3. Добавьте adDMEM/F12+/+ до 10 мл. Аккуратно инвертируйте трубку 3-4 раза, чтобы перемешать. Центрифуга при 450 x g в течение 5 минут при 4 °C.
  2. Разрушение 3D-органоидов на отдельные клетки
    1. Аспирировать супернатант. Суспензируйте гранулу в 2 мл предварительно подогретого (37 °C) фермента TrypLE Express, дополненного 10 мкм RHOKi.
    2. Инкубировать в водяной бане при 37 °C в течение 15 минут. Используйте пипетку P1000 для смешивания элемента каждые 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте суспензию клетки под перевёрнутым микроскопом с помощью 4x объектива, чтобы убедиться, что клетки в основном одиночные. Приемлемы небольшие сгустки из 2-3 клеток. Обычно достаточно 15 минут инкубации, но при необходимости это можно продлить.
    3. Добавьте 10 мл adDMEM/F12+/+. Аккуратно инвертируйте трубку 3-4 раза, чтобы перемешать. Центрифуга при 450 x g в течение 5 минут при 4 °C.
  3. Подвеска с одной ячейкой
    1. Аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу. Суспензировать клеточную гранулу в культурной среде с дополнением 10 мкм RHOKi (300 мкл культурной среды на каждую яме 3D-органоидов, используемых на шаге 1.1.1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Среда для культуры состоит из: Advance Dulbecco Modified Eagle Medium/F12, 10 ммоль L−1 HEPES, 1x GlutaMAX, 1x B27, 1 мМ N-ацетилцистеина, 10% среды с кондиционированным Ноггином, 10% R-спондина с 1 кондиционированной средой, 50 нг·мл-1 EGF, 1 нМ 5α-дигидротестостерона (DHT), 0,2 мкм TGFβi и 100 нг·мл-1 примоцина (см. таблицу материалов). Для экспериментов с инфекциями используйте посевную среду без Примоцина.
    2. Считайте количество ячеек в подвешенном режиме с помощью камеры счёта Нойбауэра.
    3. Разбавить суспензию клетки в культурной среде с добавлением 10 мкм RHOKi до концентрации 62 500 клеток·мл-1. Используйте 200 мкл клеточной суспензии на одну скважину для засея на пластинах с 48 лунками (тканевая культура, обработанная производителем, см. Таблицу материалов) или 300 мкл на одну скважину на камерных μ-затворах (см. Таблицу материалов). Поместите пластину в инкубатор для клеточной культуры при 37 °C и 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая яма 3D-органоидов, используемая в шаге 1.1.1. обычно даёт примерно 200 000 ячеек.
    4. Через один день большинство отдельных ячеек прикрепляются к двумерной поверхности. Меняйте культурный материал каждые 2-3 дня. Конфлуэнция достигается в течение 7 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что RHOKi добавляется только для начального посева, а не для последующих изменений среды.
  4. Дифференцирование модели на основе органоидов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте следующим шагам для получения дифференцированной органоидной модели, обогащённой люминальными клетками.
    1. Добавьте 10 нМ DHT к подвешенному элементу (шаг 1.3.3). Используйте посевную среду с добавлением 10 нМ ДГТ для последующих изменений среды (каждые 2-3 дня).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если к суспензии клетки (и последующим изменениям среды) не добавляется ДГТ, модель на основе органоидов будет обогащена базальными клетками.

2. Измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER)

  1. Засеять суспензию органоидной ячейки в концентрации 62 500 клеток·мл-1, используя 300 мкл (полученного на шаге 1.3.3) на 8-ядочном ПЭТ-μ слайде с 40 электродами на каждую яме (см. Таблицу материалов). Добавьте 300 мкл культурной среды, описанной в 1.3.1, в одну из колодцев без клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Яма без клеток используется как заготовка для измерений.
  2. Подключите μ-слайд к системе анализа клеток на основе импеданса (см. таблицу материалов) при 16-луночной станции, размещённой внутри инкубатора тканевой культуры. Измеряйте TEER на 400 Гц в течение 7 дней. Меняйте культурный материал каждые 2-3 дня.

3. Иммунофлуоресцентное окрашивание

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого метода убедитесь, что ячейки засеиваются в камерные μ-слайды (см. Таблицу материалов), которые совместимы с приложениями высокоразрешающей микроскопии.

  1. В выбранную точку времени удалите среду и три раза промывайте клетки 1x PBS. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом (PFA) на 15 минут при комнатной температуре (избегайте воздействия света).
    ВНИМАНИЕ: 4% параформальдегид может вызвать аллергическую кожную реакцию, серьёзное повреждение глаз и подозревается в причине рака. Всегда используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ). Избегайте вдыхания пыли, паров, газов, туманов, паров или спреев. Носите защитные перчатки и следите, чтобы загрязнённая одежда оставалась в лаборатории до должной дезинфекции. Утилизировать содержимое и контейнеры через одобренное предприятие по утилизации отходов.
  2. После фиксации промой клетки три раза с помощью 1x PBS (по 5 минут каждая). Пермеабилизируйте клетки с 0,5% Triton X-100 (см. Таблицу материалов) на 15 минут при комнатной температуре.
    ВНИМАНИЕ: Triton X-100 вызывает раздражение кожи и серьёзные повреждения глаз. Он очень токсичен для водных организмов с долгосрочными последствиями и может вызывать эндокринные нарушения в окружающей среде. При обращении носите защитные перчатки, защиту для глаз и лица. Утилизировать содержимое и контейнеры через одобренное предприятие по утилизации отходов. Избегайте выброса в окружающую среду.
  3. Помой клетки дважды с помощью 1x PBS (по 5 минут каждая). Блокируйте ячейки блокирующим буфером (1% BSA в PBS, см. Таблицу материалов) на 30 минут при комнатной температуре.
  4. Разбавить первичные антитела в блокирующем буфере (1% BSA в 1x PBS) и инкубировать с клетками ночью при 4 °C на качающейся платформе. На следующий день инкубировать 1 час при комнатной температуре. (см. Таблицу материалов для разбавления антител).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для окрашивания F-актина фаллоидином или плазматической мембраны с помощью CellMask (см. таблицу материалов) пропустите шаг 3.4.
  5. Промой клетки три раза с помощью 1x PBS (по 5 минут каждая). Разведите вторичные антитела — фаллоидин или CellMask (см. таблицу материалов) в блокирующем буфере (1% BSA в 1x PBS) и инкубировать с клетками 1 час при комнатной температуре.
  6. Промой клетки три раза с помощью 1x PBS (по 5 минут каждая). Инкубировать клетки 15 минут при комнатной температуре с Hoechst (см. таблицу материалов), разбавленной в 1x PBS для окрашивания ядер.
  7. Промой клетки три раза с помощью 1x PBS (по 5 минут каждая) и оставьте ячейки с 1x PBS. Храните при 4 °C.
  8. Снимите камерные μ-стеклянные стекли (см. Таблицу материалов) в лазерной сканирующей конфокальной микроскопии или флуоресцентном микроскопе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обзорные изображения можно получить с помощью 20-кратного объектива на флуоресцентном микроскопе для оценки общей эффективности и распространения инфекции. Изображения с более высоким разрешением были получены с помощью конфокального микроскопа с 40-кратным погружением в воду для визуализации отдельных бактерий, прикреплённых к эпителиальных клеткам или внутренне внутри них. Флуорофоры возбуждались с помощью лазерных линий на 405, 499, 590 и 653 нм, в зависимости от используемых флуорофоров. Выбросы были обнаружены с окнами излучения, установленными на 415–516 нм для Hoechst, 509–573 нм для GFP или Alexa 488, 600–651 нм для McCherry или Alexa 594 и 663–720 нм для Alexa 647. Были изготовлены Z-трубы с размером ступени 0,5 мкм, покрывающие всю толщину эпителиального слоя. Изображения были получены с разрешением 1024 на 1024 пикселя, частотой сканирования 400 Гц и средним уровнем кадров 4, что обеспечивает хорошее качество изображения. Мощность лазера и усиление детектора оставались постоянными во всех условиях одного эксперимента. Все параметры изображения, включая мощность лазера, усиление детектора, скорость сканирования и усреднение, должны быть оптимизированы и скорректированы по мере необходимости в зависимости от используемого конфокального микроскопа.

