Method Article

Быстрый магнитно-микрогранулированный метод для эффективной очистки нейтрофилов низкой плотности

DOI:

10.3791/69407

⸱

November 11th, 2025

 ,  ,  ,  , 
1Departamento de Inmunología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейтрофилы низкой плотности (ПДН) значительно увеличиваются при некоторых заболеваниях. LDN обычно выделяют с помощью сортировки клеток. Мы представляем практический метод получения чистых и жизнеспособных LDN. После центрифугирования периферической крови с градиентом плотности клетки инкубируют с магнитными микрогранулами, а затем ЛДН отделяют с помощью магнитных колонок.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейтрофилы, важные лейкоциты врожденного иммунитета, традиционно считались однородной клеточной популяцией. Тем не менее, последние данные показали, что нейтрофилы существуют в нескольких субпопуляциях. Одной из таких субпопуляций являются нейтрофилы низкой плотности (LDN). LDN в небольших количествах обнаруживаются в крови здоровых людей, но их количество значительно увеличивается при таких заболеваниях, как системная красная волчанка, аутоиммунные расстройства, рак и инфекции. В этих случаях ПДН могут участвовать в патогенезе заболевания. Единственным способом выделения LDN является центрифугирование периферической крови с градиентом плотности. Однако после центрифугирования LDN совместно очищают с мононуклеарными ячейками. Таким образом, изучение этой субпопуляции нейтрофилов является сложной задачей. Не существует стандартной методологии для отделения LDN от мононуклеарных клеток. Как правило, ЛДН разделяют путем сортировки клеток в проточном цитометре. Однако этот метод требует длительного времени сортировки (часов) для получения достаточного количества чистых клеток для дальнейших функциональных исследований. Это серьезно влияет на жизнеспособность и функцию клеток. Здесь мы предлагаем практический метод получения большого количества чистых и жизнеспособных LDN за короткое время. После центрифугирования с градиентом плотности фракцию мононуклеарной клетки инкубируют с магнитными микрогранулами, анти-CD66b, а затем LDN разделяют через магнитные колонки через < 30 мин. Очищенные LDN (CD66b+ клетки) мечут моноклональными антителами против CD10, CD11b, CD14, CD15, CD16b, CD33, CD62L, CD66b и CD98 и анализируют с помощью проточной цитометрии для подтверждения. Очищенные LDN полностью функциональны, о чем свидетельствует их способность производить активные формы кислорода и образовывать внеклеточные ловушки нейтрофилов. Этот новый метод очистки позволяет получить LDN с высокой чистотой (более 90%) и жизнеспособностью (более 96%) за короткий период времени. Этот метод может быть легко масштабирован для получения большого количества чистых LDN для оценки функций LDN при различных заболеваниях с помощью биохимического или другого омиксного анализа.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейтрофилы, преобладающие лейкоцитыв крови человека1, являются ключевыми участниками врожденной иммунной системы. Они поступают в больших количествах в ткани с воспалением или инфекцией2. Там нейтрофилы активируют несколько эффекторных функций, таких как фагоцитоз 3,4, дегрануляция 5,6 и образование внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ)7. Кроме того, нейтрофилы также участвуют в адаптивном иммунном ответе8. Классический взгляд на нейтрофилы рассматривает их как однородные клетки, вырабатываемые в костном мозге с заранее определенными реакциями 9,10. Тем не менее, недавние исследования показывают, что нейтрофилы являются гетерогенными клетками с множественными фенотипическими и функциональными состояниями как в здоровом, так и в болезненном состояниях 11,12,13,14,15.

Среди нескольких субпопуляций нейтрофилов нейтрофилы низкой плотности (LDN) привлекли большой интерес из-за их свойств и из-за того, что их количество увеличивается принекоторых заболеваниях. LDN были обнаружены в крови пациентов с системной красной волчанкой (СКВ) в 1986-19 годах. Они были обнаружены в результате процесса разделения лейкоцитов с градиентом плотности20,21. После центрифугирования крови или обогащенной лейкоцитами плазмы на плотной среде (например, по Фиколлу-Паку) моноциты и лимфоциты (известные как мононуклеарные клетки периферической крови [PBMC]) образуют полосу в верхней (низкоплотной) части пробирки. Нейтрофилы оседают на дне пробирки. Среди PBMC также было обнаружено несколько нейтрофилов; это LDN (Рисунок 1). Небольшое количество ЛДН содержится в крови здоровых особей22. Тем не менее, количество LDN значительно увеличивается при множественной иммуносупрессии и хронических воспалительных состояниях, включая СКВ23,24, сепсис25, псориаз26, астму27, ювенильный идиопатический артрит28, васкулит, ассоциированный с антинейтрофильными цитоплазматическими антителами (ANCA)29, ВИЧ-инфекцию30, малярию31 и туберкулез32. Несмотря на то, что количество LDN увеличивается при всех упомянутых патологиях, LDN в основном изучались в контекстеСКВ 17. LDN из крови пациентов с СКВ, по-видимому, обладает большей способностью к образованию НВЛ33, секреции большого количества провоспалительных медиаторов34 и активации Т-клеток24. Однако при других состояниях, таких как рак, LDN, как сообщается, состоит из зрелых и незрелых нейтрофилов35, обладающих подавляющими свойствамиТ-клеток 36,37,38. Аналогичным образом, у пациентов с COVID-19 также сообщается, что LDN подавляет пролиферацию Т-клеток39, но, в отличие от СКВ, LDN, по-видимому, продуцирует меньше НВЛ39. Поэтому происхождение, состав и функциональные свойства ЛДН до сих пор остаются спорными.

