Методическая статья

Стандартизированная изоляция и цитокиновое примирование мезенхимальных стромальных клеток, полученных из мышиного костного мозга, для усиления иммуномодуляции

DOI:

10.3791/69397

⸱

5 декабря 2025 г.

 ,  , 
1Molecular and Cellular Biology Laboratory, ICMR-National Institute for Research in Reproductive and Child Health, Indian Council of Medical Research (ICMR), 2Department of Medicine and Carbone Cancer Center, University of Wisconsin in Madison

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Здесь мы демонстрируем протокол изоляции мезенхимальных стромальных клеток, полученных из костного мозга мыши, а также метод цитокинного прайминга для усиления иммуносупрессивного эффекта BMSC на иммунные клетки.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) обладают сильной регенеративной и иммуномодуляционной функцией. Эти свойства делают MSC мощными клеточными фармацевтическими препаратами для лечения множества иммунных расстройств. Костный мозг является основным и наиболее часто используемым источником MSC. Доклинические механистические исследования с использованием мышиных моделей имеют решающее значение для получения знаний об оптимальных стратегиях доставки препарата для BMSC в клинических испытаниях на людях. Поэтому стандартизация процесса производства мышиных MSC также имеет решающее значение для достижения лучших терапевтических результатов. Одна из главных целей этого протокола — показать, как контролируемое интерферон-гамма (IFN-γ) прайминг усиливает внутренние иммуносупрессивные свойства BMSC. Мы описываем образование условной среды (КМ) из необработанных или предварительно лицензированных IFN-γ BMSC и оцениваем их биологическую активность с помощью первичных перитонеальных макрофагов. С помощью ELISA и проточного цитометрического профилирования протокол подробно описывает, как секретом, полученный из BMSC — особенно при подкреплении IFN-γ — обеспечивает противовоспалительной поляризации макрофагов, характеризующуюся повышенной выработкой IL-10 и маркерами, связанными с M2. В целом этот протокол устанавливает единую основу для создания функционально согласованных мышиных BMSC и оценки их иммуномодуляторной мощи. Снижая техническую вариабельность и обеспечивая визуальную и процедурную ясность, она способствует улучшению воспроизводимости в доклинических исследованиях MSC и способствует оптимизации стратегий внедрения MSC для трансляционных исследований.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мезенхимальные стромальные клетки, полученные из костного мозга (BMSC), имеют широкое применение как в доклинических, так и в клинических исследованиях. Их низкая иммуногенность, легкая доступность и способность к многолинейной дифференциации делают BMSC перспективными кандидатами для использования в клинических условиях в качестве клеточных фармацевтических препаратов 1,2,3. Их иммуносупрессивные и регенеративные свойства широко использовались в клинических исследованиях для лечения воспалительных заболеваний, таких как болезнь «трансплантат против хозяина» (GVHD)4,сепсис 5 и воспалительные заболевания кишечника (ВЗК)6. Стромальная ниша костного мозга включает гетерогенную популяцию стромальных клеток. Тем не менее, все МСК соответствуют критериям, определённым Международным обществом клеточной терапии (ISCT), которые включают: пластическое присоединение, экспрессию поверхностных рецепторов — CD73, CD90 и CD105 у человека, а также CD29, CD44 и CD90 у мышей — без экспрессии гемопоэтических или эндотелиальных маркеров — CD11b, CD14, CD19, CD34, CD45, CD79a, HLA-DR, а также способность к адипогенной терапии, хондрогенная, или остеогеннаядифференциация 7.

BMSC остаются функциональными за счёт высвобождения паракринных факторов, известных как секретом, включающих цитокины, хемокины, факторы роста, внеклеточные везикулы и различные другие растворимые и контактно-зависимыемолекулы 8,9. Секретом MSC модулирует нишу, взаимодействуя с элементами врождённой иммунной системыдвунаправленно 10. Факторы, выделяющиеся во время взаимодействия MSC с макрофагами, могут смещать макрофаги в сторону провоспалительного или противовоспалительного фенотипа11,12. Напротив, функциональное состояние МСК также регулируется локальными иммунными клетками — особенно макрофагами — через механизмы обратнойсвязи 11. Этот перекрёсток MSC и макрофагов незаменим для иммуносупрессивной функции MSC. Принятые переносные MSC снижают воспаление тканей только при наличии макрофагов, как это наблюдается на моделях у мышей с колитом. В отличие от этого, взаимодействие MSC с B- или T-лимфоцитами при отсутствии макрофагов недостаточно для оказания терапевтическогоэффекта 13.

