Моделирование метастазов в мозг: стандартизированный анализ метастатической колонизации и гистологических ростовых паттернов с помощью стереотаксической интракортикальной инъекции

Краткое содержание

Стереотактическая инъекция внутричерепной инъекции позволяет точно и локализованно имплантировать опухолевые клетки в кору мыши, что делает её мощной моделью для изучения метастатической колонизации мозга.

Аннотация

Метастазы в мозге — это распространённое и разрушительное осложнение запущенных солидных опухолей, часто сопровождаемое плохим прогнозом, неврологическим ухудшением и снижением качества жизни. Частота отказов центральной нервной системы (ЦНС) и неврологической смерти быстро растёт, однако механизмы, приводящие к финальной стадии метастазирования в мозг, такие как вторичное распространение, повторная колонизация и вклад гистологического паттерна роста (HGP) как потенциального суррогатного параметра, остаются плохо изученными.

Стандартизированная стереотаксическая модель интракортикальной инъекции позволяет точно и воспроизводимо имплантировать опухолевые клетки или смешанные популяции с стромальной или иммунной компонентами непосредственно в кору мозга мыши. Этот протокол также поддерживает создание доклинического архива тканей, предоставляя надёжную платформу для изучения основных аспектов колонизации ЦНС, таких как: метастатический отросток, специфическая для HGP динамика роста и патофизиологические механизмы, способствующие неврологической недостаточности. Кроме того, эта модель поддерживает фармакологическое тестирование в воспроизводимом клинически значимом контексте.

В отличие от системных методов инъекций (например, хвостовой вены или интракардиологии), которые оптимизированы для изучения ранних метастатических этапов, но приводят к переменным и часто низким темпам колонизации мозга, стереотактическая модель обеспечивает стабильный метастаз, специфичный для мозга и позволяет исследовать поздние стадии метастазирования ЦНС. По сравнению с системами ex vivo , такими как органоиды или культуры срезов мозга, стереотаксическая модель in vivo сохраняет васкуляризацию, системную сигнализацию и всю сложность иммунного ландшафта мозга, что поддерживает долгосрочные исследования прогрессирования опухоли и терапевтического ответа.

Предоставляя воспроизводимую и клинически значимую платформу, наша модель расширяет способность области выявлять прогностические маркеры, исследовать терапевтические стратегии и понимать механизмы метастазирования мозга на поздних стадиях.

Введение

Метастазы в мозге — это распространённое и разрушительное осложнение у пациентов с солидными опухолями, часто сопровождаемое с плохим прогнозом, значительным неврологическим ухудшением и снижением качества^{жизни 1,2,3}. В частности, отказ центральной нервной системы (ЦНС) и неврологическая смерть становятся всё более частыми исходами при таких видах рака, как рака легких, груди и^{меланома 4,5,6,7}. Отказ ЦНС при метастазах в мозге может возникать из-за различных механизмов, включая локальный масс-эффект, перитухольный отёк, внутричерепное кровоизлияние и менингеальное распространение, которые могут действовать независимо или синергетически и в конечном итоге приводить к неврологической^{смерти 8}.

Несмотря на клиническую значимость, патофизиологические механизмы, лежащие в основе отказа ЦНС и финальных стадий метастатического прогрессирования, остаются слабо изученными. Такие процессы, как альтернативное распространение, вторичное распространение и повторная колонизация, редко становятся предметом целенаправленного исследования⁸. Как клинические, так и доклинические исследования часто ограничивают свои анализы конечными показателями, такими как количество метастазов в мозге, размер или общая выживаемость (ОС), тем самым упуская критические механистические инсайты и истинные причины неврологического упадка и смерти.

В этом контексте мы и другие выявили различные гистологические паттерны роста (HGP) в метастазах в мозг, которые коррелируют с клиническими результатами^{9, 10 и 11}. Были описаны три основных ГГП: i) неинфильтративные, отмеченные хорошо очерченной опухольной границей, часто окружённой реактивным астроцитарным краем; ii) эпителиальный инфильтрат, когда кластеры опухолевых клеток проникают в соседнюю паренхиму мозга без астроцитного удержания; и iii) диффузный инфильтрат, характеризующийся широкомасштабной инфильтрацией отдельных опухолевых клеток или небольших кластеров, вызывающим обширный астроглиоз^10,12.