Поскольку LDN находятся вместе с PBMC, их изучение технически сложно. Чтобы в полной мере изучить свойства ЛДН при разных патологиях, необходимо проводить их очищение. Распространенной процедурой разделения LDN является сортировка флуоресцентных клеток 22,40,41,42,43,44,45. Однако сортировка клеток требует длительного времени для разделения клеток. Это может привести к потере клеток или низкому восстановлению, если время сортировки недостаточно. Кроме того, клетки подвергаются чрезмерной нагрузке, что приводит к переменным результатам при изучении функции этих клеток. Длительное время сортировки также увеличивает стоимость экспериментальных процедур и требует специализированного персонала.

Здесь мы представляем быстрый и эффективный метод получения большого количества чистых и жизнеспособных человеческих LDN за очень короткое время. После центрифугирования с градиентом плотности LDN разделяют с помощью магнитной сортировки ячеек (MACS; Рисунок 1). Основным преимуществом данного метода очистки является то, что ЛДН отделяются с высокой чистотой (более 90%) и жизнеспособностью (более 96%). Кроме того, очищенные LDN полностью функциональны, о чем свидетельствует их способность генерировать активные формы кислорода (АФК) и высвобождать НВЛ. Этот протокол может быть легко реализован в любой лаборатории, заинтересованной в биологии нейтрофилов, для быстрого отделения LDN от крови людей с множественными заболеваниями с целью дальнейшего изучения этих клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры в этом протоколе соответствуют рекомендациям Комитета по биоэтике исследований человека при Instituto de Investigaciones Biomédicas - Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM). Все участники дали информированное согласие.

1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови (ПМЦ) и нейтрофилов из крови человека

  1. Получите около 10 мл крови от здорового взрослого добровольца с помощью венепункции. Добавьте 10 ЕД/мл гепарина в качестве антикоагулянта.
    ВНИМАНИЕ: Выбросьте иглу в контейнер для утилизации биологически опасных игл. Шприцы и другие материалы, контактирующие с кровью, должны быть помещены в пакет и автоклавированы перед утилизацией.
  2. В коническую центрифужную пробирку объемом 15 мл добавьте 2 мл 6% декстрана T500 в PBS. Затем добавьте 10 мл крови, слив ее вниз по стенке пробирки. Переверните пробирку пару раз, чтобы смешать кровь и декстран.
  3. Дайте трубке отдохнуть 45 минут, пока эритроциты не осядут. Богатая лейкоцитами плазма появляется над слоем эритроцитов.
  4. В еще одну центрифужную пробирку объемом 15 мл добавьте 5 мл градиентной среды плотности. Осторожно пипетируйте плазму, не касаясь эритроцитов, и наложите ее поверх среды. Должны быть сформированы две отдельные фазы.
  5. Центрифугируйте пробирку при давлении 516 x g в течение 20 минут при 4 °C. Мононуклеарные ячейки (ПМК) образуют полосу между плазмой и слоями среды. Нейтрофилы образуют гранулу на дне (рис. 1).
  6. Изоляция ПМЦ
    1. Удалите путем аспирации плазму на верхней части PBMC, не касаясь клеток. Соберите клетки из полосы между плазмой и средой. Убедитесь, что вы делаете аспирацию как можно меньше среды.
    2. Поместите ячейки в коническую центрифужную пробирку объемом 50 мл. Добавьте 20 мл PBS. Центрифугируйте пробирку при давлении 400 x g в течение 5 минут при 4 °C.
    3. Осторожно аспирируйте надосадочную жидкость и соскребите трубку, чтобы разделить клетки. Добавьте 10 мл холодного PBS для ресуспендирования клеток. Подсчитайте PBMC с помощью камеры Нейбауэра.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте пипетку для ресуспендирования клеток, так как это может повредить клетки.
  7. Выделение нейтрофилов
    1. Уберите градиент плотности среды. Разделите клетки, соскребая пробирку, и добавьте 10 мл холодного PBS.
    2. Поместите ячейки в свежую центрифужную пробирку объемом 50 мл и центрифугируйте при 400 x g в течение 5 минут при 4 °C. Аспирируйте надосадочную жидкость и разделите клетки, как описано в шаге 1.6.3.
  8. Для устранения остаточных эритроцитов добавьте 10 мл холодного гипотонического раствора (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 мМ Hepes, pH = 7,4) и аккуратно перемешайте ровно 1 мин.
  9. Быстро добавьте 10 мл холодного гипертонического раствора (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 мМ HEPES, pH = 7,4) для получения изотонического раствора.
  10. Подсчитайте нейтрофилы с помощью камеры Нейбауэра (чистота > 95%). Гранулируйте ячейки центрифугированием, как показано на шаге 1.6.2. и ресуспендировать их в холодном PBS. Держите трубку на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сообщается, что период полувыведения нейтрофилов in vitro составляет 8 - 12 ч 46,47,48. По нашему опыту работы с этим протоколом, нейтрофилы сохраняют свои функции в течение примерно 6–8 ч.

2. Очистка нейтрофилов низкой плотности (ЛДН)

  1. Центрифугируйте PBMC при давлении 400 x g в течение 5 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки в 120 мкл буфера для холодной стирки (1% BSA в PBS).
  2. Добавьте 35 мкл магнитных микрогранул CD66b. Выдержать смесь в темноте при температуре 4 °C в течение 30 минут. Аккуратно перемешивайте каждые 10 минут, чтобы предотвратить агрегацию клеток.
  3. Добавьте 1 мл буфера для холодной стирки. Поместите клетки в микроцентрифугу и вращайте при 400 x g в течение 3 минут.
  4. Удалите надосадочную жидкость, отделите клеточную гранулу, соскоблив пробирку, и повторно суспендируйте клетки в 1 мл промывочного буфера.
  5. Поместите магнитную разделительную колонку на магнит. Добавьте 0,5 мл промывочного буфера в колонку и пропустите его через колонку.
  6. Перенесите ячейки (1 мл) на колонку. Пусть буфер проходит по столбцу капля за каплей.
  7. Добавьте в колонку 0,5 мл промывочного буфера и дайте ему пройти. Добавьте в колонку еще 0,5 мл промывочного буфера.
  8. Снимите колонку с магнита и поместите ее в микроцентрифужную пробирку. Добавьте в колонку 1 мл промывочного буфера.
  9. Вставьте поршень в верхнюю часть колонки и осторожно надавите, чтобы размыть ячейки. Снимите поршень и поставьте колонку поверх новой микроцентрифужной трубки.
  10. Добавьте еще 1 мл буфера для стирки. Вставьте поршень в верхнюю часть колонки и осторожно надавите, чтобы размыть ячейки.
  11. Поместите обе пробирки в микроцентрифугу и вращайте их при давлении 800 x g в течение 3 минут. Наконец, ресуспендируйте клетки (LDN) из обеих трубок в 1 мл холодной PBS. Держите на льду.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Первые 2 мл проточного потока содержат остальную часть PBMC. Эти клетки могут быть использованы для других исследований.

3. Многоцветная проточная цитометрия

  1. Ресуспендируйте очищенные клетки в концентрации 1 x 106 клеток/мл в меченом буфере (1% FBS в PBS). Добавьте 250 мкл клеток в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  2. Добавьте соответствующие антитела против молекул нейтрофильной мембраны (подробнее см. Таблицу материалов). Инкубируйте клетки в течение 30 минут при температуре 4 °C, защищая их от света.
  3. Добавьте 1 мл PBS. Поместите пробирки в микроцентрифугу и вращайте их при давлении 800 x g в течение 3 минут.
  4. Аспирируйте надосадочную жидкость, разбейте клеточную гранулу, постукивая по трубке, и ресуспендируйте клетки в 0,5 мл 1% параформальдегида.
  5. Держите клетки при температуре 4 °C защищенными от света до анализа с помощью проточной цитометрии. Анализируйте клетки с помощью проточной цитометрии, регистрируя 10 000 событий на образец. Выполните сортировку ячеек так, как описано ранее22.
    ВНИМАНИЕ: Параформальдегид является раздражителем для кожи и дыхательных путей. Убедитесь, что вы не дышите парами.

4. Обнаружение активных форм кислорода (АФК)

  1. В микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл добавьте 2,5 x10 5 клеток. Поместите пробирки в микроцентрифугу и вращайте при давлении 800 x g в течение 3 минут.
  2. Аспирируйте надосадочную жидкость, соскребите трубку, чтобы разделить клетки, и повторно суспендируйте клетки в 100 мкл 15 мкМ дигидрородамина 123 в PBS.
  3. Инкубируйте клетки, защищенные от света, при температуре 37 °C в течение 20 минут. Добавьте 1 мл PBS.
  4. Поместите пробирки в микроцентрифугу и вращайте при давлении 800 x g в течение 3 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость, соскребите трубку, чтобы разделить клетки, и ресуспендируйте их в 100 мкл 50 нМ форбол 12-миристат 13-ацетата (PMA) в PBS.
  5. Инкубируйте клетки, защищенные от света, при температуре 37 °C в течение 45 минут. Добавьте 1 мл PBS.
  6. Поместите пробирки в микроцентрифугу и вращайте их при давлении 800 x g в течение 3 минут. Аспирируйте надосадочную жидкость, соскребите трубку, чтобы разделить клетки, и повторно суспендируйте их в 0,5 мл 1% параформальдегида в PBS.
  7. Держите клетки при температуре 4 °C защищенными от света до анализа с помощью проточной цитометрии. Анализируйте клетки с помощью проточной цитометрии, регистрируя 10 000 событий на образец.

5. Визуализация внеклеточных ловушек нейтрофилов (НВЛ)

  1. Поместите покровные стекла в лунки 12-луночного планшета и покройте их 10 мкг/мл поли-L-лизина. Инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 4 °C при осторожном перемешивании.
  2. Удалите поли-L-лизин и промойте покровные стекла PBS, инкубируя пластину в течение 5 минут при комнатной температуре с легким перемешиванием. Промойте покровные стекла PBS еще два раза.
  3. Снимите PBS и дайте покровным стеклам высохнуть, поместив пластину внутрь колпака с ламинарным потоком на 2 часа.
  4. Ресуспендируйте LDN при концентрации 1 x 106 кл/мл в среде RPMI-1640 с 5% FBS. Возьмите 350 μл (3,5 x 105 клеток) клеточной суспензии и поместите их в лунку 12-луночного планшета, содержащего покровные стекла.
  5. Выдержите планшет в течение 30 минут в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C. Добавьте в каждую лунку по 3,5 мкл 5 мкМ PMA, разведенных в PBS (конечная концентрация PMA 50 нМ).
  6. Выдержите планшет в течение 4 часов в инкубаторе с 5%CO2 при температуре 37 °C. Добавьте 350 мкл 8% параформальдегида в PBS и выдержите чашку в течение ночи в инкубаторе с 5%CO2 при температуре 37 °C.
  7. Поместите прозрачную пленку на подставку для пробирки, как описано ранее49, так, чтобы на отверстиях пробирок образовались лунки.
  8. Заполните каждую лунку различными растворами для стирки или испачкайте покровные стекла, образуя большую каплю. Снимите покровные стекла и положите их вверх дном на каплю воды на 5 минут. Таким же образом промойте покровные стекла еще три раза водой.
  9. Поместите покровные стекла вверх дном на каплю блокирующего буфера (5% BSA в PBS) и выдерживайте в течение 20 минут при комнатной температуре.
  10. Перенесите покровные стекла в каплю соответствующего первичного антитела (например, антиэластазы или антицитруллина) в блокирующий буфер и инкубируйте в течение 60 минут при комнатной температуре.
  11. Стирайте покровные стекла 2x в 0,01% Tween-20 в PBS. Переложите покровные стекла в каплю соответствующего вторичного антитела в блокирующий буфер, содержащий 150 нМ DAPI, и инкубируйте в течение 60 мин при комнатной температуре, защищенной от света.
  12. Стирайте покровные стекла 2x в 0,01% Tween-20 в PBS. Поместите каплю антивыцветающего монтажного материала на предметное стекло и положите покровные стекла вверх ногами.
  13. Заклейте покровные стекла по периметру лаком для ногтей. Храните смонтированные предметные стекла при температуре 4 °C, защищенном от света. Визуализируйте НВЛ с помощью флуоресцентного микроскопа.

6. Обнаружение внеклеточных ловушек нейтрофилов (НЭО)

  1. Ресуспендируйте клетки в концентрации 5 x 105 клеток/мл в 500 нМ Sytox Green, разведенные в среде RPMI-1640 с 5% FBS.
  2. Возьмите 100 мкл (5 x 104 клеток) клеточной суспензии и поместите их в лунку 96-луночного планшета для культуры тканей.
  3. Выдержите планшет в течение 20 минут в инкубаторе с 5% содержаниемCO2 при температуре 37 °C. Добавьте в каждую лунку по 20 мкл 300 нМ PMA, разведенных в среде RPMI-1640 (конечная концентрация PMA 50 нМ).
  4. Перенесите пластину в предварительно нагретый считыватель микропланшетов. Инкубируйте планшет при температуре 35 °C в течение 4 часов, проводя измерения флуоресценции с нижней части планшета каждые 5 минут (с использованием фильтров возбуждения 485 нм и фильтра излучения 528 нм).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейтрофилы низкой плотности (LDN) у здоровых людей составляют около 5% PBMC (рис. 2A). Описанный здесь протокол обычно обеспечивает чистый (> 90%) LDN. Клетки также эффективно восстанавливаются (выход около 98%) с высокой жизнеспособностью (> 95%; Рисунок 2В). Для сравнения, LDN также были очищены с помощью сортировки клеток, активируемых флуоресцентными веществами, как описано ранее22. Вкратце, PBMC...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Как правило, нейтрофилы рассматривались как однородные клетки. Тем не менее, последние данные показали, что нейтрофилы могут существовать в виде клеток с различными состояниями активации и/или множественными фенотипами. Таким образом, могут существовать различные субпопуляции нейтрофилов 13,14,15. Одна из субпопуляций нейтрофилов, нейтрофилы низкой плотности (LDN), вызвала большой интерес из-за ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы утверждают, что данное исследование проводилось без каких-либо коммерческих или финансовых связей, которые могли бы быть восприняты как потенциальный конфликт интересов.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы благодарят Сесара Диас-Годинеса (Instituto de Investigaciones Biomédicas-UNAM) за его помощь в проведении флуоресцентной микроскопии для визуализации НВЛ. Это исследование было поддержано грантом PAPIIT IN205523 от Dirección General de Asuntos del Personal Académico, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM), Мексика, и грантом CF-2023-I-610 от Secretaría de Ciencias, Humanidades, Tecnología e Inovación (Secihti), Мексика.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
  Анти-цитруллина к поликлональному антителу кроликаAbCamAB1009321/50 разбавления
96-колодцевая пластина для культивирования тканейCostar; Корнинг, Инк.3596
Alexa Fluor 488 — антитело IgG1 для мышей CD11b против человекаBioLegend3013170,25 и мю; g/mL
Alexa Fluor 647 — антиантитело IgM для мышей CD66bBioLegend3051090,05 и мю; g/mL
Антимышиный антител IgG (H+L) к козлам, Alexa Fluor 488Инвитроген — Thermo Fisher ScientificA-110011/50 разбавления
Анти-нейтрофильное эластазное мышиное моноклональное антитело IgG1Санта-Крус БиотехнологияSC-5554910 & микро; g/mL
Антиантитело IgG IgG (H+L) к ослинам, Alexa Fluor 555Инвитроген — Thermo Fisher ScientificA-315721/50 разбавления
Антитело IgG1 у мышей CD62L против человека APCBioLegend3048090,03 & mu; g/mL
APC/Cyanine7 антитело IgG1 у мышей CD14BioLegend3671070,25 и мю; g/mL
Attune NxT потоковый цитометр и bbsp;Thermo Fisher Scientific, Inc.(синие/красные лазеры)
Бычий сывороточный альбумин (BSA) Fraction VMP Biomedicals810025
Brilliant Violet 510 — антитело IgG1 для мышей CD33 против человекаBioLegend3666090,30 и мю; g/mL
DAPIКальбиохем/EMD Миллипор268298
Dextran T500Pharmacosmos A/C5.51005E+11
Дигидрородамин-123Anaspec, Inc.AS-85711
Сортировщик ячеек FACSБектон Дикинсон  Модель FACSAria
Сыворотка плода крупного рогатого скота (FBS)Gibco16000-044
Фиколь-ПакMerck KGGE 17-1440-03
FITC антитела IgG1 к мыши CD98BioLegend3156030,30 и мю; g/mL
Программное обеспечение FlowJoБектон ДикинсонВерсия 10, 2019
Флуоресцентный инвертированный микроскопОлимпМодель IX-70
ГепаринInhepar - PiSA Farmaceutica36601495000 UI/mL
ХепесСигма ОлдричH7006
MACSprep Chimerism CD66b МикробусиныMiltenyi Biotec130-111-552
МагнитMiltenyi Biotec130-042-102
Магнитный разделительный столбецMiltenyi Biotec130-042-201
МикроцентрифугаЭппендорфМодель 5415C
Считыватель микропластинBioTek InstrumentsСинергия моделей HT
ПараформальдегидСигма Олдрич158127
ПЭ антитела IgG1 к мыши CD10BioLegend3122030,05 и мю; g/mL
ПЭ антитела IgG2a у мышей CD16bBD Pharmingen550868Разбавление на 1/40
PE/Cyanine5 антитело IgG1 у мышей CD15 против человекаBioLegend3230130,25 и мю; g/mL
Форбол 12-миристат 13-ацетат (ПМА)Сигма ОлдричP8139
поли-L-лизинСигма ОлдричP2658
Рефрижераторная центрифугаЭппендорфМодель 5702R
Среда для культуры тканей RPMI-1640Gibco23400-021
SYTOX GreenMolecular Probes, Inc.S-7020
Tween-20 Сигма ОлдричP2287
VectashieldVector LaboratoriesH-1000

