Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Моделирование макрофагов, ассоциированных с опухолями, in vitro: роль секретируемых факторов в динамике микроокружения опухолей

453 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69406

⸱

30 декабря 2025 г.

 ,  ,  , 
1Instituto de Farmacología, Facultad de Medicina, Universidad de Buenos Aires, 2Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), 3Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET, Academia Nacional de Medicina

В этой статье

Краткое содержание

В этой рукописи представлен протокол in vitro для создания макрофагоподобных клеток, ассоциированных с опухоли, путём воздействия человеческих моноцитов на кондиционированную среду из опухолевых клеточных линий.

Аннотация

Макрофаги обладают удивительной пластичностью, позволяя им приобретать различные функциональные состояния в ответ на различные факторы окружающей среды. В солидных опухолях они часто составляют самую распространённую популяцию иммунных клеток в микросреде опухоли, где их называют макрофагами, ассоциированными с опухолями (ТАМ). ТАМы тесно взаимодействуют с злокачественными клетками, активно способствуя прогрессированию опухоли, ангиогенезу и обходу иммунитета. Опухолевые клетки могут перепрограммировать макрофаги через прямой контакт между клетками и широкий спектр секретируемых факторов, формируя их поляризацию в сторону проопухолевых фенотипов. Для изучения этих механизмов поляризации TAM in vitro мы предлагаем метод, который подвергает человеческие моноциты воздействию растворимых факторов, присутствующих в среде, обусловленной линиями опухолевых клеток. Этот протокол позволяет генерировать TAM-подобные макрофаги в контролируемых условиях, облегчая анализ фенотипических и функциональных изменений, вызванных сигналами, полученными от опухоли. Наш подход предлагает воспроизводимую и физиологически значимую модель для изучения взаимодействий опухолей и макрофагов, углубляет наше понимание перепрограммирования макрофагов и поддерживает исследования новых терапевтических стратегий в онкологической иммунологии и иммунотерапии.

Введение

Макрофаги — это многофункциональные врождённые иммунные клетки, чья удивительная пластичность позволяет им принимать разнообразные фенотипы в ответ на сигналы окружающейсреды 1. Внутри солидных опухолей макрофаги часто становятся самой многочисленной популяцией иммунных клеток и дифференцируются в макрофаги, ассоциированные с опухолями (TAMs)2. Эти клетки активно перепрограммируются микроокружением опухолей для поддержки роста опухоли, стимулирования ангиогенеза, облегчения метастазирования и подавления эффективных противоопухолевых иммунных ответов. Опухолевые клетки обеспечивают эту поляризацию как через прямые взаимодействия между клетками, так и через сложный репертуар секретируемых факторов, включая цитокины, хемокины и факторы роста, которые изменяют транскрипционные и функциональные программымакрофагов 3. Это динамичное взаимодействие лежит в основе центральной роли TAMs в биологии рака и подчёркивает пластичность макрофагов как вызов и возможность для терапевтическоговмешательства 2.

Клиническая значимость TAM всё больше признаётся: их численность в опухолях часто коррелирует с плохим прогнозом и устойчивостью к терапии 4,5. В результатеTAMs 6 стали привлекательными терапевтическими целями. Стратегии, направленные на блокировку их рекрутации, ингибирование выживания или перепрограммирование на воспалительные и опухолицидные фенотипы, в настоящее времяисследуются 6. Понимание механизмов, с помощью которых факторы, произтичающие от опухолей, поляризуют макрофаги в TAM, является необходимым для разработки эффективных иммунотерапии. Хотя блокада иммунных контрольных пунктов показала большой успех при многих видах рака, её эффективность остаётся ограниченной вдругих 7. Сочетание терапий, направленных на Т-клетки, таких как анти-Программированный Белок Клеточной Смерти 1 (PD-1) или Анти-Программированный Клеточная Лиганд 1 (PDL-1), с стратегиями перепрограммирования макрофагов может усилить общий противоопухолевой иммунный ответ.

Традиционные экспериментальные модели для изучения биологии TAM включают in vivo модели рака мышей, которые создают сложную и физиологически значимуюсреду 8. Эти модели дали фундаментальное понимание рекрутинга и его функции TAM. Однако значительные межвидовые различия в иммунной сигнализации, биологии опухолей и онтогенезе макрофагов могут ограничивать прямой перевод в человеческие заболевания 9,10. Кроме того, сложность систем in vivo затрудняет выделение и изучение конкретных сигнальных путей или молекулярных событий, определяющих поляризацию макрофагов.