4. Бактериальная инфекция уропатогенной E. coli (UPEC)

ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно используйте модель на основе органоидов, поддерживаемую 7 дней без примоцина (см. таблицу материалов) для следующих шагов.

В этом исследовании использовался уропатогенный штамм E. coli UTI89, который постоянно экспрессирует белок mCherry из плазмиды pFPV-mCherry (устойчивый к ампициллину).

ВНИМАНИЕ: При работе с инфекционными патогенами (уровень биобезопасности 2) надевайте перчатки и соответствующую защиту для глаз и лица. Всегда носи полностью застёгнутый лабораторный халат. Проводите все процедуры в сертифицированном биологическом шкафе безопасности. Очистить рабочие поверхности и тщательно помой руки после работы с биологическими материалами. Собирайте отходы BSL-2 в специализированные контейнеры для биологических опасностей, подходящие для автоклава. Обезвредить отходы перед утилизацией с помощью автоклава или другого подходящего метода дезактивации.

  1. За три дня до эксперимента с инфекцией выведите штамм UPEC на агарную пластину LB, дополненную соответствующим антибиотиком (в этом протоколе использовался ампициллин 100 мкг·мл-1 ) и инкубировать 16-24 часа при 37 °C.
    ВНИМАНИЕ: Некоторые антибиотики могут вызывать аллергические реакции или раздражение при контакте и способствовать развитию антимикробной устойчивости при неправильном выбросе. Всегда готовьте и добавляйте антибиотики в биологический защитный шкаф, одновременно надевая соответствующее средство индивидуальной защиты (перчатки и защиту глаз). Утилизировать растворы, содержащие антибиотики, в химические отходы через одобренное предприятие по утилизации отходов.
  2. За два дня до эксперимента с инфекцией инокулируют 3 мл бульона LB, дополненный соответствующим антибиотиком (ампициллином 100 мкг·мл-1), используя одну колонию UPEC из агарной пластины (шаг 4.1). Инкубировать статически при 37 °C в течение 12-16 часов.
  3. За день до эксперимента с инфекцией завершите бактериальную культуру с шага 4.2 и измерите еёOD 600. Вычислите объём этой культуры, необходимый для инокуляции 3 мл бульона LB, дополненного ампициллином (100 мкг·мл-1), до начальногоОД 600 равного 0,05, используя следующую формулу: Объём (μL) = (0,05 * 3 000 мкл) / измеренныйOD 600. Добавьте рассчитанный объём культуры из шага 4.2. до свежего бульона LB и инкубировать статически при 37 °C в течение 24 часов.
    ПРИМЕЧАНИЕ:OD 600 ночной культуры из шага 4.2 должен быть между 1.7 и 2.2.
  4. В день заражения проведите вихрь бактериальной культуры с шага 4.3 и измерите еёOD 600. СобратьOD 600 1 из культуры, затем центрифугировать при 12 000 г в течение 2 минут при комнатной температуре. Удалите супернатант.
  5. Ресуспендировать в 1 мл среды без примоцина без органоидных культур без ДГТ. Разбавьте до MOI 100.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая скважина в 48-колодной пластине считается имеющей примерно 150 000 ячеек на седьмой день. Эта оценка была получена путём подсчёта клеток в глубине до заражения в нескольких экспериментах. Для точной корректировки MOI рекомендуется засеять одну дополнительную скважину для подсчёта клеток перед заражением. Чтобы определить объём бактериальной суспензии (шаг 4.4), умножьте количество клеток в яме на MOI, чтобы получить общее количество бактерий, необходимых в каждой скважине, затем делите это число на концентрацию бактерий (8 × 10⁵ бактерий/мкл), чтобы получить объём в мкл.
  6. Замените культурную среду из модели на основе органоидов на культурную среду, содержащую бактерии. Регулируйте объём в зависимости от поверхности культуры: используйте 200 мкл на скважину для пластин с 48 лунками и 300 мкл на скважину для μ-затворов. Инкубировать 1 час в инкубаторе для клеточной культуры при 37 °C и 5%CO2.
  7. После инкубационного периода аспирируйте среду, содержащую бактерии, из органоидной модели. Промой колодец 3 раза с помощью adDMEM/F12+/+, чтобы удалить внеклеточные бактерии.
  8. Добавьте культурную среду с 50 мг·мл-1 гентамицином для уничтожения внеклеточных бактерий. Инкубировать 30 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию гентамицина может потребовать корректировки в зависимости от используемого бактериального штамма. При использовании концентрации выше 50 мкг·мл-1 рекомендуется проверить клеточную цитотоксичность.
  9. Удалите средний материал и замените свежим средством с добавлением гентамицина 10 мкг·мл-1 на оставшееся время заражения.
    Обработайте инфицированные клетки для флуоресцентного окрашивания, следуя разделу 3, или для количественной оценки с помощью проточной цитометрии, следуя разделу 5.

5. Количественная оценка инфекции с помощью потоковой цитометрии

  1. Аспирируйте культурную среду и промывайте клетки 3 раза с помощью 1x PBS. Используйте 100 мкл фермента TrypLE Express для отделения клеток. Инкубировать 5-10 минут, пока все клетки не отсоединятся.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого условия достаточно скважины из пластины с 48 лунками.
  2. Соберите суспензию ячейки и перенесите её в колодец с пластиной на 96 лунок (коническое дно). Добавьте сверху 100 мкл буфера потокового цитометра (1x PBS, 10% FBS, 5 мМ EDTA) для инактивации фермента TrypLE Express.
  3. Центрифугуйте плиту с 96 лунками при 450 x g в течение 5 минут при 4 °C. Удалите супернатант и снова суспензуйте гранулу в буфере потокового цитометра 150 мкл.
  4. Получите и количественно оцените заражённые клетки с помощью потокового цитометра (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проточная цитометрия проводилась с использованием возбуждающего лазера с толщиной 488 нм и эмиссионного фильтра 615/20 нм для обнаружения клеток mCherry. Данные были собраны с высокой скоростью расхода (66 мкл·мин⁻¹), с наличием не менее 10 000 событий на образец и включающими только события с высотой прямого рассеяния более 80 000. Инфицированные клетки были выявлены на основе флуоресценции mCherry в сравнении с неинфицированным (наивным) контролем, после исключения обломков и дублетов. Маркер жизнеспособности (например, йодид проидия или другие живые/мёртвые пятна) может быть включен в стратегию гейтинга для оценки жизнеспособности клеток. Это может быть особенно полезно при первой работе с моделью, чтобы диссоциация клеток не повлияла негативно на клетки.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает создание органоидной модели эпителия простаты мыши, которая репризирует тип клеток и транскрипционную экспрессию эпителиального компартмента родной ткани. Эта модель создана с использованием 3D-органоидов взрослых стволовых клеток, полученных из ткани предстательной железы взрослых мышей. Эти органоидные культуры затем поддерживаются в культуре и передаются еженедельно. Для модели на основе органоидов первый шаг в рабочем процессе (рисунок 1A) начинается с использования 3D-органоидов 7-дневной давности. Этот период необходим, чтобы они достигли подходящего размера и плотности клеток для последующего посева на двумерную поверхность. После перехода небольшие фрагменты органоидов (рисунок 1B, День 0) были засеяны в ЭКМ и оставлены для роста. Со временем они вырастают в крупные сферические структуры с определённым внутренним просветом к 7-му дню (рисунок 1B). После диссоциации 7-дневных органоидов на отдельные клетки клетки посеяли на пластину, обработанную тканевой культурой (рисунок 1C, день 0), используя ту же культурную среду, что и для трёхмерных органоидных культур (1nM DHT), чтобы образовать монослой. К первому дню прилипшие клетки начали размножаться. В последующие дни монослой расширялся и достигал слияния между 3-м и 5-м днём, как наблюдала яркая микроскопия (рисунок 1C). Для характеристики морфологических изменений со временем и мониторинга времени, когда органоидная модель достигает слияния, мы окрашили плазматическую мембрану CellMask и провели флуоресцентную визуализацию в нескольких временных точках (см. рисунок 1D).

