Method Article

Оптимизированная последовательная изоляция крипт и мезенхимальных стромальных клеток из ткани свининого кишечника

DOI:

10.3791/69429

⸱

December 19th, 2025

 , 
1Department of Animal and Avian Sciences, University of Maryland

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этом исследовании представлен поэтапный протокол для последовательного выделения кишечных крипт и кишечных мезенхимальных стромальных клеток (iMSC) из свиномолочной ткани. Метод генерирует двумерные энтероидные монослои и iMSC, подходящие для разработки воспроизводимых, физиологически значимых моделей эпителиально-стромальной кокультуры, чтобы исследовать клеточные перекрёстные контакты во время гомеостаза и регенерации кишечника.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кишечный эпителий тесно взаимодействует с подлежащими мезенхимальными стромическими клетками кишечника (iMSC), регулируя развитие, гомеостаз и регенерацию. Однако стандартизированные методы последовательного выделения как эпителиальных, так и стромальных фракций из свиновидной ткани ограничены. Этот протокол описывает оптимизированный пошаговый процесс для выделения крипт и iMSC из одного и того же джеюнального сегмента поросят. Метод использует диссоциационный буфер на основе этиледиаминететрауксусной кислоты/дитиотрейтола (ЭДТА/ДТТ) для освобождения крипт, а затем внеклеточного матрикса с помощью коллагеназы/диспазы для выделения iMSC. Этот подход минимизирует пространственные вариации в изолированных клетках. Изолированные крипты были успешно культивированы и сформировали типичные расширяющиеся двумерные (2D) энтероидные монослои на покрытых гидрогелем коллагеном пластинах. Культивируемые iMSC прилипали к колбам культуры и экспрессировали стромальные маркеры, такие как рецептор фактора роста альфа (PDGFRα) и кластер дифференцировки 81 (CD81), определённые методом иммунного окрашивания. В целом, этот оптимизированный протокол изоляции даёт как эпителиальные, так и стромальные клетки из одного и того же джеюнального сегмента поросят, что обеспечивает воспроизводимую основу для будущих исследований с участием кишечных органоидов и ко-культурных систем iMSC с целью выяснения механизмов, контролирующих эпителиально-стромальные взаимодействия у свиней — трансляционно значимая модель для воспроизведения человеческой физиологии и развития животных.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Кишечный эпителий — это динамическая ткань, которая проходит непрерывное самообновление и дифференциацию для поддержания гомеостаза кишечника и облегчения регенерации после поврежденийслизисты 1,2. Кишечные эпителиальные клетки происходят из кишечных стволовых клеток (ISC) и взаимодействуют с различными факторами микросреды 3,4,5,6,7,8. Субэпителиальные компартменты, главным образом пластинка propria и muscularis mucosa, состоят из различных клеточных популяцийразных линий 9. Среди этих популяций клеток кишечные мезенхимальные стромальные клетки (iMSC), включая фибробласты и миофибобласты, производят трофические и факторы роста, которые модулируют ствол, пролиферацию и дифференцировку ISC для регулирования эпителиального гомеостаза и регенерации 6,7,10,11.

Для изучения этих клеточных взаимодействий недавние исследования разработали новые подходы для выявления возможных механизмов действия, которые управляют перекрёстными контактами эпителиальных клеток кишечника и iMSC. Кокультурные системы, объединяющие органоиды со стромовыми или иммунными клетками, продвинули наше понимание взаимодействия эпителиев-субэпителиальных клеток в процессе развития, регенерации, скрининга лекарств и моделирования заболеваний 12,13,14,15,16,17. Однако большинство исследований органоидных кокультур использовали мышиные ткани, которые часто не могут эффективно имитировать физиологию и фенотипы заболеваний человека, что ограничивает их клиническуютрансляционную значимость 18.

