Методическая статья

Морфологическая характеристика передней регенерации у Diopatra claparedii

DOI:

10.3791/69421

⸱

13 марта 2026 г.

 ,  ,  , 
1Faculty of Science and Marine Environment, Universiti Malaysia Terengganu, 2STEM Foundation Centre, Universiti Malaysia Terengganu

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол предоставляет сфокусированную основу для характеристики процесса передней регенерации у Diopatra claparedii, служа важным шагом для будущих регенеративных исследований.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полихеты обладают способностью регенерировать передние и задние сегменты после травмы или самоампутации, обеспечивая удобную систему для изучения восстановления ран и формирования тканей. Для поддержки сравнительных и механистических исследований регенерации кольцевых кольцев в данном исследовании представлен протокол для индуцирования и характеристики передней регенерации у Diopatra claparedii (D. claparedii). Протокол описывает шаги обращения с образцом, иммобилизации и точной ампутации, а также запланированные точки наблюдения для документирования морфологического прогрессирования на протяжении регенерации. D. claparedii аккуратно извлекали из трубок с помощью палочки с тупым концом и иммобилизовали 4% хлорида магния для стимуляции расслабления. Передняя ампутация проводилась на4-м чэтигре под стереомикроскопом, а процесс регенерации контролировался на 1, 6, 15, 30 и 60 днях после ампутации. Процедура обеспечивает последовательную индукцию передней регенерации и фиксирует ключевые морфологические особенности на ранних этапах закрывания ран, формирования бластемы и восстановления сегментов. Обеспечивая воспроизводимый рабочий процесс и морфологический справочник для D. claparedii, этот протокол предоставляет практическую основу, поддерживающую будущие исследования, направленные на связь морфологических наблюдений с клеточными или молекулярными процессами регенерации кольцевых.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Полихеты составляют почти 65% всех описанных видов кольчатых, что делает их одной из самых разнообразных групп морскихбеспозвоночных 1. Недавно обновлённый список видов многохэтных (Annelida) зафиксировал в общей сложности 57 видов, относящихся к 47 родам в 30 семействах из прибрежных вод Малайзии, при этом большинство видов (53 вида) были зарегистрированы на полуостровеМалайзия 2. Среди них Diopatra claparedii (D. claparedii) Grube, 1878, или местно известный как ruat sarung, является одним из коммерчески эксплуатируемых видов многоцветных в Малайзии. Преимущественно встречается на илистых отмелях западного побережья полуострова Малайзия, включая такие места, как пляж Джерам,Селангор 2,3.

D. claparedii относится к семейству Onuphidae и представляет собой оседлый полихет, проживающий в трубках, известный своей способностью к регенерации как передних, так и задних сегментов тела. Это включает компоненты центральной и периферическойнервной систем 4. Его чётко очерченный сегментарный план тела и выраженная регенеративная способность делают D. claparedii перспективной и удобной моделью беспозвоночных для исследования регенерации тканей в относительно сложных биологических системах. Выбор D. claparedii в качестве модельного организма для исследований регенерации обусловлен его экологической значимостью, региональной значимостью и текущими пробелами в научных знаниях о его регенеративной способности. Этот вид коммерчески добывается и широко используется в качестве рыболовной приманки в Малайзии, что свидетельствует о его хорошо известном местном сообществе и он не считаетсяредким 2,3. Таким образом, исследование регенерации у D. claparedii имеет практическую и экономическую ценность, поскольку результаты могут способствовать распространению научных знаний среди местных заинтересованных сторон и потенциально информировать стратегии поддержки устойчивости популяции через лучшее понимание механизмов регенерации.

Кроме того, D. claparedii демонстрирует специфическое географическое распределение по Юго-Восточной Азии, особенно высокое представительство в прибрежных экосистемахМалайзии 2,3. Однако большинство исследований регенерации полихетов и других кольчатых сосредоточены на видах из Америки или других неазиатскихрегионов 5,6. Например, хорошо изученная Diopatra neapolitana (D. neapolitana), часто используемая как регенеративный биомаркер, имеет широкое распространение, охватывающее Красное море, Индийский океан, Средиземное море иАтлантический океан 7. В связи с этим исследования регенерации кольчатых, обитающих в Юго-Восточной Азии, включая D. claparedii, остаются ограниченными.