В отличие от этого, модели in vitro предлагают более простые и контролируемые условия для анализа этих механизмов. Наиболее широко используемый подход заключается в поляризации макрофагов, полученных из моноцитов, с помощью определённых стимулов: интерферон гамма-гамма (IFN) и бактериальный липополисахарид (LPS) для получения провоспалительных макрофагов (M1), или интерлейкина 4 (IL-4) и интерлейкина 10 (IL-10), либо дексаметазона для получения различных противовоспалительных макрофагов (M2) подтипов 11,12,13,14. Эти модели помогли выявить молекулярные маркеры и транскрипционные программы, связанные с каноническими состояниями поляризации макрофагов. Тем не менее, они не способны воспроизвести сложную, многофакторную среду, с которой сталкиваются макрофаги внутри опухолей, где поляризация возникает из-за одновременного воздействия множества растворимых медиаторов, метаболических сигналов и взаимодействий междуклетками 15,16. Хотя классическая классификация M1/M2 по-прежнему полезна для описания функциональных состояний макрофагов, теперь ясно, что существует гораздо больше популяций макрофагов, чем считалось ранее. Работа группы доктора Жинху и других, используя одноклеточные транскриптомические подходы, продемонстрировала широкое разнообразие подмножеств макрофагов, обнаруженных как в физиологических условиях, так и приболезни 17,18. Это подчёркивает, что TAM, хотя часто описывают как похожие на профили, похожие на M2, не являются строго эквивалентными макрофагам, дифференцируемым исключительно каноническими цитокиноми; наоборот, они имеют общие черты, но также демонстрируют чёткие и контекстно-зависимые различия.

Чтобы преодолеть этот разрыв, мы предлагаем протокол in vitro, который моделирует поляризацию, похожую на TAM, подвергая макрофаги, полученные из человеческих моноцитов, воздействию условной среды, собранной из опухолевых клеточных линий. Этот метод отражает влияние опухольного секретома — богатой смеси цитокинов, хемокинов и факторов роста, выделяемых раковыми клетками. Таким образом, она предоставляет релевантную и экспериментально доступную систему для изучения фенотипического и транскрипционного перепрограммирования макрофагов в ответ на растворимые факторы, полученные из опухоли. В отличие от предыдущих подходов, при которых моноциты подвергались непосредственному воздействию опухолевой среды, этот протокол специально сосредоточен на перепрограммировании макрофагов, что лучше отражает поведение резидентных макрофагов в микросредеопухоли 19,20. Кроме того, он включает оптимизированную и простую панель поверхностных маркеров для оценки поляризации макрофагов с помощью потоковой цитометрии, что легко реализовать и расширяться в соответствии с потребностямиисследователя 14,21. Наконец, поскольку показано, что M-CSF поднимает моноциты к M2-подобному фенотипу 10,15,22,23,24, мы сознательно опустили его, чтобы убедиться, что наблюдаемая поляризация макрофагов происходит именно из-за воздействия среды, полученной от опухолиновых клеточных линий.

У этого подхода есть несколько сильных сторон: он сохраняет воспроизводимость и простоту систем in vitro, использует первичные человеческие клетки для большей трансляционной значимости и лучше отражает гетерогенный, многофакторный характер микросреды опухолей по сравнению с одноцитокиновымимоделями 25,26,27,28 . Кроме того, он способствует сравнительным исследованиям ответов макрофагов на условные среды различных типов опухолей или генетически модифицированных раковых клеток и служит платформой для тестирования фармакологических агентов, способных изменять поляризацию TAM. Помимо общей применимости, этот метод можно адаптировать для различных моделей опухолей путём выбора подходящих клеточных линий или корректировки доли условных сред. Тем не менее, пользователям следует понимать, что вариабельность между здоровыми донорами и линиями опухолевых клеток может влиять на воспроизводимость, что подчёркивает важность тщательного проектирования и стандартизации экспериментов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Периферические образцы крови были собраны у здоровых доноров после информированного согласия в соответствии с Хельсинкской декларацией. Этот протокол был утверждён Институциональным комитетом по этике Университета Буэнос-Айреса. См. таблицу материалов для получения информации обо всех материалах и реагентах, используемых в этом протоколе.

ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте стерильные условия на протяжении всего протокола, работая в шкафе уровня биобезопасности 2 (BSL-2), и обеспечивайте жизнеспособность клеток >90%. Для утилизации все биологические отходы сначала должны быть деконтаминированы путём замачивания в растворе 10% гипохлорита натрия не менее 30 минут, а затем помещён в соответствующий контейнер для биологической опасности.

1. Культура опухолевых клеточных линий и подготовка условной среды

  1. Разморозить клеточную линию MDA-MB-231 с тройным отрицательным диагнозом рака молочной железы (или другой выбранной опухоли) из хранения жидкого азота. Немедленно погрузите криотрубки, содержащие клеточные линии, в водяную ванну при температуре 37 °C и аккуратно покрутите флакон для быстрого и равномерного оттаивания. Уберите флакон сразу после того, как он почти полностью разморозился.
  2. Переместить размораживаемые клетки в центрифугационную трубку объемом 15 мл, содержащую 5 мл стерильного фосфат-буферного физиологического раствора (PBS). Центрифугуйте суспензию ячейки при 400 × г в течение 5 минут при комнатной температуре (RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс оттаивания должен проводиться быстро для сохранения жизнеспособности клетки.
  3. Аккуратно сбросьте супернатант и быстро суспензуйте клеточную гранулу в 1 мл свежей полной среды Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), содержащей высокий уровень глюкозы (4,5 г/л) с 10% плодовой бычьей сывороткой (FBS), 4 мМ глутамина и 1 мМ пирувата натрия. Подсчитайте ячейки в ресуспензионной гранулы, выполняя следующее двухэтапное последовательное разбавление:
    1. Сначала подготовьте разбавление суспензии 1:5 в стерильной среде DMEM, а затем (1:2) с окрашиванием жизнеспособности Trypan Blue, чтобы получить окончательное разбавление 1:10.
    2. Используйте световой микроскоп, чтобы подсчитать жизнеспособные клетки внутри гемоцитометра Нойбауэра (или счётной камеры). Подсчитайте жизнеспособные клетки (только клетки, исключающие синий краситель) и определите среднее количество жизнеспособных клеток на большой угловой квадрат.
    3. Вычислите окончательную концентрацию по следующей формуле: Клетки/мл = (Средние ячейки на квадрат) x (Коэффициент разбавления) x 10 000.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Суспензировать клетки в нужном объёме полной среды DMEM для получения конечной концентрации 1x 105клеток/мл.
  4. Посеять 2,5 x 105–5,0 x 10 x 10 5 клеток в термотермос T25 с 5 мл полной среды DMEM. Поддерживайте культуру при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%CO2 до достижения необходимой плотности клеток для сбора урожая.
  5. На следующий день после посева проверьте прикрепление клеток под микроскопом. Если более 50 % клеток плавают (что указывает на гибель клеток), аккуратно аспирируйте старую среду и замените её 2,5 мл свежей, предварительно нагретой средой.
  6. Ежедневно следите за ростом клеток. Когда культура достигает примерно 90% слияния (примерно 2,3 x 106 клеток в колбе T25), обычно в течение 5 дней, клетки готовы к субкультивированию (разделению). Чтобы разделить ячейки в соотношении 1:8, следуйте следующим шагам:
    1. Удалите отработанную среду с помощью стерильной пипетки Pasteur.
    2. Промыйте монослой клетки один раз 3 мл стерильного 1x PBS, чтобы удалить остаточную сыворотку, которая ингибирует трипсин. Аспирируйте и сбросьте 1x PBS.
    3. Добавьте в клетки 1 мл раствора 0,25% трипсина-1 мм этилендиаминететрауксусной кислоты (ЭДТА) и инкубировать при 37 °C и 5%CO2 на увлажнённом инкубаторе в течение 3 минут, чтобы отделить клетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальное время инкубации при использовании Трипсина/ЭДТА зависит от конкретной клеточной линии и, возможно, потребуется корректировка. Проверьте клетки под микроскопом через 3 минуты, чтобы убедиться, что они полностью отсоединились.
    4. Нейтрализуйте ферментативную активность, добавив 3 мл полного DMEM-среды. Сразу после этого аккуратно пипетуйте вверх и вниз, чтобы полностью отсоединить и подвесить клетки.
  7. Перенесите 3,5 мл суспензии ячейки в коническую трубку объёмом 15 мл и центрифугуйте её 5 минут при 400 x g при RT.
  8. Аккуратно удалите супернатант и вновь суспензуйте клеточную гранулу в 1 мл замораживающей среды (которая должна содержать 90% FBS плюс 10% диметилсульфоксида (DMSO). Перенесите и аликвотируйте суспензию клетки в криовиалы, обеспечивая концентрацию 5 x 105 клеток в трубке для дальнейшего использования.
    1. Замораживание нужно постепенно охлаждать, помещая криовиалы в контейнер Mr. Frosty (или аналогичный контейнер с контролируемой скоростью заморозки). Перенесите контейнер в морозильник при температуре -80°C и оставьте клетки заморозить на ночь. Клетки можно содержать при -80°C несколько дней, но затем их следует перевести в жидкий азот для длительного хранения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ведите подробные записи прохождения клетки и используйте ранние отрывки для экспериментов. Рекомендуется использовать ячейки с менее чем 20 пассажами.
  9. Когда новые культуры снова достигнут ~90% слияния, аспирируйте и собирайте супернатант в коническую трубку объёмом 15 мл. Если вы хотите сохранить культуру, замените собранный том на свежий полный формат DMEM.
    1. Центрифугуйте собранный супернатант при 400 × г в течение 5 минут при 4 °C, чтобы гранулировать и удалить клеточный мусор. Оставьте супернатант (очищенную кондиционированную среду), а гранулу выбросите.
  10. Аликвотируйте очищенные кондиционированные среды на порции по 1 мл, маркируйте трубки и храните их при -20 °C до использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для контроля качества всегда ведите запись о дате сбора условных носителей и о предварительном разморозке аликвота. Настоятельно рекомендуется избегать размораживания одного и того же аликвота более двух раз. Кроме того, используйте кондиционированный препарат в течение одного месяца после даты заморозки, чтобы обеспечить оптимальную активность.