В большинстве протоколов изоляции мышиного кишечника эпителиальные и стромальные клетки получаются из отдельных сегментов ткани, что может давать образцы с немного отличающимися характеристиками, что потенциально влияет на воспроизводимость вэкспериментах 19,20. В настоящее время не существует стандартизированных оптимизированных протоколов для выделения крипт и iMSC свининого кишечника из одного образца ткани. Кроме того, практические ограничения в получении подходящих образцов кишечника человека заставили многих исследователей полагаться на несовпадающие типы клеток из разных органов (например, человеческие энтероиды с кожными фибробластами) для оценки перекрёстного взаимодействия эпителиально-мезенхимальных клеток, что потенциально запутывает интерпретацию данных 21,22,23.

Хотя недавно опубликованный протокол биопсии кишечника у человека выделял крипты и получил фибробласты путём роста из оставшейся ткани, истощённой эпителием, аналогичные стандартизированные подходы отсутствуют усвиней 24. Свиньи используются как подходящая животная модель для трансляционных исследований из-за их анатомического и физиологического сходства с людьми 2,18,25,26,27,28,29. Таким образом, этот метод представляет собой последовательный протокол изоляции, который восстанавливает кишечные крипты и iMSC из одного и того же свиноголового сегмента на основе физиологической, анатомической и морфологической структурыкишечника 4,30. Процедура обеспечивает воспроизводимую основу для изоляции как крипт, так и iMSC, подходящих для будущих исследований ко-культуры свининого кишечника.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Отрезок диаметром 5 см был рассечен из вырезанного проксимального ежуна 21-дневных поросят, содержащихся в свиноводческом комплексе Университета Мэриленда в Колледж-Парке. Процедура (R-JUN-22-30), использовавшаяся для жертвоприношения поросёнка, соответствовала рекомендациям по уходу за животными и политике использования, одобренным Институциональным комитетом по уходу и использованию животных университета. Перед переходом к этапам изоляции изложение протокола представлено на рисунке 1, а список реагентов и оборудования, используемых для последовательной изоляции свино-кишечных крипт и iMSC, приведён в Таблице материалов.

1. Этап подготовки до изоляции

  1. Подготовьте 30 мл буфера для промывания на 5 см сегмента ткани в конических трубках по 50 мл.
  2. Регулируйте объём в зависимости от количества взятых образцов тканей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте Таблицу 1 для состава буфера для мойки. Все этапы подготовки тканей и выделения клеток проводятся на столе.