Предыдущие исследования полихетов показали чёткие и воспроизводимые стадии регенерации, включая закрытие ран, образование бластемы и дифференцировку сегментарныхтканей 7,8. Хотя ранее уже сообщались молекулярные исследования D. claparedii, исследования, специально сосредоточенные на регенерации, остаются редкими. Кроме того, существующие исследования в значительной степени делают акцент на молекулярной характеристике, а не на экспериментальных протоколах регенерации. Кроме того, D. claparedii демонстрирует как процессы дедифференциации, так и редифференциации, что отражает механизмы, более сопоставимые с теми, что у более высокихорганизмов 9. Эта сложность регенеративного ответа подчёркивает растущее признание полихетов как ценных промежуточных моделей, эффективно преодолевая разрыв между простыми и сложными позвоночными в исследованиях регенерации.

Настоящее исследование устраняет этот пробел, разрабатывая и оптимизируя протокол регенерации D. claparedii, обеспечивая надёжную основу для будущих функциональных, развивающихся и молекулярных исследований регенерации этого регионально важного вида многоцветных. В частности, этот протокол предлагает надёжный подход к изучению последовательных стадий и лежащих в основе механизмов регенерации у полихетов. Это позволяет систематически наблюдать и характеризовать ключевые регенеративные процессы, включая заживление ран, формирование бластемы и сегментацию.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этическое заявление

Это исследование было одобрено Комитетом по этике исследований Университета Малайзии Теренгану под номером одобрения UMT/JKEPH/2026/173

1. Сбор и привычка к D. claparedii

  1. Найдите D. claparedii в илистой зоне эстуарной межприливной зоны (средний уровень прилива с умеренно мелким песком), которая служит его естественной средой обитания.
  2. Выкопайте верхнюю часть полихетных трубок, аккуратно вкопав в осадки лопатой, чтобы не повредить трубки.
  3. Проверьте наличие червя внутри каждой трубки, аккуратно зажав трубку и проверив наличие движения или сопротивления.
  4. Выбирайте только образцы с минимальной расслабленной длиной тела 5 см.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбирайте полихеты по длине тела, чтобы уменьшить повреждения при работе и избежать фрагментации при взвешивании.
  5. Собирайте осадки с помощью лопаты из тех же мест для поддержания экологической стабильности в лаборатории.
  6. Транспортировать собранные образцы в лабораторию в переносных охлаждающих контейнерах при комнатной температуре. Накройте трубки полотенцем, увлажнённым морской водой, чтобы поддерживать влажность и снижать стресс во время транспортировки.
  7. В лаборатории ручно отделяйте мусор от осадка, затем сушите его на воздухе под прямым солнечным светом, пока он полностью не высохнет и не освободится от остаточной влаги.
  8. Удалите или очистите любые другие организмы (например, мелких крабов, ракушек или инородных веществ), чтобы убедиться, что осадок не содержит загрязнителей.
  9. Промывайте полихетные трубки искусственной морской водой (ASW), чтобы удалить мусор и любые живые организмы, прикреплённые к поверхности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для противолодочной борьбы смешайте 1/4 стакана морской соли Instant Ocean в очищенной воде объёмом 1,9 л.
  10. Подготовьте аквариум в пластиковом аквариуме с осадками с исходного участка и заполните искусственной противолодочной системой, отрегулированной до солёности 23-25 ppt (рисунок 1). Поддерживайте температуру воды на уровне 28 °C на протяжении всего периода привыкания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объём использованной противолодочной среды составлял 58 л, определяемый по размерам аквариума: 61,5 см (L) x 32 см (W) x 33,5 см (H).
  11. Переложите D. claparedii в цилиндрические пластиковые контейнеры (диаметром 7 см, высотой 15 см), наполовину заполненные осадками, с плотностью одного полихета на контейнер.
  12. Полностью погрузите контейнеры в аквариум с помощью аэрированной противолодочной борьбы. Позвольте полихетам закопаться и восстановиться.
  13. Кормите полихетов кормом для тонущих рыб 2-3 раза в неделю, чтобы обеспечить постоянное питание на протяжении всего периода привыкания. Регулярно удаляйте излишки пищи, чтобы предотвратить накопление, рост грибков и загрязнение.
  14. Привычка оценивалась с помощью поведенческих наблюдений, при этом активное исследование (движение тела) и поиск пищи (реакция на стимулы) указывали на возвращение к нормальному физиологическому состоянию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте период привычки в течение двух недель перед началом любых экспериментальных процедур, чтобы черви могли восстановиться после любого стресса или случайной ампутации, возникшей во время сбора.