Первое клиническое испытание третьей фазы с использованием аллогенных BMSC было проведено компанией Osiris Therapeutics в США для лечения стероидно-рефрактерного GVHD (NCT00366145)1. С тех пор было проведено множество доклинических и клинических исследований, хотя успех клинических испытаний не оправдал ожиданий, основанных на доклинических результатах. Для повышения успеха клинических испытаний на основе MSC необходима оптимизация стратегий применения лекарств. Понимание оптимального маршрута доставки, терапевтической дозы клеток и физиологического состояния клеток в момент оказания помощи крайне важно. Например, в модели мышей при колите in vivo исследования показали, что криоконсервированные МСК или внутривенное введение являются неоптимальными методами введения14.

Различные подходы, такие как предварительное лицензирование цитокинов, генетическая модификация или гипоксическая предусловленность, широко изучены для улучшения персистенции in vivo и терапевтической полезностиMSC 15. В модели ишемии задних конечностей мышей предварительная подготовка гипоксии (2%O2) улучшила пролиферационную и миграционную способность MSC за счёт увеличения экспрессии белка теплового шока — 78-кD глюкозорегулируемого белка (GRP78)16. Предварительное лицензирование IL-1β (интерлейкин-1 бета) увеличивает способность MSC использовать нейтрофилы, моноциты, лимфоциты и эозинофилы17. После доставки in vivo MSC подвергаются воздействию активированного T и NK-клеток, полученного IFNγ, который усиливает выработку индолеамина 2,3-диоксигеназы (IDO) MSC18. ИДО является важным компонентом секретома МСК, который снижает скорость пролиферации Т-клеток. Интересно, что иммуносупрессивная способность МСК снижается при совместном культивировании с IFNγ-/- мышинымиТ-лимфоцитами 19. Исследования показали, что предварительное лицензирование IFN-γ снижает скорость апоптоза, опосредованного Т-клетками, в криоконсервированных MSC 13,20. Прайминг IFNγ улучшает терапевтический эффектBMSC 13 . Все эти данные в совокупности указывают на незаменимую роль IFNγ в производстве более мощных иммуносупрессивных МСК.

Для определения наиболее эффективного способа доставки MSC широко используются животные модели с точки зрения их этической доступности. Для снижения вариабельности доклинических исходов крайне важно разработать оптимизированный метод производства MSC, обеспечивающий высокий выход, жизнеспособность клеток и стабильность современем 21. Прохождение MSC — важная переменная, которая может привести к различным терапевтическим результатам. Во время экстракорпорального культивирования пассирование может регулировать характеристику и силу МСК, и после определённого количества проходов клетки становятсястареющими 22. Поэтому в любом клиническом или доклиническом исследовании крайне важно быть последовательным в использовании номера пассажа MSC. Аналогично, согласованность с конкретным протоколом изоляции MSC также является ключевым фактором для достижения воспроизводимости результатов использования MSC. Среди многих подходов популярны методы выделения клеток на основе антител23, метод отрицательного отбора24, ферментноепищеварение 25 . Однако применимость этих методов зависит от источника, так как неправильное использование снижает урожайность, мощность и способность к дифференциации по трилинейности.

Здесь мы представляем стандартизированный протокол для изоляции и характеристики BMSC, с акцентом на предпочтительные номера проходов, технику криоконсервации и сбор среды условий, полученных из BMSC. Мы также предоставляем протокол для прайминга MSC с помощью IFN-γ и, наконец, демонстрируем сравнительное исследование того, как перитонеальные макрофаги по-разному реагируют на нормальные или предварительно лицензированные BMSC с IFN-γ.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Настоящее исследование было проведено с одобрения и в соответствии с рекомендациями комитета по этике животных Национального института исследований репродуктивного и детского здоровья ICMR (проект IAEC No.09/23) и Институционального комитета по уходу и использованию животных Университета Висконсин-Мэдисон. Для настоящего исследования использовались самки мышей C57Bl/6J возрастом от 6 до 8 недель, выведенные и содержащиеся в специфических условиях, свободных от патогенов (SPF).

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы следовали протоколам биобезопасности, установленным Институциональным комитетом по биобезопасности (IBSC), работая над исследованиями in vivo или in vitro . Вкратце, для изучения на животных мы сохраняли аккуратное обращение, чтобы снизить стресс и риск травм. Мы использовали подходящие средства индивидуальной защиты, такие как защитные очки, перчатки, лабораторный халат, маску и одноразовую шапочку для буффанта. Для химических реагентов биологической опасности, таких как DMSO, мы использовали биобезопасный шкаф для обработки химикатов. Мы использовали специальный контейнер для отброса биологически опасных реагентов или острых предметов.

1. Выделение мезенхимальных стромальных клеток мышиного костного мозга

ПРИМЕЧАНИЕ: После сбора задних конечностей остальные этапы должны выполняться в ламинарном капюшоне с культурой тканей и стерильными асептическимитехниками 26.