2. Стадия подготовки кишечной ткани

  1. Поместите вырезанную кишечную ткань в 30 мл буфера для промывки в конических трубках объёмом 50 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вырезанные салфетки можно поместить в буфер для холодной стирки на час перед использованием.
  2. Промыйте салфетку на 3× охлаждённым буфером для стирки с помощью шприца на 21 G, чтобы удалить содержимое светильника.
  3. Положите ткань на стерилизованную пену из полистирола и аккуратно удалите брыжейную и жировую ткани из серозы.
  4. Вскрытие ткани продольно с помощью хирургического лезвия для открытия просвета (рисунок 2A).
  5. Переложите частично очищенную вскрытую ткань в свежий буфер и промывайте дважды, или пока буфер не станет прозрачным.
  6. Положите салфетку в буфер для промывания в чашке Петри диаметром 100 мм и нарежьте её на кусочки 10-15 мм с помощью нового хирургического лезвия (рисунок 2B,C). Этот этап увеличивает площадь поверхности, подвергаемую буферу расщепления.
  7. Перенесите измельченную ткань в новую коническую трубку объёмом 50 мл.
  8. Аккуратно стирайте буфером для стирки и дайте нарезанной ткани осесть под действием силы тяжести примерно 30 секунд (рисунок 2D).
  9. Аккуратно аспирируйте супернатант, оставляя только столько буфера, чтобы покрыть ткани в конической трубке.
  10. Стадия эпителиальной диссоциации
    1. Добавьте 30 мл предварительно нагретого буфера для диссоциации эпителия (Таблица 2) и инкубируем 20-30 минут при 37 °C в статической ванне с шариками или в трясущейся водяной бане при примерно 9 × г.
    2. Аккуратно встряхивайте трубку каждые 15 минут, чтобы увеличить выход крипт из эпителиальной мембраны.
    3. Дайте ткани осесть и аккуратно аспирировать супернатант серологической пипеткой, оставив только достаточно буфера для покрытия оседлой ткани в конической трубке.
    4. Добавьте 30 мл свежего буфера для мытья в оседшую ткань и энергично встряхните, чтобы освободить ворсинки, склепы и мусор (рисунок 3A). Дайте остаткам ткани осеть, затем аккуратно декантуйте буферный супернатант промывки, содержащий подвешенные сегменты крипты, через 100-мкм клеточное сито в новую коническую трубку объёмом 50 мл.
      1. Повторите процесс добавления свежего буфера для промывки в оставшуюся ткань и декантирования три раза (3×). Пипетте 10 мкл буфера для мытья, содержащего крипты, в чашку Петри диаметром 100 мм и изучите плотность крипты под стереомикроскопом.
        ПРИМЕЧАНИЕ: После каждой мойки храните буфер с криптами.
    5. После третьей промывки буфер с криптами должен быть чистым и с минимальным количеством мусора (рисунок 3B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки ткани с внеклеточным матриксом (ЭКМ) храните в конической трубке для последующего процесса изоляции с помощью iMSC.
    6. Центрифугуйте подвеску крипты при 150 × г в течение 2 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать фрагменты крипты.
    7. Аспирируйте и переподвесьте гранулу крипты в эпителиальной культурной среде.
    8. Снова центрифугуйте подвешенные крипты при 150 × г в течение 2 минут, чтобы собрать осколки склепа.
    9. Добавьте эпителиальную культурную среду для повторного подвески крипт и пипетки 5× используя наконечник пипетки объёмом 1000 мкл.
    10. Посеять примерно 100 ресуспензированных крипт на заранее подготовленные коллагеновые гидрогелевые пластины типа 1 с шестью колодцами, чтобы культивировать и расширить крипты в двумерные (2D) энтероидные монослои.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте подготовку пластин с гидрогелем с коллагеном в таблице 3. Итоговая концентрация коллагена типа 1 должна составлять 1,0 мг/мл. Избегайте покрытия чрезмерно плотными криптами или фрагментами мусора, чтобы предотвратить загрязнение дрожжами или грибками. Антибиотико-антимикотик (анти-анти) в буфере и посевной среде должен обеспечивать защиту.
    11. Изучить клетки под инвертированным фазово-контрастным микроскопом перед инкубацией при 37 °C в увлажнённом инкубаторе с 5%CO2 .
    12. Замените посевную среду в течение 12 часов после посева, чтобы удалить плавающий мусор и снизить бактериальное загрязнение.
    13. Выращивайте энтероиды с помощью эпителиальной культурной среды (Таблица 4) и заменяйте среду через день примерно до 8-го дня, когда расширенные двумерные монослои достигнут ≥85 % слияния для субкультуры.
  11. Стадия диссоциации внеклеточного матрикса
    ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжайте процесс изоляции с оставшимися фрагментами ткани, содержащими внеклеточный матрикс в конической трубке (рисунок 3C и рисунок 4A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя ЭДТА в буфере эпителиальной диссоциации может подавлять активность коллагеназы, предыдущие три этапа промывания удаляют весь ЭДТ и ДТТ. Таким образом, активность коллагеназы не должна подвергаться влиянию в последующем процессе.
    1. Оставшуюся ткань снова измельчите на мелкие кусочки, прежде чем изолировать iMSC в пластинке проприи.
    2. Добавьте 25 мл внеклеточного буфера для пищеварения (Таблица 5) в ткань и инкубировать в статической ванне из шариков в течение 15-20 минут при 37 °C (рисунок 4B).
    3. После инкубации сильно встряхивайте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант станет мутным, с меньшим количеством плавающих фрагментов ткани. Пипетта 10 мкл супернатанта под инвертированным микроскопом для изучения плотности iMSC в супернатанте. Продолжайте инкубацию ткани в бисерной бате ещё 15 минут, если наблюдаемая плотность iMSC низкая.
    4. Аккуратно декантуйте супернатант (сразу после интенсивного встряхивания на этапе 2.2.3) через сито 100 мкм в новую коническую трубку, чтобы минимизировать загрязнение.
    5. Центрифугуйте суспензию ячейки при 280 × г в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы пеллетировать iMSC.
    6. Аспирируйте супернатант и ресуспендуйте iMSC в мезенхимальной культурной среде (см. iMSC культурные медиа в таблице 6).
    7. Центрифугуйте вновь подвешенные iMSC при 280 × г в течение 5 минут, чтобы смыть буфер диссоциации.
    8. Аспирировать и повторно подвесить iMSC в мезенхимальной культурной среде.
    9. Поместите iMSC в колбу T75 с размером примерно 5 ×10 5 клеток на колбу.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пластинчатые клетки покрывают примерно 60% поверхности колбы, поскольку мезенхимальные клетки требуют умеренной или высокой плотности посева для оптимального роста.
    10. Замените посевную среду в течение 12 часов после нанесения пластины, чтобы удалить лишние остатки и предотвратить бактериальное загрязнение.
    11. Изучайте клетки, похожие на фибробласти, под инвертированным фазово-контрастным микроскопом на второй день после посева.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Меняйте среду мезенхимальной культуры через день. iMSC должны достигать примерно 85 % слияния и быть готовы к субкультуре к 4-му дню.