Поскольку сигнализация андрогенных рецепторов (AR) является ключевым регулятором дифференцировки клеток в простате, а модуляция концентрации тестостерона (или ДГТ) в среде органоидного культурирования показала направленную дифференцировку стволовых клеток в базальные или люминальныеклетки 32, мы скорректировали уровень ДГТ в культурной среде, чтобы способствовать обогащению люминальных клеток (DHT 10 нМ) или базальных (без ДГТ, Управление; Метод1, рисунок 2A). Как показано на рисунке 2 (B-F), существенных различий в росте или слиянии клеток не наблюдалось. Как и ожидалось, в контрольном состоянии (органоидная культурная среда без ДГТ) большинство клеток экспрессировали цитокератин 5 (KRT5), маркер базальных стволовых клеток простаты (рисунок 2B,E). В отличие от этого, лишь несколько клеток экспрессировали низкие уровни CD24a, маркера дифференцированных клеток предстательной железы (рисунок 2B,F).

Добавление 1 нМ ДГТ, как мы ужеописали 32, привело к смешанной популяции, включающей как базальные, так и люминальные клетки. Однако экспрессия CD24a оставалась низкой, что указывает на неполную дифференцировку в люминальные клетки (рисунок 2C, F32). Повышение ДГТ до 10 нМ способствовало полной дифференцировке люминальных клеток при сохранении базальных клеток после 7 дней культуры (рисунок 2D-F). Дифференциация моделей на основе органоидов также может быть оценена с помощью микроскопии яркого поля. Хотя различия между состояниями не очень очевидны при разреженности клеток (День 0–5, Рисунок 1C, Дополнительный рисунок 1A), морфология и внешний вид клеток становятся чёткими и заметными между тремя условиями культуры при микроскопии Brightfield на 7-й день (Рисунок 1C, Дополнительный рисунок 1A,B). При отсутствии ДГТ клетки выглядели более плоскими и нерегулярными по форме, тогда как при 10 нМ ДГТ клетки были плотно упакованы с полигональной структурой, напоминающей морфологию булыжника (дополнительный рисунок 1B).

Примечательно, что 3D-органоидные культуры также претерпели морфологические изменения при выращивании с разными концентрациями ДГТ. В частности, наблюдалось явное увеличение размера органоидов, зависящее от дозы, при этом самые крупные органоиды формировались при наличии 10 нМ ДГТ (рисунок 1B, дополнительный рисунок 2A,B). Эти результаты показывают, что путь AR критически важен не только для дифференцировки клеток, но и для модуляции динамики роста органоидов простаты у мышей.

Для оценки целостности эпителия и поляризации моделей мы провели измерения трансэпителиального электрического сопротивления (TEER) в органоидной модели, выращенной с отсутствием или 10 нМ ДГТ. Значения TEER со временем увеличивались в обоих случаях, но значительно повышались при наличии 10 нМ ДГТ (рисунок 3A), что указывает на усиление функции эпителиального барьера. Эти результаты были подтверждены фаллоидиновым окрашиванием актиновых нитей, которые обычно организованы в апикальное кольцо на пересечении клеток клеток в люминальных эпителиальных клетках простаты. При условии ДГТ 10 нМ актиновое кольцо выглядело более определённым по сравнению с контрольным, что соответствует повышенной полярности клеток и организации эпителия (рисунок 3B). Кроме того, иммунокрашивание zonula occludens 1 (ZO-1) выявило увеличение узких соединений при условии 10 нМ ДГТ (рисунок 3C), что дополнительно поддерживает усиление целостности эпителиального барьера и дифференцировку в сторону люминального фенотипа. Ортогональные проекции показывают, что органоиды, культивируемые с 10 нМ ДГТ, демонстрируют чётко определённую эпителиальную полярность (дополнительный рисунок 3A). Базальные клетки KRT5⁺ расположены внизу, а люминальные клетки CD24a⁺ распределены вдоль эпителиального слоя, демонстрируя более сильную интенсивность окрашивания в сторону апикальной стороны. Эта архитектура схожа с наблюдаемой в ткани простаты мыши (дополнительный рисунок 3B). Стоит отметить, что данные из Атласа белков человека показывают, что эти маркеры имеют сопоставимую локализацию в ткани предстательной железы человека, где базальные клетки KRT5⁺ лежат под световым слоем CD24a⁺ (дополнительный рисунок 3C)33. В отличие от этого, клетки, культивируемые под контролем или при условиях 1 нМ ДГТ, не показывают чёткого пространственного разделения между базальными и люминальными маркерами, а высота клеток была значительно ниже, чем в условиях 10 нМ (дополнительный рисунок 3A). Это указывает на то, что добавление 10 нМ ДГТ способствует дифференциации и поляризации эпителия в двумерной модели способом, сопоставимым с родным эпителием простаты. Поскольку органоидная модель, выращенная с 10 нМ ДГТ, очень похожа на родной эпителий простаты у мыши (рисунок 2D, дополнительный рисунок 3A,B), она служит релевантной платформой для изучения взаимодействий хозяина и патогена. Для демонстрации применимости модели мы использовали инфекции UPEC, в частности штамм UTI89, один из самых часто используемых штаммов UPEC в области половых органов. Как показано на рисунке 4A, бактерии выращивались в бульоне LB в течение 24 часов (как описано в Методе 4) и инкубировались вместе с клетками в течение одного часа. Внеклеточные бактерии затем уничтожались гентамицином для количественной оценки инвазии и внутриклеточной репликации. При заражении органоидной модели UPEC прилипал к эпителиальным клеткам в больших количествах (0 hpi; Рисунок 4B, левая панель; Рисунок 4C). Затем, после обработки гентамицином (1 hpi), количество UPEC-положительных клеток значительно уменьшилось из-за гибели внеклеточных бактерий (рисунок 4B, средняя панель; Рисунок 4C). При 24 hpi количество инфицированных клеток оставалось неизменным (рисунок 4C), однако конфокальная микроскопия показала, что внутриклеточные бактерии продолжают размножаться, формируя структуры, похожие на сообщество, аналогичные ранее описанным в эпителии мочевого пузыря (рисунок 4B, правая панель). Инфицированные клетки были идентифицированы с помощью флуоресценции mCherry с использованием неинфицированных (наивных) контролей в качестве ориентира, исключая остатки и дублеты (дополнительный рисунок 4).

