1. Подготовка образцов синтетической кожи
Лист синтетической кожи на основе коллагена (VITRO-Skin) был разрезан на прямоугольные образцы размером 5,0 см × 2,5 см в асептических условиях в шкафе для биобезопасности. Каждый образец помещался в стерильную чашку Петри и хранился при 4 °C до использования. Перед вакцинацией образцы уравновешивались до комнатной температуры и увлажнялись в камере влажности согласно инструкциям производителя, чтобы имитировать уровень увлажнения человеческой кожи.
2. Подготовка микробных культур
Американская коллекция типовых культур (ATCC) референсные штаммы, включая Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 25922), Enterobacter aerogenes (ATCC 13048), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), Acinetobacter baumannii (ATCC 19606), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883) и Candida albicans (ATCC 10231), использовались. Отдельные колонии были инокулены в 5 мл триптического соевого бульона (TSB) в асептических условиях. Бактериальные культуры инкубировали при 35 °C в течение 24 часов, а грибковые культуры — при 22 °C в течение 5 дней. После инкубации мутность была скорректирована до 0,5 стандарта Макфарланда (примерно 1,5 × 10⁸ CFU/mL) с использованием стерильного фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) для антимикробных анализов.
3. Инокуляция синтетических моделей кожи
Каждый увлажнённый синтетический участок кожи был инокулен 100 мкл микробной суспензии и равномерно распределен с помощью стерильного одноразового распределителя. Инокуляционные поверхности сушились на воздухе в течение 15 минут в стерильной камере в лабораторных условиях (22-24 °C, 60%-70% влажности). Образцы были распределены по трём группам: необработанная контрольная система (группа A), источник света (синий светодиод, 405 нм), облучение (группа B) и светодиодное УФ-C (265 нм) облучение (группа C). На рисунке 1 показано схематическое представление экспериментов при оценке антимикробной эффективности источника света с использованием синтетической модели кожи.
4. Конфигурация источника света и облучение
На алюминиевом радиаторе было установлено светодиодное устройство с синим светом 405 нм для предотвращения накопления тепла и обеспечения термически безопасного облучения синтетических образцов кожу (см. рисунок 2). Излучение измерялось на точной плоскости обработки с помощью калиброванного оптического измерителя мощности, с учетом толщины датчика. Рабочая радиация была стандартизирована до 30 мВт/см² путём регулировки расстояния передачи светодиода.
Равномерность освещения по всему обработочному полю проверялась путём измерения излучения в 16 равномерно расположенных точках, что дало среднее количество 30,14 ± 0,78 мВт/см² (см. рисунок 3). Для базового сравнения бактерицидных эффектов обработка УФ-C проводилась с использованием светодиодного источника 265 нм, подающего 3 мВт/см² на расстоянии 20 см в течение 2 минут.
Флюэнция рассчитывалась как излучение × время экспозиции и соответствовала 27 Дж/см² для синего света (30 мВт/см² × 900 с) и 3,6 Дж/см² для ультрафиолетового света.
Для антимикробных анализов гидратированные синтетические образцы кожи, вакцинированные микробными суспензиями, асептически помещались в стерильные чашки Петри (крышки сняты) и размещались прямо под синим светодиодом. Образцы, назначенные в группу облучения (группа B), подвергались непрерывному воздействию до достижения целевого флюэнса (15 мин). Длительность воздействия в 15 минут (27 Дж/см²) была выбрана на основе предварительных экспериментов с временным убийством, которые продемонстрировали стабильную антимикробную эффективность среди видов и при этом отражали практическую продолжительность воздействия для потенциальных клинических или точечных применений. Температура каждого образца измерялась каждые 5 минут с помощью бесконтактного инфракрасного термометра, чтобы убедиться, что при освещении не произошло значительного нагрева. Мониторинг температуры не выявил измеримого повышения температуры поверхности (>2 °C) во время излучения синим светом, что подтверждает, что наблюдаемые антимикробные эффекты были нетермальными.
5. Антимикробная эффективность светодиодов синего света и УФ-C против патогенов ран
После обработки каждый синтетический образец кожи был перенесён в стерильную трубку объёмом 15 мл с содержанием 9,0 мл PBS (pH 7,4). Трубки мягко вихрили в течение 1 минуты, чтобы вытеснить микробы, прилипшие к поверхности. Были подготовлены серийные десятикратные разбавления, и 100 мкл аликвотов были покрыты на триптическом соевом агаре (TSA) для бактерий и Sabouraud Dextrose Agar (SDA) для грибов. Пластины инкубировали (бактерии при 35 °C в течение 24 часов; грибы при 22 °C в течение 5 дней), а также перечислялись колониообразующие единицы (CFU). Микробная редукция количественно оценивалась с помощью следующих уравнений:
Редукция логарифма = log10(A) - log10(B)
Процент уменьшения = ((A - B)/A) × 100
где A = счёт КФУ из контроля; B = количество КФУ из обработанных образцов.
Отрицательные контроли включали пластины только с медиа и PBS для проверки стерильности, а для сравнения эффективности лечения использовались необработанные инокуляционные образцы. Положительные контрольные пластины состояли из инокуляционных микробных суспензий ATCC для подтверждения жизнеспособности культуры. Все экспериментальные этапы проводились в асептических условиях.