2. Регенерация

  1. Выберите четайгер 4 в качестве стандартного места ампутации для обеспечения последовательных и успешных результатоврегенерации 7,9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор места ампутации на4-м месяце основан на предварительных данных. Используйте сегмент 10 только при необходимости, так как он восстанавливается медленнее.
  2. Приготовьте анестетический раствор с 4% (вес/объём) гексагидратом хлорида магния (MgCl₂·6H₂O) в противолодочной борьбе (4 г MgCl₂·6H₂O в 1 л противолодочной борьбы).
  3. Аккуратно вытолкните полихет из трубки, используя тупую палку, вставленную в переднее отверстие.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте повреждения организма во время удаления.
  4. Затем погрузите полихет в анестетический раствор, пока он полностью не расслабится и не обездвижится (примерно 15 минут).
  5. Ампутация на чэтигре 4 стерилизированным скальпелем под стереомикроскопом, обеспечивая точность и минимальное повреждение тканей (рисунок 1).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда носите соответствующие средства индивидуальной защиты и осторожно, чтобы избежать порезов при обращении со скальпелем.
  6. Вернуть заднюю часть червя в исходную трубку с помощью щипца, сначала вставить передний конец для естественного повторного прорывания.
  7. После этой процедуры ежедневно следите за червями на предмет изменений в поведении и физическом состоянии, включая признаки инфекции, распада тканей или смертности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Лица, проявляющие аномальное поведение, видимый некроз или прогрессирующее ухудшение, считались неуспешными в выздоровлении и исключались из дальнейшего анализа.
  8. На этом этапе задержите пищу до прогресса регенерации, так как область рта отсутствует из-за передней ампутации. Возобновите нормальное питание после развития рта, примерно через 60 дней после ампутации (п.а.).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживайте одинаковые условия окружающей среды (солёность воды в диапазоне 23-25 ppt и температура воды стабильно 28 °C) на протяжении всего процесса регенерации.
  9. Зафиксировать изображения успешно регенерированных полихетов с помощью стереомикроскопа в определённые дни (1, 6, 15, 30 и 60) в год.
  10. Полный мониторинг регенерации после 60 год в год.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Процесс регенерации у D. claparedii контролировался непрерывно до полной регенерации головы. Общий паттерн регенерации был сопоставим с описанным для D. neapolitana (рисунок 2). Закрытие раны в месте ампутации было завершено в течение 1 дня после ампутации (p.a.). К 6-му дню годовщины у выживших наблюдалась чётко выраженная бластема, что указывает на активную регенерацию тканей. На этом этапе примерно 90% че...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кольца, состоящие из сегментированных червей, обитающих в морской, пресноводной и наземной среде, обладают удивительными регенеративными способностями на различных уровнях биологической организации. Они варьируются от восстановления клеток и обновления зародышевых клеток до структурного роста и, в некоторых случаях, полной регенерации тела из мелких фрагментовтела 8,10. Настоящий протокол сосредоточен на передней регенерации ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Исследовательская работа была поддержана грантом TAPE Talent and Publication Enhancement Research Grant (55269), присуждённым SZA.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Искусственная морская водаМгновенный океан
Цифровой портативный гидрометр солёностиScionix
MgCl2· 6Ч<суб>2OSigmaM2670
Scapel
СтереомикроскопLeica Microsystem
TeraBits Complete Fish FoodТетра
Пинцет