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор рабочего процесса и морфологической эволюции органоидов предстательной железы и моделей, основанных на органоидах, со временем. (A) Схематическое представление экспериментального рабочего процесса (Метод 1). (B) Изображения Brightfield, показывающие морфологическое развитие органоидов простаты, дополненные 1 нМ ДГТ, зафиксированные на днях 0, 1, 3, 5 и 7 (слева направо). Шкала: 200 мкм. (n = 3). (C) Яркие изображения органоидной модели, дополненные 1 нМ DHT, сделанные на днях 0, 1, 3, 5 и 7 (слева направо). Шкала: 200 мкм. (n = 3). (D) Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентной микроскопии органоидной модели, дополненные 1 нМ ДГТ и окрашенные CellMask (красный) на 1, 3, 5 и 7 дни (слева направо). Ядра были контрокрашены Hoechst 33342 (синий). Шкала масштаба: 50 мкм. (n = 3) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-2
Рисунок 2: DHT модулирует дифференциацию родословной в модели, основанной на органоидах. (A) Схематическое представление различных условий, используемых для дифференцировки. (B-D) Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентной микроскопии органоидной модели, выращиваемые в течение 7 дней при (B) отсутствии (Ctrl) или наличии (C) 1 нМ или (D) 10 нМ ДГТ. Снимки были сделаны на 1, 3, 5 и 7 дни (слева направо). Модели на основе органоидов были окрашены для CD24a (маркер люминальных клеток, зелёный) и KRT5 (базальноклеточный маркер, пурпурный). Ядра были контрокрашены Hoechst 33342 (синий). Шкала: 50 мкм. (n = 4). (E,F) Количественная оценка изображений клеток (E) KRT5+ и (F) CD24a+ в органоидной модели, выращенной без DHT (Ctrl), 1nM или 10nM. Данные отображаются в процентах положительных ячеек на поле зрения. Статистический тест: односторонний ANOVA с пост-хок тестом Тьюки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-3
Рисунок 3: Органоидная модель, дифференцированная с 10 нМ ДГТ, демонстрирует более высокую клеточную поляризацию по сравнению с контрольной .(A) TEER-анализ органоидной модели, выращиваемой в течение 7 дней при отсутствии (Ctrl; розовый) и наличии DHT (10 нМ; зелёный). Полоски ошибок обозначают SD (n = 3). Статистический тест: односторонний ANOVA с пост-хок тестом Тьюки. (B,C) Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентной микроскопии органоидной модели, выращиваемые в течение 7 дней без (Ctrl; вверх) или с 10 нМ ДГТ (снизу) и окрашенные на (B) F-актин (красный) и (C) ZO-1 (красный). Ядра были контрокрашены Hoechst 33342 (синий). Шкала масштаба: 50 мкм. (n = 3) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

figure-results-4
Рисунок 4: Анализ динамики инфекции в модели, основанной на органоидах. (A) Схематическое представление протокола инфекции (раздел 4). (B) Репрезентативные изображения иммунофлуоресцентной микроскопии, показывающие инфицированную органоидную модель через 0, 1 и 24 часа после заражения (HPI; слева направо). UPEC визуализированы красным цветом. Ядра были контрокрашены Hoechst 33342 (синий). Шкала: 50 мкм. (n = 3). (C) Анализ проточной цитометрии клеток UPEC-положительных (mCherry положительных, инфицированных клеток) при 0, 1 и 24 hpi. Стратегия гейтинга показана на дополнительном рисунке 4. Полоски ошибок обозначают SEM (n = 3). Статистический тест: односторонний ANOVA с пост-хок тестом Тьюки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: Морфологическая эволюция модели на основе органоидов со временем. (A,B) Яркие изображения модели на основе органоидов при (A) отсутствии (Ctrl) и (B) присутствии 10 нМ DHT, сделанных на днях 0, 1, 3, 5 и 7 (слева направо). Шкала шкалы: 200 мкм. (n = 3) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Концентрация ДГТ влияет на трёхмерный рост органоидов предстательной железы. (A) Яркие изображения органоидной модели при отсутствии (Ctrl; сверху) и при наличии 10 нМ DHT (внизу), снятые на днях 0, 1, 3, 5 и 7 (слева направо). Шкала: 200 мкм. (n = 3). (B) Количественная оценка размера 3D органоида на 7-й день, выращиваемый при трёх различных условиях: отсутствие DHT (Ctrl; розовый), 1 нМ DHT (фиолетовый) и 10 нМ DHT (зелёный). Статистический тест: односторонний ANOVA с пост-хок тестом Тьюки (n = 3). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 3: Характеристика морфологии органоидов простаты и эпителиальной полярности. (A) Ортогональные проекции конфокальных z-стеков, иллюстрирующие организацию эпителий и полярность от апикальной к базальной при различных концентрациях ДГТ (Ctrl, 1 нМ и 10 нМ ДГТ). Базальные клетки были окрашены на KRT5 (маджента), а люминальные клетки — на CD24a (зелёный). Шкала шкалы: 50 мкм.(B) Иммунофлуоресцентное окрашивание ткани мыши с вложенной в OCT с базальными (KRT5, пурпурная) и люминальная (CD24a, зелёная) эпителиальная маркировка. Ядра контрастируют с DAPI (синим цветом). Шкала: 50 мкм. Кратко, участки мышиной ткани фиксировались 4% PFA, дегидрированы ночью сахарозой 30%, а OCT —32. Затем слайды регидратировались в PBS на 10 минут и иммунокрашены, следуя разделу 3. (C) Иммуногистохимический анализ экспрессии белков CD24a и KRT5 в ткани предстательной железы человека ( панель C была извлечена из базы данных The Human Protein Atlas Database (версия 25.0; Атлас белка человека proteinatlas.org), Uhlén, M. и др. (2015)33, https://www.proteinatlas.org/ENSG00000186081-KRT5/tissue/prostate). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 4: Стратегия гейтинга проточной цитометрии для идентификации инфицированных клеток. Ячейки сначала были ограничены на основе высоты бокового рассеяния (SSC-H) и высоты прямого рассеяния (FSC-H), чтобы исключить мусор, затем проводились гейтинги на SSC-H против боковой площади рассеяния (SSC-A) для выбора отдельных ячеек. mCherry-положительные (инфицированные) клетки затем были идентифицированы с помощью Counts и PE-Texas Red-H флуоресценции (гистограмма). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

На простате могут поражаться различные заболевания, включая доброкачественную гиперплазия предстательной железы, простатит и рак простаты. Эти заболевания очень распространены и существенно влияют на качество жизнипациентов 2. Несмотря на значительное влияние на здравоохранение, наше понимание этих заболеваний, особенно основных механизмов и реакций хозяина при нераковых состояниях, остаётся ограниченным. Это во многом связано с отсутствием физиологически значимых экспериментальных моделей. С одной стороны, бессмертные клеточные линии не отражают сложность или статус дифференцировки, как нормальный эпителий простаты. С другой стороны, модели животных, в основном грызуны, вызывают этические сомнения и не являются экономически эффективными. Альтернативным подходом является использование первичных клеток человека или эксплантаций тканей, полученных пациентом. Однако ограниченная доступность свежей ткани простаты ограничивает их широкое применение. Эти ограничения подчёркивают необходимость других систем in vitro, которые физиологически значимы, просты в использовании и управляемы экспериментально. В этом контексте технология органоидов взрослых стволовых клеток изменила моделирование заболеваний. Эти трёхмерные культуры способны самоорганизовываться, сохраняя эпителиальную идентичность и разнообразие эпителиальныхклеток 23,34,35,36,37,38. Хотя их 3D-архитектура позволила применять их в исследованиях рака, тестировании лекарственных средств и регенеративноймедицине (23,34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41), их замкнутая структура с апикальной поверхностью, обращённой внутрь, создаёт практические трудности для экспериментального доступа, особенно для in vitro Модели заражения. Апикальные органоиды решают это ограничение, меняя эпителиальную полярность, обнажая апикальную поверхность для прямых исследованийинфекции 27,28. Однако их эффективность как модели инфекции может ограничиваться вариабельностью размера, неравномерным воздействием патогенов и хрупкостью в долгосрочной инфекции.