  1. Усыпить мышь путём вывиха шейки матки, затем тщательно промыть её 70% этанолом. С помощью офтальмологических щипцов аккуратно подправьте кожу брюшной полости между двумя тазобедренными суставами мыши и аккуратно разрежьте кожу ножницами.
  2. Отдельте кожу, аккуратно потянув к стопе. Обрезайте тазобедренные суставы и лодыжку, чтобы освободить обе задние конечности.
  3. Быстро перенесите задние конечности в ледяной ДМЭМ с добавлением 1 пенициллина/стрептомицина и 2% FBS, чтобы избежать повреждения тканей до дальнейшего вскрытия.
  4. Возьмите каждую заднюю конечность в чашку Петри с ледяной средой. Аккуратно отдерьте мышцу и соединительные ткани с бедренной и большеберцовой кости, аккуратно соскребая диафиз кости. Переложите очищенную кость в новую чашку Петри с ледяной средой.
  5. Отсоедините бедренную и большеберцовую кости, затем сделайте разрез на концах большеберцовой и бедренной кости чуть ниже конца полости костного мозга. Максимально защитите полость костного мозга во время процедуры рассечения бедренной кости и большеберцовой кости.
  6. Возьмите стерильный шприц объемом 1 мл с иглой 21 г и возьмите среду из пластины Петри. Стерильными щипцами держите вырезанную бедренную кость и аккуратно вводите иглу в полость костного мозга. Промывайте полость костного мозга, чтобы получить костный мозг. Повторяйте этот шаг, пока кость не станет белой. Промывайте большеберцовую кость так же.
  7. Аккуратно вводите и вытягивайте пипетку, чтобы рассеять комки клеток в чашке Петри. Используя фильтрующую сетку диаметром 70 мм, фильтруйте суспензию клетки, чтобы удалить костные частицы. Соберите фильтрат и центрифугуйте его при температуре 230 г в течение 5 минут при комнатной температуре.
  8. Отбросьте супернатант и снова суспензируйте гранулу с полным материалом (DMEM, 10% FBS, 5% L-глутамина, пенициллин и стрептомицин). Измерьте выход и жизнеспособность клеток по исключению Trypan blue и с учетом гемоцитометра.
  9. Семена клеток в колбу, обработанную тканевой культурой, размером 75см² , с плотностью клеток 5000 клеток/см² в полном средеDMEM 13. Удалять неадгезирующие гемопоэтические клетки после 48 часов культуры, меняя среду. Заменяйте медиа на свежие каждые 3-4 дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте флягу для клеточной культуры вместо чашки, чтобы избежать загрязнения. Не доставайте флягу из инкубатора часто, чтобы проверить клетки, так как это нарушает их рост.
  10. Чтобы отделить клеточные клетки, промыйте их 1 раза PBS, добавьте 0,25% трипсина-ЭДТА, держите клетки в трипсине 5 минут. Это помогает отделить клетки от колодца.
  11. Добавьте полный материал, повторите суспензию и центрифугуйте при температуре 230 г в течение 5 минут при комнатной температуре. Отбросьте супернатант. Добавьте полную среду DMEM в гранулу, повторно суспендуйте и засейте клетки с плотностью 5 000 клеток/см².
  12. Пропускайте клетки каждые 3-4 дня, меняя среду каждые 3-4 дня. После третьего отрывка проанализируйте MSC с помощью потокового цитометрического анализа, как описано на шаге 6. Используйте клетки прохода 3-5 для любого эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для криоконсервации клеток для будущего экспериментального использования центрифугуйте их при нужном объёме, реуспензуйте в замороженной среде, храните 1 x 106 клеток в 1 мл замораживающей среды в каждом криовиальном процессе при -80 °C на ночь, после чего переведите клетки в азот для длительного использования.
    Состав замораживающих сред: 70% DMEM, 20% FBS, 10% DMSO.

2. Подготовка кондиционированной среды из культивированных MSC

  1. Засейте клетки с плотностью 5000 клеток/см, 2 дюйма 6 колодцев. Культура MSC до 80% слияния.
  2. Соберите кондиционированную среду из клеточной культивирующей пластины и центрифугуйте при 230 г в течение 5 минут при комнатной температуре, затем отфильтруйте и используйте для обработки.

3. Подготовка IFNγ праймерованной среды из культивированных MSC

  1. Посейте клетки в пластине из 6 колодцев при плотности 5000 клеток/см². Обрабатывайте клетки 25 нг/мл IFNγ в течение 48 часов. Проведите исследование, зависящее от дозы, чтобы получить оптимальный эффект IFNγ на МСК. Для этого эксперимента выберите диапазон концентраций IFNγ — 5, 10, 25, 50, 100 нг/мл, чтобы предварительно лицензировать MSC. Концентрации 5 и 10 нг/мл были значительно менее эффективны при поляризации макрофагов, и оптимальной концентрацией было определено 25 нг/мл (Дополнительный рисунок 1).
  2. После декантирования среды с IFN-γ промывайте скважину 2 раза PBS, чтобы обеспечить полное удаление IFN-γ. Любой остаточный IFN-γ может повлиять на результат исследования.
  3. Инкубировать клетки ещё 24 часа в нормальной среде DMEM при 37 °C. Через 24 часа собирайте кондиционированную среду по шагу 2.