3. Иммуноцитохимический анализ

  1. Культивировать примерно 5 000 iMSC на скважину в пластине на 96 лунок с мезенхимальной культурной средой в течение 2-3 дней, пока клетки не достигнут примерно 80% слияния.
  2. Аккуратно аспирируйте среду и дважды промывайте культивированные iMSC 100 мкл 1× PBS на скважину при комнатнойтемпературе 31. Все ссылки на наборы для окрашивания иммунокраски приведены в Таблице материалов.
  3. Добавьте 100 мкл 4% параформальдегида (PFA) на каждую скважину для фиксации культивированных iMSC и инкубируйте на статическом столе при комнатной температуре в течение 30 минут.
  4. Промыйте фиксированные культивированные iMSC дважды с 100 мкл 0,1% Tween-20/PBS (PBST) по 5 минут каждая, а затем пропустите 100 мкл 0,5% Triton X-100/PBS в течение 30 минут.
  5. Добавьте 100 мкл 5% бычьей сывороточной альбумина (BSA)/PBST в каждую скважину, чтобы блокировать неспецифическое связывание фиксированных клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте при комнатной температуре на 1 час, после чего дважды мыть с 100 мкл PBST по 5 минут каждая.
  6. Добавьте 100 мкл разбавленных первичных антител (1:250; то есть 1 мкл первичных антител в 250 мкл разбавляющего антитела) в каждую яме и инкубируйте клетки ночью при 4 °C. Основные используемые антитела — PDGFRα и CD81.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Включайте отрицательные контрольные колодцы, добавляя только разбавляющее антитело без первичных антител.
  7. На второй день смойте первичные антитела дважды 100 мкл PBST по 5 минут каждое.
  8. Разбавить вторичные антитела в 1× PBS с использованием следующих соотношений: Alexa Fluor Plus 555 (1 мкл:100 мкл), Alexa Fluor Plus 647 (1 мкл:100 мкл) и DAPI (1 мкл:800 мкл).
  9. Контрокрашивание клеток разбавлёнными вторичными антителами при комнатной температуре в течение 1 часа.
  10. Промывайте клетки дважды с 1× PBS по 5 минут каждая.
  11. Добавьте 100 мкл монтажного материала на каждую скважину, накройте пластину, оберните её алюминиевой фольгой и храните при 4 °C до 6 месяцев до флуоресцентной съёмки.