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yvan-Charvet, L., Ng, L. G. Granulopoiesis and neutrophil homeostasis: A metabolic, daily balancing act. Trends Immunol. 40 (7), 598-612 (2019).
  2. Liew, P. X., Kubes, P. The neutrophil's role during health and disease. Physiol. Rev. 99 (2), 1223-1248 (2019).
  3. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Phagocytosis: A fundamental process in immunity. Biomed Res Int. 2017, 9042851(2017).
  4. Uribe-Querol, E., Rosales, C. Phagocytosis: Our current understanding of a universal biological process. Front Immunol. 11, 1066(2020).
  5. Faurschou, M., Borregaard, N. Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation. Microbes Infect. 5 (14), 1317-1327 (2003).
  6. Lacy, P., Eitzen, G. Control of granule exocytosis in neutrophils. Front Biosci. 13, 5559-5570 (2008).
  7. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
  8. Rosales, C. Neutrophils at the crossroads of innate and adaptive immunity. J Leukoc Biol. 108 (1), 377-396 (2020).
  9. Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
  10. Lawrence, S. M., Corriden, R., Nizet, V. The ontogeny of a neutrophil: Mechanisms of granulopoiesis and homeostasis. Microbiol Mol Biol. Rev. 82 (1), e00057-e00117 (2018).
  11. Aroca-Crevillén, A., Vicanolo, T., Ovadia, S., Hidalgo, A. Neutrophils in physiology and pathology. Annu Rev Pathol. 19, 227-259 (2024).
  12. Hellebrekers, P., Vrisekoop, N., Koenderman, L. Neutrophil phenotypes in health and disease. Eur J Clin Invest. 48 (Suppl 2), e12943(2018).
  13. Ng, L. G., Ostuni, R., Hidalgo, A. Heterogeneity of neutrophils. Nat Rev Immunol. 19 (4), 255-265 (2019).
  14. Qu, J., Jin, J., Zhang, M., Ng, L. G. Neutrophil diversity and plasticity: Implications for organ transplantation. Cell Mol Immunol. 20 (9), 993-1001 (2023).
  15. Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Front Physiol. 9, 113(2018).
  16. Silvestre-Roig, C., Fridlender, Z. G., Glogauer, M., Scapini, P. Neutrophil diversity in health and disease. Trends Immunol. 40 (7), 565-583 (2019).
  17. Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Low-density granulocytes in systemic autoimmunity and autoinflammation. Immunol Rev. 314 (1), 313-325 (2023).
  18. Ning, X., Wang, W. M., Jin, H. Z. Low-density granulocytes in immune-mediated inflammatory diseases. J Immunol. 2022, 1622160(2022).
  19. Hacbarth, E., Kajdacsy-Balla, A. Low density neutrophils in patients with systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, and acute rheumatic fever. Arthritis Rheum. 29 (11), 1334-1342 (1986).
  20. Böyum, A. Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human blood. Isolation of monuclear cells by one centrifugation, and of granulocytes by combining centrifugation and sedimentation at 1 g. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 77-89 (1968).
  21. García-García, E., Uribe-Querol, E., Rosales, C. A simple and efficient method to detect nuclear factor activation in human neutrophils by flow cytometry. J Vis Exp. (74), e50410(2013).
  22. Blanco-Camarillo, C., Alemán, O. R., Rosales, C. Low-density neutrophils in healthy individuals display a mature primed phenotype. Front Immunol. 12, 672520(2021).
  23. Midgley, A., Beresford, M. W. Increased expression of low-density granulocytes in juvenile-onset systemic lupus erythematosus patients correlates with disease activity. Lupus. 25 (4), 407-411 (2016).
  24. Rahman, S., et al. Low-density granulocytes activate T cells and demonstrate a non-suppressive role in systemic lupus erythematosus. Ann Rheum Dis. 78 (7), 957-966 (2019).
  25. Morisaki, T., Goya, T., Ishimitsu, T., Torisu, M. The increase of low-density subpopulations and CD10 (calla) negative neutrophils in severely infected patients. Surg Today. 22, 322-327 (1992).
  26. Lin, A. M., et al. Mast cells and neutrophils release IL-17 through extracellular trap formation in psoriasis. J Immunol. 187 (1), 490-500 (2011).
  27. Fu, J., Tobin, M. C., Thomas, L. L. Neutrophil-like low-density granulocytes are elevated in patients with moderate to severe persistent asthma. Ann Allergy Asthma Immunol. 113 (6), 635-640 (2014).
  28. Ramanathan, K., et al. Neutrophil activation signature in juvenile idiopathic arthritis indicates the presence of low-density granulocytes. Rheumatology (Oxford). 57 (3), 488-498 (2018).
  29. Grayson, P. C., et al. Neutrophil-related gene expression and low-density granulocytes associated with disease activity and response to treatment in antineutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis. Arthritis Rheumatol. 67 (7), 1922-1932 (2015).
  30. Cloke, T., Munder, M., Taylor, G., Müller, I., Kropf, P. Characterization of a novel population of low-density granulocytes associated with disease severity in HIV-1 infection. PLoS One. 7, e48939(2012).
  31. Rocha, B. C., et al. Type I interferon transcriptional signature in neutrophils and low-density granulocytes is associated with tissue damage in malaria. Cell Rep. 13 (12), 2829-2841 (2015).
  32. Deng, Y., et al. Low-density granulocytes are elevated in mycobacterial infection and associated with the severity of tuberculosis. PLoS One. 11 (4), e0153567(2016).
  33. Villanueva, E., et al. Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus. J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).
  34. Denny, M. F., et al. A distinct subset of proinflammatory neutrophils isolated from patients with systemic lupus erythematosus induces vascular damage and synthesizes type I IFNs. J Immunol. 184 (6), 3284-3297 (2010).
  35. Sagiv, J. Y., et al. Phenotypic diversity and plasticity in circulating neutrophil subpopulations in cancer. Cell Rep. 10 (4), 562-573 (2015).
  36. Sionov, R. V., Fridlender, Z. G., Granot, Z. The multifaceted roles neutrophils play in the tumor microenvironment. Cancer Microenviron. 8 (December), 125-158 (2015).
  37. Hassani, M., et al. On the origin of low-density neutrophils. J Leukoc Biol. 107 (5), 809-818 (2020).
  38. Vanhaver, C., et al. Immunosuppressive low-density neutrophils in the blood of cancer patients display a mature phenotype. Life Sci Alliance. 7 (1), e202302332(2023).
  39. Dwivedi, A., et al. Emergence of dysfunctional neutrophils with a defect in arginase-1 release in severe COVID-19. JCI Insight. 9 (17), e171659(2024).
  40. Cabrera, L. E., et al. Characterization of low-density granulocytes in COVID-19. PLoS Pathog. 17 (7), e1009721(2021).
  41. Dumont, B. L., et al. Low-density neutrophils and neutrophil extracellular traps (nets) are new inflammatory players in heart failure. Can J Cardiol. 40 (9), 1524-1535 (2024).
  42. Dumont, B. L., et al. Low-density neutrophils contribute to subclinical inflammation in patients with type 2 diabetes. Int J Mol Sci. 25 (3), 1674(2024).
  43. Jones, B. E., et al. Anca autoantigen gene expression highlights neutrophil heterogeneity, where expression in normal-density neutrophils correlates with anca-induced activation. Kidney Int. 98 (3), 744-757 (2020).
  44. Li, Y., et al. The proportion, origin, and pro-inflammation roles of low-density neutrophils in SFTS disease. BMC Infect. Dis. 19 (1), 109(2019).
  45. Martin, K. R., et al. Cd98 defines a metabolically flexible, proinflammatory subset of low-density neutrophils in systemic lupus erythematosus. Clin Transl Med. 13 (1), e1150(2023).
  46. Murphy, M. P., Caraher, E. Mcl-1 is vital for neutrophil survival. Immunol Res. 62 (2), 225-233 (2015).
  47. Nauseef, W. M. Neutrophils, from cradle to grave and beyond. Immunol Rev. 273 (1), 5-10 (2016).
  48. Pérez-Figueroa, E., Álvarez-Carrasco, P., Ortega, E., Maldonado-Bernal, C. Neutrophils: Many ways to die. Front Immunol. 12, 631821(2021).
  49. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. Neutrophil extracellular traps: How to generate and visualize them. J Vis Exp. (36), e1724(2010).
  50. Emmendörffer, A., Hecht, M., Lohmann-Matthes, M. L., Roesler, J. A fast and easy method to determine the production of reactive oxygen intermediates by human and murine phagocytes using dihydrorhodamine 123. J Immunol Methods. 131 (2), 269-227 (1990).
  51. Pioch, J., Blomgran, R. Optimized flow cytometry protocol for dihydrorhodamine 123-based detection of reactive oxygen species in leukocyte subpopulations in whole blood. J Immunol Methods. 507, 113308(2022).
  52. Liu, X., et al. Pad4 takes charge during neutrophil activation: Impact of pad4 mediated net formation on immune-mediated disease. J Thromb Haemost. 19 (7), 1607-1617 (2021).
  53. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184 (2), 205-213 (2009).
  54. Alemán, O. R., Mora, N., Cortes-Vieyra, R., Uribe-Querol, E., Rosales, C. Transforming growth factor-β-activated kinase 1 is required for human fcγriiib-induced neutrophil extracellular trap formation. Front Immunol. 7, 277(2016).
  55. Kraaij, T., et al. A novel method for high-throughput detection and quantification of neutrophil extracellular traps reveals ROS-independent net release with immune complexes. Autoimmun Rev. 15 (6), 577-584 (2016).
  56. Sanchez Gonzalez, A., Bardoel, B. W., Harbort, C. J., Zychlinsky, A. Neutrophil methods and protocols. , Humana Press - Springer Science+Business Media. New York. (2014).
  57. Mishalian, I., Granot, Z., Fridlender, Z. G. The diversity of circulating neutrophils in cancer. Immunobiology. 222 (1), 82-88 (2017).
  58. Wright, H. L., Makki, F. A., Moots, R. J., Edwards, S. W. Low-density granulocytes: Functionally distinct, immature neutrophils in rheumatoid arthritis with altered properties and defective TNF signalling. J Leukoc Biol. 101 (2), 599-611 (2017).
  59. Bruger, A. M., et al. How to measure the immunosuppressive activity of mdsc: Assays, problems and potential solutions. Cancer Immunol Immunother. 68 (4), 631-644 (2019).
  60. Kimberly, R. P., Ahlstrom, J. W., Click, M. E., Edberg, J. C. The glycosyl phosphatidylinositol-linked FCγRIII PMN mediates transmembrane signaling events distinct from FCγRII. J Exp Med. 171 (4), 1239-1255 (1990).
  61. Rosales, C., Uribe-Querol, E. Fc receptors: Cell activators of antibody functions. Adv Biosci Biotech. 4, 21-33 (2013).
  62. Unkeless, J. C., Shen, Z., Lin, C. W., Debeus, E. Function of human fcγriia and fcγriiib. Semin Immunol. 7 (1), 37-44 (1995).
  63. Ghaemdoust, F., Keshavarz-Fathi, M., Rezaei, N. Natural killer cells and cancer therapy, what we know and where we are going. Immunotherapy. 11 (14), 1231-1251 (2019).
  64. Lanier, L. L., Le, A. M., Civin, C. I., Loken, M. R., Phillips, J. H. The relationship of CD16 (leu-11) and leu-19 (NKH-1) antigen expression on human peripheral blood NK cells and cytotoxic T lymphocytes. J Immunol. 136 (12), 4480-4486 (1986).
  65. Huizinga, T. W., et al. The pi-linked receptor fcriii is released on stimulation of neutrophils. Nature. 333 (6174), 667-669 (1988).
  66. Jongstra-Bilen, J., Harrison, R., Grinstein, S. Fcγ-receptors induce mac-1 (cd11b/cd18) mobilization and accumulation in the phagocytic cup for optimal phagocytosis. J Biol Chem. 278 (46), 45720-45729 (2003).
  67. Tak, T., et al. Human CD62Ldim neutrophils identified as a separate subset by proteome profiling and in vivo pulse-chase labeling. Blood. 129 (26), 3476-3485 (2017).
  68. Lakschevitz, F. S., et al. Identification of neutrophil surface marker changes in health and inflammation using high-throughput screening flow cytometry. Exp Cell Res. 342 (2), 200-209 (2016).
  69. Schröder, A. K., Uciechowski, P., Fleischer, D., Rink, L. Crosslinking of CD66 b on peripheral blood neutrophils mediates the release of interleukin-8 from intracellular storage. Hum Immunol. 67 (9), 676-682 (2006).
  70. Skubitz, K. M., Campbell, K. D., Skubitz, A. P. Cd66a, cd66b, cd66c, and cd66d each independently stimulate neutrophils. J Leukoc Biol. 60 (1), 106-117 (1996).
  71. Basic principle of magnetic cell separation. , Miltenyi Biotec. https://www.miltenyibiotec.com/UN-en/products/macs-cell-separation/basic-principle-of-magnetic-cell-separation.html?query=:relevance:allCategoriesOR:10000089 (2025).
  72. Connelly, A. N., et al. Optimization of methods for the accurate characterization of whole blood neutrophils. Sci. Rep. 12 (1), 3667(2022).
  73. Hardisty, G. R., et al. High purity isolation of low density neutrophils casts doubt on their exceptionality in health and disease. Front Immunol. 12, 625922(2021).
  74. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - the dark side of neutrophils. J Clin Invest. 126 (5), 1612-1620 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Low Density NeutrophilsMagnetic MicrobeadsNeutrophil PurificationDensity GradientPeripheral BloodFlow CytometryMononuclear CellsReactive Oxygen SpeciesNeutrophil Extracellular TrapsCD66b Marker

Related Articles