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Anderson, D. T. Embryology and Phylogeny in Annelids and Arthropods. International Series of Monographs in Pure and Applied Biology Zoology. 50, Elsevier. (2013).
  2. Razmi Shah, R. S. B., Ibrahim, Y. S., Villalobos-Guerrero, T. F., Sato, M. Updated Checklist of Polychaete Species (Annelida) Recorded from Malaysia, with Remarks on the Research History. Biodivers. Data J. 11, e110021(2023).
  3. Idris, I., Arshad, A. Checklist of Polychaetous Annelids in Malaysia with Redescription of Two Commercially Exploited Species. Asian J. Anim. Vet. Adv. 8, 409-436 (2013).
  4. Rouse, G., Pleijel, F. Polychaetes. , Oxford University Press. (2001).
  5. Lindsay, S. M., Jackson, J. L., Forest, D. L. Morphology of Anterior Regeneration in Two Spionid Polychaete Species: Implications for Feeding Efficiency. Invertebr. Biol. 127, 65-79 (2008).
  6. Whitford, T. A., Williams, J. D. Anterior Regeneration in the Polychaete Marenzelleria viridis (Annelida: Spionidae). Invertebr. Biol. 135, 357-369 (2016).
  7. Pires, A. Studying Annelida Body Regeneration under Environmental Stress in Diopatra neapolitana. Methods Mol. Biol. 2450, 195-206 (2022).
  8. Kozin, V. V., Filippova, N. A., Kostyuchenko, R. P. Regeneration of the Nervous and Muscular System after Caudal Amputation in the Polychaete Alitta virens (Annelida: Nereididae). Russ. J. Dev. Biol. 48 (3), 198-210 (2017).
  9. Nazri, M. U. I. A., Mahmud, M. H., Saidi, B., Mat Isa, M. N., Ehsak, Z., Ross, O., Idris, I., Ismail, W. I. W. Cellular and Molecular Profiles of Anterior Nervous System Regeneration in Diopatra claparedii Grube, 1878 (Annelida, Polychaeta). Heliyon. 7 (2), e06307(2021).
  10. Bely, A. E. Early Events in Annelid Regeneration: A Cellular Perspective. Integr. Comp. Biol. 54 (4), 688-699 (2014).
  11. Górska, B., Gromisz, S., Włodarska-Kowalczuk, M. Size Assessment in Polychaete Worms-Application of Morphometric Correlations for Common North Atlantic Taxa. Limnol. Oceanogr. Methods. 17, 254-265 (2019).
  12. Qu, F., Nunnally, C., Rowe, G. T. Polychaete Annelid Biomass Size Spectra: The Effects of Hypoxia Stress. J. Mar. Sci. 983521, (2015).
  13. Galasso, H. L., Richard, M., Lefebvre, S., Aliaume, C., Callier, M. D. Body Size and Temperature Effects on Standard Metabolic Rate for Determining Metabolic Scope for Activity of the Polychaete Hediste (Nereis) diversicolor. PeerJ. 6, e5675(2018).
  14. Kostyuchenko, R. P., Kozin, V. V. Comparative Aspects of Annelid Regeneration: Towards Understanding the Mechanisms of Regeneration. Genes. 12 (8), 1148(2021).
  15. Pugliese, C., Mazza, R., Andrews, P. L., Cerra, M. C., Fiorito, G., Gattuso, A. Effect of Different Formulations of Magnesium Chloride used as Anesthetic Agents on the Performance of the Isolated Heart of Octopus vulgaris. Front. Physiol. 26 (7), 610(2016).
  16. Vervoort, M., Gazave, E. Studying Annelida Regeneration using Platynereis dumerilii. Methods Mol. Biol. 2450, 207-226 (2022).
  17. Wibowo, E. S., Atang, A., Setiyono, E., Hana, H., Simanjuntak, S. B. I., Susilo, U., Sucharitakul, P., Apriyanti, Y., Pamungkas, J. Biological Aspects of Diopatra claparedii Grube, 1878 (Onuphidae, Polychaeta) Maintained at Different Salinity Levels. Ilmu Kelaut.: Indones. J. Mar. Sci. 30 (1), 1-6 (2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи