Методическая статья

Сравнительный подход к количественному подсчету клеток в самых разных мозгах млекопитающих

DOI:

10.3791/69446

⸱

16 января 2026 г.

 ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Institute Cavalieri Ottolenghi, 2Department of Veterinary Sciences, University of Turin, 3Department of Anthropology and Center for the Advanced Study of Human Paleobiology, The George Washington University

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Современные нейронауки должны исследовать различия между многими видами, включая лабораторных грызунов и людей. Однако технические трудности возникают, когда речь идёт о крупномозговых млекопитающих. Этот подход рассматривает межвидовые вариации нейронных популяций у совершенно разных млекопитающих, что даёт сопоставимые результаты для картирования для выявления эволюционных закономерностей.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Большинство нейробиологических исследований проводится на лабораторных грызунах. Несмотря на множество сходств в мозгах млекопитающих, существуют важные различия, которые могут вводить в заблуждение в переводе. Заметные межвидовые различия были обнаружены в пластичности мозга, особенно в нейрогенезе. Различные нейрогенные процессы могут быть распространены из-за эволюционных компромиссов, проявляющих различия между структурами мозга и млекопитающих, а также изменяя потенциал пластичности у разных видов, таких как мыши и люди. Сравнение самых разных видов поднимает множество вопросов: сравнительные исследования сталкиваются с техническими трудностями при работе крупного мозга; Использование разнородных экспериментальных подходов в разных лабораториях может ограничить сравнение результатов; Гетерогенность может быть связана с разными временными процессами нейроразвития у млекопитающих, что добавляет переменные в сравнение.

Для преодоления этих ограничений был разработан подход к изучению межвидовых вариаций популяции нейронов коры II слоя у млекопитающих, сильно различающихся по размеру мозга, гиренцефалии, социоэкологической нише и возрасту. Несмотря на некоторые переменные, которые невозможно полностью стандартизировать, предлагается метод, сочетающий уменьшенную гетерогенность при сборе мозгов и создание общих анатомических структур в качестве ориентиров для проведения подсчёта клеток на соответствующих уровнях мозга. Полученные данные (например, плотность клеток) могут быть отображены на филогенетические деревья для выявления эволюционных закономерностей и анализировать на ковариацию с нейроанатомическими особенностями (например, размер мозга, площадь корковой поверхности). Этот подход продемонстрировал значительные различия в количестве незрелых нейронов коры между филогенетическими группами и выявил ковариацию с размером мозга. Метод также может использоваться для количественной оценки различий на разных этапах развития одного вида и распространяться на другие разнообразные млекопитающие и биологические процессы для картирования сопоставимых результатов, позволяющих более точно оценить различные популяции клеток в мозге взрослого человека для поддержки пластичности.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Нейронаучные исследования в основном используют инбридных мышей и крыс для передачи результатов людям. Несмотря на многочисленные молекулярные, клеточные и даже анатомические сходства, существуют и важные межвидовые различия, которые могут вводить в заблуждение при интерпретации доклиническихданных 1,2. Хотя необходимы сравнительные исследования, они затруднены техническими и практическими трудностями при работе с крупным мозгом (например, от среднего 0,5 г у мышей до 1300 г у людей; Рисунок 1A). Кроме того, разнородные экспериментальные подходы разных лабораторий могут ограничивать сравнение результатов, особенно количественных анализов, иногда вызывая споры. Это случай структурной пластичности мозга с особым вниманием к нейрогенным процессам 3,4,5 — теме, представляющей интерес для понимания нейропластичности развития и восстановлениямозга 6,7.

Недавние открытия в области пластичности мозга убедительно свидетельствуют о значительных различиях в ходе эволюции в наличии, частоте и анатомическом расположении различных типов нейрогенныхпроцессов 8. Примером служит очевидное снижение нейрогенеза, вызванного стволовыми клетками, у взрослых млекопитающих с крупным мозгом, по сравнению с лабораторнымигрызунами 5,9,10, вероятно, связано с разным расширением областей мозга и функций как адаптация к экологическимдавлениям 7,8, а также с разными временными процессами нейроразвития 11,12. Скорость нейрогенеза, по-видимому, заметно различается между мышами и людьми, что поднимает вопространсляции 13.