Здесь мы представляем протокол для создания органоидной модели простаты мыши, которая воспроизводит состав эпителиальных клеток и транскрипционный профиль родного мышиного эпителия, обеспечивая при этом лёгкий доступ к апикальной поверхности. Оптимизированная в нашей предыдущейработе 32, эта модель позволяет точно контролировать ключевые экспериментальные переменные, включая плотность посева, равномерное воздействие стимулов, определённое соотношение бактерий к клеткам (MOI) и высокопроизводительные параметры визуализации, которые часто трудно стандартизировать в обычных 3D-органоидных системах.

В соответствии с принципом 3Rs (Заменить, Уменьшить, Очистить) для экспериментов наживотных 42, органоиды, используемые в качестве источника первичных клеток для этой модели, получены из диких наивных мышей, принесённых в жертву для несвязанных целей, таких как размножение. Простаты получаются за счёт пожертвований от близлежащих ветеринарных предприятий, что снижает необходимость жертвоприношения дополнительных животных специально для этого протокола.

Надёжная и надёжная дифференцировка органоидов и моделей на основе органоидов крайне важна для точного воспроизведения клеточного состава и функциональных характеристик нативной ткани, обеспечивая их актуальность как в in vitro моделях. Дифференцировка клеток внутри органоидов сильно зависит от специфического состава культурной среды, включая точные концентрации факторов роста и фармакологических агентов (т.е. ингибиторов лекарств). Манипуляция этими факторами позволяет прямую дифференцировать к определённым линиям клеток, что демонстрируется в различных органоидных системах. Например, у кишечных органоидов удаление WNT способствует дифференцировки энтероцитов, что может быть дополнительно усилено интерфероном гамма (рассмотрено в38 статьях). Дифференцировка в кубковые клетки может быть достигнута удалением ингибитора p38 и никотинамида или ингибированием Notch с помощью DAPT/DBZ (рассмотрено в38 году). Также доказано, что IGF-1 и FGF-2 поддерживают долгосрочное расширение культур, обогащённых секреторнымиклетками (43). Кроме того, IL-22 усиливает дифференцировку клеток Панета, и энтероэндокринные клетки образуются путём ингибирования путей, включая Notch иBMP 38. Аналогично, желудочные органоиды и монослои на основе органоидов демонстрируют дифференциацию в сторону пит-клеток при удалении WNT из культурной среды, а добавление никотинамида в среду направляет клетки в фенотип железы (шейные и главные клетки)31,44,45.

В простате андрогенный рецептор (AR) играет ключевую роль в поддержании гомеостазатканей 46,47,48,49. Тестостерон, вырабатываемый клетками Лейдига в яичках, превращается в ДГТ в эпителиальных клетках предстательной железы с помощью 5α-редуктазы. ДГТ активирует AR, который димеризируется, транслоцируется в ядро и связывается с элементами андрогенного ответа для регулирования генов, участвующих в дифференцировке клеток игомеостазе 50. Предыдущие исследования показали, что добавление 1 нМ в 3D-органоидах простаты мышей достаточно для дифференцировки клеток в люминальныеклетки 51. Другие также показали, что приём витамина D (в частности 1,25-дигидроксивитамина D) способствовал росту органоидов предстательной железы человека и ускорял дифференцировку, ингибируя каноническую активность WNT и подавляя члена семейства WNTDKK3 52. Однако в этих исследованиях использовались только трёхмерные органоиды. Наши предыдущие исследования32 и другие53 показали, что добавление 10 нМ ДГТ в 3D-органоидах недостаточно для полной дифференцировки. В отличие от этого, использование описанной здесь 2D-модели, то есть засев клеток в 2D с 10 нМ DHT, достаточно для дифференцировки модели до состояния, похожего на нативнуюткань 32. Чтобы понять это различие между 3D- и 2D-моделями, потребуется дальнейшая работа, но это может быть объяснено разными механофизическими сигналами между системами или наличием ECM, содержащих факторы роста в 3D-модели.

В ткани предстательной железы можно обнаружить три основных типа эпителиальных клеток: люминальные, базальные и нейроэндокринные клетки. Из них только люминальные и базальные клетки присутствуют во всех опубликованных на сегодняшний день органоидных моделях. Отсутствие редких нейроэндокринных клеток указывает на то, что текущие протоколы органоидов могут быть не полностью оптимизированы. Между люминальными и базальными клетками популяция промежуточных клеток предстательной железы также описывается как переходное состояние, экспрессирующее как люминальные (то есть CD24a), так и базальные (например, SCA-1)маркеры 18,51. Эта подпопуляция часто встречается в области периуретральной простаты, поэтому их часто называют люминальными клетками периуретральности54. Хотя это было зарегистрировано в некоторых трёхмерных органоидных системах при специфических условиях дифференцировки или сигнализации53,55, в нашей системе не наблюдается чёткого разделения между люминальными и промежуточнымиклетками 32. Одно из возможных объяснений заключается в том, что при трёхмерной генерации органоидов мы не различаем отдельные области простаты, и чтобы избежать загрязнения клетками уретры, удаляем ткань, непосредственно прилегающую к уретральной предстательной железной связи. Таким образом, органоидные культуры, полученные из проксимальных или прилегающих к уретры областей, скорее всего, более способны к образованию промежуточных клеток.

Целостность барьера считается отличительной чертой зрелого и дифференцированного эпителия, обеспечивая защитный барьер от попадания токсинов и микробов в подлежащие ткани. Плотные соединения (богатые белкамиZO-1 56) играют важную роль в регулировании параклеточной проницаемости и поддержании целостности эпителиальногобарьера 57. По мере дифференцировки эпителиальных клеток созревание этих межклеточных соединений укрепляетбарьер 58. Поэтому оценка целостности барьера является важным показателем для эпителиальной модели in vitro . В этом протоколе мы показываем три дополнительных метода оценки целостности барьера: измерение TEER, иммуно-окрашивание ZO-1 и окрашивание F-актином. Хотя все три метода эффективно оценивают целостность барьера, они существенно различаются по оборудованию и необходимым ресурсам. Измерения TEER обеспечивают количественное значение, которое можно отслеживать со временем, давая динамическое понимание функции барьера; однако для этой техники требуется специализированное оборудование и программное обеспечение, которое может быть не в каждой лаборатории. В отличие от этого, окрашивание антителами против ZO-1 или фаллоидином гораздо более управляемое по времени и стоимости (например, окрашивание фаллоидина можно провести примерно за 3 часа — раздел 3).