4. Изоляция РНК и qPCR-анализ

  1. Извлечение полной мРНК из iMSC, культивируемых в колбах T75, с использованием техники разделения кислотного гуанидиния тиоцианата-фенол-хлороформа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Определите концентрацию и чистоту РНК с помощью спектрофотометра.
  2. Обратная транскрипция полной мРНК в кДНК для использования в качестве шаблона для количественного анализа обратной транскрипционной полимеразной цепной реакции (qRT-PCR) для проверки амплификационных графиков для выбранного праймера гена Sus scrofa, GAPDH (вперед: ATCCTGGGCTACACTGAGGAC; обратная: AAGTGGGGGTTGAGGCAATG), как сообщалось в предыдущихисследованиях 2,28.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Во время эпителиальной диссоциации этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) хелатирует ионы кальция, нарушая кальциевые сцепления, зависящие от кальция, в то время как дитиотрейтол (DTT) разрывает дисульфидные связи в муциновых гликопротеинах для облегчения слизи. Таким образом, совместное использование хелатирующего соединения (ЭДТА) и восстановительного агента (ДТТ) обеспечивает эффективное освобождение криптов из эпителиальной мембраны без нарушения структуры внеклеточного матрикса (ЭКМ) 2...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Выделение кишечных крипт и iMSC из одного и того же свиновидного джеюнального сегмента предлагает новый подход к сохранению специфических клеточных и функциональных характеристик сегмента ткани. Это крайне важно, поскольку кишечные ткани обладают региональной и пространственной идентичностью, что было показано в предыдущих исследованиях насвиньях 2,36,37,38. Пр...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность финансовой поддержки от Программы конкурсных грантов MAES в Университете Мэриленда, Колледж-Парк, США.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,5M EDTAPromegaPR-V4231
1 M буфера HEPESThermoFisher15630080Для подготовки гидрогелевых пластин коллагена
Наконечники пипетов 1000 мклAlkali Scientific FT1000104027-530
10x PBSИнвитрогенAM9624Для подготовки гидрогелевых пластин коллагена
1N гидроксид натрияТермоSS266-1Для подготовки гидрогелевых пластин коллагена
1x HBSSThermoFisher14025092
1X PBSХиклонSH30256FS
4 % параформальдегид (PFA)ThermoFisherAAJ61899AK
Конические трубки объемом 50 млThermoFisher12-565-271
6 скважинных плитФишербрандFB012927
7,5% раствор бикарбоната натрияКорнингMT25035CIДля подготовки гидрогелевых пластин коллагена
Advance DMEM/F12 Gibco 12634-010
Alexa Fluor плюс 647ИнвитрогенA32728Вторичные антитела
Alexa плюс 555 - A32732 ИнвитрогенA32732Вторичные антитела
Алюминиевая фольгаРейнольдсhttps://www.amazon.com/dp/B00M8ZEAW4?ref=fed_asin_title&th=1
АНТИ-АНТИGibco15240096
B27ThermoFisher12587010
BSAФишербрандBP1600-100
CD81 Proteinintech66866-1-igПервичное антитело
Вода сорта клеточной культурыХиклонSH30529FSДля подготовки гидрогелевых пластин коллагена
Коллаген, тип 1Корнинг356236Для подготовки гидрогелевых пластин коллагена
Коллагеназа IVGibco17104019
Петри-тарелка Corning 100 ммКорнинг07-202-011
Криоконсервационные среды криосторных клетокТехнологии стволовых клеток7930
криовиальная для клеток Фишербранд1050026
Разбавитель антител DakoDako/AgilentНомер части: S302283-2Первичный разбавитель антител
Люминесцентные монтажные носители DakoDako/AgilentНомер части: S302380-2
DAPIPromocell/VWR10180-470ДНК-окрашивание
Dispase IIРош4942078001
DMEM, высокий уровень глюкозыКорнингMT10013CV
DTTSigma646563
EGFPeprotech315-09
FBS (HI)Avantor1300-500H
ГастринAnaspecAS-64149
ГентамицинMP BiomedicalsICN1676045
GlutaMaxThermoFisher35050061
HEPESThermoFisher15630-080
Перевёрнутый флуоресцентный микроскопNikonЗатемление Ti2Флуоресцентная визуализация
Инвертированный фазово-контрастный микроскопNikonEclipse TS100Для культивированных клеток — визуализация  
Продвинутый набор для синтеза cDNA iScriptБио-Рад1725038Комплект RT-PCR
iTaq Universal SYBR Green SupermixБио-Рад1725122Комплект qPCR
Условные носители LWRNATCCCRL-3276Материалы LWRN были подготовлены внутри компании в соответствии с процедурой ATCC
N-ацетилцистеинБиография MP194603
Спектрофотометр Nanodrop 2000ThermoFisherND 2000
НикотинамидSigmaN0636-100G
Оптические пластины с 384 лунками и штрихкодомПрикладные биосистемы4483285Комплект qPCR
PDGFR и альфа;AbcamAB230457Первичное антитело
Простагландин E2 (PGE2)Cayman Chemical 14010
QuantStudio 5Прикладная биосистемаA28570Инструмент qPCR
SB202190Лаборатории LCS-1700
СтереомикроскопNikon SMZ745
Колба T 75ФишербрандFB012937
Triton X100ФишербрандPI85111
Тризольный реагент  Инвитроген15596026
Tween 20, 100% неионный моющее средствоБио-радиация1706531
Y27632ApexBioA3008-200