Клинически инфильтративные HGP связаны с значительно худшим прогнозом по сравнению с неинфильтративными^{паттернами 9,10,11}. Кроме того, HGP, по-видимому, отражают ключевые аспекты динамики роста опухоли и механизмов, приводящих к неврологической смерти. В то время как неинфильтративные метастазы обычно расширяются в одно поражение и ограничивают жизненно важные структуры мозга, инфильтративные поражения демонстрируют вторичное распространение (начиная с существующего поражения, а не из первичной опухоли) внутри ЦНС, способствуя широкому повреждению и полному разрушению органов (неопубликованные данные). Инфильтративные поражения также могут повторно колонизировать мозговые клетки, способствуя метастазированию менингеальных мозгов и дополнительно усложняя ход^{болезни 10,13}. Несмотря на клиническую значимость, HGP метастазов в мозге и последние стадии колонизации ЦНС, включая вторичное распространение и повторную колонизацию одного и того же органа, остаются недостаточно изученными, во многом из-за отсутствия подходящих экспериментальных моделей.

Чтобы устранить этот разрыв, мы предлагаем стереотаксическую модель инъекции внутричерепной мозга, которая позволяет точно, воспроизводимую имплантацию опухолевых клеток или клеточных смесей, включающих опухолевые клетки и один или несколько неопухолевых типов клеток в кору мозга экспериментальных мышей. Эта модель преодолевает ключевые ограничения моделей системных метастазов и предоставляет надёжную платформу для изучения ключевых аспектов колонизации ЦНС, таких как: взаимодействие опухолей и иммунных клеток во время^{колонизации 14}, влияние предварительно обработанных клеточных^{смесей 15}, метастазный рост¹⁶, специфическая для HGP динамика роста и патофизиологические механизмы, способствующие неврологической неэффективности (неопубликованные данные). Кроме того, эта модель поддерживает фармакологическое тестирование в воспроизводимом и клинически значимом^{контексте 14,15}.

Этот протокол предлагает подробную методологическую основу для реализации стереотактической модели инъекций для изучения HGP при метастазах в мозге. Также поддерживается разработка структурированного доклинического архива образцов и цифровой библиотеки тканей для систематического изучения биологии колонизации ЦНС на поздних стадиях. Наша цель — позволить выявлять прогностические и потенциально предсказательные биомаркеры, способствовать разработке улучшенных терапевтических стратегий и повысить способность предсказывать острые и хронические реакции паренхимы мозга и иммунной системы. С помощью такого подхода мы стремимся предоставить стандартизированную платформу для систематического изучения колонизации ЦНС и метастатического прогрессирования.

Протокол

Все процедуры с животными, описанные в этом протоколе, проводились в соответствии с институциональными рекомендациями и утверждён правительством Нижней Франконии (номер разрешения: RUF-55.2.2-2532-2-1678). Этот протокол предназначен для стереотаксической интракортикальной инъекции опухолевых клеток у сингенных взрослых мышей (10-12 недель) в качестве модели метастатической колонизации мозга. Любые изменения в протоколе должны обсуждаться с назначенным специалистом по защите животных.

