Окрашивание пероксисом в клетках млекопитающих с помощью пероксисоспецифических зондов

Краткое содержание

Зонды PeroxiSPY используются для обнаружения пероксисом в клетках млекопитающих. Здесь мы демонстрируем, как использовать зонды для окрашивания пероксисом в живых и фиксированных клетках.

Аннотация

Пероксисомы — это повсеместные органеллы, играющие важную роль в здоровье человека, и их дисфункция приводит к различным генетическим нарушениям. Визуализация пероксисом является ключом к выявлению дисфункции пероксисом; однако прогресс был ограничен отсутствием пероксисом-специфических зондов. Разработав PeroxiSPY — пероксисом-специфические зонды, имитирующие естественные пероксисомные метаболиты, мы позволили в реальном времени обнаружить, отслеживать и количественно оценивать динамику пероксисомы в живых клетках млекопитающих. Кроме того, применение этой техники к клеткам пациентов с пероксисомными нарушениями выявляет патологические фенотипы. Здесь мы предлагаем подробный протокол обнаружения пероксисом в живых млекопитающих, а также обнаружения пероксисом после окрашивания в фиксированных клетках. Мы демонстрируем, как окрашивать пероксисомы в живых клетках с помощью пероксисом-специфических зондов, сосредотачиваясь на подготовке клеток, времени проведения, воспроизводимости и устранении неполадок. Эти зонды позволяют быстрое, специфическое и нетоксичное обнаружение пероксисомов живыми клетками, предлагая уникальный количественный метод оценки функции пероксисом и её дисфункции при заболеваниях, связанных с пероксисомами.

Введение

Пероксисома — самая распространённая эукариотическая органелла, некоторые клетки превышают тысячу^{пероксисом 1}. Их функции критически важны для развития организма и метаболической^{адаптации 1,2}, что подтверждается рядом человеческих пероксисомных заболеваний, обычно неизлечимых нейродегенеративных и нейрометаболических состояний у маленьких^{детей 3,4}. Насколько нам известно, ранее существовало отсутствие селективных методов для маркировки пероксисом в живых клетках и тканях. Эти инструменты незаменимы для исследований и диагностики, позволяя напрямую и количественно измерять несколько аспектов формирования пероксисом, функции⁶. Эти зонды достаточно универсальны, чтобы, с одной стороны, количественно оценивать функцию пероксисомы в клетках, а с другой — применяться в анализах трансляционной эффективности или для диагностики пероксисомных^{расстройств 6}. Окрашивание PeroxiSPY — это быстрая, специфическая, нецитотоксическая техника для неинвазивного обнаружения пероксисом, связанных с живыми клетками. Здесь мы описываем, как окрашивать пероксисомы в клеточных линиях млекопитающих с помощью пероксисомных зондов (зонды также демонстрировали специфическое пероксисомное окрашивание в эмбрионах данио-рерио, но не подходят для окрашивания пероксисом, в клетках Arabidopsis thaliana ⁶). Окрашивания можно выполнить менее чем за 10 минут. Затем зонд можно обнаружить в течение нескольких часов или фиксировать с помощью протокола фиксации параформальдегида для дальнейшего иммунного окрашивания.

Протокол

1. Окрашивание живых клеток

1. Подготовка к культуре клеток для визуализации живых клеток (продолжительность: 24 часа)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исследование следовало стандартным протоколам культивирования клеток для всех экспериментов. Клеточные линии поддерживались в DMEM или DMEM/F12 для SH-SY5Y, дополненными 10% плодовой бычьей сывороткой (FBS), 1% пенициллином/стрептомицином при 37 °C и 5%_CO2. Некоторые системы визуализации чувствительны к составу среды. Если микроскоп обнаруживает сигнал от фенол-красного в среде, используйте альтернативы без фенола. Кроме того, если микроскоп не оснащён камерой_CO2 , замените среду на среду с HEPES (pH 7.4).
   1. За день до эксперимента разделите клетки на пластину с стеклянным дном, чтобы на следующий день достигать слияния 30-70%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе использовались пластины диаметром 35 мм с 4 скважинами.
      1. (Критически) Не используйте голодающие или напряжённые клетки для разделения для эксперимента. Убедитесь, что клеточные линии регулярно меняют свежие среды (как минимум каждые 2-3 дня) и разделяются до того, как они достигнут 90% слияния. Цель — иметь здоровую клеточную линию, чтобы обеспечить равномерное окрашивание.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые клетки, например стволовые клетки, требуют стеклянного покрытия соответствующим слоем покрытия, например, Matrigel, который не мешает окрашиванию.
2. Подготовка установки визуализации (продолжительность: 1 час)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализация органелл и их динамики требует высокого пространственного разрешения. Для этого протокола использовался конфокальный микроскоп с модулем фотоумножителя GaAsP, камерой_CO2 и блоком регулирования температуры. Визуализация проводилась с использованием двухнаправленного гальванометра с объективом CFI Plan Apo Lambda 60x oil NA 1.42, а для зонда 555 использовался лазер мощностью 561 нм (50 мВт). Используйте лазер 640 нм или эквивалент для зонда 650. Пероксисомы визуализировались в человеческих клеточных линиях. Время инкубации зондов может различаться для разных клеточных линий. Рекомендуется оптимизировать тайминг, визуализируя клетки в разные моменты времени после окрашивания (рисунок 2A).
   1. Инициируйте конфокальную систему. Убедитесь, что уровень_CO2 и температура (37 °C) стабилизированы в течение 20 минут, прежде чем начать окрашивание и вводить клетки в микроскоп.
      ПРИМЕЧАНИЕ: (Критично) Важно убедиться, что клетки остаются здоровыми на протяжении всего эксперимента с помощью визуального осмотра, а pH и температура среды поддерживаются. Это можно добиться с помощью контрольных блоков параметров и визуального осмотра окраски среды, если используется фенол-красный. Для этого можно использовать контроллеры температуры и_CO2 .
   2. Настройте программное обеспечение конфокального микроскопа. Запустите программное обеспечение и включите лазер 561 нм для окрашивания 555 нм. Корректируйте параметры захвата и мощности лазера. Этот протокол использует 1% мощности лазера, HV (усиление) 100 и разрешение 1024 пикселей 1024 пикселя с 3 зумом для изображения ячеек.
3. Пероксисомное окрашивание (продолжительность: 1-5 минут)
   1. Пипетта — аликвот зонда для конечной рабочей концентрации 1 мкм, например, для 0,5 мл среды, пипетка — 0,5 мкл зонда.
   2. Выберите скважину для морилки и маркируйте снаружи маркером.
   3. Из выбранной скважины пипеткой извлеките все (0,5 мл) среды и подайте его в микроцентрифугную трубку с зондом аликвот из шага 1.3.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно удалить все материалы из колодца на этом этапе для равномерного окрашивания.
   4. Поднимаю и опускаю пипеты три раза, чтобы смешивать медиа и зонд. Вдохните всю смесь в пипетку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смешивание с помощью вихря можно использовать вместо пипетирования.
   5. Капля за каплём возвращайте смесь обратно в выбранную скважину, чтобы пипетка контактировала со стенкой колодца. После добавления смеси обратно в колодец запустите таймер на 10 минут.
   6. Закройте крышку, нанесите каплю погружного масла на объектив (в этом протоколе используется масляный объектив 60×) и поставьте пластину на микроскоп для съёмки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется оптимизировать концентрацию зонда для каждой линии клетки для обеспечения равномерного окрашивания. Рекомендуется тестировать при 0,25, 0,5, 1 и 2 мкм в течение 5-20 минут; более низкие концентрации обычно окрашиваются на более низком фоне (рисунок 2A). В зависимости от линии клетки и чувствительности детектора микроскопа, окрашенные клетки можно снимать уже через 5 минут после добавления зонда до 24 часов после добавления. В некоторых случаях, например, при визуализации стволовых клеток, визуализация клеток может продолжаться более 180 минут после добавления зонда без изменения сигнала. В любой момент можно сменить носитель, чтобы смыть зонд. Это приведёт к постепенной потере окрашивания примерно через 30 минут для HEK293T клеток.
4. Конфокальная визуализация пероксисом в живых клетках (продолжительность: 10 мин–3 часа)
   1. После того как пластина будет установлена на микроскопе, отрегулируйте фокус на клетках в окрашенной яме и начните визуализацию.
   2. Когда ячейки в фокусе, регулировать усиление (чувствительность высокого давления или датчика) и мощность лазера с использованием стандартных правил настройки конфокального микроскопа.
   3. Найти и разместить (Zoom-In) группу ячеек. После фокусировки на ячейках настройте параметры получения до необходимого качества изображения.
      1. Установите параметры изображения для получения изображений: мощность лазера 0,5–1%, усиление 100 HV (усиление) в программном обеспечении NIS-Elements. Проверьте, не перенасыщенное ли изображение (если да, измените интенсивность и усиление).
      2. Выберите размер сканирования. Получите 1024 изображения с разрешением 1024 пикселя, скорость сканирования (1/2-1/4), линейное усреднение (2), зум (3), подходящий для проводимого изображения.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Пероксисомы двигаются во время получения изображения, что может привести к появлению артефактов. Рекомендуемые параметры оптимизируются для минимизации следов движения при обеспечении достаточного качества изображений для количественной оценки. При создании таймлапса убедитесь, что перед началом видео указаны интервал, продолжительность и циклы. Зонды готовы к фотографированию.
   4. Получите и сохраняйте все изображения с доступными метками (здесь используется формат .nd2 NIS-Elements Nikon Software).

