Протокол построения мышиной модели гипертонического фиброза миокарда с использованием ангиотензина II

Summary

Непрерывная инфузия ангиотензина II (Ang II) с помощью осмотических насосов является одним из классических методов построения животных моделей гипертонического фиброза миокарда. Этот протокол систематически оптимизировал процесс построения данной модели и проработал ключевые моменты имплантации осмотического насоса, позиционирования и установки концентрации Ang II.

Abstract

Непрерывная инфузия ангиотензина II (Ang II) с помощью осмотических насосов является широко используемым подходом для создания животных моделей гипертензивного фиброза миокарда. Тем не менее, этот метод имеет определенные ограничения в текущих отчетах, такие как нестабильность Ang II, неточное размещение насоса и отсутствие стандартизированной процедуры. В настоящее время доклады о методологии создания остаются относительно ограниченными. Этот протокол позволил систематически оптимизировать создание моделей гипертензивного фиброза миокарда, индуцированного осмотическим насосом Ang II, у мышей, включая стандартизированное приготовление раствора Ang II, калибровку дозировки, точную подкожную имплантацию осмотических насосов и количественные стандарты для оценки показателей модели. Экспериментальные результаты показали, что осмотический насос Ang II индуцировал гипертензивный фиброз миокарда у мышей с высокими показателями выживаемости. Уровень систолического артериального давления (САД) стабилизировался на уровне 160 мм рт.ст. после семи дней подкожной имплантации. У модельных мышей значительно снизились фракции выброса левого желудочка и увеличились конечные диастолические размеры левого желудочка. По сравнению с группой симуляционной хирургии увеличивалось отложение коллагена в гипертензивной интерстициальной ткани миокарда и периваскулярных областях. Это исследование, основанное на небольшом размере выборки (n = 6), предварительно подтвердило возможность создания мышиной модели гипертензивного миокардиального фиброза с использованием Ang II в сочетании с осмотическим насосом, а также установило систему количественной проверки фенотипа.

Introduction

Фиброз миокарда (МФ), основной патологический исход гипертензии, характеризуется чрезмерным отложением коллагеновых волокон в поврежденном или сжатом миокарде. Он представляет собой одну из наиболее важных форм гипертензион-опосредованного повреждения органов-мишеней и способствует прогрессирующей сердечной дисфункции ^1,2. Создание соответствующих животных моделей имеет важное значение для продвижения механистических исследований и разработки новых терапевтических стратегий для гипертонического фиброза миокарда. Ангиотензин II (Ang II), центральный эффектор ренин-ангиотензиновой системы, играет ключевую роль в патогенезе гипертензии³. Таким образом, индукция на основе Ang II стала широко используемым подходом для создания моделей гипертензии у мышей.

Современные методы построения животных моделей гипертонии в основном включают хирургическую индукцию, фармакологическую индукцию и трансгенные спонтанные модели. Хирургическая индукция обычно использует такие методы, как сужение почечной артерии, сужение восходящей аорты или сужение дуги аорты, чтобы искусственно увеличить сопротивление кровотоку, тем самым вызывая повышенное кровяное давление⁴. Несмотря на то, что эти методы позволяют быстро установить состояния гипертензии, подходящие для изучения процессов ремоделирования сердца, связанных со стрессовой нагрузкой, они включают в себя сложные процедуры с многочисленными послеоперационными осложнениями. Фармакологическая индукция обычно использует внутрибрюшинную инъекцию или пероральное введение для повышения артериального давления у экспериментальных животных⁵. Несмотря на то, что технология относительно проста, стабильность модели остается подверженной влиянию дозировки лекарств, частоты введения и стрессовых реакций животных. Трансгенные модели, такие как спонтанно гипертензивные крысы и мыши с артериальной гипертензией ДГПЖ/2J, которые демонстрируют стабильные фенотипы гипертензии, широко используются в исследованиях наследственной гипертензии. Тем не менее, их уникальные патогенетические механизмы ограничивают их способность моделировать многофакторную клиническую гипертензию.

В последнее время стали популярны модели лечения гипертензии, основанные на непрерывной инфузии Ang II с помощью подкожных осмотических насосов. Этот метод обеспечивает устойчивое высвобождение Ang II с постоянной скоростью, поддерживая стабильные концентрации в крови в течение длительных периодов времени, чтобы точно имитировать патологические процессы и воспроизводить гипертензивный фиброз миокарда^у мышей ^6,7,8. Тем не менее, остаются важные ограничения, особенно в отношении стандартизации протокола и непоследовательных фиброзных исходов, на которые могут влиять такие факторы, как техника имплантации насоса и специфические для животных реакции⁹. Чтобы устранить эти пробелы, в данном исследовании уточнена модель на основе осмотического насоса Ang II, стандартизированы ключевые этапы и предоставлен визуализированный протокол. Эти усовершенствования повышают воспроизводимость и практическую применимость, предлагая ценную справочную информацию для будущих исследований гипертонического фиброза миокарда.

Protocol

Все экспериментальные процедуры проводились в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию Национальных институтов здравоохранения, а протоколы экспериментов были одобрены Комитетом по исследованиям животных Юго-Западного медицинского университета (номер одобрения SWMU2020317).

1. Приготовление раствора Ang II и заполнение осмотического насоса

1. Выберите 12 самцов мышей класса SPF C57BL/6J (см. Таблицу материалов) массой 20 ± 1 г, отобрав 8-недельных животных по однородности их развития для контроля возрастных факторов. Разделите мышей на фиктивную хирургическую группу и модельную группу с помощью простого метода рандомизации, по 6 мышей в каждой группе.
2. Измерьте начальную массу тела мыши и определите дозу Ang II (см. Таблицу материалов) в 1,46 мг/кг/сут.
   Примечание: Согласно предварительному эксперименту, оптимальной дозой Ang II является 1,46 мг/кг/сут. Эта доза надежно поддерживает систолическое артериальное давление на уровне около 160 мм рт.ст., эффективно вызывая патологический фиброз миокарда и обеспечивая выживание животных в течение 4-недельного исследования.
3. Добавьте 2,45 мл 0,9% стерильного физиологического раствора, предварительно охлажденного до 4 °C, к 10 мг лиофилизированного порошка Ang II. Тщательно перемешайте раствор и держите его на льду для немедленного использования.
4. Выполните процедуру на льду, используя шприц для забора раствора Ang II, затем последовательно введите по 200 мкл (концентрация 3,91 ммоль/л) в каждую из шести камер осмотического насоса (см. Таблицу материалов).
5. Активируйте осмотический привод давления, погрузив насос в стерильный физиологический раствор при температуре 37 °C на 48 часов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Заполните осмотические насосы для группы фиктивной хирургии равным объемом физиологического раствора. Поскольку Ang II является светочувствительным, процедура должна проводиться под полной защитой от света.

2. Имплантация осмотических насосов и конструирование модели ⁶

1. Подготовка животных и обезболивание
   1. Голодают мышки в течение 4 ч со свободным доступом к воде. Затем взвесьте каждую мышь и рассчитайте подходящую дозу анестетика (80 мг/кг пентобарбитала натрия)¹⁰.
   2. Обезболивание мышей путем внутрибрюшинного введения рассчитанной дозы пентобарбитала натрия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обращение с пентобарбиталом требует соблюдения правил, работы в вытяжном шкафу, ношения защитного снаряжения и маркировки остаточной жидкости для отдельной утилизации.
2. Удалите шерсть со спинной кожи на участке, простирающемся от основания хвоста до средней спинной области, с помощью бритвы или крема для депиляции.
3. Тщательно продезинфицируйте выбритый участок трижды 70% этанолом¹¹.
4. С помощью скальпеля сделайте подкожный разрез 0,5 см в пределах продезинфицированного участка.
5. Через разрез с помощью щипцов тупо отделите подкожную клетчатку по направлению к задней части шеи, создав карман.
6. Направьте корпус насоса кончиком катетера к голове мыши. Затем зажмите наконечник кровоостанавливающими щипцами и введите насос подкожно в том направлении.
7. После имплантации помпы сшить подкожную клетчатку прерывистыми 6-0 рассасывающимися нитями и закрыть разрез кожи хирургическими швами. Затем поместите мышь в предварительно нагретый до 37 °C термоковрик до полного восстановления от анестезии (примерно 5-10 минут).
8. Непрерывно вливать приготовленный раствор Ang II в заданной дозе (1,46 мг/кг/сут) с помощью осмотических насосов в течение 28 дней.
9. По завершении 28-дневного периода инфузии соберите все экспериментальные данные. Затем обезболите мышей таким же образом, как это было сделано при предыдущих обезболиваниях, то есть следуя процедурам, описанным в шагах 2.1.1-2.1.2, и усыпьте их путем вывиха шейки матки.

3. Измерение артериального давления

1. Оборудование (см. Таблицу материалов) Предварительный подогрев: Установите нагревательную платформу на 37-38 °C для обеспечения расширения сосудов в кровеносных сосудах хвоста мыши.
2. Аккуратно возьмитесь за мышь и поместите ее в удерживающий держатель, следя за тем, чтобы хвост свободно выступал через заднее отверстие. Затем тщательно очистите обнаженный хвост ватным тампоном, пропитанным спиртом.
3. Поместите надувную манжету у основания хвоста. Расположите датчик импульса примерно на 5-10 мм дистальнее манжеты в средней и нижней части хвостовой части.
4. Активируйте устройство и подождите, пока форма импульсной волны стабилизируется, прежде чем продолжить.
5. Запустите цикл измерения. Система автоматически надувает манжету до давления, превышающего 200 мм рт.ст., чтобы перекрыть кровоток, а затем медленно сдувает со скоростью 2-3 мм рт.ст. в секунду. Датчик обнаруживает повторное появление пульсовой волны при возобновлении потока, определяя систолическое давление.
6. Измеряйте систолическое артериальное давление (САД) с интервалом в 7 дней после моделирования, всего пять измерений. Для каждой мыши в каждый момент времени запишите три последовательных показания, обеспечивая 2-минутный перерыв между последовательными измерениями.
7. После замеров верните мышь в клетку с едой и водой. Очистите держатель и хвостовую втулку, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение.

4. Измерение сердечной функции

1. На 28-й день моделирования обезболить всех подопытных мышей пентобарбиталом натрия (80 мг/кг пентобарбитала натрия).
2. Расположите мышь в положении лежа на спине на платформе с постоянной температурой.
3. Проводят трансторакальную эхокардиографию с помощью ультразвуковой системы (см. Таблицу материалов). Подключите конечности мыши к электродам на платформе для мониторинга сигналов электрокардиограммы (ЭКГ).
4. Получите визуализацию по короткой оси на уровне мышц молочной железы с помощью ультразвука в М-режиме для визуализации сердца и анализа сердечной функции. Сделайте три изображения на мышь и усредните данные для последующего анализа внутренних диастолических размеров левого желудочка (LVIDd), систолического внутреннего диаметра левого желудочка (LVIDs), фракционного укорочения левого желудочка (LVFS) и фракции выброса левого желудочка (LVEF).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте контакт зонда с грудной стенкой, не сдавливая грудную полость; обеспечить линию отбора проб М-режима перпендикулярно межжелудочковой перегородке; Выполняйте непрерывные измерения в течение ≥ 3 сердечных циклов для получения средних значений.

5. Окрашивание Массоном

1. Забор и фиксация сердца
   1. Обезболите мышь пентобарбиталом натрия (80 мг/кг пентобарбитала натрия). Затем с помощью ножниц сделайте продольный разрез примерно на 1,5 см в грудной полости, перевяжите крупные сердечные сосуды и быстро иссеките сердце, чтобы избежать тракционной травмы¹².
   2. Немедленно промойте иссеченное сердце с помощью предварительно охлажденного PBS, чтобы удалить кровь, и аккуратно промокните излишки влаги с помощью чистой фильтровальной бумаги. Затем выполните поперечный разрез вдоль сосочковой мышцы, чтобы получить срез ткани толщиной 3 мм.
   3. Для фиксации погрузите образцы сердца в 4% параформальдегид на срок более 48 часов, обеспечивая минимальное отношение ткани к фиксирующему объему 1:10.
2. Удалите сердечную ткань из 4% фиксатора параформальдегида. Затем под вытяжным шкафом тонко нарезать ткань толщиной 4 мкм хирургическим ножом и перенести срезы в кассету для обезвоживания¹³.
3. Загрузите срезы тканей в дегидратор и выполните следующие действия: 70% этанол, 80% этанол, 95% этанол в течение 1 ч каждый; 100% этанол I и II по 45 мин каждый; ксилол I и II по 30 мин каждый.
4. Погрузите ткань в парафин, а затем затвердейте блоки на предварительно охлажденной до -20 °C холодной пластине.
5. С помощью парафинового микротома можно получить продольные срезы толщиной 4 мкм из залитых парафином тканевых блоков. Затем последовательно погрузите секции в следующие растворы на 5 минут каждая, чтобы депарафинизировать и регидратировать их: ксилол I, ксилол II, абсолютный этанол, 95% этанол, 80% этанол, 70% этанол и, наконец, дистиллированную воду.
6. Погрузите ткань в приготовленный раствор для окрашивания железом Вейгерта на 8 мин. Затем повторно промойте дистиллированной водой, чтобы удалить излишки раствора для окрашивания. Дифференцировать в растворе для дифференцировки кислого этанола в течение 5 с, с последующим воронением в растворе воронения Массона в течение 5 мин. Наконец, смойте дистиллированной водой¹⁴.
7. Окрашивайте срезы карминным красным в течение 10 минут, нанося примерно 200-300 μл на предметное стекло, чтобы обеспечить полное и равномерное покрытие ткани. Затем промойте срезы в 0,2% ледяной уксусной кислоте в течение 1 минуты.
8. Обрабатывайте участки раствором фосфомолибдиновой кислоты в течение примерно 5 минут или до тех пор, пока мышечные волокна не покраснеют. Затем окрашивайте срезы достаточным объемом анилинового синего раствора, чтобы полностью покрыть ткань (обычно 200-300 мкл на предметное стекло) в течение 5 минут. Наконец, промойте срезы 0,2% раствором ледяной уксусной кислоты¹⁵.
9. Обезвоживайте срезы с помощью сортированного этанола. Приступайте к очищению тканей ксилолом с помощью трех погружений по 1-2 минуты каждое.
10. Смонтируйте секции, нанеся небольшое количество нейтральной смолы и накрыв покровным стеклом.
11. Микроскопическое (см. Таблицу материалов) исследование: Наблюдайте за окрашенными Массоном тканями при увеличении 40×, 20× и 10×. Сфотографируйте каждый слайд, чтобы сохранить репрезентативные изображения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Утилизируйте все отходы в соответствии с протоколами безопасности учреждения. Раствор кислотной дифференцировки и ледяную уксусную кислоту собирают в коррозионностойкие бочки, отходы высокой концентрации обезвреживают до рН 6-8, не смешивают со щелочными растворами. Храните этанол во взрывозащищенных бочках в прохладном месте, вдали от источников огня. Держите ксилол в коричневых бочках, работайте в вытяжном шкафу с надетым защитным снаряжением, не смешивайте кислоты (вещества) с этанолом. Поместите ткани животных в промаркированные контейнеры, запечатайте их и храните в условиях замораживания¹⁶. Наконец, передать все отходы для утилизации в квалифицированные профессиональные учреждения; Категорически запрещается смешивать отходы или утилизировать их небрежно.

6. Статистический анализ

1. Собирайте все числовые данные и анализируйте их с помощью GraphPad Prism 9.0.
2. Используйте независимую выборку t-критерия для анализа различий между группами.
3. Установите статистическую значимость как **P < 0,01 для высокозначимых и *P < 0,05 для значимых.

Results

Двенадцати мышам были имплантированы подкожно осмотические насосы, и они выжили. У всех модельных групп развилась гипертоническая болезнь (n = 6). Через семь дней после имплантации среднее САД в модельной группе превысило 160 мм рт.ст. (рис. 1А). На 14, 21 и 28 сутки САД в модельной группе стабильно оставался выше 160 мм рт. Напротив, в группе фиктивной хирургии поддерживался нормальный уровень САД (примерно 90-110 мм рт.ст.) на протяжении всего эксперимента без значительного повышения.

...

Discussion

В этом протоколе были оптимизированы ключевые этапы, связанные с непрерывной инфузией Ang II для индуцирования гипертензивного фиброза миокарда с использованием осмотического насоса, а также подробно описаны критические аспекты, такие как положение осмотического насоса при имплантации и установка концентрации Ang II. Насос модели 2004 года был выбран из-за его продолжительности в 4 недели, а доза Ang II была рассчитана на основе номинальной скорости инфузии с учетом минимальной вариабель...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ang II	Корпорация Sigma-Aldrich	Sigma, A9525
Аппарат для анестезии животных	Shenzhen Reward Life Science Co., Ltd	R530
Аппарат искусственной вентиляции лёгких животных	Shenzhen Reward Life Science Co., Ltd	R415
GraphPad Prism	GraphPad Software Inc.	Версия 9.0
Интеллектуальный неинвазивный монитор артериального давления	Nippon Soft Dragon Co., Ltd	Софтрон, BP-98A
Оптический микроскоп	Yijingtong Optical Technology (Shanghai) Co., Ltd	OLYMPUS, SZ61TR
Раствор и набор для окрашивания Masson Tricolor	Beijing Soleibao Technology Co., Ltd	Solarbio, G1340
Мышей	Chengdu Dossy Exprimental Animals CO., Ltd	C57BL/6J
Осмотические насосы	Корпорация ALZA	Alzet, модель 2004
Системы ультразвуковой визуализации	FUJIFILM VisualSonics Corporation, Канада	FUJIFILM, Vevo 3100