1. Предоперационные процедуры

1. Акклиматизация животных
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши должны быть акклиматизированы не менее 7 дней до начала экспериментальных процедур.
   1. Содержать экспериментальных животных группами в стандартных лабораторных условиях (22 ± 2 °C, относительная влажность 50-60%, цикл свет/тьма 12 часов) с импровизованным доступом к корму и воде.
   2. Для обеспечения благополучия и снижения стресса обеспечьте обогащение окружающей среды в виде гнездовых материалов, укрытий и грызущих блоков.
   3. Обращайтесь с животными один раз в день (3-5 минут за сеанс) в период акклиматизации, чтобы приучить их к контакту с людьми. Кроме того, проводите пробные процедуры, имитирующие ключевые аспекты предстоящей операции, включая взвешивание и воздействие анестезиологической установки, без проведения инвазивных вмешательств. Эти сессии направлены на привыкание животных к процедурной среде и минимизацию изменчивости, связанной со стрессом.
2. Физический осмотр (предоперационный осмотр)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед введением опухолевых клеток все животные должны пройти тщательное физическое и неврологическое обследование, чтобы исключить любые ранее существующие аномалии, не связанные с исследованием. Животных с нарушениями или аномалиями следует исключить из исследования. Физический осмотр можно провести за день до инъекции.
   1. Проведите полный физический осмотр, оценивая общее состояние здоровья, включая состояние шерсти, осанку, дыхание, походку, вес тела и общее поведение.
   2. Оцените неврологическую функцию с помощью теста с висящей проволокой для оценки силы хватки и координации. Для проведения теста подвесной проволоки подвесят горизонтальный провод (примерно 2 мм в диаметре) между двумя опорами, при этом выходные платформы расположены на концах примерно на 30 см над мягкой поверхностью. Поставьте мышь в центр провода и дайте ей схватить провод передними лапами. Отпусти мышь и сразу начинай отсчёт времени. Заканчивают испытание, когда мышь достигает одной из платформ или падает. Считайте, что мышь успешна, если она достигает платформы в течение 60 секунд; Запишитесь как неисправное, если он упадёт или не достигнет платформы в течение этого времени.
3. Подготовка рабочих мест
   1. В день операции (0-й день) установите четыре специализированных рабочих места, как описано ниже, чтобы обеспечить эффективный рабочий процесс и сохранить стерильную технику на протяжении всей процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильные хирургические материалы (подкладки, марлевые компрессы, швы и т.д.) и хирургические инструменты с автоклавом (скальпель, щипцы, ножницы, лопатка и др.).
      1. Рабочая станция #1 — подготовка животных до операции: используйте эту рабочую станцию для взвешивания мышей, подготовки анестезиологического раствора и введения анестезии. Подготовьте чистую поверхность с весами, двумя клетками с подстилкой (одна для анестезированных мышей), шприцем объемом 1 мл с раствором анестетика и глазной мазью.
      2. Рабочая станция #2 — Подготовка до и после операции: используйте эту рабочую станцию для разреза кожи головы, герметизации черепа и зашивания раны. Подготовьте чистую поверхность с скальпелем, шприцом объёмом 10 мл с 0,9% NaCl, костным воском, лопаткой, материалом для шва, щипцами и ножницами, ватными палочками, дезинфицирующим средством (70% этанола), шприцом на 1 мл с обезболивающими и грелкой или аналогичной согревающей платформой.
      3. Рабочая станция #3 — Подготовка опухолевых клеток: используйте это рабочее место для подготовки раствора опухолевых клеток перед инокуляцией. Подготовьте чистую поверхность с ледяным ящиком с шприцом Гамильтона объёмом 10 мкл и трубкой Эппендорфа с клеточной суспензией в внеклеточной матриксе (ECM) среде, пипеткой с наконечниками 100 мкл для повторного суспензия клеток и тремя сосудами для очистки шприца Гамильтона после инокуляции опухолевых клеток, содержащих дистиллированную воду, 70% этанол и 0,9% NaCl.
      4. Рабочая станция #4 — стереотаксическая инъекция: используйте эту рабочую станцию для стереотактической инъекции опухолевых клеток в кору мозга. Подготовьте чистую поверхность с стереотактической рамой для мелких животных, точной стоматологической дрели, крупными щипцами и ватными палочками.
4. Подготовка суспензии опухолевых клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все процедуры подготовки суспензии опухолевых клеток должны выполняться в сертифицированном биологическом шкафу безопасности (капюшон класса II) с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ), включая лабораторный халат, перчатки и защиту глаз, чтобы обеспечить стерильность и защитить персонал от возможной биологической опасности.
   1. Трипсинизуйте клетки с помощью 1 мл трипсина 1x EDTA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется использовать опухолевые клетки на экспоненциальной стадии роста.
   2. Точно определите количество клеток с помощью соответствующего метода подсчёта (например, гемоцитометра или автоматического счётчика клеток).
   3. Подготовьте клеточную суспензию, содержащую 1 x 10³ клетки в 3 мкл ECM-среде на животное. Используйте смесь ECM и стандартной культурной среды 2:1 с 10% FCS и другими добавками по мере необходимости. Масштабируйте объём суспензии и количество клеток в зависимости от количества животных (например, для 10 мышей подготовьте 10 ×^{10 3} клеток в среде ECM объемом 30 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество инъекционных клеток должно тщательно титрироваться для каждой клеточной линии.
   4. Держать ячейку на льду до инъекции, максимум 2 часа.