4. Выделение и культивирование макрофагов, полученных из перитонеальных полостей

  1. Введите 5 мл ледяного PBS (с 3% FBS) в брюшинную полость мышей, затем мягко массируйте брюшную полость.
  2. Восстанавливайте раствор PBS с помощью стерильного шприца. Собирайте в трубку на 10 мл. Центрифугуйте раствор при 300 x g в течение 5 минут.
  3. Удалите супернатант. Растворить гранулу в полной среде RPMI (RPMI, 10% FBS, 1x пенициллин и стрептомицин). Покройте клетки с объёмом 5000 клеток/см².
  4. Удалите неприлипшие клетки через 24 часа и посевывайте до слияния. Используйте клетки для дальнейших экспериментальных процедур по мере необходимости.

5. Ферментно-связанный иммуносорбентный анализ

  1. Для обнаружения IL-10, полученного из макрофагов, обработанных BMSC-CM, следуйте следующим шагам.
    1. Обрабатывайте макрофаги BMSCs-CM в течение 24 часов и забирайте супернатант на следующий день.
    2. Измерьте количество IL-10 с помощью комплекта IL-10 ELISA согласно инструкциям производителя.
  2. Для обнаружения CCL2, полученного из BMSC или обработанных IFNγ BMSC, используйте комплект CCL2 ELISA согласно инструкциям производителя.

6. Анализ потоковой цитометрии для MSC и фенотипирования макрофагов

  1. Посейте клетки в пластине с 6 колодцами и сделайте слияние. Промывайте 1 раз с PBS (1 мл), затем трипсинизуйте. Добавьте трипсин в концентрации 0,25% и инкубуйте 5 минут в трипсине, чтобы полностью поднять клетки с пластины.
  2. Добавьте медиа для деактивации активности трипсина. Соберите клетки в полистироловую трубку объёмом 10 мл. Центрифуга при 300 x g в течение 5 минут при 4 °C для макрофагов и 230 x g на 5 минут при 4 °C для BMSC.
  3. Удалите супернатант и снова суспензируйте клетки в 2 мл буфера для окрашивания (ледяной PBS с 2% FBS и 0,05% азида). Вращайте при 230 x g в течение 7 минут. Декантируйте и разрушайте гранулу. Добавьте 1 мл красителя Ghost red 780 жизнеспособности и 50 мл буфера FACS, снова суспензируйте и поместите в проточную трубку. Окрашивайтесь в темноте 30 минут.
  4. Через 30 минут промой клетки 1 мл буфера для морилки. Декантируйте и разрушайте гранулу. Добавьте желаемый объём контроля антител или изотипа. Инкубировать ещё 30 минут в темноте. Промой клетки с помощью буфера для морилки, декантирования и повторного взвешивания в 400 мл буфера для морилки. Пробирка готова к извлечению.
  5. Для подготовки живого окрашивателя после трипсинизации и центрифугирования растворите гранулу в 2 мл буфера для окраски. Удалите 1 мл в другой микроцентрифугной пробирке и добавьте 10 мл ДМСО для уничтожения клеток. Вихрь и инкубация в течение 10 минут. Теперь смешайте его с остальным 1 мл раствора, содержащего ячейку, в проточной трубке.
  6. Добавьте 1 мл буфера для окрашивания и открените при температуре 230 г в течение 7 минут. Декантируйте и разрушайте гранулу. Добавьте 1 мл красителя Ghost red 780 жизнеспособности и 50 мл буфера FACS, снова суспензируйте и поместите в проточную трубку. Окрашивайтесь в темноте 30 минут. Через 30 минут промой клетки 1 мл буфера для морилки. Декантируйте и разрушайте гранулу. Заново подвесьте его в 400 мл буфера для морилки. Живой окрашиваемый образец готов к получению.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для окрашивания макрофагов у мышей перед стандартным протоколом окрашивания следует добавить дополнительный этап окрашивания. Чтобы избежать неточности в данных о потоке, блокировка FC-рецептора является критически важным шагом, который предотвращает связывание неспецифических антител с Fc-рецепторами на клетках. Для блокировки Fc-рецептора добавьте 1 мл Fc-блокирующего реагента (очищенного антитела против мышей CD16/CD32) в суспензию клетки и инкубировать 15 минут при комнатной температуре. Выполните оставшиеся этапы окрашивания антител от потока, не смывая реагент, блокирующий Fc.
  7. Для анализа данных потока сначала следует выбирать отдельные ячейки на основе параметров прямого и бокового рассеяния. Этот шаг крайне важен для удаления мусора и элементарных заполнителей. Затем отдельные клетки будут закрыты на основе живого окрашивания. Проведите дополнительный анализ на основе популяции живых клеток (дополнительный рисунок 2).

