Методическая статья

Простая техника микроаспирации для выделения соматических клеток из криоконсервированной спермы лошадей в качестве ядерных доноров для клонирования

DOI:

10.3791/69404

⸱

19 декабря 2025 г.

 ,  ,  , 
1Doctorado en Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana, 2Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, 3Integrated Cell Culture & Bioimaging Laboratory, Division of Science, Mathematics & Agribusiness, Mayville State University, 4Conservation, Genetics & Biotech, LLC, 5Laboratorio de Manejo de la Reproducción Animal, Departamento de Producción Agrícola y Animal, División de Ciencias Biológicas y de la Salud, Universidad Autónoma Metropolitana-Xochimilco

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол представляет простую технику микроаспирации для выделения жизнеспособных соматических клеток (СК) из криоконсервированной спермы лошадей. В отличие от традиционных методов, этот метод избегает длительных культур in vitro и помогает избежать загрязнения сперматозоидами, что позволяет немедленно применять их в клонировании соматических клеток.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сперма — это сложная жидкость, которая, помимо сперматозоидов, содержит и другие популяции клеток, включая иммунные клетки, незрелые мужские зародышевые клетки, эпителиальные клетки и фибробласты. Эти клетки имеют диплоидное состояние, что делает их подходящими кандидатами в качестве ядерных доноров для клонирования переноса ядра соматических клеток (SCNT). Создание жизнеспособных эмбрионов и потомства было продемонстрировано с помощью этих клеток. Эффективные методы их выделения из спермы включают центрифугирование и методы осмотического градиента; однако для установления первичных культур из этих изолированных клеток необходимы длительные периоды экстракорпорального культурирования. Кроме того, полученные образцы содержали большое количество сперматозоидов, что мешает формированию и поддержанию культур in vitro . На сегодняшний день первичные культуры были успешно установлены только на основе свежих образцов спермы, тогда как попытки использовать криоконсервированную сперму постоянно терпели неудачу. Это ограничение значительно ограничивает возможность получения клонов из криоконсервированных образцов спермы. В данном исследовании предлагается простая методика на основе микроаспирации для выделения соматических клеток из криоконсервированной спермы лошади. Такой подход позволяет быстро восстановить достаточное количество клеток для немедленного применения в процедурах клонирования SCNT.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клонирование переносом ядра соматических клеток — бесценный инструмент для спасения и размножения особей, представляющих зоотехнический и научный интерес. Множество клеточных линий использовались в качестве ядерных доноров, включая клетки, полученные из кожи, мышц, гранулезы, лимфоцитов и клетокмочи 1,2,3,4. Интересно, что сперма стала новой альтернативой для сбора соматических клеток (СК), используемых в качестве доноров ядра дляклонирования 5,6. Это открытие особенно важно для спасения людей, у которых сохранилась только сперма. Однако установление первичных культур из SC, выделенных из замороженной спермы, оказалось неудачным и на сегодняшний день остаётся главным препятствием для получения клонированных животных из этогоисточника 7,8,9. Эти клетки, вероятно, происходят из железистого эпителия и оболочки канальцев, из семенных выделений и, что важно, от загрязнения спермы мочой, при этом последние являются хорошо известным источником соматических клеток с высоким пролиферативным и недифференцированнымпотенциалом 3.

Были реализованы различные методы выделения SC из спермы, включаяцентрифугирование 5, осмотическиеградиенты 7,8,10 и проточнуюцитометрию 11. Однако соматические клетки, после выделения этими методами, всё равно требуют оптимальных условий для прикрепления, роста ипролиферации 8. Специфические требования этих клеток делают культуру in vitro более сложной, поскольку для установления первичных клеточных культур необходимы длительныеинкубационные периоды 9. Кроме того, высокая концентрация сперматозоидов в образцах мешает как инициации, так и поддержанию этих культур5.

В отличие от ранее описанных подходов, эта техника микроаспирации обладает несколькими явными преимуществами. Он позволяет отбирать СК по размеру иморфологии 12 и позволяет восстанавливать ядра как из жизнеспособных, так и из нежизнеспособных клеток — стратегия, успешно продемонстрированная на использовании замороженной ткани без криопротекторов13 и сублимированных репродуктивныхклеток 14,15,16. Важно, что SC можно использовать сразу после размораивания спермы, что снижает риск плоидных ошибок, обычно связанных с расширенной культурой первичных соматических клеток, используемых для клонирования животных in vitro (17,18). В частности, техника сосредоточена на криоконсервированной сперме лошадей, что позволяет собрать достаточное количество СК для немедленного применения для SCNT12.

Производство микропипеток и развитие методов микроаспирации значительно продвинулись за последние десятилетия. Использование этих инструментов позволяет точно манипулировать гаметами, эмбрионами и их цитоструктурами, открывая новые возможности в области репродуктивной биотехнологии (https://www.jove.com). Методы микроманипуляции позволяют оценивать механические свойства клеток и дают ценные сведения об их физиологическомсостоянии 19,20, однако эта область до сих пор относительно неизучена.

На сегодняшний день ни одно исследование не выяснило эффективную технику выделения СК из спермы с использованием любых вариантов микроманипуляций. Учитывая ограничения традиционных методов изоляции, это исследование предлагает практический протокол на основе микроаспирации для изоляции SC из криоконсервированной спермы лошадей, что позволяет немедленно использовать их в процедурах соматического клонирования после сбора препарата.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Криоконсервированные образцы спермы, сохранявшиеся более 19 лет в жидком азоте, были получены у коммерческих дистрибьюторов, уполномоченных соответствующими ветеринарными органами Мексики, в соответствии с Мексиканским официальным стандартом NOM-027-ZOO-1995, регулирующим зоосанитарный процесс получения спермы от домашних животных. Все образцы спермы, использованные или непригодные для анализа, были инактивированы и утилизированы в соответствии с институциональными протоколами биобезопасности и применимыми нормативами, включая NOM-087-ECOL-SSA1-2002 для управления биологически-инфекционными отходами в Мексике. Остаточная плановая кислота (HF) безопасно нейтрализовалась под вытяжной вытяжкой, медленно перемещая её в пластиковый контейнер и постепенно добавляя небольшие порцииCaCO3 или Ca(OH)2, пока шипение не прекратилось, образуя нерастворимыйCaF2. pH нейтрализованной суспензии был подтверждён как от 6 до 8, прежде чем она была переведена в неорганические химические отходы согласно местным правилам. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Изготовление иглой с помощью микропипетки для изоляции соматических клеток

  1. Выберите боросиликатные стеклянные капилляры (1,0 мм O.D. × 0.78 мм I.D. × 100 мм).
  2. Используйте микропипетку, чтобы получить капилляры с мелкими наконечниками. Отрегулируйте точку резки, чтобы изменить диаметр наконечника.
  3. Вставьте капилляр в тягач и плотно зафиксируйте его.
  4. Аккуратно вынимите микропипетку после вытягивания и положите её горизонтально на микрокузницу.
  5. Выровняйте нагреватель и микропипетку в поле зрения микроскопа.
  6. Определите точку сечения с помощью прицела окуляра (рисунок 1A,B).
  7. Подведите кончик микропипетки к стеклянной шарике (на нить нагревателя).
  8. Постепенно увеличивайте огонь, пока кончик не растворится в бусинке.
    1. Выключи обогреватель.
    2. Дайте кончику прилипнуть к шарику и отделиться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не обязательно сгибать микропипетку; его можно использовать в прямой форме. Однако, если оператор предпочитает, может образоваться угол (рисунок 1C).
  9. Не разглаживайте кончик, так как этот этап не нужен для процедуры.
  10. Очистите кончики пипетки, погружая каждый кончик подряд в течение ~10 секунд в:
    1. 20% платористоводородной кислоты (HF).
      ВНИМАНИЕ: Фториковая кислота очень токсична и коррозионна. Используйте средства индивидуальной защиты, указанные поставщиком. Делайте акцент на использовании защитной защиты для глаз и лица, перчаток и лабораторного халата, и всегда используйте капюшон с дымом.
    2. Стерильная двойная дистиллированная вода.
    3. Абсолютный этанол.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для облегчения мытья кончиков пипетки подготовьте вышеупомянутые растворы в стерильных трубках Corning объемом 15 мл.
  11. Сушите микропипетки в духовке при 50 °C.
  12. Храните микропипетки в стерильном контейнере.

2. Микроаспирационная установка.

