В этом исследовании представлен поэтапный протокол для последовательного выделения кишечных крипт и кишечных мезенхимальных стромальных клеток (iMSC) из свиномолочной ткани. Метод генерирует двумерные энтероидные монослои и iMSC, подходящие для разработки воспроизводимых, физиологически значимых моделей эпителиально-стромальной кокультуры, чтобы исследовать клеточные перекрёстные контакты во время гомеостаза и регенерации кишечника.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Оптимизированная последовательная изоляция крипт и мезенхимальных стромальных клеток из ткани свининого кишечника
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Кишечный эпителий тесно взаимодействует с подлежащими мезенхимальными стромическими клетками кишечника (iMSC), регулируя развитие, гомеостаз и регенерацию. Однако стандартизированные методы последовательного выделения как эпителиальных, так и стромальных фракций из свиновидной ткани ограничены. Этот протокол описывает оптимизированный пошаговый процесс для выделения крипт и iMSC из одного и того же джеюнального сегмента поросят. Метод использует диссоциационный буфер на основе этиледиаминететрауксусной кислоты/дитиотрейтола (ЭДТА/ДТТ) для освобождения крипт, а затем внеклеточного матрикса с помощью коллагеназы/диспазы для выделения iMSC. Этот подход минимизирует пространственные вариации в изолированных клетках. Изолированные крипты были успешно культивированы и сформировали типичные расширяющиеся двумерные (2D) энтероидные монослои на покрытых гидрогелем коллагеном пластинах. Культивируемые iMSC прилипали к колбам культуры и экспрессировали стромальные маркеры, такие как рецептор фактора роста альфа (PDGFRα) и кластер дифференцировки 81 (CD81), определённые методом иммунного окрашивания. В целом, этот оптимизированный протокол изоляции даёт как эпителиальные, так и стромальные клетки из одного и того же джеюнального сегмента поросят, что обеспечивает воспроизводимую основу для будущих исследований с участием кишечных органоидов и ко-культурных систем iMSC с целью выяснения механизмов, контролирующих эпителиально-стромальные взаимодействия у свиней — трансляционно значимая модель для воспроизведения человеческой физиологии и развития животных.
Введение
Кишечный эпителий — это динамическая ткань, которая проходит непрерывное самообновление и дифференциацию для поддержания гомеостаза кишечника и облегчения регенерации после поврежденийслизисты 1,2. Кишечные эпителиальные клетки происходят из кишечных стволовых клеток (ISC) и взаимодействуют с различными факторами микросреды 3,4,5,6,7,8. Субэпителиальные компартменты, главным образо....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Отрезок диаметром 5 см был рассечен из вырезанного проксимального ежуна 21-дневных поросят, содержащихся в свиноводческом комплексе Университета Мэриленда в Колледж-Парке. Процедура (R-JUN-22-30), использовавшаяся для жертвоприношения поросёнка, соответствовала рекомендациям по уходу за животными и политике использования, одобренным Институциональным комитетом по уходу и использованию животных университета. Перед переходом к этапам изоляции изложение протокола представлено на рисунке 1, а список реагентов и оборудования, используемых для последовательной изоляции свино-кишечных крипт и iMSC, приведён в
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Во время эпителиальной диссоциации этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) хелатирует ионы кальция, нарушая кальциевые сцепления, зависящие от кальция, в то время как дитиотрейтол (DTT) разрывает дисульфидные связи в муциновых гликопротеинах для облегчения слизи. Таким образом, совместное использование хелатирующего соединения (ЭДТА) и восстановительного агента (ДТТ) обеспечивает эффективное освобождение криптов из эпителиальной мембраны без нарушения структуры внеклеточного матрикса (ЭКМ) 2.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Выделение кишечных крипт и iMSC из одного и того же свиновидного джеюнального сегмента предлагает новый подход к сохранению специфических клеточных и функциональных характеристик сегмента ткани. Это крайне важно, поскольку кишечные ткани обладают региональной и пространственной идентичностью, что было показано в предыдущих исследованиях насвиньях 2,36,37,38. Пр.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Авторы выражают признательность финансовой поддержки от Программы конкурсных грантов MAES в Университете Мэриленда, Колледж-Парк, США.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| 0,5M EDTA | Promega | PR-V4231 | |
| 1 M буфера HEPES | ThermoFisher | 15630080 | Для подготовки гидрогелевых пластин коллагена |
| Наконечники пипетов 1000 мкл | Alkali Scientific FT1000 | 104027-530 | |
| 10x PBS | Инвитроген | AM9624 | Для подготовки гидрогелевых пластин коллагена |
| 1N гидроксид натрия | Термо | SS266-1 | Для подготовки гидрогелевых пластин коллагена |
| 1x HBSS | ThermoFisher | 14025092 | |
| 1X PBS | Хиклон | SH30256FS | |
| 4 % параформальдегид (PFA) | ThermoFisher | AAJ61899AK | |
| Конические трубки объемом 50 мл | ThermoFisher | 12-565-271 | |
| 6 скважинных плит | Фишербранд | FB012927 | |
| 7,5% раствор бикарбоната натрия | Корнинг | MT25035CI | Для подготовки гидрогелевых пластин коллагена |
| Advance DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| Alexa Fluor плюс 647 | Инвитроген | A32728 | Вторичные антитела |
| Alexa плюс 555 - A32732 | Инвитроген | A32732 | Вторичные антитела |
| Алюминиевая фольга | Рейнольдс | https://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1 | |
| АНТИ-АНТИ | Gibco | 15240096 | |
| B27 | ThermoFisher | 12587010 | |
| BSA | Фишербранд | BP1600-100 | |
| CD81 | Proteinintech | 66866-1-ig | Первичное антитело |
| Вода сорта клеточной культуры | Хиклон | SH30529FS | Для подготовки гидрогелевых пластин коллагена |
| Коллаген, тип 1 | Корнинг | 356236 | Для подготовки гидрогелевых пластин коллагена |
| Коллагеназа IV | Gibco | 17104019 | |
| Петри-тарелка Corning 100 мм | Корнинг | 07-202-011 | |
| Криоконсервационные среды криосторных клеток | Технологии стволовых клеток | 7930 | |
| криовиальная для клеток | Фишербранд | 1050026 | |
| Разбавитель антител Dako | Dako/Agilent | Номер части: S302283-2 | Первичный разбавитель антител |
| Люминесцентные монтажные носители Dako | Dako/Agilent | Номер части: S302380-2 | |
| DAPI | Promocell/VWR | 10180-470 | ДНК-окрашивание |
| Dispase II | Рош | 4942078001 | |
| DMEM, высокий уровень глюкозы | Корнинг | MT10013CV | |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| EGF | Peprotech | 315-09 | |
| FBS (HI) | Avantor | 1300-500H | |
| Гастрин | Anaspec | AS-64149 | |
| Гентамицин | MP Biomedicals | ICN1676045 | |
| GlutaMax | ThermoFisher | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher | 15630-080 | |
| Перевёрнутый флуоресцентный микроскоп | Nikon | Затемление Ti2 | Флуоресцентная визуализация |
| Инвертированный фазово-контрастный микроскоп | Nikon | Eclipse TS100 | Для культивированных клеток — визуализация |
| Продвинутый набор для синтеза cDNA iScript | Био-Рад | 1725038 | Комплект RT-PCR |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Био-Рад | 1725122 | Комплект qPCR |
| Условные носители LWRN | ATCC | CRL-3276 | Материалы LWRN были подготовлены внутри компании в соответствии с процедурой ATCC |
| N-ацетилцистеин | Биография MP | 194603 | |
| Спектрофотометр Nanodrop 2000 | ThermoFisher | ND 2000 | |
| Никотинамид | Sigma | N0636-100G | |
| Оптические пластины с 384 лунками и штрихкодом | Прикладные биосистемы | 4483285 | Комплект qPCR |
| PDGFR и альфа; | Abcam | AB230457 | Первичное антитело |
| Простагландин E2 (PGE2) | Cayman Chemical | 14010 | |
| QuantStudio 5 | Прикладная биосистема | A28570 | Инструмент qPCR |
| SB202190 | Лаборатории LC | S-1700 | |
| Стереомикроскоп | Nikon | SMZ745 | |
| Колба T 75 | Фишербранд | FB012937 | |
| Triton X100 | Фишербранд | PI85111 | |
| Тризольный реагент | Инвитроген | 15596026 | |
| Tween 20, 100% неионный моющее средство | Био-радиация | 1706531 | |
| Y27632 | ApexBio | A3008-200 |
Ссылки
- Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: New insights into intestinal stem cells. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (1), 19-34 (2019).
- Yin, L., et al. Changes in progenitors and differentiated epithelial cells of neonatal piglets. Anim Nutr....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
Теги