2. Изоляция периферических мононуклеарных клеток крови (PBMC)

ПРИМЕЧАНИЕ: PBMC выделены из 40 мл периферической крови, с антикоагуляцией с 3,8% цитратом натрия. Изоляция выполняется с использованием градиента плотности Фиколла-Гипака (1077) и центрифугирования. Весь этот протокол должен проводиться в стерильных условиях в шкафу BSL2.

  1. Аликоагулянтный образец периферической крови в коническую трубку объёмом 15 мл или 50 мл перед предстоящим этапом центрифуга.
  2. Центрифугите образцы крови на низкой скорости — 200 × г в течение 15 минут при RT для разделения компонентов крови. В результате этого процесса образуется плазма, богатая тромбоцитами (PRP) в качестве верхнего слоя, а снизу — клеточная фракция (красные и белые кровяные клетки). Используйте центрифугу с ускорением: 4 и замедление: 2, при максимальном уровне 5.
  3. После центрифугирования аспирируйте супернатант (верхнюю фракцию), то есть PRP, и перенесите его в новую стерильную трубку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется для дальнейших экспериментов, собранный PRP можно снова центрифугировать при 600 × г при RT в течение 10 минут (максимальное ускорение и замедление) для удаления тромбоцитов, а плазму без тромбоцитов хранить при -20 °C для других анализов.
  4. Нижняя клеточная фракция, полученная при начальной центрифуге на втором этапе, должна быть аккуратно разведена до итогового объёма в 2–3 раза с использованием стерильного температуры комнатной температуры 1x PBS. Мягко гомогенизируйте путём инверсии полученной суспензии и используйте её для центрифугирования плотностного градиента Фиколла-Гипака.
  5. Наливайте 15 мл комнатной температуры Ficoll-Hypaque в стерильную трубку объёмом 50 мл.
  6. Аккуратно и медленно нанесите 30 мл разбавленной крови поверх Ficoll-Hypaque, чтобы не смешаться обе фазы.
  7. Центрифугировать слоистую трубку Ficoll-blood на 25 минут при давлении 600 × г при RT. Выставить центрифугу без тормоза (ускорение: 1; Замедление: 0).
  8. Используйте стерильную пипетку Пастера, чтобы сбросить не менее 4 мл полученной верхней фракции, чтобы избежать пролива. Затем используйте ту же пипетку для извлечения белого кольца, содержащего PBMC, образовавшееся между верхней фракцией и прозрачной фракцией Фиколла-Гипака. Избегайте сбора Ficoll вместе с кольцом PBMC.
  9. Перенесите кольцо PBMC из трубки в стерильную центрифугную трубку на 15 мл с не менее 3 мл 1x PBS.
  10. Заполните трубку на 15 мл дополнительными 1x PBS и центрифугой при 600 × g (максимальное ускорение и торможение) на 10 минут при RT.
  11. Удалить супернатант инверсией, снова заполнить его 1x PBS и центрифугировать при 600 × g ( максимальное ускорение и замедление) в течение 10 минут при RT.
  12. Удалите супернатант и снова суспензируйте PBMC в 2–3 мл стерильного 1x PBS плюс 2% термоинактивированного FBS (1x PBS-2% FBS), затем увеличите объём до 10 мл. Посчитайте клетки, подготовив суспензию 1:5, разбавленную в стерильном холоде 1x PBS, а затем (1:2) в 0,4% Trypan Blue, чтобы получить окончательное разбавление 1:10. Используйте клеточную камеру на световом микроскопе, как описано в шаге 1.3.2, для подсчёта.
  13. Убавьте подвеску PBMC на 300 × g на 5 минут при 8-10 °C. Ресуспензировать клетки в нужном объеме стерильного холодного 1x PBS-2% FBS для получения конечной концентрации 108 клеток/мл. Оставьте эти клетки при 4 °C до следующего шага.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе собранные PBMC можно заморозить в криогенном флаконе при10-8 клетках/мл в среде замораживания (90% FBS-10% DMSO). Храните при -80 °C в контейнере Mr. Frosty на ночь, чтобы клетки медленно замерзли. На следующий день перенесите клетки в ящик для хранения и оставьте при -80 °C на пару дней, либо переведите в резервуар с жидким азотом на длительный срок хранения, либо продолжите процедуру.

3. Сортировка моноцитов CD14+ с помощью магнитных шариков

ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные моноциты CD14+ получаются из PBMC с помощью набора для магнитной сортировки CD14+ с положительнымотбором человека 11. Процент клеток CD14+ в PBMC зависит от донора, но оценивается в 10% (от 5 до 20%). Адаптируйте начальное количество PBMC и конечные объёмы реакции в зависимости от необходимого количества моноцитов для вашего эксперимента. Рекомендуемый минимальный объём реакции составляет 100 мкл, даже при обработке менее 1 × 107 PBMC.