  1. Проверьте, работает ли система микроаспирации, а джойстик микроаспирации расположен по центру панели управления.
  2. Для систем с маслом убедитесь, что внутри нет воздушных пузырьков, так как они могут повлиять на точность движения.
  3. Вставьте аспирационную микропипетку соматической клетки в удерживающий манипулятор с доминирующей стороны руки оператора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Замените микропипетку на новую, если кончик засорится во время сбора соматических клеток.

3. Оттаивание и разбавление криоконсервированной спермы лошадей

  1. Удалите трубочки из жидкого азота, подвергайте воздуху на 10 секунд и размораживайте при 37 °C в течение 30 секунд.
  2. Первое разбавление спермы: возьмите образец размораживаемой спермы (250 мкл) и разведите 1,0 мл среды DMEM/F12, дополненную 10% сывороткой плода бычьей крупной рогатого скотки, 0,1 мг/мл бычьей сыворотки, 12,5 мкм β-меркаптоэтанола и 1% антибиотик-антимикотиком.
    1. Инкубировать смесь при 37 °C в течение 30 минут.
  3. Второе разбавление спермы: взять 25 мкл из первого разбавления, разбавить в 975 мкл по 1x DPBS с добавлением 0,1 мг/мл поливинил-спирта (ПВА) или поливинилпирролидона (ПВП) и положить в микроцентрифугную трубку объёмом 1,5 мл и аккуратно перемешать.
    1. Поддерживайте эту смесь при 37 °C на протяжении всего процесса сбора клеток.

4. Приготовление блюд для коллекции SC

  1. Соберите SC с помощью двух крышек из культурных тарелок диаметром 35 мм.
  2. Подготовьте первую крышку следующим образом (крышка #1, рисунок 2A).
    1. Возьмите 100 мкл второго разбавления спермы и отложите его в центр крышки (см. рисунок 2A).
    2. Сделайте вторую микрокаплю (10 мкл) 1x DPBS с дополнением 0,1 мг/мл PVA или PVP поверх первой капли (см. рисунок 2A).
    3. Полностью покройте обе микрокапли парафиновым маслом, чтобы предотвратить испарение и поддерживать температурную стабильность во время аспирации SC.
  3. Подготовьте вторую крышку для удаления клеточных остатков и сопутствующих сперматозоидов (крышка #2, рисунок 2B).
    1. Поместите три капли по 30-50 мкл 1x DPBS с добавлением 0,1 мг/мл PVA или PVP в центр крышки; Не покрывайте их минеральным маслом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте эту посевную миску только после того, как все соматические клетки будут отобраны, чтобы предотвратить изменения физико-химических свойств раствора DPBS из-за воздействия воздуха.
  4. Выполняйте все этапы микроаспирации под перевёрнутым микроскопом при комнатной температуре. Избегайте резких перепадов температуры.

5. Процедура микроаспирации для выделения СК из криоконсервированной спермы лошадей

  1. Поставьте первую крышку (крышка #1, рисунок 2A) на стадии микроскопа, готовую к сбору SC.
  2. Выберите микропипетку с нужным диаметром для сбора СК и подключения их к механической аспирационной системе.
  3. Аккуратно вставьте микропипетку в микрокаплю и выровняйте её с нижней частью крышки посуды. После того как пипетка получила атмосферную культурную среду, начинайте индивидуальный захват СК.
  4. Внизу тарелки должны быть видны различные морфологии клеток (рисунок 3).
  5. Разместите кончик микропипетки рядом с каждым SC и аспирируйте их под отрицательным давлением. Аспирируйте все круглые и вытянутые клетки независимо от их размера. Объём аспирации варьируется между захватами SC.
  6. После захвата 10 клеток поместите их в микрокаплю, расположенную сверху (10 мкл) (рисунок 2A). Повторяйте этот шаг, пока не получите необходимое количество SC для эксперимента по клонированию.
  7. Держите все захваченные соматические клетки внутри этой микрокапли на протяжении всего процесса сбора.
  8. После получения необходимого количества СК для клонирования выполните простую процедуру промывания с помощью микрокапель для удаления сопутствующих сперматозоидов, клеточных мусора и микробных загрязнителей.
  9. Возьмите вторую крышку посуды и выполните последовательное трёхэтапное промывкание SC (крышка #2, рисунок 2B):
    1. Захватите соматические клетки микропипеткой и аккуратно нанесите их на поверхность первой капли. Дайте им оседнуть 3-5 минут (рисунок 2B; Drop #1).
    2. Повторите шаг 5.9.1 и положите их во второй капель (рисунок 2B; Drop #2).
    3. Повторите шаг 5.9.1 и осадите соматические клетки в третью каплю (рисунок 2B; Drop #3).
  10. В качестве последнего шага поместите изолированные соматические клетки в финальную микрокаплю, подготовленную для последующего использования в процедурах переноса ядра соматических клеток (рисунок 4D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирируйте SC в минимальном объёме среднего объёма при каждом повторном захвате, чтобы минимизировать количество сперматозоидов, мусора и микробных загрязнителей.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Таблица 1 показывает, что метод микроаспирации эффективно восстанавливает соматические клетки из криоконсервированной спермы лошадей, при этом скорость захвата варьируется от 317,7 ± 9,60 до 424,7 ± 33,65 клетки в час у трёх жеребцов. Жеребец #03 показал наивысший выход, что демонстрирует эффективность метода даже при длительном хранении образцов. Данные показывают, что метод последовательно и эффективно изолирует соматические клетки от спермы, а средние скорости захвата ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Микроманипуляция клетками и гаметами позволила упростить сложные методы вспомогательной репродукции. Примеры таких методов включают соматическое клонирование с помощью Hand Made Cloning21, ассистированноевылупление 22, интрацитоплазматическую инъекцию сперматозоидов (ICSI)23 и пронуклеарную микроинъекцию зигот24, среди прочих.