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gehart, H., Clevers, H. Tales from the crypt: New insights into intestinal stem cells. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 16 (1), 19-34 (2019).
  2. Yin, L., et al. Changes in progenitors and differentiated epithelial cells of neonatal piglets. Anim Nutr. 8 (1), 265-276 (2022).
  3. Pastula, A., Marcinkiewicz, J. Cellular interactions in the intestinal stem cell niche. Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 67 (1), 19-26 (2019).
  4. Mccarthy, N., Kraiczy, J., Shivdasani, R. A. Cellular and molecular architecture of the intestinal stem cell niche. Nat Cell Biol. 22 (9), 1033-1041 (2020).
  5. Beumer, J., Clevers, H. Cell fate specification and differentiation in the adult mammalian intestine. Nat Rev Mol Cell Biol. 22 (1), 39-53 (2021).
  6. Pasztoi, M., Ohnmacht, C. Tissue niches formed by intestinal mesenchymal stromal cells in mucosal homeostasis and immunity. Int J Mol Sci. 23 (9), 5181(2022).
  7. Kraiczy, J., et al. Graded BMP signaling within intestinal crypt architecture directs self-organization of the Wnt-secreting stem cell niche. Cell Stem Cell. 30 (4), 433-449 (2023).
  8. Niec, R. E., et al. Lymphatics act as a signaling hub to regulate intestinal stem cell activity. Cell Stem Cell. 29 (7), 1067-1082 (2022).
  9. Paerregaard, S. I., et al. The small and large intestine contain related mesenchymal subsets that derive from embryonic gli1(+) precursors. Nat Commun. 14 (1), 2307(2023).
  10. Maimets, M., et al. Mesenchymal-epithelial crosstalk shapes intestinal regionalisation via Wnt and Shh signalling. Nat Commun. 13 (1), 715(2022).
  11. Ayansola, H., Mayorga, E. J., Jin, Y. Subepithelial stromal cells: Their roles and interactions with intestinal epithelial cells during gut mucosal homeostasis and regeneration. Biomedicines. 12 (3), 668(2024).
  12. Wang, Y., et al. Long-term culture captures injury-repair cycles of colonic stem cells. Cell. 179 (5), 1144-1159 (2019).
  13. Xia, X., et al. Mesenchymal stem cells promote healing of nonsteroidal anti-inflammatory drug-related peptic ulcer through paracrine actions in pigs. Sci Transl Med. 11 (516), eaat7455(2019).
  14. Zhang, W., et al. Dietary calcium and phosphorus amounts affect development and tissue-specific stem cell characteristics in neonatal pigs. J Nutr. 150 (5), 1086-1092 (2020).
  15. Zhou, J. Y., et al. Zinc l-aspartate enhances intestinal stem cell activity to protect the integrity of the intestinal mucosa against deoxynivalenol through activation of the Wnt/beta-catenin signaling pathway. Environ Pollut. 262, 114290(2020).
  16. Yang, S., et al. Organoids: The current status and biomedical applications. MedComm (2020). 4 (3), e274(2023).
  17. Zhao, Z., et al. Organoids. Nat Rev Methods Primers. 2 (1), 94(2022).
  18. Gonzalez, L. M., Moeser, A. J., Blikslager, A. T. Porcine models of digestive disease: The future of large animal translational research. Transl Res. 166 (1), 12-27 (2015).
  19. Nieuwenhuis, T. O., et al. Patterns of unwanted biological and technical expression variation among 49 human tissues. Lab Invest. 104 (6), 102069(2024).
  20. Pastula, A., et al. Three-dimensional gastrointestinal organoid culture in combination with nerves or fibroblasts: A method to characterize the gastrointestinal stem cell niche. Stem Cells Int. 2016, 3710836(2016).
  21. Kraski, A., et al. Structured multicellular intestinal spheroids (SMIS) as a standardized model for infection biology. Gut Pathog. 16 (1), 47(2024).
  22. Darling, N. J., Mobbs, C. L., Gonzalez-Hau, A. L., Freer, M., Przyborski, S. Bioengineering novel in vitro co-culture models that represent the human intestinal mucosa with improved Caco-2 structure and barrier function. Front Bioeng Biotechnol. 8, 992(2020).
  23. Freer, M., Cooper, J., Goncalves, K., Przyborski, S. Bioengineering the human intestinal mucosa and the importance of stromal support for pharmacological evaluation in vitro. Cells. 13 (22), 1859(2024).
  24. Meran, L., Tullie, L., Eaton, S., De Coppi, P., Li, V. S. W. Bioengineering human intestinal mucosal grafts using patient-derived organoids, fibroblasts and scaffolds. Nat Protoc. 18 (1), 108-135 (2023).
  25. Burrin, D., et al. Translational advances in pediatric nutrition and gastroenterology: New insights from pig models. Annu Rev Anim Biosci. 8, 321-354 (2020).
  26. Lunney, J. K., et al. Importance of the pig as a human biomedical model. Sci Transl Med. 13 (621), eabd5758(2021).
  27. Barnett, A. M., et al. Porcine colonoids and enteroids keep the memory of their origin during regeneration. Am J Physiol Cell Physiol. 320 (5), C794-C805 (2021).