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общая экспериментальная схема описана на рисунке 1. Костный мозг мыши был собран как с бедренной, так и с большеберцовой кости, был засеян, пропущен и характеризуется циркуляционной цитометрией (рисунок 1A). Были собраны среды для условий BMSC (BMSCs-CM) с предварительной лицензией IFNγ или без него, а несколько флаконов BMSCs-CM хранили при -80 °C для будущих экспериментальных нужд (рисунок 1B).

Клетки, полученные из костного мозга, были подсчитаны гемоцитометром (рисунок 2A) и засеяны с плотностью 5000 клеток/см² в полной среде DMEM. Через 48 часов меняли первую среду, а затем — каждые 3-4 дня, до полного слияния. Мы прошли через клетки, когда они достигли 80% слияния (рисунок 2B). В четвёртом отрывке мы охарактеризовали клетки на основе экспрессии специфических для MSC маркера. Клетки были положительными CD44, CD29 и CD90, а также отрицательными на CD45, CD11b и CD34 (см. рисунок 2C). BMSC могут различаться на адипогенные, остеогенные и хондрогенныелинии 14, 27, 28 и 29. Это поддерживает рекомендации Международного общества клеточной терапии по идентификации.

Для понимания иммуносупрессивного эффекта MSC-CM мы обрабатывали макрофаги, полученные из перитонеальной полости (PMφ), а также применяли BMSCs-CM (рисунок 3A). Мы провели анализ потоковой цитометрии макрофагов, обработанных BMSC-CM (рисунок 3B,C). Макрофаги, приспособленные к культуре, проживающие в брюшной полости, были окрашены поверхностными маркерами, специфическими для M1 и M2. Мы предотвратили связывание неспецифических антител путём инкубации макрофагов очищенным противомышиным CD32/CD16 (Mouse Fc Block перед добавлением окрашивающих антител) до начала окрашивания клеточных маркеров. Изучалась экспрессия специфических для M1 маркеров, CD86 и iNOS, а также специфических для M2 маркеров CD206 и CD163. Клетки сначала были гейтированы на основе гемопоэтического маркера CD45.2 (для C57BL6). ИЛ-10 является фирменным цитокином фенотипа M2. IL-10, выделяемый макрофагами, обработанными MSC-CM, был измерен в исследовании ELISA (рисунок 3D). Поскольку LPS/IFNg индуцирует поляризациюM1 30, такое лечение служило отрицательным контролем.

CCL2 — один из характерных цитокинов, выявленных в секретоме MSC, который запускает поляризациюмакрофагов 13. CCL2, выпущенный MSC, был обнаружен ELISA (рисунок 3E). Для подтверждения роли CCL2 в поляризации макрофагов мы предварительно обработали макрофаги ингибитором CCR2, затем обработкой MSC-CM (рисунок 3F), и поляризация макрофагов была вновь обнаружена в исследовании IL-10 ELISA (рисунок 3F).

Наши результаты ясно демонстрируют, что секретом МСК может вызывать противовоспалительные поляризации макрофагов, что подтверждается увеличением выработки IL-10 в макрофагах кишечника после обработки кондиционированными средами (Рисунок 3).