2. Интраоперационные процедуры

1. Анестезия для мышей
   1. Взвешивайте каждую мышь с помощью точных весов и рассчитывайте необходимый объём анестетика исходя из веса тела.
   2. Вводите рассчитанный объём анестезии внутрибрюшинно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте режим анестезии, который охватывает всю процедуру (примерно 2 часа). Например: кетамин 10% (гидрохлорид кетамина, 100 мг/мл; 100 мг/кг массы тела) в сочетании с Домитором (гидрохлорид медетомидина, 1 мг/мл; 0,25 мг/кг массы тела) или аналогичным протоколом.
   3. После подтверждения достаточной глубины анестезии положите мышь на заранее нагретую грелку (поддерживаемую при температуре 37-38 °C) для терморегуляции и нанесите глазную мазь для защиты роговицы от высыхания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедите достаточную глубину анестезии, аккуратно щипнув заднюю лапу щипцем. Операцию следует делать только если отмены не наблюдается.
2. Подготовка и разрез кожи головы
   1. Введите лидокаин перед операцией для местной анестезии в месте разреза. Используйте раствор лидокаина 1% (5 мг/мл) и вводите примерно 0,05–0,1 мл подкожно вдоль запланированной линии разреза. Дайте анестетику не менее 2-3 минут, прежде чем приступать к разрезу на коже головы.
   2. Тщательно продезинфицируйте кожу головы с помощью раствора на основе йода.
   3. Растяните кожу и сделайте разрез по средней линии примерно 3-4 мм вдоль черепа с помощью стерильного скальпеля.
   4. С помощью того же скальпеля аккуратно соскрести надственность, чтобы обнажить поверхность черепа.
3. Установка стереотактических рам, идентификация координат и краниотомия
   1. Зафиксируйте голову мыши в стереотаксической раме с помощью наушников.
   2. Используя стереотактическую руку, определите Брегму (пересечение корональных и сагиттальных швов черепа), затем переместите стереотактическую руку на 2 мм впереди и 1 мм латерально (справа) к месту инъекции в лобной коре, как показано на рисунке 1B , и отметьте её хирургическим маркером.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в месте инъекции присутствует сосуд, его расположение можно скорректировать до 0,5 мм для предотвращения кровотечения.
   3. Аккуратно просверлите череп с помощью прецизионной стоматологической дрели, стараясь не проникнуть в твердую мозговую смесь.
   4. Проверьте отверстие, аккуратно прощупывая стерильными щипцами, чтобы почувствовать прорыв.
4. Инъекция опухолевых клеток
   ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро на этом этапе, так как ECM начинает затвердеть при комнатной температуре, что может повлиять на точность и стабильность инъекции.
   1. Тщательно суспензируйте суспензию опухолевых клеток, проводя пипеты вверх и вниз, чтобы обеспечить равномерное распределение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте вихрей, чтобы предотвратить образование пузырьков воздуха.
   2. Загрузите 3 мкл подвески ячейки в шприц Hamilton объёмом 10 мкл и поместите его в стереотаксическую раму с помощью соответствующего держателя.
   3. Аккуратно разместите иглу шприца над отверстием для жернов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что фаска иглы направлена влево, чтобы повысить воспроизводимость во время инъекции.
   4. Введите иглу вертикально в ткань мозга на глубину 3,5 мм. После достижения этой глубины медленно убирайте иглу на 0,5 мм, чтобы предотвратить рефлюкс клеточной суспензии во время и после инъекции.
   5. Вводите 3 мкл суспензии опухолевых клеток медленно в течение 1 минуты. После полного объёма иглой держите иглу на месте ещё 2 минуты, чтобы клетки и ECM оселились, минимизируя риск рефлюкса.
   6. Аккуратно вынимите шприц и вынимите мышь из стереотаксической рамки.
5. Швы и восстановление после анестезии
   1. Аккуратно промывайте череп стерильным раствором NaCl с 0,9%.
   2. Высушите и запечатайте отверстие костного воска.
   3. Закройте разрез на коже головы 3–4 швов, убедившись, что каждый шов завязан тремя тугими узлами, расположенными близко к краям раны для правильного заживления.
   4. Отметьте уши мыши соответствующим рисунком пробивания, соответствующим назначенному идентификационному номеру.
   5. При необходимости наносите глазную мазь повторно, чтобы предотвратить высыхание роговицы во время восстановления. Сразу после этого верните мышь в заранее нагретую грелку (поддерживаемую при 37-38 °C) для поддержки терморегуляции и плавного восстановления после анестезии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется содержать мышей индивидуально во время восстановления, чтобы предотвратить травмы при взаимодействии бодрствующих и выздоравливающих животных.
   6. Тщательно очистите и продезинфицируйте шприц Hamilton, промывая иглу и ствол три раза подряд: сначала дистиллированной водой, затем 70% этанола, и наконец стерильным раствором 0,9% NaCl.
   7. После чистки храните шприц Hamilton на льду до следующего использования.