6. Временно-зависимая антимикробная эффективность облучения синим светом
Для оценки эффекта, зависящего от флуэнса, длительность воздействия синего света была установлена на 2 мин, 5 минут, 10 минут, 15 минут, 20 минут и 30 минут. Антимикробная активность оценивалась с помощью перечисления CFU, как указано выше, что позволило проанализировать зависимость от дозы.
7. Эффективность светодиода синего света в аэрозольной камере, имитируя нозокомиальные условия
Для имитации воздействия воздушного воздействия была использована специализированная акриловая аэрозольная камера при контролируемых условиях окружающей среды (рисунок 4). Аэрозольные микробные суспензии (~1,5 x 106 CFU/mL) были введены с помощью небулайзера, а синтетические образцы кожи экспонировали в течение 30 минут. Синий свет направлялся на образцы на протяжении всей экспозиции (10 мкВт/см², расстояние 20 см). В контрольном эксперименте применялись идентичные условия экспозиции, но устройство BL-LED оставалось выключенным. Плотность микробных клеток в аэрозольной камере отслеживалась с помощью измерений активности осадки, при которых агарные пластины помещались внутрь камеры перед воздействием. Жизнеспособные микробные клетки, прилипшие к синтетическим образцами кожи (2 см x 2 см), были количественно измерены с помощью стандартного анализа количества пластин, описанного выше. Это низкое излучение (10 мкВт/см²) было выбрано для имитации реальных условий окружающего освещения в медицинских учреждениях, где непрерывное высокоинтенсивное облучение невозможно.
8. Оптическая передача и испытания вложенных колоний
- Оптическая передача через синтетическую подложку кожи
Для количественного измерения проникновения синего света через синтетическую кожу излучение измерялось с помощью калиброванного оптического измерителя мощности, расположенного в плоскости обработки. Интенсивность BL (405 нм, 30 мВт/см²) фиксировалась с увлажнёнными синтетическими образцами кожи, размещёнными горизонтально между светодиодом и детектором. Пропускающая способность (%) рассчитывалась как отношение передаваемого излучения (с кожей) и падающего излучения (без кожи).
Передача в водных условиях оценивалась с помощью спектрофотометра UV-Viz. Увлажнённая синтетическая полоска для кожи была вертикально вставлена в стандартную полистироловую кюветку, наполненную деионизированной водой. Кюветка, наполненная водой, служила только заготовкой. Было зафиксировано поглощение на 405 нм, а процент пропускания рассчитан с использованием %T = 10(-A) × 100.
- Функциональная валидация с использованием вложённого колониального анализа
Анализы на редукцию микробов поверхностных и вложенных колоний проводились как функциональный коррелят передачи, при этом образцы инокуляцировались на одну поверхность, но облучались с противоположной (нижней) стороны для имитации микробов, находящихся под поверхностью кожи. ХФУ были количественно оценены, как описано выше в разделе антимикробной эффективности.
9. FT-IR спектроскопия для деградации синтетической кожи после воздействия синего света и УФ-C
Для оценки возможных химических и структурных изменений синтетической кожной матрицы на основе коллагена из-за воздействия света была проведена инфракрасная спектроскопия преобразования Фурье (FT-IR). Синтетические образцы кожи (2 см × 2 см) были увлажнены согласно инструкции производителя, аналогично образцам, используемым в микробных анализах. Гидратированные образцы подвергались воздействию либо синего света 405 нм (30 мВт/см²), либо 265 нм УФ-C (3 мВт/см²) в течение 15 минут (стандартное воздействие, 27 Дж/см²) или 60 минут (в худшем случае стрессовых условий). После облучения образцы аккуратно промокнули для удаления поверхностной влажности и немедленно анализировали с помощью FT-IR.
10. Измерение ATR-FTIR
Спектры получались с помощью ИК-спектрофотометра, оснащённого совместимым программным обеспечением для анализа. Все образцы анализировались с помощью модуля Attenuated Total Reflectance (ATR) iD7. Для выделения спектральных изменений, связанных с облучением, (1) Было проведено прямое сравнение спектра между необработанными контрольными и облучёнными образцами. (2) Сравнения, вычитаемые по базовому уровню, проводились с использованием необработанного контрольного образца в качестве фонового ориентира перед сканированием облучённых образцов, что позволяло визуализировать только новые или изменённые пики.
Этот двойственный подход снижает топографический шум и улучшает обнаружение тонких изменений в областях амида и отпечатков пальцев. Уровень гидратации, толщина образца и ориентация были стандартизированы для всех образцов для снижения спектральной вариабельности. Каждое состояние воздействия (контрольное — BL-15 мин, BL-60 мин, УФ-15 мин, УФ-60 мин) сканировалось в три экземпляжа.
11. Статистический анализ
Все эксперименты проводились с использованием независимых биологических тройных копий, если не указано иное. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD) или как среднее с 95% доверительными интервалами (CI), как указано в легендах рисунка. Нормальность распределения данных оценивалась с помощью теста Шапиро-Вилка. Парные сравнения между двумя группами (например, синий свет против УФ-C, поверхностные и встроенные колонии) проводились с помощью непарных двуххвостых t-тестов Студента. Для сравнений, включающих более двух условий или временных точек, применялся односторонний анализ дисперсии (ANOVA), за которым следовало соответствующее постфактическое тестирование. Конкретный статистический критерий, используемый для каждого сравнения, обозначается в соответствующей легенде рисунка. p-значение <0,05 считалось статистически значимым.