Рисунок 1
Рисунок 1: Блок-схема исследования. (A) Мыши C57BL/6 были усыплены. Костный мозг был промыт из бедренной кости и большеберцовой кости, центрифугирован и обработан в течение недели, при этом медиа менялся каждые 3 дня. МСК проходили и в 4-м пассаже характеризулись изучением потоковой цитометрии и адипогенеза. (B) Проход 4 MSC был засеян в пластинах с 6 колодцами, в одном наборе с добавлением IFNγ при концентрации 25 нг/мл, а в другом — без обработки. Через 48 часов замените обычные свежие полные DMEM-носители. Через 24 часа соберите среду из пластины, центрифуги и фильтра. Храните условный носитель при -80 °C для дальнейшего использования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2: Фенотипическая характеристика. (A) Клетки, полученные из костного мозга, подсчитывались гемоцитометром перед засевом. (B) Клетки росли до 80% слияния перед каждым проходом. (C) Клетки прохода 4 характеризулись анализом потоковой цитометрии с использованием специфических MSC-маркеров у мышей. Шкала соответствует размеру 100 мм. Рисунок 2C был изменён из14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Анализ секретомов BM-MSC. (A) Схема экспериментов. (B) Репрезентативный графический цитометрический анализ фортока PMφ, обработанного MSC-CM. Клетки, полученные из брюшины, были зафиксированы на основе гемопоэтических маркеров CD45.2-положительной популяции. Выбранная популяция дополнительно окрашивалась маркерами-специфическими для M1 CD86 или iNOS, специфическими для M2 маркерами CD206 или CD163, а также двойным окрашиванием CD11b в каждом случае. (C) Процент популяции клеток M1 или M2 был количественно измерен. Популяция клеток, обработанная LPS/IFNγ, выступала в качестве отрицательного контроля. (D) ИФА проводилась для количественной оценки IL-10, выделяемого MSC-CM-обработанным PMφ. ELISA проводился для количественной оценки (E) CCL2, выпущенного MSC-CM, (F) IL-10, выпущенного PMφ. Как показано на рисунке, один набор экспериментов проводился в присутствии антагониста CCR2. Полоски ошибок представляют среднее ± SEM. Данные представляют собой 3 независимых эксперимента с 3 образцами MSC в каждой группе. T-тест Студента использовался для статистического анализа всех экспериментов. ∗p < 0,05, ∗∗p < 0,01, ∗∗∗p < 0,001, ∗∗∗∗p < 0,0001. Рисунок 3B-F был изменён из13. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Дополнительный рисунок 1: BMSC были предварительно лицензированы с IFNg 0, 5, 10, 25, 50, 100 нг/мл. Макрофаги обрабатывались предварительно лицензированными IFNγ MSCs-CM. ELISA проводился для количественной оценки IL-10, выделяемого PMφ, обработанным MSC-CM. Полоски ошибок представляют среднее ± SEM. Данные представляют собой 3 независимых эксперимента с 3 образцами MSC в каждой группе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: (A-C) Отдельные ячейки были выбраны на основе параметров прямого и бокового рассеяния. (D) Одиночные камеры были закрыты на основе живых окрашиваний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выделение мезенхимальных стромальных клеток, полученных от костного мозга мышиного мозга, является ключевым методом для понимания внутренних иммуносупрессивных и регенеративных свойств МСК в животных моделях in vivo . Хотя метод кажется простым и простым, необходимо выполнить несколько шагов с точностью, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение и обеспечить оптимальный выход клетки. Каждый этап процедуры должен проводиться асептически в ультрачистой среде.

Чтобы избежать низкой урожайности клеток, выбирайте мышей в возрастной группе 6-8 недель. При обрезании концов бедренной кости и большеберцовой кости полость костного мозга должна быть максимально защищена, а процесс промыва должен быть плотным, но плавным, чтобы обеспечить полное удаление костного мозга. Изолированные клетки следует инкубировать при соответствующей концентрации CO₂ и в увлажнённых условиях. Во время смены среды необходимо аккуратно промыть клетки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) перед заменой среды, чтобы устранить загрязняющие гемопоэтические клетки. Чтобы избежать заражения гемопоэтическими клетками, во время повторного прохода трипсинизация не должна превышать 5 минут. На раннем этапе смена среды не должна быть слишком быстрой, так как частые изменения среды могут вызвать бактериальное загрязнение.

В каждом проходе необходимо криоконсервировать клетки несколькими партиями для поддержания консистенции и доступности. Для прайминга IFN-γ необходимо провести эксперимент, зависящий от дозы, чтобы определить наиболее эффективные условия предварительного лицензирования для среды, обусловленной MSC. В наших экспериментах мы тестировали диапазон концентраций IFNγ, то есть 5, 10, 25, 50, 100 нг/мл, чтобы предварительно лицензировать MSC. Затем оптимальной концентрацией было определено 25 нг/мл.

Для сохранения целостности данных для всех экспериментальных тестов следует последовательно использовать ячейки с определённым номером пассажей. Для характеристики потоковой цитометрической характеристики MSC следует использовать клетки из третьего прохода и выше для обеспечения надёжного обнаружения экспрессии поверхностных рецепторов. Различение живых и мёртвых клеток при окрашивании потоковой цитометрии крайне важно, так как снижает вероятность ложноотрицательных результатов.

Результаты представляют собой ключевой механизм, с помощью которого экзогенно доставляемые BMSC ослабляют воспаление кишечника во время колита. Прайминг IFN-γ усиливает влияние среды, обусловленных MSC, на поляризацию макрофагов. CCL2, выделяемый из BMSC, — это критический хемокин, который действует на макрофаги, индуцируя поляризацию M2. Наши предыдущие результаты показали, что хемокины CCL2 и CXCL12 совместно действуют на макрофаги, способствуя их поляризации. Это событие крайне важно для распространения противовоспалительных сигналов через последующий модулирование фенотипов Т-клеток и В-клеток13.