3. Послеоперационные процедуры

1. Послеоперационная анальгезия
   1. Вводите обезболивающие подкожно, пока мышь находится под анестезией, чтобы обеспечить немедленное облегчение боли после операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте обезболивающие, подходящие для такого типа процедуры. Например, карпрофен при 10 мг/кг массы тела.
   2. Когда мышь полностью проснётся и восстановит нормальную моторную функцию, перенесите её в чистую клетку с чистой подстилкой. Кратко следите за поведением и дыханием животного.
   3. После полного выздоровления вводите обезболивание через питьевую воду (например, метамизол в 200 мг/кг массы тела) не менее 24 часов после операции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы стимулировать потребление воды, подслащайте питьевую воду сахарозой 0,5%. Оборачивайте бутылки в алюминиевую фольгу, чтобы защитить раствор от света, и заменяйте их ежедневно. Маркируйте каждую бутылку, чтобы отслеживать потребление обезболивающих. Если анальгетики не принимаются через питьевую воду или наблюдаются признаки боли, вводите карпрофен (10 мг/кг массы тела) подкожно каждые 12 часов до полного выздоровления.
2. Мониторинг мышей
   1. Внимательно следите за всеми мышами каждые 24 часа в первые 48 часов после операции, оценивая моторную функцию и поведение. С третьего дня следите за мышами как минимум каждые 3 дня, включая измерения массы тела.
   2. Если наблюдаются признаки стресса или аномального поведения (например, нарушенная моторная активность, необычное поведение), проведите тест с висящей проволокой, как описано ранее. Если мышь проходит тест, продолжайте мониторинг и повторяйте тест через день.
   3. Немедленно усыпить мышей (см. раздел 3.4) после достижения одного из заранее определённых гуманных целевых показателей: потеря веса > 20% от первоначального веса тела (день 0), непрохождение теста на висячую проволоку или длительное умеренное страдание до 48 часов.
3. Терапевтическое лечение (по желанию)
   1. После полного послеоперационного восстановления может быть начата терапевтическая схема в зависимости от дизайна эксперимента. Если это так, четко определите время начала лечения в протоколе исследования и адаптируйте план мониторинга с учетом ожидаемых и возможных побочных эффектов терапевтического вмешательства.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Лечение не должно начинаться, пока животное не проявит нормальное поведение, стабильный вес и не проявит признаков послеоперационного дискомфорта.
4. Эвтаназия и сбор тканей
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши должны быть эвтаназированы сразу после достижения заранее определённых гуманных целей или в определённые экспериментальные периоды, как того требуют конкретные исследовательские цели.
   1. Анестезиируйте мышь соответствующим способом (см. шаг 2.1.2).
   2. Откройте грудную полость и проведите транскардиальную перфузию с помощью 10-20 мл ледяного стерильного 0,9% NaCl, затем 10-20 мл ледяного 4% параформальдегида (PFA).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если для дальнейших приложений (например, выделение РНК или FACS) требуется свежая ткань, опустите этап перфузии PFA.
   3. Соберите мозг и другие интересующие органы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Органы могут быть мгновенно замораживаны в жидком азоте, фиксированы формалином для обработки FFPE или использованы непосредственно для дальнейших анализов.
5. Структурированный посмертный анализ
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для подтверждения метастатического роста и характеристики связанных гистопатологических признаков следует провести посмертный анализ мозговой ткани с использованием как натуральных (свежезамороженных), так и фиксированных (FFPE) образцов.
   1. Рассечение тканей
      1. Вскрытие мозга на уровне места инъекции, как показано в схеме, приведённой на рисунке 1C.
      2. Переднюю часть оставьте для обработки в свежей заморозке (FF). Разделим эту часть на инжекционные (i.) и неинжекционные (n.i.) полушария.
      3. Сохранить центральную часть для фиксации формалина и вложения парафина (FFPE).
      4. Отбросьте заднюю часть, включая мозжечок и ствол мозга.
   2. Обработка образцов
      1. Переднюю часть быстро заморозьте в жидком азоте и храните образцы FF при -80 °C до дальнейшего использования.
      2. Зафиксируйте центральную часть в 5-7 мл 4% PFA при комнатной температуре в течение 48 часов перед обработкой FFPE.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксация PFA должна проводиться в капюшоне с химическим дымом при ношении соответствующих средств индивидуальной защиты, чтобы избежать воздействия токсичных паров.
   3. Количественная оценка метастатической нагрузки (образцы FF)
      1. Изолировать полную РНК с помощью соответствующего набора для экстракции или протокола, оптимизированного для мозговой ткани.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Изоляция РНК должна проводиться в биологическом защитном шкафу с использованием соответствующих СИЗ для предотвращения загрязнения и воздействия опасных реагентов.
      2. Проведите количественное ПЦР (qPCR) с использованием маркера, специфичного для опухолевых клеток, такого как Ck8.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные мишени (например, иммунные или стромальные клеточные маркеры) могут быть оценены путём выбора соответствующих генных маркеров. Секвенирование РНК (РНК-секвенирование) может использоваться в качестве альтернативы для анализа на уровне всего транскриптома.
      3. Рассчитайте относительную опухолевую нагрузку, нормализуя интересующий ген (GOI, например, Ck8) к гену домашнего хозяйства (HK).
   4. Гистологический анализ (образцы FFPE)
      1. Внедрить формалин-фиксированную ткань в парафин.
      2. Разрезать образцы на срезы толщиной 3 мкм с помощью микротома.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Использование микротома должно выполняться обученным персоналом с соответствующими средствами индивидуальной защиты, используя защитную защиту лезвий, когда лезвия не нарезают и не утилизируют лезвия в контейнерах для острих, чтобы обеспечить безопасность.
      3. Проведите стандартное окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) и иммуногистохимию (IHC) с использованием соответствующих антител, таких как Ck8 (опухолевые клетки), Cd3 (Т-клетки), Iba1 (микроглия/макрофаги) и Gfap (астроциты).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры H&E и IHC должны проводиться в хорошо проветриваемом помещении или в вытяжной вытяжке для обеспечения безопасности и предотвращения химического воздействия.
      4. Цифровым способом сканируйте все окрашенные слайды с помощью высокоразрешающего сканера, чтобы создать цифровую библиотеку тканей.
      5. Оценить гистологический паттерн роста (HGP) метастазирования в мозг согласно опубликованному^{протоколу 10,12}.

Результаты

Стереотактический протокол инъекции (рисунок 1) может применяться как к сингеническим, так и к ксенотрансплантатным моделям мышей, включая дикие или генетически модифицированные штаммы, в зависимости от научного вопроса. Может использоваться любая подходящая клеточная линия, способная расти в мозге. Примеры мышиных опухолевых клеточных линий, которые могут колонизировать мозг, включают, но не ограничиваются, опухолевые клетки молочной железы 4T1 и 410.4, колоректальные раковые клетки CMT93 и линию меланомы B16-F10. Время, необходимое для установления метастазов в мозге опухолевых клеток, варьируется в зависимости от клеточной линии — от нескольких дней до нескольких недель, а пенетранция также варьируется. Мы рекомендуем использовать модель с пенетрантностью ~70%, то есть как минимум у 7 из 10 животных развиваются метастазы в течение максимального экспериментального периода в 20 недель (рисунок 2A). Каждая клеточная линия должна быть индивидуально оптимизирована, а количество инъекционных клеток тщательно титрировано.

В качестве примера мы сравнили две тесно связанные модели метастазирования мозга при сингенном раке молочной железы: 410.4 и его производное 4T1. Несмотря на их генетическое^{сходство 17}, эти клеточные линии демонстрируют заметно иное поведение и паттерны роста в^{мозге 16}. Хотя обе системы достигают схожего метастатического бремени (рисунок 2B), каждый демонстрирует уникальный временной ход (рисунок 2C) и чётко отличающиеся HGP (рисунок 2D). Для систематической оценки и сравнения эффективности колонизации между различными клеточными линиями мы разработали Индекс колонизации — математическую формулу, интегрирующую количество инъекционных клеток, медианное время выживаемости и успех колонизации (рисунок 2E-G).

При первом выполнении стереотаксической инъекции или тестировании новой клеточной линии крайне важно тщательно оценивать модели роста и сравнивать результаты у животных, на клиниках и в экспериментаторах для обеспечения воспроизводимости. Одним из критических этапов является инъекция опухолевых клеток, во время которой может произойти утечка суспензии клетки. Это может привести к ошибочной локализации опухоли, особенно к ятрогенному засеянию опухолевых клеток на черепе и/или мозговых мозгах, что может привести к ложноположительным метастазам менингеаля, которые не представляют собой истинную внутримозговую колонизацию с последующим вторичным менингеальным распространением. Эти сценарии показаны на рисунке 3.