  28. Gonzalez, L. M., Williamson, I., Piedrahita, J. A., Blikslager, A. T., Magness, S. T. Cell lineage identification and stem cell culture in a porcine model for the study of intestinal epithelial regeneration. PLoS One. 8 (6), e66465(2013).
  29. Stieler Stewart, A., Freund, J. M., Blikslager, A. T., Gonzalez, L. M. Intestinal stem cell isolation and culture in a porcine model of segmental small intestinal ischemia. J Vis Exp. (135), e57647(2018).
  30. Meran, L., Baulies, A., Li, V. S. W. Intestinal stem cell niche: The extracellular matrix and cellular components. Stem Cells Int. 2017, 7970385(2017).
  31. Mahe, M. M., et al. Establishment of gastrointestinal epithelial organoids. Curr Protoc Mouse Biol. 3 (4), 217-240 (2013).
  32. Koliaraki, V., Kollias, G. Isolation of intestinal mesenchymal cells from adult mice. Bio-Protocol. 6 (18), 1940(2016).
  33. Chang, C. W., et al. Mesenchymal stem cell seeding of porcine small intestinal submucosal extracellular matrix for cardiovascular applications. PLoS One. 11 (4), e0153412(2016).
  34. Chen, J., et al. Human intestinal organoid-derived PDGFRα+ mesenchymal stroma enables the proliferation and maintenance of Lgr4+ epithelial stem cells. Stem Cell Res Ther. 15 (1), 16(2024).
  35. Beaumont, M., et al. Intestinal organoids in farm animals. Vet Res. 52 (1), 33(2021).
  36. Wiarda, J. E., Becker, S. R., Sivasankaran, S. K., Loving, C. L. Regional epithelial cell diversity in the small intestine of pigs. J Anim Sci. 101, skac318(2023).
  37. Vermeire, B., Gonzalez, L. M., Jansens, R. J. J., Cox, E., Devriendt, B. Porcine small intestinal organoids as a model to explore etec-host interactions in the gut. Vet Res. 52 (1), 94(2021).
  38. Wiarda, J. E., Trachsel, J. M., Sivasankaran, S. K., Tuggle, C. K., Loving, C. L. Intestinal single-cell atlas reveals novel lymphocytes in pigs with similarities to human cells. Life Sci Alliance. 5 (10), e202201442(2022).
  39. Uniken Venema, W. T. C., et al. Gut mucosa dissociation protocols influence cell type proportions and single-cell gene expression levels. Sci Rep. 12 (1), 9897(2022).
  40. Schaaf, C. R., et al. A lgr5 reporter pig model closely resembles human intestine for improved study of stem cells in disease. FASEB J. 37 (6), e22975(2023).
  41. Joo, S. S., et al. Porcine intestinal apical-out organoid model for gut function study. Animals (Basel). 12 (3), 372(2022).
  42. Gomez-Martinez, I., et al. A planar culture model of human absorptive enterocytes reveals metformin increases fatty acid oxidation and export. Cell Mol Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 409-434 (2022).
  43. Jacob, J. M., et al. Pdgfralpha-induced stromal maturation is required to restrain postnatal intestinal epithelial stemness and promote defense mechanisms. Cell Stem Cell. 29 (5), 856-868 (2022).
  44. Modina, S. C., et al. Stages of gut development as a useful tool to prevent gut alterations in piglets. Animals (Basel). 11 (5), 1412(2021).
  45. Tang, W., et al. Ileum tissue single-cell mRNA sequencing elucidates the cellular architecture of pathophysiological changes associated with weaning in piglets. BMC Biol. 20 (1), 123(2022).
  46. Dong, X., et al. Identification of optimal reference genes for gene expression normalization in human osteosarcoma cell lines under proliferative conditions. Front Genet. 13, 989990(2022).
  47. Mccarthy, N., et al. Distinct mesenchymal cell populations generate the essential intestinal BMP signaling gradient. Cell Stem Cell. 26 (3), 391-402 (2020).
  48. Mussard, E., et al. Culture of piglet intestinal 3d organoids from cryopreserved epithelial crypts and establishment of cell monolayers. J Vis Exp. (192), e64917(2023).
  49. Zhang, M., et al. Long-term expansion of porcine intestinal organoids serves as an in vitro model for swine enteric coronavirus infection. Front Microbiol. 13, 865336(2022).
  50. Benz, P., Plenge, M., Wagner, S., Mazzuoli-Weber, G. Two-dimensional porcine intestinal organoids reflecting the physiological properties of native gut. J Vis Exp. (215), e67666(2025).
  51. Lee, B. R., Ock, S. A., Park, M. R., Lee, M. G., Byun, S. J. Establishing porcine jejunum-derived intestinal organoids to study the function of intestinal epithelium as an alternative for animal testing. J Anim Reproduction Biotechnol. 39 (1), 2-11 (2024).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Crypt IsolationMesenchymal Stromal CellsPorcine Intestinal TissueSequential IsolationEDTA DTT DissociationCollagenase DigestionEnteroid MonolayersCollagen HydrogelStromal MarkersEpithelial Stromal Interactions
Video Coming Soon

Related Articles