В нашем исследовании мы специально следовали простому протоколу выделения BMSC, основанному на пластичном прилипающем свойстве MSC. Для выделения BMSC на основе специфических для MSC поверхностных маркеров можно использовать с помощью потоковой цитометрии или иммуномагнитной сортировки. Однако при обоих этих методах существует риск потери большого количества клеток во время подготовки образца. Поскольку костный мозг мышей содержит очень мало MSC (оценивается примерно в 0,001–0,08% клеток костного мозга), мы предпочли стандартный метод изоляции с пластическим прилипыванием на основе свойств. Однако у этого метода есть несколько недостатков. Основной риск — это заражение гемопоэтических клеток, что может снизить терапевтическую способность МСК. Поэтому определение конкретного номера проходов крайне важно, когда значительная популяция клеток экспрессирует специфические поверхностные рецепторы MSC.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Стипендия от DBT/Wellcome Trust India Alliance для младших специалистов для J.G. Рукопись содержит фонд NIRRCH ID: REV/1502/02-2023 лаборатории DM. Эта работа была поддержана Национальным институтом здоровья, Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварения и почек, R01DK109508 присуждена Ж. Галипо. Это исследование также было поддержано грантом поддержки Онкологического центра Карбон Университета Висконсина P30 CA014520.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Клетка для культивирования с вертикальным ламинарным потоком, оснащённая ультрафиолетовым светом 
Стерильные хирургические ножницы
25/75 см2 колба  
Шприцы 5/10 мл с иглами 27G
6-well культурные блюда 
АккутазаКорнинг#AT104
Anit-Mouse F4/80 APCБиолегенда#123116
Антимышиный CD 11b PEBD PharMingen#557397
Антимышиный CD 45.2 APCBD PharMingen#558702
Антимышиный CD163 Percp eFluor710eBioscience#46-1631-80
Антимышиный CD206 PEБиолегенда#141706
Антимышиный CD86 FITCBD PharMingen#553691
Антимышиный iNOS PE-Cy7eBioscience#25-5920-80
Комплект для ELISA CCL2Инвитроген#554722
Антагонист CCR2 (RS 102895)Sigma#R1903
Центрифуга 
DPBSКорнинг#21-031-CV
Модифицированный орлиный медиум Dulbecco (DMEM)Корнинг# 10-013-CV
Сыворотка плода крупного рогатого скотаSigma#F8067
Фильтрующая сетка (70 мм) 
Краска для жизнеспособности Ghost Red 780Тонбо-бионаука#13-0865-T100
IL-10 ELISA KitИнвитроген#88-7105-88
L-глутаминКорнинг#25-005-CI
Микроскоп с оборудованием для фазового контраста
Мышиный IFN и гамма;R& Системы D#485-MI-100
Пенициллин-стрептомицинКорнинг#30-002-CI
Крысиный антимышиный CD16/CD32BD PharMingen#553142
RPMImediumКорнинг#10-040-CV
Стерильные хирургические щипцы (прямые и изогнутые)
Инкубатор с контролем температуры и состава газа
ТрипсинКорнинг#25052-CL
Водяная баня с регулированием температуры