2. Окрашивание фиксированных клеток

1. Подготовка к культуре клеток для визуализации живых клеток (продолжительность: 24 часа)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех экспериментов соблюдались стандартные протоколы культивирования клеток. Клетки Huh7 поддерживались в DMEM/F12 с добавлением 10% FBS, 1% пенициллина/стрептомицина при 37 °C и 5%_CO2.
   1. За день до эксперимента разделите клетки на пластину с накладками, чтобы на следующий день достичь соединения 30-70%.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Засеять 50 000 ячеек/скважину в 12-колодцевых пластинах с 18-мм накрытиями, или 15 000 ячеек/скважину в 24-колодцевых пластинах с 13-мм накрытиями.
2. Пероксисомное окрашивание (продолжительность: 1-5 минут)
   1. Разведите зонд новыми средами до конечной рабочей концентрации 4 мкм в пустой светочувствительной микроцентрифугной трубке, например, для 0,5 мл среды, пипетки 2 мкл зонда (стандартный раствор: 1 мМ).
   2. Выберите скважину для морилки и маркируйте снаружи маркером.
   3. Из выбранной скважины аспирируйте все (0,5 мл) среды и замените его на пробную среду с шага 2.2.1. Капля за капляй вводите зондовую среду в выбранную скважину, чтобы пипетка контактировала со стенкой колодца.
   4. После возвращения смеси в колодец инкубируете клетки при 37 °C в течение 10-15 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента ячейки светочувствительны и должны быть покрыты алюминиевой фольгой.
3. Фиксация после окрашивания и визуализация пероксисом в фиксированных клетках
   1. После окрашивания аккуратно удалите среду и дважды промывайте клетки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS).
   2. Нанесите раствор 4% параформальдегида (PFA) в PBS при комнатной температуре в течение 20 минут.
   3. Аккуратно уберите PFA в специально предназначенный контейнер для отходов. Промывайте клетки один раз с помощью PBS.
      ВНИМАНИЕ: PFA токсична и должна быть утилизирована в соответствии с институциональными нормативами.
   4. Чтобы продолжить иммунофлуоресценцию, следуйте следующим шагам
      1. Добавьте 0,5% Triton-X (разбавленного в PBS) для пермеабилизации клеток. Оставьте на 2,5 минуты.
      2. Аккуратно снимите Triton-X. Промывайте клетки дважды, по 10 минут с помощью PBS.
      3. Заблокируйте раствором 5% бычьей сыворотки альбумина (BSA) в PBS на 20 минут при комнатной температуре или ночью при 4 °C.
      4. Переходите к стандартной процедуре иммунофлуоресценции.

Результаты

Зонды PeroxiSPY спроектированы так, чтобы имитировать естественные субстраты пероксисом — ветвлённые и очень длинноцепочечные жирные^{кислоты 5}. Таким образом, окрашивание приведёт к импорту зондов из цитоплазмы в пероксисомы ^5,6,7, зависящий от аденозинтрифосфата (АТФ) связывающего кассетного подсемейства D (ABCD). В зависимости от метаболического состояния клетки, АТФ-зависящий транспорт ABCD может эффективно и быстро импортировать зонды, что приводит к высокому соотношению пероксисомы к цитоплазме интенсивности флуоресценции (рисунок 1A). Критически важные шаги для обеспечения высокого соотношения включают предотвращение голодания клеток за счёт регулярной замены клеточной среды и предотвращение их выращивания при высокой слиянии.

Для проверки специфики пероксисомного окрашивания рекомендуется включить несколько контрольных элементов (рисунок 1B,C). Ко-локализационный анализ с эталонным пероксисомальным маркером, например, маркер импорта белка — GFP-SKL (рисунок 1B,C). Кроме того, если доступны клеточные линии с дефицитом пероксисомы, например, PEX19 KO, окрашивание в этих клетках отсутствует (рисунок 1B)^5,8.