  1. Добавьте 10 мкл коктейля положительного выбора на каждые 100 мкл PBMC, пипетки вверх и вниз и оставьте на льду 15 минут.
  2. Вихрь бусины подвешивают на 30 секунд перед использованием. Затем добавьте 10 мкл шариков на каждые 100 мкл подвески PBMC. Хорошо перемешайте и инкубуйте 15 минут на льду.
  3. Добавьте 1x PBS-2% FBS -1 mM EDTA к итоговому объёму 2,5 мл, аккуратно перемешайте подвеску, вставьте трубку на магнит и инкубируете 5 минут.
  4. Инвертируйте магнит (не снимая трубку) поверх трубки для отброса на 2-3 секунды, избегая трясения. Положительные клетки останутся в трубке.
  5. Вынимите трубку из магнита и добавьте 1x PBS-2% FBS -1 мМ EDTA на стенки трубки до конечного объёма 2,5 мл.
  6. Снова вставьте трубку в магнит и инкубуйте 5 минут.
  7. Инвертируйте магнит (не снимая трубку) поверх трубки для отброса на 2-3 секунды, избегая трясения. Вынимите трубку от магнита и добавьте 3 мл 1x PBS-2% FBS на стенки трубки, чтобы восстановить все клетки.
  8. Потратите 10 мкл, чтобы подсчитать количество клеток CD14+ в камере Нойбауэра световым микроскопом. Разбавьте Trypan Blue в соотношении 1:2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вычислите количество ячеек по следующему уравнению: Количество ячеек CD14+ = количество живых ячеек среды на квадрант x коэффициент разбавления x 10.000.
  9. Поместите суспензию CD14+ в новую стерильную трубку объёмом 15 мл и промывочные ячейки, центрифугирая при 600 × г ( максимальное ускорение и замедление) в течение 10 минут при 4 °C.
  10. Ресуспензировать клетки CD14+ с использованием среды RPMI 1640, дополненной полной средой 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицина (P/S) в удобном объёме, чтобы получить 2,5 x10 6 клеток/мл на следующем этапе, учитывая количество полученных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Держите моноциты CD14+ на льду до следующего шага, чтобы избежать прикрепления этих клеток к пластиковой стенке трубки.

4. Дифференциация макрофагов

  1. Пластинчатые очищенные моноциты CD14+ в 2,5 x 105 клеток, взвешенных в 250 мкл полной среды RPMI (10% FBS-1% PS) на одну скважину в обработанной пластине с 48 лунками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это также можно сделать с половиной меньшим количеством ячеек в пластине с 96 хорошо обработанными работами.
  2. Добавьте стерильную воду в окружающие пустые колодцы, чтобы уменьшить испарение во время инкубации пластин.
  3. Инкубировать клетки в течение 5 дней при 37 °C с 5% CO₂ в увлажнённом инкубаторе без нарушения, ежедневно следя за морфологией, дифференцировкой и жизнеспособностью.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя M-CSF (25 нг/мл) можно добавить для дифференцировки, мы подтверждаем, что наш протокол использует только 10% высококачественного FBS для получения макрофагов M0 после пяти дней культуры. Мы конкретно рекомендуем избегать M-CSF из-за его потенциала способствовать подготовке моноцитов к M2-подобномуфенотипу 10,22.

5. Воздействие макрофагов на кондиционированные среды и анализ

  1. На пятый день дифференцировки аккуратно удалите 50% (125 мкл) среды из каждой колодцы и замените на одну из них:
    1. 125 мкл свежей RPMI полной средой (управляющей),
    2. 125 мкл среды, обусловленной линией опухолевых клеток (например, из MDA-MB-231), или
    3. 125 мкл полной среды DMEM (контроль для кондиционируемых сред).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для начальной оптимизации с использованием новых линий опухолевых клеток тестируйте диапазон концентраций условных сред (например, 10%, 25% и 50%). Этот диапазон предполагается для обеспечения жизнеспособности макрофагов и изменений в дифференциации. Выбирайте более высокую концентрацию кондиционированных сред, которая демонстрирует высокую жизнеспособность макрофагов.
  2. Продолжайте инкубацию до 7-го дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На пятый день получают макрофаги M0, затем ещё 2 дня культуры в присутствии условных сред достаточно, чтобы вызвать экспрессию маркеров поляризации поверхности. Маркеры поверхности поляризации определяются с помощью потоковой цитометрии, аналогично, при использовании стандартизированных цитокинов для генерации макрофагов M1 илиM2 11,14.
  3. Ежедневно оценивайте жизнеспособность и морфологию макрофага под микроскопом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ежедневно отслеживайте дифференциацию макрофагов в течение 7-дневного периода культуры. Клеточная прикреплённость используется как индикатор здоровой и жизнеспособной культуры. Более высокая доля вереноснообразных клеток свидетельствует о повышении дифференцировки и поляризации в группе обработки с кондиционированной средой (КМ), как показано на рисунке 2.