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Galipeau, J., Sensebe, L. Mesenchymal Stromal Cells: Clinical Challenges and Therapeutic Opportunities. Cell Stem Cell. 22, 824-833 (2018).
  2. Fan, X. L., Zhang, Y., Li, X., Fu, Q. L. Mechanisms underlying the protective effects of mesenchymal stem cell-based therapy. Cell Mol Life Sci. 77, 2771-2794 (2020).
  3. Pittenger, M. F., et al. Mesenchymal stem cell perspective: cell biology to clinical progress. NPJ Regen Med. 4, 22(2019).
  4. Kadri, N., Amu, S., Iacobaeus, E., Boberg, E., Le Blanc, K. Current perspectives on mesenchymal stromal cell therapy for graft versus host disease. Cell Mol Immunol. 20, 613-625 (2023).
  5. Premer, C., Hare, J. M., Yuan, S. Y., Wilson, J. W. Mesenchymal stem/stromal cells as a therapeutic for sepsis: a review on where do we stand. Stem Cell Res Ther. 16, 245(2025).
  6. Eiro, N., Fraile, M., Gonzalez-Jubete, A., Gonzalez, L. O., Vizoso, F. J. Mesenchymal (Stem) Stromal Cells Based as New Therapeutic Alternative in Inflammatory Bowel Disease: Basic Mechanisms, Experimental and Clinical Evidence, and Challenges. Int J Mol Sci. 23 (16), 8905(2022).
  7. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8, 315-317 (2006).
  8. Gonzalez-Gonzalez, A., Garcia-Sanchez, D., Dotta, M., Rodriguez-Rey, J. C., Perez-Campo, F. M. Mesenchymal stem cells secretome: The cornerstone of cell-free regenerative medicine. World J Stem Cells. 12, 1529-1552 (2020).
  9. Trigo, C. M., Rodrigues, J. S., Camoes, S. P., Sola, S., Miranda, J. P. Mesenchymal stem cell secretome for regenerative medicine: Where do we stand. J Adv Res. 70, 103-124 (2025).
  10. Giri, J., Modi, D. Endometrial and placental stem cells in successful and pathological pregnancies. J Assist Reprod Genet. 40, 1509-1522 (2023).
  11. Lu, D., Xu, Y., Liu, Q., Zhang, Q. Mesenchymal Stem Cell-Macrophage Crosstalk and Maintenance of Inflammatory Microenvironment Homeostasis. Front Cell Dev Biol. 9, 681171(2021).
  12. Galipeau, J. Macrophages at the nexus of mesenchymal stromal cell potency: The emerging role of chemokine cooperativity. Stem Cells. 39, 1145-1154 (2021).
  13. Giri, J., Das, R., Nylen, E., Chinnadurai, R., Galipeau, J. CCL2 and CXCL12 Derived from Mesenchymal Stromal Cells Cooperatively Polarize IL-10+ Tissue Macrophages to Mitigate Gut Injury. Cell Rep. 30, 1923-1934.e4 (2020).
  14. Giri, J., Galipeau, J. Mesenchymal stromal cell therapeutic potency is dependent upon viability, route of delivery, and immune match. Blood Adv. 4, 1987-1997 (2020).
  15. Kahrizi, M. S., et al. Recent advances in pre-conditioned mesenchymal stem/stromal cell (MSCs) therapy in organ failure: a comprehensive review of preclinical studies. Stem Cell Res Ther. 14, 155(2023).
  16. Lee, J. H., Yoon, Y. M., Lee, S. H. Hypoxic Preconditioning Promotes the Bioactivities of Mesenchymal Stem Cells via the HIF-1alpha-GRP78-Akt Axis. Int J Mol Sci. 18 (6), 1320(2017).
  17. Carrero, R., et al. IL1beta induces mesenchymal stem cells migration and leucocyte chemotaxis through NF-kappaB. Stem Cell Rev Rep. 8, 905-916 (2012).
  18. English, K., Barry, F. P., Field-Corbett, C. P., Mahon, B. P. IFN-gamma and TNF-alpha differentially regulate immunomodulation by murine mesenchymal stem cells. Immunol Lett. 110, 91-100 (2007).
  19. Sheng, H., et al. A critical role of IFNgamma in priming MSC-mediated suppression of T cell proliferation through up-regulation of B7-H1. Cell Res. 18, 846-857 (2008).
  20. Chinnadurai, R., et al. Cryopreserved Mesenchymal Stromal Cells Are Susceptible to T-Cell Mediated Apoptosis Which Is Partly Rescued by IFNgamma Licensing. Stem Cells. 34, 2429-2442 (2016).
  21. Fernandez-Santos, M. E., et al. Optimization of Mesenchymal Stromal Cell (MSC) Manufacturing Processes for a Better Therapeutic Outcome. Front Immunol. 13, 918565(2022).
  22. Mastrolia, I., et al. Challenges in Clinical Development of Mesenchymal Stromal/Stem Cells: Concise Review. Stem Cells Transl Med. 8, 1135-1148 (2019).
  23. Van Vlasselaer, P., Falla, N., Snoeck, H., Mathieu, E. Characterization and purification of osteogenic cells from murine bone marrow by two-color cell sorting using anti-Sca-1 monoclonal antibody and wheat germ agglutinin. Blood. 84, 753-763 (1994).
  24. Baddoo, M., et al. Characterization of mesenchymal stem cells isolated from murine bone marrow by negative selection. J Cell Biochem. 89, 1235-1249 (2003).
  25. Siclari, V. A., et al. Mesenchymal progenitors residing close to the bone surface are functionally distinct from those in the central bone marrow. Bone. 53, 575-586 (2013).
  26. Huang, S., et al. An improved protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. J Orthop Translat. 3, 26-33 (2015).
  27. Rafei, M., Birman, E., Forner, K., Galipeau, J. Allogeneic mesenchymal stem cells for treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis. Mol Ther. 17, 1799-1803 (2009).
  28. Krakenes, T., et al. The neuroprotective potential of mesenchymal stem cells from bone marrow and human exfoliated deciduous teeth in a murine model of demyelination. PLoS One. 18, e0293908(2023).
  29. Kannan, S., Gokul Krishna, S., Gupta, P. K., Kolkundkar, U. K. Advantages of pooling of human bone marrow-derived mesenchymal stromal cells from different donors versus single-donor MSCs. Sci Rep. 14, 12654(2024).
  30. Muller, E., et al. Toll-Like Receptor Ligands and Interferon-gamma Synergize for Induction of Antitumor M1 Macrophages. Front Immunol. 8, 1383(2017).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

IFNM2

Похожие статьи