Рисунок 1: Пред, внутри- и послеоперационные процедуры стереотаксической инъекции опухолевых клеток у мышей. Схематический обзор процедуры. (A) Предоперационная фаза включает акклиматизацию животных, оценку состояния, подготовку операционного места и суспензию опухолевых клеток. (B) Внутриоперационная фаза включает индукцию анестезии, разрез головы, установку в стереотаксическую раму, точную краниотомию, введение опухолевых клеток в кору головного мозга с использованием стереотактических координат, закрытие раны и восстановление после анестезии. (C) Послеоперационная фаза включает введение обезболивающих, регулярный мониторинг для оценки послеоперационного восстановления, общего состояния здоровья и развития неврологических симптомов (тест на висячую проволоку), затем эвтаназия и изъятие органов. Включён структурированный посмертный анализ для оценки метастатической нагрузки в свежезамороженной (FF) ткани с помощью qPCR и оценки гистологических паттернов роста образцов FFPE из цифровой библиотеки слайдов. Ключевые процедурные этапы иллюстрируются последовательно, чтобы подчеркнуть время и хирургический рабочий процесс. Изображение создано в BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2: Репрезентативные результаты метастатического роста в мышиных моделях метастазирования мозга после стереотаксической инъекции клеток рака груди 4T1 и 410.4. (A) Макроскопические изображения, показывающие отсутствие роста опухоли у контрольных мышей Balb/C, инъекционируемых ЭКМ (контрольная группа) и наличие видимых метастатических поражений у мышей, введённых суспензиями опухолевых клеток и ECM (Met). (B) Количественная оценка метастатической нагрузки у контрольных мышей, введённых ЭКМ (CTRL), и мышей с метастазами в мозге, полученными из клеток рака молочной железы 4T1 и 410.4. Метастатическая нагрузка была оценена методом qPCR с использованием Ck8 в качестве опухольного маркера, с Gapdh и Pgk1 как генами домашнего хранения (HK). Данные представлены как средние значения с отдельными точками данных. Статистический анализ проводился с использованием одностороннего ANOVA, за которым последовал тест множественных сравнений Даннетта (n = 5; ****P < 0,0001). (C) Кривые выживаемости Каплана-Мейера, сравнивающие общую выживаемость (OS) мышей, стереотаксически введённых только ЭКМ (контрольная, чёрная), 4T1 (оранжевый) или 410,4 (синий) опухолевых клеток. Статистический анализ проводился с использованием теста Log-rank (Мантел-Кокс) (4T1 против 410,4; n = 10; ***P < 0,001). (D) Репрезентативные гистологические изображения метастазов в мозге, полученных из клеток 4T1 и 410.4, иллюстрирующие различия в паттернах роста, включая когортные и цеповидные инфильтративные эпителиальные HGP соответственно. Срезы ткани были окрашены антителом к антицитокератину 8. (E) Сравнительный анализ эффективности колонизации с использованием Индекса колонизации (CI). Показаны значения CI 4T1 (оранжевый) и 410,4 (синий). (F) Формула, используемая для расчёта CI. (G) Таблица, суммирующая параметры, включённые в CI для обеих моделей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3: Репрезентативные примеры успешных и субоптимальных результатов стереотактических инъекций. (A,C) Макроскопические изображения, показывающие метастазический рост в разных местах: (A) рост опухоли в черепе и мозговых каналах, вызванный неправильной инъекцией и утечкой опухолевых клеток, и (C) успешным паренхимическим метастазированием после правильной интракортикальной инъекции. (B,D) Соответствующие гистологические срезы подтверждают (B) интраменингеальный рост опухоли с последующей инфильтрацией в паренхиму мозга и (D) вторичную диссеминизацию в мозговые мозги из-за установленного паренхимального метастаза. Срезы ткани были окрашены антителом к антицитокератину 8. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Стереотаксическая интракраниальная техника позволяет точно и локализованно доставлять опухолевые клетки или клеточные смеси непосредственно в кору мозга экспериментальных мышей. В сочетании со структурированным посмертным анализом эта модель особенно ценна для изучения поздних стадий метастазирования в мозге, включая метастазное вырастание, вторичное внутриорганное распространение и потенциальную причину смерти. В отличие от этого, методы системных инъекций (например, в хвостовую вену или внутрисердечные инъекции) лучше подходят для изучения ранних стадий метастатического каскада, таких как выживаемость опухолевых клеток в кровообращении, экстравазация и посев в удалённых органах. Однако эти подходы не являются специфичными для мозга и обычно приводят к низким и непоследовательным темпам колонизации^мозга 18,19,20.

Системные модели также показывают высокую биологическую вариабельность, особенно в отношении того, какие области мозга затронуты, что делает терапевтические исследования сложными и требующими больших животных в когортах. Кроме того, у животных часто развиваются экстракраниальные метастазы, что может привести к раннему прекращению исследования¹⁹. Эти ограничения значительно снижают их полезность для изучения метастазов в мозге на поздних стадиях. Кроме того, вторичное распространение и повторная колонизация особенно сложно исследовать с помощью системных моделей, поскольку различие между первичным распространением (исходящим из первичной опухоли) и вторичным распространением (возникающим в результате уже установленных метастазов) практически невозможно. Кроме того, структурированный посмертный анализ, особенно для оценки макрометастатического роста и HGP метастазов в мозге, ограничен в этих условиях.

По сравнению с системами ex vivo, такими как органоиды, полученные пациентами (PDO), и органотипические срезы мозга (co)-^{культуры 21,22,23,24}, стереотаксическая инъекция обладает рядом критически важных преимуществ. Хотя ex vivo модели сохраняют элементы нативной архитектуры мозга и могут включать резидентные и инфильтрирующие иммунные клетки пациентов или доноров, им отсутствует васкуляризация, системная сигнализация и полная сложность микросреды опухоли in vivo, особенно дальнейшая инфильтрация Т-клеток или других иммунных клеток, полученных из крови или костного^{мозга 23}. Эти ограничения ограничивают их применение краткосрочных исследований и упрощёнными условиями, такими как скрининг на наркотики или базовые анализы взаимодействия между клетками и мозгом. В отличие от этого, стереотаксический подход поддерживает долгосрочные исследования прогрессирования опухоли, иммунного ответа и терапевтического вмешательства в живом, целом организме. Важно, что оценка неврологических симптомов как гуманной конечной точки позволяет клинически значимую измерить макрометастазное начало. Это делает модель ещё более отражающей ход человеческих заболеваний, что особенно ценно в трансляционных исследованиях. Хотя она включает использование животных, что поднимает этические вопросы, учитываемые соблюдением 3R (Замена, Редукция и Совершенствование), эта модель в настоящее время не может быть полностью заменена альтернативами ex vivo. Его способность воспроизводить полный физиологический контекст метастазирования в мозге делает его незаменимым для продвижения понимания метастатической динамики и специфической для ЦНС патофизиологии.