6. Сбор макрофагов для оценки маркеров поляризации с помощью потоковой цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: По желанию, для дальнейшего расширения фенотипной характеристики макрофагов, ассоциированных с опухоли, выделите РНК для измерения экспрессии генов, связанных с поляризацией (например, TGM2, IRF-4 и CXCL10) с помощью количественной полимеразной цепной реакции (qPCR) или собрайте супернатанты культуры для измерения канонического производства цитокинов (например, TNFα, IL-6 и IL-10) с помощью ферментно-связанного иммуносусорбентного анализа (ELISA), как сообщила наша группа11, 14.

  1. Сбросьте её, аккуратно аспирируя стерильной пипеткой Пастера или наконечником объёма культурной среды каждой колодцы и добавьте 200 мкл холодного буфера 1x PBS-2% FBS-1 мМ EDTA для сбора клеток.
  2. Инкубировать 10–15 минут на льду, затем добавить 200 мкл 1x PBS-2% FBS, чтобы разбавить буфер EDTA. Собирайте макрофаги, пипетируя вверх и вниз (всё ещё на льду) ещё 5 минут, пока все клетки не отсоединятся.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг крайне важен для получения достаточного количества жизнеспособных макрофагов. Важно не продлевать время экспозиции ЭДТА дольше, чем рекомендовано, чтобы сохранить жизнеспособность клеток. После завершения процедуры проверьте клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они полностью отделены.
  3. Собирайте макрофаги на микротрубке объемом 1,5 мл и промывайте их с 1 мл 1x PBS-2% FBS центрифугой при 400 × г в течение 5 минут при 8-10 °C.
  4. Повторно суспензируйте гранулы макрофагов с 200 мкл 1x PBS-5% FBS и перенесите их на микропластину с круглым дном на 96 лунок для неспецифического блокирования при RT на 15 минут. Центрифугуйте клетки при температуре 400 x g в течение 5 минут при 8-10 °C.
  5. Сбросьте супернатант, быстро перевернув пластину.
  6. Приготовьте соответствующий коктейль из непосредственно конъюгированных антител в 1x PBS-2% FBS с коэффициентом разбавления 1:50 для каждого антитела. Окрашивайте каждый образец 50 мкл антитела и инкубуйте 30 минут в темноте на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Коктейль антител: CD11b-PE/Cy7 (200 мкг/мл), CD64-AlexaFluor 647 (150 мкг/мл), CD163-PerCP/Cy5.5 (200 мкг/мл), HLADR-PE (40 мкг/мл) и CD206-AlexaFluor 488 (400 мкг/мл). Концентрация антител с предварительной реакцией приведена в Таблице 1; каталожные номера можно найти в Таблице материалов.
  7. Промыйте окрашенные макрофаги, добавив 150 мкл 1x PBS, и центрифугуйте при 400 × г в течение 5 минут при 8-10 °C.
  8. Сбросьте супернатант, быстро перевернув пластину.
  9. Чтобы измерить жизнеспособность клетки, добавьте 100 мкл фиксируемого красителя Zombie Violet (1:1 000 в 1x PBS) и инкубировать в темноте 30 минут на льду.
  10. Промыйте окрашенные клетки, добавив 100 мкл 1x PBS и центрифугируя при 400 г в течение 5 минут при 8-10 °C. Повторите процедуру стирки, используя 200 мкл 1x PBS.
  11. Фиксируйте, повторно подвешивая клеточную гранул 20 мкл свежеприготовленного параформальдегида 1% и инкубировав их 20 минут на льду и в темноте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: для фиксации использовался 1% параформальдегид без проницаемости. Опционально: коммерческий фиксационный компонент (из комплекта BD fixative/permeabilization) также может использоваться для этого шага11.
  12. Промывайте ячейки, добавив 180 мкл 1x PBS-2% FBS и центрифугу при 400 г в течение 5 минут при 8-10 °C. Повторите процедуру стирки, используя 200 мкл 1x PBS-2% FBS.
  13. Отбросьте супернатант путём инверсии пластины и ресуспензируйте гранулу в 200 мкл 1x PBS для измерения в оборудовании проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если окрашивающиеся и фиксированные образцы не могут быть проведены проточной цитометрией в один день, храните их при 4 °C и защищайте от света. Анализируйте образцы как можно скорее в ближайшие дни.
  14. Анализируйте результаты потоковой цитометрии с помощью программного обеспечения FlowJo. Стратегия гейтинга начинается с исключения мусора с помощью прямого и бокового рассеяния (FSC/SSC). Затем выберите живые макрофаги как клетки Zombie Violet CD11b⁺.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку автофлуоресценция макрофагов зависит от донора, важно использовать контрольные методы, полученные от одного и того же донора, для каждого эксперимента.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Мы получили тройноотрицательные клетки, ассоциированные с опухолями рака молочной железы (TAM), обрабатывая макрофаги, полученные из моноцитов, с использованием 50% кондиционированной среды (CM) из клеточной линии MDA-MB-231. Моноциты были отсортированы из периферических мононуклеарных клеток (PBMC) шести независимых здоровых доноров и дифференцированы согласно нашему протоколу. Подготовка КМ использовала клетки MDA-MB-231 с совпадением 90 % (см. рисунок 1

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

Описанный здесь протокол предоставляет воспроизводимый и практичный подход к изучению поляризации, ассоциированной с опухолями, макрофагов, похожим на макрофагов, путем воздействия среды, обусловленной линией опухолевых клеток. Эта система фиксирует влияние растворимых факторов, секретируемых опухолевыми клетками, которые, как известно, играют ключевую роль в перепрограммировании макрофагов в микросредеопухоли 7,9,10,15,19,20.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые нужно раскрывать.

Благодарности

Мы признаём признательность за финансовую поддержку, предоставленную Национальным агентством по развитию науки и технологий (ANPCyT-FONCYT) через гранты PICT 2021 I-INVI-00034 (для DR), PICT 2021-I-A-00807 (для E.A.C.S.) и PICT 2021-I-A-00716 (для A.E.E.). Мы также благодарим Национальный научно-технический исследовательский совет (CONICET) за грант PIP 2022-0763 и Университет Буэнос-Айреса за PIDAE 2022, присуждённый А.Э.Е.

M.C.L. был обладателем стипендии Legado Peruilh от Медицинской школы Университета Буэнос-Айреса и является обладателем докторской стипендии ANPCyT-FONCYT. D.R., E.A.C.S. и A.E.E. — профессиональные исследователи в CONICET.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Alexa Fluor 488 мышь против человека  Клон антитела CD206 15-2BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США.Кот# 321113; RRID:AB_571874
Alexa Fluor 647 мышиный античеловеческий клон CD64 к антителам 10.1BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США.Кот# 305012; RRID:AB_528867
BD Cytofix/CytopermBD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, СШАКот# 554714Комплект фиксации/проницаемости
Модифицированная орлиная среда Dulbecco (DMEM), высокое содержание глюкозыGibco  Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США  Кот# 11965092
EasySep Положительный набор для отбора человека CD14; Коктейль EasySep Positive Choice; Магнитные наночастицы EasySep; Easy Sep MagnetSTEMCELL Technologies, Ванкувер, КанадаCat# 18058
FACS Cantocytometer Бектон Дикинсон, Франклин-Лейкс, Нью-Джерси, США.
Сыворотка плода крупного рогатого скота, квалифицированная, Новая Зеландия Gibco™   Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США  Кот# 10091148
Ficoll-Paque PLUS CytivaGE Healthcare — науки о жизни, СШАКот# 17144003
FlowJoFlowJo LLC.RRID:SCR_008520
GraphPad Prism   GraphPad Software Inc.RRID:SCR_002798
Partec CyFlow пространственный цитометр и nbsp;Sysmex Partec, Германия
Клон антитела LLA-DR L243 против ПЭBioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США.Cat# 307605; RRID:AB_314683
PE/Cy7 крысиный клон антитела к мышей/человеку CD11b M1/70BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США.Кот# 101216; RRID:AB_312799
Клон антитела PerCP/Cy5.5 на мыши с антителами CD163 GHI/61BioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США.Кот# 333607; RRID:AB_1134006
RPMI 1640 MediumGibco  Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США  Кот# 11875119
Раствор пирувата натрияSigma-Aldrich Merck, Сан-Луис, Миссури, США. Cat#  S8636
Трипсин-ЭДТА (0,25%), фенол красныйGibco  Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США  Кот# 25200056
Набор для фиксируемой жизнеспособности Zombie VioletBioLegend, Сан-Диего, Калифорния, США.Кот# 423113

Ссылки

  1. Murray, P. J., et al. Macrophage activation and polarization: Nomenclature and experimental guidelines. Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).
  2. Goswami, S., Anandhan, S., Raychaudhuri, D., Sharma, P. Myeloid cell-targeted therapies for solid tumours. Nat Rev Immunol. 23 (2), 106-120 (2023).
  3. Christofides, A., et al. The complex role of tumor-infiltrating macrophages. Nat Immunol. 23 (8), 1148-1156 (2022).
  4. Umakoshi, M., et al. Macrophage numbers in the marginal area of sarcomas predict clinical prognosis. Sci Rep. 13 (1), 1290(2023).
  5. Toor, S. M., et al. Myeloid cells in circulation and tumor microenvironment of breast cancer patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (6), 753-764 (2017).
  6. Chen, Y., et al. Targeting tumor-associated macrophages: A potential treatment for solid tumors. J Cell Physiol. 236 (5), 3445-3465 (2021).
  7. Caverzan, M. D., et al. Exploring monocytes-macrophages in immune microenvironment of glioblastoma for the design of novel therapeutic strategies. Brain Sci. 13 (4), 542(2023).
  8. Anfray, C., Ummarino, A., Calvo, A., Allavena, P., Torres Andon, F. In vivo analysis of tumor-associated macrophages in the tumor microenvironment. Methods Mol Biol. 2614, 93-108 (2023).
  9. Linde, N., Gutschalk, C. M., Hoffmann, C., Yilmaz, D., Mueller, M. M. Integrating macrophages into organotypic co-cultures: A 3D in vitro model to study tumor-associated macrophages. PLoS One. 7 (7), e40058(2012).
  10. Karimova, A. F., et al. In vitro functional assays to assess the reciprocal interplay between tumor cells and macrophages. FASEB J. 38 (13), e23730(2024).
  11. Carrera Silva, E. A., Errasti, A. E. Reprograming model of human monocyte-derived macrophages for in-vitro assays. J Vis Exp. (218), e67651(2025).
  12. Colado, A., et al. The kinase inhibitors R406 and GS-9973 impair T cell functions and macrophage-mediated anti-tumor activity of rituximab in chronic lymphocytic leukemia patients. Cancer Immunol Immunother. 66 (4), 461-473 (2017).
  13. Colado, A., et al. Effect of the BTK inhibitor ibrutinib on macrophage- and gammadelta T cell-mediated response against Mycobacterium tuberculosis. Blood Cancer J. 8 (11), 100(2018).
  14. Nowak, W., et al. Pro-inflammatory monocyte profile in patients with major depressive disorder and suicide behaviour and how ketamine induces anti-inflammatory M2 macrophages by NMDAR and mTOR. EBioMedicine. 50, 290-305 (2019).
  15. Gattas, M. J., et al. A heterotypic tridimensional model to study the interaction of macrophages and glioblastoma in vitro. Int J Mol Sci. 22 (10), 5105(2021).
  16. Risnik, D., et al. Immunoregulatory effects of lurbinectedin in chronic lymphocytic leukemia. Cancer Immunol Immunother. 69 (5), 813-824 (2020).
  17. Mulder, K., et al. Cross-tissue single-cell landscape of human monocytes and macrophages in health and disease. Immunity. 54 (8), 1883-1900.e5 (2021).
  18. Silvin, A., et al. Dual ontogeny of disease-associated microglia and disease inflammatory macrophages in aging and neurodegeneration. Immunity. 55 (8), 1448-1465.e6 (2022).
  19. Maeda, A., Digifico, E., Andon, F. T., Mantovani, A., Allavena, P. Poly(I:C) stimulation is superior than imiquimod to induce the antitumoral functional profile of tumor-conditioned macrophages. Eur J Immunol. 49 (5), 801-811 (2019).
  20. Ummarino, A., Anfray, C., Maeda, A., Andon, F. T., Allavena, P. In vitro methods to evaluate macrophage polarization and function in cancer. Methods Mol Biol. 2614, 81-91 (2023).
  21. Carestia, A., et al. Platelets promote macrophage polarization toward pro-inflammatory phenotype and increase survival of septic mice. Cell Rep. 28 (4), 896-908.e5 (2019).
  22. Vogel, D. Y., et al. Human macrophage polarization in vitro: Maturation and activation methods compared. Immunobiology. 219 (9), 695-703 (2014).
  23. Ferrer, M. F., et al. Junin virus triggers macrophage activation and modulates polarization according to viral strain pathogenicity. Front Immunol. 10, 2499(2019).
  24. Ortiz Wilczynski, J. M., et al. The synthetic phospholipid C8-C1P determines pro-angiogenic and pro-reparative features in human macrophages restraining the proinflammatory M1-like phenotype. Front Immunol. 14, 1162671(2023).
  25. Dunsmore, G., et al. Timing and location dictate monocyte fate and their transition to tumor-associated macrophages. Sci Immunol. 9 (97), eadk3981(2024).
  26. Wang, X., Chen, J., Jia, G. From dichotomy to diversity: Deciphering the multifaceted roles of tumor-associated macrophages in cancer progression and therapy. Cancer Biol Med. 21 (2), 132-138 (2023).
  27. Hochstadt, J., Martinez Pacheco, S., Casanova-Acebes, M. Embracing diversity: Macrophage complexity in cancer. Trends Cancer. 11 (4), 351-364 (2025).
  28. Xu, J., et al. Dual roles and therapeutic targeting of tumor-associated macrophages in tumor microenvironments. Signal Transduct Target Ther. 10 (1), 268(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Поляризация макрофаговмоделирование in vitroдифференцировка моноцитовкондиционированная средавзаимодействия опухоли и макрофаговрепрограммирование макрофаговиммунология рака
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.