Разработка эффективных методов выделени...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Лабораторию управления репродукцией Департамента сельскохозяйственного и животноводства Автономного университета Метрополитен-Сочимилько (UAM-X) за техническую и логистическую поддержку.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2 бета-меркаптоэтанолSIGMAM7522Культура соматических клеток
1x DPBSGIBCOREF-21600010Манипуляция соматическими клетками
Абсолютный этанолHYCELEL CRISOL 50181-1L73Для изготовления пипеток
Антибиотик-антимикотик 100 разINVITRO SA. Mé xicoКультура соматических клеток
Боросиликатные капилляры (1,0 мм O.D. и умноженно; 0,78 мм I.D. и 100 мм длина)ГАРВАРДСКИЙ АППАРАТ, СШАEC1-30-0035Для изготовления пипеток
BSASIGMAA3311Культура соматических клеток
DMEM/F12 mediumGIBCOREF-12500-062Культура соматических клеток
Криоконсервированный образец спермы у лошадейКриоконсервированные образцы спермы были получены у коммерческого дистрибьютора и хранились более 19 лет в жидком азоте. Все образцы замороженной спермы лошадей были получены у коммерческих дистрибьюторов, уполномоченных соответствующими ветеринарными органами Мексики, в соответствии с Мексиканским официальным стандартом NOM-027-ZOO-1995, Зоосанитарный процесс обработки спермы домашних животных.
Прицел окуляраИнструмент для изготовления пипетокНеобходимое оборудование
Сыворотка плода для быкаGIBCOREF-26140-079Культура соматических клеток
Гидрофлюрная кислотаСИГМА-ОЛДРИЧ339261Для изготовления пипеток
Инвертируемый оптический микроскопЗатмение, TE 200NIKONМикроманипуляция соматическими клетками
Laboratory  Сухая духовкаИнструмент для изготовления пипетокНеобходимое оборудование
MicroforgeИнструмент для изготовления пипетокНеобходимое оборудование
Набор микроманипуляторов для инвертированного микроскопаМикроманипуляция клеткамиНеобходимое оборудование
Микропипеточный вытягивательP-97, ПРИБОР САТТЕРАИнструмент для изготовления пипетокИспользуйте следующие настройки и mdash; Заезд: 720; Пулл: 30; Скорость: 50; Время: 220; Давление
Минеральное маслоSIGMAM8410Манипуляция соматическими клетками
Nunclon  контейнеры для клеточной культуры, диаметр и времена; H 35 мм и раз; 10 ммНАНКЛОНNunc 153066
ПВАSIGMAP8136Культура соматических клеток
PVPSIGMAP5288Культура соматических клеток
Раствор Trypan Blue 0,4%GIBCOREF- 15250061Клеточный краситель