Этот протокол описывает, как использовать 3D-органоиды простаты мышей для создания апикально доступной 2D-модели. Несколько обзоров выявили преимущества и недостатки органоидов и органоидных систем при изучении взаимодействий хозяина ипатогена 23,36,59. В исследованиях инфекций крайне важно учитывать естественное место взаимодействия между патогенами и эпителием хозяина. В простате люминальные клетки обычно являются первой точкой контакта, поэтому доступ к апикальной поверхности необходим для точного моделирования динамики инфекции. У традиционных трёхмерных органоидов простаты апикальная поверхность обращена к просвету органоидов и не имеет прямого доступа. В таких случаях воздействие патогенов может осуществляться с помощью микроинъекций, что является низкопроизводительным и технически сложным, либо путем нарушения органоидов, что снижает полярность эпителия и приводит к появлению нефизиологических участковвзаимодействия 23. В отличие от этого, апикально доступная двумерная модель, представленная в этом протоколе, обеспечивает прямой доступ к световой поверхности. Это обеспечивает контролируемое и физиологически значимое воздействие патогенов, точную регулировку MOI и совместимость с высокопроизводительными, высокоразрешающими или живыми клеткавыми платформами визуализации. Здесь мы демонстрируем использование этой модели в качестве системы инфицирования in vitro с использованием эталонного штамма UPEC UTI89, широко используемого справочника, представляющего основные виды бактерий, ответственные за бактериальныйпростатит 9. Однако эту модель легко адаптировать для изучения других патогенов простаты, таких как Enterococcus faecalis или Pseudomonas aeruginosa, что делает её универсальной платформой для биологии инфекций простаты.

Диссоциация 3D-органоидов является критически важным шагом для успешного создания модели на основе органоидов. Отсутствие полной диссоциации трёхмерных органоидов, приводящее к образованию крупных фрагментов, может ухудшить прилипывание клетки к поверхности культуры, а длительное воздействие диссоциационного реагента более 30 минут снижает жизнеспособность клетки. Кроме того, важно поддерживать стабильный интервал прохода примерно в семь дней до диссоциации и засеяння, так как физиологическое состояние органоидов сильно влияет на их способность прикрепляться и дифференцироваться. Ещё одним критически важным фактором, влияющим на успешное развитие модели на основе органоидов простаты, является плотность посевов. Концентрация посева, использованная здесь, была оптимизирована для дифференцировки в течение 7 дней. Увеличение или уменьшение этой концентрации, скорее всего, приведёт к разным временам дифференцировки. Кроме того, недостаточная ресуспензия клеток перед покрытием может привести к неравномерному распределению клеток по колодцам, что приводит к переменной плотности клеток, что, в свою очередь, влияет как на пролиферацию, так и на дифференцировку. Кроме того, как и в других органоидных моделях, различные партии ЭКМ или факторов роста могут влиять на способность роста и дифференциации. Поэтому важно убедиться, что модель на основе органоидов сохраняет последовательный фенотип после изменения партии или номера партии фактора роста.

После установления модели на основе органоидов параметры инфекции также должны быть тщательно оптимизированы. Для достижения устойчивого и воспроизводимого уровня инфекции часто требуются различные МОИ в зависимости от бактериального штамма и выбранного показателя. Для штамма UPEC UTI89 (используется здесь ив 32) и для нескольких изолятовпростатита 32 MOI 100 был достаточным для получения надёжного количества инфицированных клеток в периоды сцепления, инвазии и репликации. Однако если инкубация клеток с бактериями необходимо продлить более 1 часа, следует использовать более низкий MOI для предотвращения экстраклеточного роста UPEC в среде и последующей токсичности клеток. В этом протоколе инфекция оценивалась с помощью двух методов: I) проточная цитометрия для количественного определения доли инфицированных клеток и II) конфокальная микроскопия для оценки локализации бактерий. Однако могут использоваться и другие подходы, например, анализы на формирование колоний для измерениябактериального 32, иммунокрашивание для обнаружения маркеров хозяинаили бактерий 32, а также транскриптомические анализы для профилирования ответов хозяина.

Хотя модель на основе органоидов предстательной железы обеспечивает физиологически значимую систему, при применении её к исследованиям инфекций следует учитывать несколько ограничений. Одним из основных ограничений этой модели является отсутствие резидентных или периферических иммунных клеток, что ограничивает её способность полностью захватывать ответ хозяина на инфекцию (например, рекрутация иммунных клеток или иммунно-опосредованный клиренс). Другие важные компоненты, отсутствующие в модели, включают сосудистую структуру, строму и нервы, которые могут влиять на взаимодействие хозяина и патогена. Включение дополнительных типов клеток, таких как стромальные фибробласты, иммунные клетки и эндотелиальные клетки, поможет воссоздать более полную тканевую микросреду. Современные системы ко-культуры или микрофлюидные платформы органа на чипе могут дополнительно поддерживать сложные клеточные взаимодействия и позволять динамические исследования инфекции. Кроме того, при использовании органоидов, полученных из животных моделей, необходимо учитывать различия, специфичные для вида, особенно при изучении патогенов, специфичных для человека. Хотя наша предыдущаяработа 32 показала, что результаты модели на основе органоидов предстательной железы мышей могут быть воспроизведены в человеческих тканях, межвидовые вариации в регуляции генов, экспрессии рецепторов или гормональных ответах всё же могут ограничивать прямое значение модели для человеческой физиологии. Включение органоидов, полученных от человека, по возможности повысит трансляционную ценность, позволяя изучать специфические для человека взаимодействия и реакции патогенов. Хотя эти дополнения могут укрепить органоидные модели как мощные инструменты для изучения биологии простаты, патогенезу инфекций и терапевтического развития, чисто эпителиальная модель, которую мы представляем, предлагает упрощённую и разделённую систему. Это позволяет целенаправленно исследовать эпителиально-специфические взаимодействия хозяина и патогена без вмешательства других компонентов ткани.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эта работа была поддержана BMFTR (FiRe-UPec, 01KI2107 to C.A.), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG GRK 2157; 3D тканевые модели для изучения микробных инфекций человеческими патогенами, проект 11, до C.A.). Благодарим Натали Буркард и Николя Шлегеля (Университетская больница Вюрцбурга) за поддержку ECIS1600R оборудованием. Схемы создавались с помощью BioRender.com.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
48 скважинных пластинСарштедт83.3923Форма дна: плоская
5&альфа;-Андростан-17&бета;-ол-3-один дигидротестостеронСигма-ОлдричA8380Он получил обозначение DHT. Стандартный раствор 10μ М в 100% этаноле
8-колодящий ПЭТ-слайд с 40 электродами на каждую скважину Прикладная биофизика8W10E+Слайды, используемые для измерений TEER
96 скважинных пластинСарштедт82.1583Форма низа: коническая
Advance Dulbecco' модифицированный Eagle medium/F12 Термо Фишер Сайентифик12634028При добавлении 10 ммол L&minus он получил обозначение adDMEM/F12+/+; 1 HEPES и 1x GlutaMAX
АмпипилинРотK029.2 Концентрация запаса 100 мг/мл
Антиантитела к CD24aProteintech10600-1-APПервичные антитела; разбавление 1:100 в 1x PBS 1%BSA
Антицитокератин 5 Alexa Fluor 647 антитела Abcam ab193895Первичные антитела; разбавление 1:100 в 1x PBS 1%BSA
анти-Rabbit IgG Alexa Fluor 488  АнтителаИнвитрогенA21441Вторичные антитела; разбавление 1:500 в 1x PBS 1%BSA
Анти-ZO-1 поликлональное антителоProteintech21773-1-APПервичные антитела; разбавление 1:750 в 1x PBS 1% BSA
B27, 50xТермо Фишер Сайентифик12587010
Бычий рогатый скот, сывороточный альбумин (BSA) Фракция V, NZ-OriginРот8076.3Компонент блокирующего буфера, используемого при 1% в 1x PBS
камерные и микро-Слайды 8 скважинИбиди80806Модификация поверхности: ibiTreat
Коническая трубка (15 мл)Сигма ОлдричT1943Плоское дно лучше подходит для мелких гранул. 
Динатрий этилендиаминетра-ацетат 2H2O (ЭДТА)Roth 8043.2Самодельный: 93,0 г на 400 мл H2O, отрегулировать pH до 8,0, только объём с H2O до 500 мл; 0,5 млн EDTA; Компонент буфера потокового цитометра
Сбалансированный сольный раствор Дульбекко (DPBS)Gibco14190-144PBS
Микроскоп ECHO Revolve ЭХО
ECIS  Z-Theta -  Система анализа клеток на основе импедансаПрикладная биофизикаECIS  Z-ThetaСистема включает: станции на 16 и/или 96 скважин; внешний управляющий модуль; Ноутбук ПК; программное обеспечение для управления, получения и отображения ECIS; модуль повышенного поля для автоматизированной миграции ячеек и электропорации 
Сыворотка для плода (FBS) SuperiorСигма ОлдричS0615Компонент буфера потокового цитометра; компонент культурной среды клеточной линии 293T; компонент культурной среды HEK293T клеточной линии
Флэш Фаллоидин Ред 594Биолегенда424203Разбавление 1:250 в 1x PBS 1%BSA
Буфер потокового цитометра1x PBS, 10% FBS, 5 mM EDTA
Gentamicin Сигма ОлдричG1272
GlutaMAX Термо Фишер Сайентифик35050-038L-аланил-L-глутамин дипептид, компонент adDMEM/F12+/+ 
Гарвардский биохром Ultrospec 10 Cell DensitymeterFisher Scientific10704417
HCS CellMask — насыщенно-красная краскаЖизненные технологииH32721Разбавление 1:1 000 в 1x PBS 1% BSA
HEK293T клеточная линия, трансфектована с помощью вектора экспрессии Noggin-Fc мышиКлеточная линия от профессора доктора КлеверсаИспользовался для производства Noggin; среда для культуры: 500 мл DMEM, с высоким содержанием глюкозы, GlutaMAX, пируват (Gibco Life Technologies, 31966) + 50 мл FBS; Farin и др. Гастроэнтерология 143.6 (2012): 1518-1529
HEPES Термо Фишер Сайентифик15630056Компонент adDMEM/F12+/+ 
Hoechst 33342 Жизненные технологииH3570Разбавление 1:5 000 в 1x PBS
Эпидермальный фактор роста человека (EGF) PeprotechAF-100-15Запас концентрации 500 и микро; g/mL
Инокуляционные петлиСарштедт86.1567.010
Инокуляционные трубкиСарштедт62.515.006
Конфокальный микроскоп Leica Stellaris 5Leica
Бульон Лурия Бертани (LB бульон)Roth X968.1
МатригельКорнинг356231Внеклеточная матрица (ECM)
N-ацетилцистеин Сигма-ОлдричA9165-25GЗапас концентрации 500 мМ
Главный министр Ноггин
NovoCyte Quanteon AgilentПотоковый цитометр
Параформальдегид (PFA)Сигма ОлдричP6148использовался при 4% в 1x PBS, 4% сахарозы
ПримоцинInvivogenAnt-pm-1
Q-VETTES полумикроRatiolab2712120
RHOKi (Y-27632)AbMoleM1817ингибитор RhoA/ROCK; Концентрационный запас 10 мМ
R-spodin1 CM
R-Spondin1, экспрессирующий 293T-клеточную линиюСигма ОлдричSCC111Используется для производства R-spo1 CM; культурная среда: 500 мл DMEM, высокий уровень глюкозы, GlutaMAX, пируват (Gibco Life Technologies, 31966) + 60 мл FBS 
TGFβ i (A-83-01)Токрис2939ингибитор ALK4/5/7; Концентрационный запас 5 mM 
Triton X-100 Сигма ОлдричT9284использовал 0,5% разбавленный в PBS 1x
Фермент TrypLE Express Gibco12605028Ферментативный агент для диссоциации клеток для переваривания 3D-органоидов простаты мыши
Уропатогенный <эм>Escherichia coli штамм UTI89Штамм WT от профессора доктора Добриндтатрансформирован с помощью pFPV-mCherry (addgene #20956)