Пероксисомные зонды могут использоваться для измерения плотности пероксисомы (рисунок 1C^)5,9 и разрабатываются для оценки импорта субстрата, динамики пероксисомы и взаимодействий. Для количественной визуализации важно стандартизировать процедуру окрашивания, время получения изображения (например, через 10–20 минут после окрашивания), подготовку клеточной линии и параметры получения. Некоторые клеточные линии требуют оптимизации концентрации зонда, а также времени для улучшения интенсивности сигнала пероксисом относительно цитозольного фона, например, 250 нМ и 20 мин лучше работают для клеток COS-7 (рисунок 2A). Клетки метаболизируют зонды, что со временем приводит к постепенному уменьшению пероксисомного окрашивания; однако соотношение пероксисомы к цитоплазме может улучшаться за 24 часа (рисунок 2B). Кроме того, мы разработали процедуру фиксации, которая позволяет совместно окрашивать с антителами и визуализировать пероксисомы позже (рисунок 2C,D).

Рисунок 1: Живоклеточная визуализация пероксисом. (A) Схема окрашивания. (B) Конфокальная микроскопия WT и PEX19 KO клеток HEK293T гиперэкспрессии GFP-SKL и окрашенных красным пероксисомным зондом (1 мкм в течение 10 минут). Масштабные планки — 1 мкм и 10 мкм. Показан профиль репрезентативной интенсивности. (C) Конфокальная микроскопия человеческих фибробластов, переэкспрессирующих GFP-SKL и окрашенных PeroxiSPY (1 мкм в течение 10 минут). Масштабные планки — 1 мкм и 10 мкм. Показан профиль репрезентативной интенсивности. (D) Конфокальная микроскопия клеток SW13 (кора надпочечников), SH-SY5Y (нейробласты), CCL-136 (миоциты), HaCat (кератиноциты), U2OS (остеобласти) и HEK293T (эмбриональная почка человека), окрашенных с помощью зонда с красным пероксисомным зондом (1 мкм в течение 10 минут). Масштабные планки — 2 мкм и 10 мкм. Количественная оценка проводилась с использованием Фиджи, как описано^{ранее, 9} и показывает количество пероксисом на микрон-квадрат, среднее ± SEM, N = 100 клеток, объединённых из 3 биологических повторов, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, тест Крускаля-Уоллиса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Оптимизация пероксисомной визуализации и окрашивание фиксированных клеток. (A) Конфокальная микроскопия клеток COS-7 (почки африканской зелёной обезьяны), окрашенных красным пероксисомным зондом согласно протоколу (1 мкм в течение 10 минут; до оптимизации) и при оптимизированных условиях (250 нМ в течение 20 минут; после оптимизации). Шкала — 10 мкм. Средняя интенсивность пикселей пероксисомов и цитозоля была количественно измерена с помощью Фиджи и выражена в виде соотношения. N = 7 ячейок (до оптимизации) и 21 ячейка (после оптимизации). Средний ± SEM, *** - p < 0,001, **** - p < 0,0001, тест Шапиро-Уилкса. (B) Конфокальная микроскопия HEK293T клеток, окрашенных красным пероксисомным зондом (1 мкм) в течение 15 минут и 24 часа. Количественная оценка показывает флуоресцентную интенсивность пероксисом и цитоплазмы, а также соотношение пероксисомы к цитоплазме, в среднем ± SEM, N = 680 пероксисом, объединённых из 3 биологических повторов, **** - p < 0,0001, тест Шапиро-Уилкса. (C) Конфокальная микроскопия клеток Huh7, окрашенных пероксисомными зондами с использованием протокола фиксации. Пероксисомы были совместно окрашены с первичным антителом против PEX14 (1:100 в блокирующем растворе, 1 час инкубации на RT) и вторичным антителом (1:1000 в блокирующем растворе, козлая анти-Rabbit Alexa Fluor 488, 1 час инкубации в RT). Показаны репрезентативные конфокальные изображения. Шкала — 10 мкм. (D) Количественная оценка показывает изменения интенсивности пероксисомной флуоресценции во время фиксации и пермеабилизации, выполненные на HEK293T клетках согласно протоколу, среднее ± SEM, N = 100 клеток, объединённых из трёх биологических повторов, **** - p < 0,0001, тест Шапиро-Уилкса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Это простое обнаружение пероксисомы можно провести менее чем за 10 минут в клетках животных. Окрашивание PeroxiSPY позволяет визуализировать, количественно оценивать и отслеживать пероксисомы в живых клетках и доступно в красном виде (Таблица материалов) и далеко-красного зонд⁵ (Таблица материалов). Окрашивание обеспечивает визуализацию, схожую с пероксисомой, аналогичную классическому сигналу пероксисомного таргетирования (PTS1)l-окрашивание¹⁰ (рисунок 1B) без необходимости чрезмерной экспрессии. Флуорофоры фотостабильны и могут использоваться для сверхразрешающей визуализации и долгосрочного набора динамики пероксисомы в различных экспериментальных^{условиях 5,9,11}. Кроме того, зонды чувствительны к работе пероксисом; Поэтому их можно использовать для выявления и количественной оценки пероксисомной^{патологии 5} в исследовательских и диагностических целях. Окрашивание пероксисомы зависит от метаболизма пероксисом, а также способности пероксисом импортировать и окислять жирные кислоты. Поэтому важно оптимизировать концентрацию и время для используемых клеточных линий. Здесь мы представляем стандартную процедуру, которая работает для тестируемых клеточных линий; однако время окрашивания можно продлить до 24 часов без потери соотношения интенсивности флуоресценции пероксисомы к цитоплазме (см. рисунок 2B).

Зонды были протестированы на многих линиях клеток млекопитающих (см. рисунок 1 и рисунок 2), а также в клетках и эмбрионах рерио^{данио-рерио 5}, продемонстрировав специфичность к пероксисомам и простоту использования. Эти зонды не были протестированы на других клетках животных, и условия и концентрации зонда потребуют оптимизации для них. Зонды не окрашивают пероксисомы в клетках Arabidopsis thaliana ⁵.

Здесь обсуждаются некоторые задачи и соответствующие их решения для устранения неполадок. Если соотношение пероксисомы к цитоплазме слишком низкое (окрашивание с низким уровнем пероксисом), убедитесь, что клетки свежерасщеплены, а затем снова раздельте их для окрашивания. Используйте 30-70% confluency для окрашивания. Оптимизируйте концентрацию зонда (слишком высокая концентрация приведёт к превышению пероксисомной способности для поглощения зондов) и тайминга (например, см. рисунок 2A). Используйте чашу с стеклянным дном 35 мм (окрашивание пластин на 96 лунок сложнее из-за малого объёма смешивания). Убедитесь, что зонды добавлены в микроцентрифугную трубку и тщательно смешаны с средой перед добавлением в ячейки. Разные линии клеток и разные условия влияют на окрашивание. Наконец, промывка зонда уменьшит фон; однако сигнал постепенно теряется, что сокращает время эффективного проведения визуализации.

Если видимых пероксисом, убедитесь, что зонд был смешан с материалом. Увеличить концентрацию зонда (например, до 2 мкм). Введите дополнительный пероксисомный маркер, чтобы пероксисомы можно было визуализировать. Если окрашивание варьируется от клетки к клетке, важно удалить всю среду и тщательно перемешать его с аликвотом перед добавлением обратно в клетки. Это обеспечивает равномерное окрашивание. Если вариации всё ещё есть, возможно, что популяция клеток неоднородна по способности импортировать пероксисомный субстрат. Синхронизация клеток путём регулярного расщепления способствует равномерному окрашиванию. Если сигнал не обнаружен, проверьте, совместимы ли настройки лазера на микроскопах с параметрами возбуждения/излучения зонда. Если фон снаружи ячейки слишком яркий, промывайте зонды, чтобы убрать этот фон; однако сигнал постепенно теряется, что сокращает окно времени, в течение которого можно эффективно проводить визуализацию. Кроме того, фиксация может использоваться для уменьшения фона. Если постфиксация сигнала очень слабая, проверьте, теряется ли сигнал после сложения Triton-X 100. Этот шаг может быть изменен или удалён в зависимости от последующих применений. Сократьте этапы мытья.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
анти-PEX14 антитела	Proteintech	10594-1-AP
Конфокальный микроскоп	Nikon	A1r	Любой конфокальный микроскоп с объективом с высоким NA, например, 60x маслом NA1.4
DMEM	Pan Biotech	P04-03590	Среда клеточной культуры
Пластины для изображения со стеклянным дном	Cellvis	D35C4-20-1.5-N
Козла против кроликов Alexa Fluor 488	ABCAM	ab150081
HEK293T	ATCC	CRL-3216
PeroxiSPY555	Спирохром	https://spirochrome.com/product/peroxi_spy555/	https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2
PeroxisPY650	Спирохром	https://spirochrome.com/product/peroxi_spy650/	https://doi.org/10.1038/s41467-024-48679-2