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pandey, A., Gupta, S. C., Gupta, N. Comparative potential of cultured skin fibroblast, cumulus, and granulosa cell to produce somatic cell nuclear transfer (SCNT) preimplantation embryos in buffaloes (Bubalus bubalis) in relation to gene expressions. Cell Reprogram. 12 (3), 357-368 (2010).
  2. Galli, C., Duchi, R., Moor, R. M., Lazzari, G. Mammalian leukocytes contain all the genetic information necessary for the development of a new individual. Cloning. 1 (3), 161-170 (1999).
  3. Olsson, P. O., Yeonwoo, J., Park, K., Yoo, Y. M., Hwang, W. S. Live births from urine derived cells. PLoS One. 18 (1), e0278607(2023).
  4. Vignon, X., et al. Developmental potential of bovine embryos reconstructed from enucleated matured oocytes fused with cultured somatic cells. C R Acad Sci III. 321 (9), 735-745 (1998).
  5. Nel-Themaat, L., et al. Isolation, culture and characterisation of somatic cells derived from semen and milk of endangered sheep and eland antelope. Reprod Fertil Dev. 19 (4), 576-584 (2007).
  6. Kjelland, M. E., Liu, J., Hyatt, D., Kraemer, D. Collection, isolation, and culture of somatic cells from avian semen. Avian Biol Res. 6 (4), 255-260 (2013).
  7. Nel-Themaat, L., et al. Cloned embryos from semen. Part 1: in vitro proliferation of epithelial cells on embryonic fibroblasts after isolation from semen by gradient centrifugation. Cloning Stem Cells. 10 (1), 143-160 (2008).
  8. Liu, J., et al. Evaluation of culture systems for attachment and proliferation of epithelial cells cultured from ovine semen. Anim Reprod Sci. 115 (1-4), 49-57 (2009).
  9. Liu, J., et al. Embryo production and possible species preservation by nuclear transfer of somatic cells isolated from bovine semen. Theriogenology. 74 (9), 1629-1635 (2010).
  10. Saini, M., et al. Isolation and culture of epithelial cells from stored buffalo semen and their use for the production of cloned embryos. Reprod Fertil Dev. 31 (10), 1581-1588 (2019).
  11. Brom-de-Luna, J. G., Canesin, H. S., Wright, G., Hinrichs, K. Culture of somatic cells isolated from frozen-thawed equine semen using fluorescence-assisted cell sorting. Anim Reprod Sci. 190, 10-17 (2018).
  12. Ramos, B., Rodríguez, A. A., Rosales, A. M., Montiel, A. J., Hernández, J. E. Identification of somatic cell populations in cryopreserved equine semen as a source of donor nuclei for somatic cloning: preliminary results. Reprod Fertil Dev. 37 (1), (2025).
  13. Moulavi, F., et al. Interspecies somatic cell nuclear transfer in Asiatic cheetah using nuclei derived from post-mortem frozen tissue in absence of cryo-protectant and in vitro matured domestic cat oocytes. Theriogenology. 90, 197-203 (2017).
  14. Wakayama, S., Ito, D., Ooga, M., Wakayama, T. Production of mouse offspring from zygotes fertilized with freeze-dried spermatids. Sci Rep. 12 (1), 18430(2022).
  15. Wakayama, S., Ito, D., Hayashi, E., Ishiuchi, T., Wakayama, T. Healthy cloned offspring derived from freeze-dried somatic cells. Nat Commun. 13 (1), 3666(2022).
  16. Loi, P., Fulka, J., Hildebrand, T., Ptak, G. Genome of non-living cells: Trash or recycle. Reproduction. 142 (4), 497-503 (2011).
  17. Wakayama, S., Wakayama, T., Wells, D. N. Encyclopedia of Life Sciences. , 1-10 (2023).
  18. Lanza, R., et al. Extension of cell life-span and telomere length in animals cloned from senescent somatic cells. Science. 288, 665-669 (2000).
  19. González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophys J. 116 (4), 587-594 (2019).
  20. Hochmuth, R. M. Micropipette aspiration of living cells. J Biomech. 33 (1), 15-22 (2000).
  21. Vajta, G., et al. Production of a healthy calf by somatic cell nuclear transfer without micromanipulators and carbon dioxide incubators using the handmade cloning (HMC) and the submarine incubation system (SIS). Theriogenology. 62 (8), 1465-1472 (2004).