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Samanta, L., Parida, R., Dias, T. R., Agarwal, A. The enigmatic seminal plasma: A proteomics insight from ejaculation to fertilization. Reprod Biol Endocrinol. 16 (1), 1-11 (2018).
  2. Ma, C., Su, H., Li, H. Global Research Trends on Prostate Diseases and Erectile Dysfunction: A Bibliometric and Visualized Study. Front Oncol. 10, 627891(2021).
  3. Roehrborn, C. G. Benign prostatic hyperplasia: an overview. RIU. 7 (Suppl 9), S3-S14 (2005).
  4. Calhoun, E. A., et al. The economic impact of chronic prostatitis. Arch Intern Med. 164 (11), 1231-1236 (2004).
  5. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries. CA Cancer J Clin. 71 (3), 209-249 (2021).
  6. Krieger, J. N., Nyberg, L., Nickel, J. C. NIH consensus definition and classification of prostatitis [5]. JAMA. 282 (3), 236-237 (1999).
  7. Khan, F. U., et al. Comprehensive overview of prostatitis. Biomed Pharmacother. 94, 1064-1076 (2017).
  8. Lipsky, B. A., Byren, I., Hoey, C. T. Treatment of bacterial prostatitis. Clin Infect Dis. 50 (12), 1641-1652 (2010).
  9. Krieger, J. N., Thumbikat, P. Bacterial Prostatitis: Bacterial Virulence, Clinical Outcomes, and New Directions. Microbiol Spectr. 4 (1), (2016).
  10. Mizokami, A., Gotoh, A., Yamada, H., Keller, E. T., Matsumoto, T. Tumor necrosis factor-alpha represses androgen sensitivity in the LNCaP prostate cancer cell line. J Urol. 164 (3 Pt 1), 800-805 (2000).
  11. Lin, H. P., et al. Difference in protein expression profile and chemotherapy drugs response of different progression stages of LNCaP sublines and other human prostate cancer cells. PLoS ONE. 8 (12), e82625(2013).
  12. Conte, M. P., et al. The adherent/invasive escherichia coli strain lf82 invades and persists in human prostate cell line rwpe-1, activating a strong inflammatory response. IAI. 84 (11), 3105-3113 (2016).
  13. Pennanen, P., et al. The effects of metformin and simvastatin on the growth of LNCaP and RWPE-1 prostate epithelial cell lines. Eur J Pharmacol. 788, 160-167 (2016).
  14. Abate-Shen, C., Shen, M. M. Mouse models of prostate carcinogenesis. Trends Genet. 18 (5), S1-S5 (2002).
  15. Rudick, C. N., et al. Uropathogenic Escherichia coli induces chronic pelvic pain. IAI. 79 (2), 628-635 (2011).
  16. Irshad, S., Abate-Shen, C. Modeling prostate cancer in mice: Something old, something new, something premalignant, something metastatic. Cancer Metastasis Rev. 32 (1-2), 109-122 (2013).
  17. Lupo, F., Rousseau, M., Canton, T., Ingersoll, M. A. The Immune System Fails to Mount a Protective Response to Gram-Positive or Gram-Negative Bacterial Prostatitis. J Immunol. 205 (10), 2763-2777 (2020).
  18. Peehl, D. M. Primary cell cultures as models of prostate cancer development. Endocr Relat Cancer. 12 (1), 19-47 (2005).
  19. Centenera, M. M., Raj, G. V., Knudsen, K. E., Tilley, W. D., Butler, L. M. Ex vivo culture of human prostate tissue and drug development. Nat Rev Urol. 10 (8), 483-487 (2013).
  20. McClurg, U. L., et al. Human ex vivo prostate tissue model system identifies ING3 as an oncoprotein. Br J of Cancer. 118 (5), 713-726 (2018).
  21. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesisin a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Sci. 345 (6194), 1247125(2014).
  22. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  23. Aguilar, C., Alves da Silva, M., Saraiva, M., Neyazi, M., Olsson, I. A. S., Bartfeld, S. Organoids as host models for infection biology - a review of methods. Exp and Mol Med. 53 (10), 1471-1482 (2021).
  24. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  25. Karthaus, W. R., et al. Identification of multipotent luminal progenitor cells in human prostate organoid cultures. Cell. 159 (1), 163-175 (2014).
  26. Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Prot. 11 (2), 347-358 (2016).
  27. Co, J. Y., et al. et al Controlling Epithelial Polarity: A Human Enteroid Model for Host-Pathogen Interactions. Cell Rep. 26 (9), 2509-2520.e4 (2019).
  28. Stroulios, G., et al. Apical-out airway organoids as a platform for studying viral infections and screening for antiviral drugs. Sci Rep. 12 (1), 7673(2022).
  29. Mayorgas, A., et al. A Novel Strategy to Study the Invasive Capability of Adherent-Invasive Escherichia coli by Using Human Primary Organoid-Derived Epithelial Monolayers. Front Immunol. 12, 646906(2021).
  30. Tindle, C., et al. Adult stem cell-derived complete lung organoid models emulate lung disease in COVID-19. eLife. 10, e66417(2021).
  31. Aguilar, C., et al. Helicobacter pylori shows tropism to gastric differentiated pit cells dependent on urea chemotaxis. Nat Commun. 13 (1), 5878(2022).
  32. Guedes, M., et al. Uropathogenic Escherichia coli invade luminal prostate cells via FimH-PPAP receptor binding. Nat Microbiol. , 1-16 (2026).
  33. Uhlén, M., et al. Tissue-based map of the human proteome. Science. 347 (6220), 1260419(2015).
  34. Bar-Ephraim, Y. E., Kretzschmar, K., Clevers, H. Organoids in immunological research. Nat Rev Immunol. 20 (5), 279-293 (2020).
  35. Bose, S., Clevers, H., Shen, X. Promises and challenges of organoid-guided precision medicine. Med. 2 (9), 1011-1026 (2021).
  36. Puschhof, J., Pleguezuelos-Manzano, C., Clevers, H. Organoids and organs-on-chips: Insights into human gut-microbe interactions. Cell Host Microbe. 29 (6), 867-878 (2021).
  37. van der Vaart, J., Clevers, H. Airway organoids as models of human disease. J Intern Med. 289 (5), 604-613 (2021).
  38. Paužuolis, M., Samperio Ventayol, P., Neyazi, M., Bartfeld, S. Organoids as a tool to study the impact of heterogeneity in gastrointestinal epithelium on host-pathogen interactions. Clin Exp Immunol. 218 (1), 16-27 (2024).
  39. Kondo, J., Inoue, M. Application of cancer organoid model for drug screening and personalized therapy. Cells. 8 (5), 470(2019).
  40. Mulaudzi, P. E., Abrahamse, H., Crous, A. Insights on Three Dimensional Organoid Studies for Stem Cell Therapy in Regenerative Medicine. Stem Cell Rev Rep. 20 (2), 509-523 (2024).
  41. Peng, Z., Lv, X., Sun, H., Zhao, L., Huang, S. 3D tumor cultures for drug resistance and screening development in clinical applications. Mol Cancer. 24 (1), 93(2025).
  42. Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. J Exp Biol. 220 (17), 3007-3016 (2017).
  43. Fujii, M., et al. Human Intestinal Organoids Maintain Self-Renewal Capacity and Cellular Diversity in Niche-Inspired Culture Condition. Cell Stem Cell. 23 (6), 787-793.e6 (2018).
  44. Bartfeld, S., et al. In vitro expansion of human gastric epithelial stem cells and their responses to bacterial infection. Gastroenterology. 148 (1), 126-136.e6 (2015).
  45. Boccellato, F., et al. Polarised epithelial monolayers of the gastric mucosa reveal insights into mucosal homeostasis and defence against infection. Gut. 68 (3), 400-413 (2019).
  46. Tan, M. E., Li, J., Xu, H. E., Melcher, K., Yong, E. Androgen receptor: structure, role in prostate cancer and drug discovery. Acta Pharmacol Sin. 36 (1), 3-23 (2015).
  47. Zhou, Y., Bolton, E. C., Jones, J. O. Androgens and androgen receptor signaling in prostate tumorigenesis. J Mol Endocrinol. 54 (1), R15-R29 (2015).
  48. Xie, Q., Liu, Y., Cai, T., Horton, C., Stefanson, J., Wang, Z. A. Dissecting cell-type-specific roles of androgen receptor in prostate homeostasis and regeneration through lineage tracing. Nat Commun. 8 (1), 14284(2017).
  49. Vickman, R. E., et al. The role of the androgen receptor in prostate development and benign prostatic hyperplasia: A review. Asian J Urol. 7 (3), 191-202 (2020).
  50. Likos, E., Bhattarai, A., Weyman, C. M., Shukla, G. C. The androgen receptor messenger RNA: what do we know. RNA Biol. 19 (1), 819-828 (2022).
  51. Karthaus, W. R., et al. Regenerative potential of prostate luminal cells revealed by single-cell analysis. Science. 368 (6490), 497-505 (2020).
  52. McCray, T., et al. Vitamin D sufficiency enhances differentiation of patient-derived prostate epithelial organoids. iScience. 24 (1), 101974(2021).
  53. De Felice, D., et al. Rarγ-Foxa1 signaling promotes luminal identity in prostate progenitors and is disrupted in prostate cancer. EMBO Rep. 2024 (2), 443-469 (2024).
  54. Crowley, L., et al. A single-cell atlas of the mouse and human prostate reveals heterogeneity and conservation of epithelial progenitors. eLife. 9, 1-24 (2020).
  55. Cambuli, F., et al. Intra-epithelial non-canonical Activin A signaling safeguards prostate progenitor quiescence. EMBO Rep. 23 (5), e54049(2022).
  56. Kuo, W. T., Odenwald, M. A., Turner, J. R., Zuo, L. Tight junction proteins occludin and ZO-1 as regulators of epithelial proliferation and survival. Ann N Y Acad Sci. 1514 (1), 21-33 (2022).
  57. Yazici, D., et al. The epithelial barrier: The gateway to allergic, autoimmune, and metabolic diseases and chronic neuropsychiatric conditions. Semin. Immunol. 70, 101846(2023).
  58. Zeyneloglu, C., et al. The epithelial barrier theory proposes a comprehensive explanation for the origins of allergic and other chronic noncommunicable diseases. FEBS Lett. 599 (22), 3208-3243 (2025).
  59. Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoid Models for Infectious Disease. Annu Rev Med. 73 (1), 167-182 (2022).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Prostate Organoid ModelHost Pathogen InteractionsMouse Prostate OrganoidsEpithelial DifferentiationUropathogenic Escherichia ColiImmunofluorescence MicroscopyTwo Dimensional CultureCell AttachmentGentamycin Protection AssayConfocal Microscopy

Похожие статьи