Несмотря на многочисленные преимущества, модель стереотаксического впрыска имеет некоторые ограничения, которые стоит учитывать. Ключевой проблемой является возможная утечка суспензии опухолевых клеток во время инъекции, что может привести к вводящим в заблуждение закономерностям роста. В частности, непреднамеренное присоединение опухолевых клеток к менингеальным клеткам может привести к ятрогенному менингеальному^{метастазу 8}, который не отражает естественный ход метастатического распространения в данной клеточной линии. Для обеспечения надёжности данных паттерны роста определённой линии опухолевых клеток следует последовательно сравнивать между животными, хирургическими процедурами и экспериментаторами. Чтобы минимизировать утечку опухолевых клеток, мы предлагаем использовать внеклеточный матрикс (ЭКМ), поскольку его гельоподобная консистенция и способность затвердеть при температуре тела делают его полезным инструментом. Однако ECM также представляет проблемы, включая необходимость быстрой обработки во время впрыска для предотвращения преждевременного затвердевания. Ещё одним важным моментом в нашем протоколе является введение опухолевых клеток в смесь ЭКМ и среды, содержащей сыворотку. Хотя FBS усиливает прививку опухолевых клеток, обеспечивая мозг питательными веществами, которые обычно ограничены в мозге, он также может способствовать воспалению. Если это вызывает опасения, в качестве альтернативы могут использоваться среды без сыворотки или сбалансированные соляные растворы (например, HBSS или PBS).

Кроме того, стереотаксическая инъекция технически более требовательна, чем другие методы, такие как внутривенная (внутривенная) инъекция. Для обеспечения воспроизводимости требуется специальное обучение, а процедура занимает значительно больше времени, обычно занимает 15-30 минут на животное против 3-5 минут для внутривенных инъекций. Такая длительность ограничивает количество животных, которые могут быть обработаны за сеанс, что может стать проблемой для терапевтических исследований, требующих больших когорт для достижения статистической мощности. Однако это ограничение можно эффективно устранить, распределяя инъекции в течение нескольких дней, что не только увеличивает гибкость экспериментов и осуществимость, но и вводит ценную биологическую вариативность, отражая более реалистичные различия между людьми как в поведении опухолевых клеток, так и в ответе хозяина.

Наконец, важно отметить, что эта модель обходит более ранние этапы метастатического каскада, как уже обсуждалось. Соответствующая экспериментальная модель должна быть выбрана на основе исследовательского вопроса и конкретной фазы изучаемого метастаза. Для исследования поздней стадии колонизации мозга стереотаксическая интракортикальная инъекция остаётся золотым стандартом.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Плоскогубцы для ушей животных	LabArt
Bepanthen® мазь для глаз и носа	Bayer Vital GmbH	1578675
Костный воск	Б. Браун	210434
Ватные палочки	Хартманн	143213
Экстракт базальной мембраны Cultrex (ECM)	B& D	3432-005-01
Дезинфицирующее средство	Б. Браун	107190
Сверло	Bilaney Consultants GmbH	D #76
Ножницы для глаз	Хермле	501
Шприц Гамильтона (10µ L том)	VWR	5491135
Грелка	Intergastro	258122
Анализ мышиной носы/зубной планки (900/1430)	Bilaney Consultants GmbH	DKI 926-B
Ножницы для глаз Нойеса	Хермле	545
Паур 60&°; Tip non noptore Mouse Ear Bars	Bilaney Consultants GmbH	DKI 922
Скальпель	PFM Medical AG	17027
Стандартные щипцы Семкина	Хермле	710
Сералонный полиамидный шов (DR-009, USP 7/0, EP 0.5)	Serag-Wiessner GmbH	V0053491
Стереотаксичный дрель — Jacobs Chuck — 18000 об/мин	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1471-200-CE-A
Стереотаксик без адаптера Rat	Bilaney Consultants GmbH	DKI 963 % 920
Шприц HDDER для 5 и 5 лет 10µ l Гамильтон	Bilaney Consultants GmbH	DKI 1772-F1
TC Needleholders Mayo-Heear 160 мм	Хермле	6425