  22. Alteri, A., et al. Revisiting embryo assisted hatching approaches: A systematic review of the current protocols. J Assist Reprod Genet. 35 (3), 367-391 (2018).
  23. Briski, O., Salamone, D. F. Past, present and future of ICSI in livestock species. Anim Reprod Sci. 246, 106925(2022).
  24. Wall, R. J. Pronuclear microinjection. Cloning Stem Cells. 3 (4), 209-220 (2001).
  25. Selokar, N. L., et al. Hope for restoration of dead valuable bulls through cloning using donor somatic cells isolated from cryopreserved semen. PLoS One. 9 (3), e90755(2014).
  26. Selokar, N. L., et al. Buffalo (Bubalus bubalis) SCNT embryos produced from somatic cells isolated from frozen-thawed semen: Effect of trichostatin A on the in vitro and in vivo developmental potential, quality and epigenetic status. Zygote. 24 (4), 549-553 (2016).
  27. Guevorkian, K., Maître, J. L. Micropipette aspiration: A unique tool for exploring cell and tissue mechanics in vivo. Methods Cell Biol. 139, 187-201 (2017).
  28. Duah, E. K., et al. Production of hand-made cloned buffalo (Bubalus bubalis) embryos from nonviable somatic cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 52 (10), 983-988 (2016).
  29. Loi, P., et al. Nuclei of nonviable ovine somatic cells develop into lambs after nuclear transplantation. Biol Reprod. 67 (1), 126-132 (2002).
  30. Fahrudin, M., Otoi, T., Suzuki, T. Developmental competence of bovine embryos reconstructed by the transfer of somatic cells derived from frozen tissues. J Vet Med Sci. 63 (10), 1151-1154 (2001).
  31. Podico, G., et al. Single-layer colloid centrifugation as a method to process urine-contaminated stallion semen after freezing-thawing. J Equine Vet Sci. 87, 102910(2020).
  32. Zhang, Y. T., et al. Evaluation of porcine urine-derived cells as nuclei donor for somatic cell nuclear transfer. J Vet Sci. 23 (2), e40(2022).
  33. Mizutani, E., et al. Generation of cloned mice and nuclear transfer embryonic stem cell lines from urine-derived cells. Sci Rep. 6, 23808(2016).
  34. Long, S., Kenworthy, S. Round cells in diagnostic semen analysis: a guide for laboratories and clinicians. Br J Biomed Sci. 79, 10129(2022).
  35. Johanisson, E., Campana, A., Luthi, R., de Agostini, A. Evaluation of 'round cells' in semen analysis: a comparative study. Hum Reprod Update. 6 (4), 404-412 (2000).
  36. Graber, M., Lane, B., Lamia, R., Pastoriza-Munoz, E. Bubble cells: Renal tubular cells in the urinary sediment with characteristics of viability. J Am Soc Nephrol. 1 (7), 999-1004 (1991).
  37. Rahmanian, N., Bozorgmehr, M., Torabi, M., Akbari, A., Zarnani, A. H. Cell separation: Potentials and pitfalls. Prep Biochem Biotechnol. 47 (1), 38-51 (2017).
  38. Håård, M. Use of frozen stallion semen in Europe. Acta Vet Scand Suppl. 88, 123-127 (1992).
  39. Klug, E., Treu, H., Hillmann, H., Heinze, H. Results of insemination of mares with fresh and frozen stallion semen. J Reprod Fertil Suppl. 23, 107-110 (1975).
  40. Pukazhenthi, B., Comizzoli, P., Travis, A. J., Wildt, D. E. Applications of emerging technologies to the study and conservation of threatened and endangered species. Reprod Fertil Dev. 18 (1-2), 77-90 (2006).
  41. Swanson, W. F., Magarey, G. M., Herrick, J. R. Sperm cryopreservation in endangered felids: developing linkage of in situ-ex situ populations. Soc Reprod Fertil Suppl. 65, 417-432 (2007).
  42. Lagutina, I., Fulka, H., Lazzari, G., Galli, C. Interspecies somatic cell nuclear transfer: Advancements and problems. Cell Reprogram. 15 (5), 374-384 (2013).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Microaspiration TechniqueSomatic Cell IsolationCryopreserved Equine SemenNuclear Donor CellsSomatic Cell Nuclear TransferEquine CloningCell Morphology SelectionMicropipette AspirationSequential Cell WashingDiploid Cell Recovery

Похожие статьи