С другой стороны, предполагается, что новый тип «нейрогенеза без деления», представленный нейронами, заблокированными в остановке созревания (так называемые незрелые или спящиенейроны 14,15,16,17,18,19), может увеличиться от маломозговых к крупномозговым видам 20,21. Интересно, что независимая от стволовых клеток популяция незрелых нейронов расположена в коре головного мозга (место высокого порядка когнитивных функций у гиренцефальныхвидов 22,23) и далеко от канонических нейрогенных участков, которые в основном связаны с обонянием и пространственной навигацией, что сохраняет большое значение для лиссенцефалическихвидов 7,8. Эти различия между структурами мозга и видами млекопитающих выходят за рамки простого сравнительного интереса, поскольку они могут быть актуальны для трансляции, изменяя потенциал пластичности у мышей и людей. По этим причинам важно оценивать «сопоставимым образом», насколько различия отражают филогенетическую вариативность среди самых разных млекопитающих, с особым акцентом на лабораторных грызунов и приматов.

Недавно разработанный подход для изучения межвидовой вариации популяции кортикальных незрелых нейронов II слоя (cIN) у млекопитающих, сильно различающихся по размеру мозга, гиренцефалии и социоэкологическойнише 22,24,25. Этот метод основан на трёх принципах: i) рассматривать несколько (разнообразных) видов млекопитающих для параллельной обработки с использованием одних и тех же процедур; ii) минимизировать переменные, которые нельзя полностью стандартизировать в совершенно разных мозгах (процедура фиксации, послесмертный интервал, возраст), а также решать видоспецифичность антител к иммуноцитохимии с помощью широко распространённых особенностей исследуемой популяции клеток в качестве внутреннего положительного контроля; и iii) для установления соответствующих анатомических структур в качестве точок отсчёта клеток по соответствующим уровням мозга различных видов (рисунок 1B и рисунок 2). Данные, полученные (например, плотность клеток) путём подсчёта клеток, идентифицированных с хорошо установленным маркером даблкортином (DCX 15,17,26), могут быть отображены на филогенетические деревья для выявления эволюционных закономерностей и анализа на ковариацию с разными параметрами, такими как размер мозга, гиренцефалия и площадь корковой поверхности.

Рисунок 1
Рисунок 1: Обработка совершенно разных мозгов млекопитающих для оценки распределения и количества cIN в кортикальной мантии. (A) Млекопитающие, принадлежащие к разным видам и отрядам, характеризуются значительно разными размерами мозга и степенями гиренцефалии и корковой экспансии. Иконки мозга воспроизводятся по лицензии BioRender. (B) Представительные корональные срезы толуидина с синим окрашением, вырезанные из мозгов разного размера и коркового удлинения мантии. Для идентификации основных нейроанатомических структур каждого вида животных используются гистологически окрашенные серийные срезы (криостат, корональный, толщиной 40 мкм); Обратите внимание на поразительные различия в размере мозга и кортикальной периферии. Иконки животных на панели A воспроизведены с разрешения Ла Розы и др.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

Наконец, поскольку все пластические процессы обычно подвергаются постепенному снижению свозрастом 27,28 лет, ещё одной проблемой сравнительной нейропластичности является оценка различных временных процессов такого снижения, которые могут быть связаны с разными временными процессами нейроразвития у млекопитающих12,29,30. На самом деле, существование быстросозревающих (мышей) и медленно созревающих видов (приматов) — ещё одна причина, почему наиболее распространённая модельная система — лабораторная мышь — ограничена в решении задач в биомедицинских науках. Описанный здесь метод также может быть полезен для рассмотрения популяций клеток в разном возрасте на протяжении жизни каждого вида, а затем для сравнения результирующих тенденций между видами. Филогенетические вариации плотности cIN, а также различия в их сохранении на протяжении веков были обнаружены у млекопитающих с мелким и крупныммозгом 22,28.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Все процедуры с животными соответствовали соответствующим национальным и институциональным нормам. Мышиные ткани были получены в Институте нейронаук Кавальери Оттоленги (NICO), Орбассано, Италия, по разрешения Министерства здравоохранения Италии (RRID: MGI:3696370), при предоставлении лабораторий Серены Боветти и Чарльза Ривера. Обнажённые ткани кротовых крыс были собраны в Университете Куин Мэри в Лондоне (Великобритания) сразу после эвтаназии согласно Приложению 1 Закона о животных (научные процедуры) 1986 года. Эксперименты с кроликами следовали Директиве Совета Европейских сообществ 86/609/ЕС и итальянскому законодательству (DL.vo 116/92), с одобрения Министерства здравоохранения Италии (разрешение 66/99-A). Мозги овец и лошадей были получены посмертно на коммерческой бойне согласно Директиве 86/609/EEC и под постоянным ветеринарным наблюдением. Собачьи мозги были предоставлены посмертно лабораторией MarshallBio (Лион, Франция) с необходимыми разрешениями; Кошачьи мозги были собраны посмертно в Падуанском университете во время рутинных диагностических вскрытий с согласия владельца. Все процедуры соответствовали законодательству ЕС и Италии. Образцы шимпанзе были обработаны в соответствии с международными руководящими принципами Совета международных организаций медицинских наук (CIOMS) и в соответствии с разрешением Национального института здоровья — Офиса по благополучию лабораторных животных (NIH-OLAW) A5761-01 (подробности по каждому виду животных и эксперименту см. дополнительную таблицу 1 и ссылки 22,25).

1. Сбор мозгов

  1. Собирайте мозги напрямую или из других учреждений и банков тканей, но рассматривайте только все полушария. Разработайте с учреждениями наилучшую процедуру извлечения мозга из животных, чтобы снизить повреждение полушария и обеспечить минимальный послесмертный интервал (PMI, см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже) и быстрое погружение в фиксационный раствор после извлечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от чувствительности интересующего антитела обратите внимание на PMI. Учитывая высокую чувствительность даблкортина (DCX) к деградации, возьмите образцы с PMI 0-1 ч (за исключением шимпанзе, PMI до 14 ч, что, однако, не повлияло на качество окрашивания, дополнительная таблица 1).
  2. Учитывая высокую изменчивость продолжительности жизни животного, заранее определите возрастные группы, которые будут собраны среди различных млекопитающих, рассматриваемых для исследования, чтобы получить сопоставимые данные.
    1. Для этого проекта и установления сопоставимых возрастных групп проанализируйте информацию из двух баз данных по истории и разнообразию животных: AnAge — кураторской базы данных старения и жизненного цикла у животных, и Animal Diversity Web, онлайн-базы данных по естественной истории, распространению, классификации и биологии сохранения животных.
    2. Разделите продолжительность жизни животного на четыре стадии (одну допуберальную и три постпуберальной, а именно «взрослая»), начиная с классификации Американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA) для жизненных стадий усобак 31, где продолжительность жизни была разделена на шесть стадий: щенок, младший, взрослый, зрелый, пожилой и гериатрический.
    3. Сжимая пожилую и гериатрическую стадию, а также взрослую и зрелую стадии, применяйте эту терминологию: допуберативный, молодой взрослый, средний возраст и пожилый/возраст 22 лет.

2. Фиксация и обработка мозговой ткани

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры фиксации могут различаться в зависимости от размера мозга и этических соображений, касающихся некоторых видов животных (большинство крупномозговых приматов или лошадей не подвергаются перфузии и должны быть исправлены погружением в фиксирующий раствор после извлечения).

  1. Держите мозг полностью погружённым в фиксационный раствор (рекомендуется 4% параформальдегид или 10% формалина).
    ПРИМЕЧАНИЕ Время фиксации зависит от размера мозга (например, 3 недели для мозга собаки; 3 месяца для мозга лошадей, дополнительная таблица 1). Избегайте низкого или чрезмерного времени в фиксирующем растворе, чтобы сохранить целостность интересующего антигена.
  2. Разрежьте предпочтительное полушарие мозга на равные срезы (толщиной 1–1,5 см) с помощью линейки (для прямого разреза) и ножа для удара.
  3. Погрузите срезы мозга в фосфатный буфер (PB) 0,1 м (28,49 г дибазового натрия фосфата и 7,8 г натрий фосфата монобазические, растворённые в дистиллированной воде, pH 7,4) и держите их под лёгким перемешиванием на шейкере 24 часа. При необходимости (см. ПРИМЕЧАНИЕ ниже), отбросьте раствор и замените его свежим раствором PB 0,1 M, pH 7,4 на следующий день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объём и количество мытья в PB 0,1 M варьируются в зависимости от размера мозга (например, 30 минут для мышиного мозга, 3 дня для лошадиного мозга). Убедитесь, что мозг полностью погружен в PB 0,1 M и что формалин, кровь и тканевые отходы больше не присутствуют, чтобы прекратить промывку.
  4. Криозащитите срезы, погружая их в сахарозные растворы с постепенно увеличивающейся концентрацией (10%, 20%, до 30%) в PB 0,1 M, pH 7,4, и поддерживайте их в мягком перемешивании на шейкере.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объём растворов сахарозы варьируется в зависимости от размера мозга. Убедитесь, что мозг полностью погружен в растворы сахарозы и полностью погружается, прежде чем перевести их в повышенную концентрацию.

3. Разрез криостата в целом полушарии

  1. Удаляйте мозговые срезы с помощью изогнутого пинцета, чтобы избежать проблем при резке.
  2. Положите срезы в формы для встраивания, наполненные оптимальной температурой резки (OCT). Если срез не заполняет форму для встраивания, вырежьте квадратный кусок парафильма чуть больше мозгового среза и добавьте среду OCT в центр изделия, затем положите срез поверх OCT.
  3. Заморозьте лом путём погружения в 300 мл жидкого азотом охлаждённого изопентана при -50 °C, пока среда OCT не станет полностью белой. Срезы мозга можно хранить при -80 °C для длительного хранения до секционирования.
  4. Перед секционированием держите разрез мозга при -20 °C не менее 5 часов, чтобы ткани медленно и однородно достигли той же температуры, что и криостат.
  5. Разрежьте срез на серийные корональные секции толщиной 40 мкм с помощью криостата, поддерживая температурный диапазон внутри камеры от -20 °C до -25 °C.
  6. Собирайте свободно плавающие участки в пластины с 12 лунками и храните их в криопротекторном растворе (150 мл глицерина, 150 мл этиленгликоля, 150 мл дистиллированной воды и 50 мл буфера F [1,682 г моноосновного дигидрата фосфата натрия и 0,385 г гидроксида натрия, растворённого в дистиллированной воде, pH 7,4]) (1 мл/скважина или более, чтобы полностью покрыть срезы в случае крупного мозга) при -20 °C до окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы целого полушария различаются в зависимости от размера мозга. Крупные мозги (например, шимпанзе, лошади) должны быть разделены на два равных блока (дорсальный и вентральный) для обработки в криостате. В этом случае свободно плавающие секции можно собирать в две пластины по 6 колодца. Альтернативой являются сечения полушарий у крупномозговых видов с скользящим микротомом, что позволяет создавать блоки большего размера.

Рисунок 2
Рисунок 2: Обработка совершенно разных мозгов по одной и той же процедуре и работа с переменными, которые невозможно стандартизировать. В описанном выше методе все процедуры, которые можно стандартизировать, выполняются одинаково: общая фиксация, вырезание последовательных корональных срезов одинаковой толщины во всём полушарии, общие иммуноцитохимические процедуры, подсчёт клеток). Фигура создана с помощью BioRender (https://app.biorender.com/). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

4. Гистологическое окрашивание

  1. Выбирайте серийные корональные сечения (1 из 12). Чтобы получить такое расстояние, выберите все секции одной ямы из 12-ядровой пластины. Используйте их для получения полного представления всего полушария и, как справочник, для выбора корональных срезов на различных сопоставимых уровнях мозга среди различных исследуемых видов (см. раздел 5). Крепите их на 1% желатинизированных стеклах. Дайте им подсохнуть несколько часов.
  2. Приготовьте следующие растворы (150 мл/раствор): этанол 50%, 70%, 96%, 100%, ксилол и толуидин синий.
  3. Протокол окрашивания: Поместить стекла в увеличивающуюся концентрацию этанола (50%-100%), по 1 минуту каждая, при 50%-70%, по 2 минуты при 96%-100%, а затем перенести в раствор ксилола на 1 минуту.
  4. Разместите слайды в обратном порядке: раствор ксилола в течение 1 минуты, затем снижая концентрацию этанола (100%-50%), по 2 минуты каждая, по 100%-96%, по 1 минуте при 70%-50%.
  5. Поместите слайды в 150 мл дистиллированного H2O (2 минуты).
  6. Поместите стекли в раствор окрашивания Toluidine Blue (5-10 минут). После этого этапа окрашенные участки становятся тёмно-синими.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время хранения в растворах для гистологического окрашивания может различаться в зависимости от вида. Проверьте секции мозга интересующего вида, чтобы определить оптимальный протокол окрашивания.
  7. Прополосните стекли в 150 мл дистиллированногоH 2Oв течение 1 минуты.
  8. Переходите к этапу дифференцировки, помещая препараты в увеличивающиеся концентрации этанола (70%-100%) в течение 1 минуты по 70%, по 2 минуты каждая, по 96%-100%, а затем переведите в ксилольный раствор на 1 минуту 30 секунд. Во время этих этапов участки будут менять цвет с тёмно-синего на небесно-голубой.
  9. Убедитесь, что участки всё ещё влажные после последнего шага ксилола перед скользящим покрытием с помощью монтажного материала (если они высохнут, промывайте их раствором ксилола в течение 5 секунд). Затем дайте слайдам подсохнуть несколько дней.

5. Выбор уровней мозга и иммуногистохимическое окрашивание

  1. Используя гистологически окрашенные срезы, полученные в разделе 4 в качестве ориентира, определите уровни мозга в зависимости от конкретных нейроанатомических особенностей: Уровень 1 (L1) — от переднего отверстия латерального желудочка до L2; Уровень 2 (L2) — от переднего начала внутренней капсулы до L3; Уровень 3 (L3) — от переднего начала миндалины до L4; Уровень 4 (L4) — от заднего закрытия латерального желудочка к расширению, эквивалентному L2 (такое же количество серийных срезов толщиной 40 мкм; Рисунок 3).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приведённые выше нейроанатомические ссылки направлены на сравнение коры головного мозга, принадлежащих мозгу с разным размером и гиренцефалией. В зависимости от интересующей области мозга анатомические особенности, используемые в качестве ориентира, могут меняться.
  2. Выберите три равномерно расположенных корональных сечения с каждого уровня мозга.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объём каждого буфера, используемого на следующих этапах, зависит от размера мозга (например, 0,5 мл/скважина для мышиных срезов, 1,5 мл/скважина для срезов лошадей). Убедитесь, что свободно плавающие участки полностью покрыты каждым буфером.
  3. Промывайте секции три раза при PBS 0,01 м, pH 7,4, по 5 минут каждая.
  4. Инкубировать секции в эндогенном растворе блокирующей пероксидазы (0,6% H2O2, 1% Triton X-100 при 0,01 M PBS, pH 7,4; 20 мин) или провести извлечение антигена с использованием лимонной кислоты (10 мМ лимонной кислоты в дистиллированной воде с добавлением 0,05% Tween 20, pH 6,0), 5 минут при 90 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от процедуры/времени фиксации и интересующего антигена, для оптимального окрашивания может потребоваться забор антигена (буфер, температура, pH и время инкубации могут варьироваться в зависимости от интересующего антигена).
  5. Стирка снова в PBS 0.01 М, pH 7.4 (3 x 5 минутных промывки).
  6. Инкубировать срезы в блокирующем растворе (1-5% бычий сывороточный альбумин (BSA), нормальная сыворотка, 1-1,5% тритон X-100 при 0,01 млн PBS, pH 7,4; 90 минут при RT).
  7. Инкубировать срезы с раствором первичных антител (1-5% BSA, 2-3% нормальной сыворотки, 1-1,5% Triton X-100, первичные антитела в 0,01 млн PBS, pH 7,4; 48 часов при 4 °C при мягком перемешивании).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела против интересующего антигена могут давать разные результаты по качеству окрашивания при использовании в разных областях мозга и в разныхвидах 26. Необходимо сравнивать набор антител от разных производителей для выбора оптимального инструмента для различных видов, рассматриваемых для исследования (чтобы снизить вариабельность между образцами).
  8. Повторите этап мойки, описанный в шаге 5.3.
  9. Инкубировать секции с вторичным биотинилированным раствором антител (1-5% BSA, 2-3% нормальной сыворотки, 1-1,5% Triton X-100, вторичные биотинилированные антитела при 0,01 млн PBS, pH 7,4; 2 часа при RT).
    ПРИМЕЧАНИЕ Метод комплекса авидин-биотин пероксидазы используется для подсчёта клеток на нейролюциду (см. раздел 6), поскольку он даёт плотный, долговечный осадок, что позволяет фокусироваться через толщину среза во время подсчёта. Иммунофлуоресценция и конфокальный анализ также могут использоваться для проведения двойного/тройного иммунокрашивания с целью дальнейшей характеристики клеток (для протоколов см. Ref.22,25,32).
  10. Приготовьте комплекс авидин-биотин-пероксидаза с помощью доступного набора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте комплексный раствор авидин-биотин пероксидазы в Tris-HCl 0,05 М, pH 7,5 (что обеспечивает стабильный pH для формирования комплекса) не менее чем за 1 час до использования, чтобы обеспечить формирование комплекса.
  11. Стирка дважды в PBS 0,01 М, pH 7,4 (2 промывки по 5 минут) и один раз в Tris-HCl 0,05 М, pH 7,5 (5 мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку комплекс авидин-биотин-пероксидаза находится в растворе с Tris-HCl 0,05M, промывка с помощью Tris-HCl 0,05 M позволяет ткани привыкать к раствору.
  12. Инкубировать срезы в комплексе авидин-биотин-пероксидаза (1 час при RT).
  13. Стирочные секции в Tris-HCl 0,05 м, pH 7,5 (3 промывки по 5 минут).
  14. Под вытяжкой инкубировать секции в растворе окрашивания 3,3' диаминобензидина (DAB) (H2O2, DAB в Tris-HCl 0,05 M, pH 7,5) до достижения оптимального окрашивания. На этом этапе секции меняют цвет с прозрачного на коричнево-бордовый цвет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Время оптимального окрашивания зависит от анализируемого вида (например, для DCX — 2-5 минут для срезов мышей, 20-30 минут для секций лошадей). Проверяйте участки пятен каждые 2 минуты, чтобы избежать чрезмерных пятен.
  15. Участки для мойки в PBS 0,01 м, pH 7,4 (3 x 5 минут мойки).
  16. Закрепляйте секции на затворе, когда высохнут, накройте покрытие с помощью монтажного материала и дайте затворам высохнуть несколько дней.

Рисунок 3
Рисунок 3: Установление нейроанатомических уровней мозга для изучения распределения и количества нейронов DCX+ в коре мозга. Четыре соответствующие нейроанатомические структуры (переднее начало латерального желудочка [уровень 1, L1]; переднее начало внутренней капсулы [L2]; переднее начало миндалины [L3]); заднее закрытие латерального желудочка [L4]; отмечены красными кругами) были признаны для установления четырёх соответствующих «уровней мозга» от переднего до заднего у всех рассматриваемых млекопитающих, чтобы изучить число cIN в коре мозга «сопоставимым» способом. (A) Приводится пример для лабораторных грызунов (мышь слева) и приматов (шимпанзе, справа). Для подсчёта клеток по всему периметру второго слоя каждого коронального среза (всего 12 секций; красные стрелки) рассматриваются для подсчёта клеток по всему периметру слоя II каждого коронального сечения (ПРИМЕЧАНИЕ: все секции содержат неокортекс, хотя только некоторые из них также содержат палеокортекс). Этот подход направлен на то, чтобы анализы проводились на соответствующих нейроанатомических уровнях в мозге с разным размером. (B) Приводится пример идентификации первого уровня (L1) в гистологически окрашенных участках совершенно разных видов млекопитающих. Иконки мозга и животных, созданные с помощью BioRender. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой фигуры.

6. Подсчёт ячеек

  1. Откройте программное обеспечение Neurolucida на рабочей станции и поместите слайд под микроскоп с выбранной целью для подсчёта клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для подсчёта клеток DCX+ использовалась цель 20x.
  2. При низком увеличении (например, 4x) нарисуйте контур кортикального слоя II с помощью инструмента Freehand контурной линии в меню Trace программного обеспечения, чтобы получить длинный периметр (как палеокортекса, так и неокортекса).
  3. Выберите предпочтительные символы для подсчёта ячеек на панели инструментов «Маркеры», которая находится в левой части экрана. Для этого анализа дифференциально подсчитайте по две разные клетки в каждой интересуемой области (палеокортекс, неокортекс) в зависимости от их морфологии (соответствующей различным созревающим состояниям: тип 1 с малой сомой и биполярной формой, диапазон диаметра сомы 3-9 мкм; тип 2 с более крупной сомой и сложной дендритной арборизацией, диапазон диаметра сомы 9–18 мкм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого анализа на панели инструментов маркеров выбираются два разных символа/типа ячеек для каждой интересующей области. Разделение диаметра сомы на разные диапазоны крайне важно для тщательной классификации клеток без чёткой морфологии, которая может находиться в промежуточном состоянии созревания. Чтобы избежать пересчета, ячейки, вырезанные на верхней поверхности сечения, исключаются из анализа.
  4. Собрать данные для филогенетического анализа из трёх различных областей: палеокортекса, неокортекса и коры головного мозга (последняя получена путём добавления данных из палео- и неокортекса).
  5. Соберите в электронную таблицу второй периметр коркового слоя (мм), который виден на панели инструментов Contour Measurements в программном обеспечении.
  6. В той же таблице соберите количество клеток типа 1 и типа 2 (видно в панели инструментов маркеров) и общее количество клеток (полученное путём сложения клеток типа 1 и типа 2) в каждой области мозга и рассмотренном уровне мозга (три секции на уровне, всего 12 секций на образец).
  7. Используйте эти данные, чтобы получить для каждого участка в каждом регионе линейную плотность ячеек (количество ячеек/мм) и процент ячеек типа 1 и 2 (количество ячеек типа 1/типа 2 делится на общее количество ячеек и умножено на 100).
  8. Вычислите медианное значение плотности (используя функцию медианы в таблице) из 12 рассматриваемых секций/образца, чтобы графически представить линейную плотность ячеек. Используйте медиану как центральную меру, поскольку выборка на группу относительно небольшая (4 животных на группу), а некоторые группы демонстрируют асимметричное распределение (медиана меньше зависит от экстремальных значений).
  9. Вычислите процент клеток типа 1 и 2 в каждом образце (используя описанную выше формулу), а затем получите среднее значение процентов среди четырёх рассматриваемых образцов/вида (используя функцию Среднее в таблице). Далее используйте линейную плотность клеток для проведения филогенетического анализа (см. раздел 7), а общее количество клеток, подсчитанных в каждом корональном срезе, для оценки общего числа незрелых нейронов/полушарий.
  10. Используйте инструмент Freehand contour на программном обеспечении Neurolucida, чтобы провести линию по диаметру сомы перпендикулярно её основной оси. Выполняя этот шаг, вычисляйте длину диаметра не менее 100 случайно выбранных DCX-положительных (DCX+) клеток обоих типов в каждом виде (25 клеток на образец) в каждой области мозга, чтобы получить диапазон диаметров сома клеток типа 1 и 2.

7. Филогенетический анализ: генерация филогенетических деревьев

  1. Создайте список проанализированных видов в Notepad с их научными названиями, а затем загрузите его на сайт https://timetree.org/.
    ПРИМЕЧАНИЕ Научные названия можно проверить, используя сайт: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy
  2. Экспортируйте полученный файл дерева, нажав кнопку в файл Newick .

8. Филогенетический анализ: интеграция данных подсчёта в филогенетическом дереве

  1. В отдельных столбцах технического листа перечислите все проанализированные виды и соответствующие данные, с которыми должны быть сопоставлены (в данном случае: плотность клеток всей коры DCX+, неокортекс DCX+ плотность клеток и плотность клеток палеокортекса DCX+). Если на один вид доступно несколько особей, рассчитайте среднее значение медианной плотности для выбранных параметров.
  2. Скачайте программное обеспечение проекта Мескит (https://www.mesquiteproject.org/), чтобы объединить филогенетическое дерево с данными подсчёта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Это программное обеспечение требует, чтобы Java уже присутствовала на компьютере.
  3. Откройте файл Newick, ранее сохранённый Timetree, нажав на Open File. Затем выберите опцию Simple Newick/Phylip Treefile . Воспринимайте файл как текст и сохраняйте его как «.nex».
  4. На новой странице, которая открывается, выберите Taxa&Trees , затем New Three Window, и выберите With Trees from Source. В всплывающем окне выберите «Хранимое дерево» и нажмите OK. Появится новая вкладка под названием «Импортированные деревья ».
  5. Графически изменяйте филогенетическое дерево (например, шрифт, размер, ветви пропорционально длине) в разделе Отображение .
  6. Добавьте новую вкладку на Mesquite, выберите Добавить , затем новую матрицу символов и выберите количество символов (для этого исследования число = 3, что соответствует трём плотностям ячеек DCX+). Рассматривайте персонажей как непрерывные данные.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Символы представляют данные, которые должны быть сопоставлены с филогенетическим деревом.
  7. Скопируйте в эту новую вкладку данные, которые будут коррелировать с филогенетическим деревом (часть 6.4), и сохраните их.
  8. На вкладке «Импортированные деревья» выберите «Анализ:Дерево» и «Отследить историю символа» для анализа состояний предков Parsimony.
  9. Сохраните файл в формате PDF.

9. Филогенетический анализ: корреляция размера мозга и плотности клеток DCX+

  1. В ранее созданном техническом листе добавьте столбец с размером мозга для каждого вида.
  2. Вычислите естественный логарифм плотности клеток DCX+ и размера мозга.
  3. Запустите предпочитаемое статистическое программное обеспечение (https://www.statskingdom.com/linear-regression-calculator.html) и выполните простую линейную регрессию
  4. Скачайте файлы с результатами и сохраняйте остатки как новые столбцы в техническом листе.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остатки отражают отклонения точек данных от регрессионной линии.
  5. В техническом листе выберите столбец с остатками и столбец с названиями видов. Затем перейдите к вставке и выберите граф гистограммы, чтобы графически отобразить остатки.

10. Филогенетический анализ: неокортикальная экстензия и неокортикальная корреляция плотности клеток DCX+

  1. В ранее созданном техническом листе добавьте столбец с данными о площади поверхности неокортикального слоя II каждого вида и вычислите натуральные логарифмы.
  2. В статистическом ПО выполняйте простую линейную регрессию, используя значения логарифмической площади поверхности неокортикального слоя II как переменную X и плотности ячеек логарифмического неокортекса DCX+ как переменную Y.
  3. Скачайте полученные файлы и сохраните остатки в новом столбце в техническом листе, где можно создать остаточный график, как в шаге 9.5.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Клетки DCX+ в коре мозга всех изучаемых видов последовательно имеют ряд общих признаков, указывающих на существование хорошо сохранившейся популяции недифференцированных нейронов (рисунок 4A). Вкратце, они: (i) топографически расположены так, чтобы образовывать монослой вдоль кортикального слоя II; (ii) показать морфологические подтипы, описанные для различных созревающих стадий в незрелых нейронах, (a) с высокой распространённостью мелких униполярных/биполярных клеток и небольшой долей клет...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Описанный здесь метод предоставляет сопоставимые количественные данные при рассмотрении различных видов, сильно различающихся по размеру мозга и нейроанатомии. Его можно использовать для оценки согласованности клеточных популяций во всем мозге различных млекопитающих, а также для отслеживания их развития у одного вида на последующих этапах — от послеродового до старения. Она начинается с предположения, что будет задействовано относительно большое количество мозгов (целых полушарий) и вид...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Маттео Пиуматти и Кьяру Ла Розу за вклад в определение протокола, представленного здесь для незрелых нейронов коры. Работа была поддержана Fondazione CRT - Cassa di Risparmio di Torino (грант RF=2022.0618) LB; PRIN2022 (грант 2022LB4X3N) для LB; Национальный научный фонд (гранты EF-2021785, DRL-2219759) и Национальные институты здравоохранения (гранты NS092988, AG067419) для CCS.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
10% формалинСигма-ОлдричHT501128
2-метилбутан&nsp;Сигма-Олдрич320404Изопентан
3,3′-Диаминобензидин тетрагидрохлоридгидратСигма-ОлдричD5637
4% параформальдегидСигма-Олдрич441244
Бычий сывороточный альбуминСигма-ОлдричA9647
Лимонная кислота SigmaC0759
Монтант DPX для гистологииСигма-Олдрич  06522
ЭтанолMerck1.00983
ЭтиленгликольСигма-Олдрич102466
ГлицеринСигма-ОлдричG7893
Раствор перекиси водородаСигма-ОлдричH1009
Киллик — O.C.T. CompoundБиооптика  05-9801
Программное обеспечение МескитПроект МескитМескит версия 3.81 (сборка 955)
Нео-креплениеСигма-Олдрич1.09016
Фосфатный буфер (PB)нанаИзготовление на заказ
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)нанаИзготовление на заказ
Гидроксид натрияРидель-де Хаэн6213
Дибазик-дигидрат фосфата натрияСигма-Олдрич71645
Монобазовый дигидрат фосфата натрияСигма-Олдрич71500
СахарозаСигма-ОлдричS9378
Толуидин БлюСигма-Олдрич89640
Triton X-100 Сигма-ОлдричT8787
Tween 20Сигма-ОлдричP9416
VECTASTAIN Elite ABC-HRP Kit пероксидаза (стандартный)Vector LaboratoriesPK-6100
Xylol Сигма-Олдрич247642

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenowitz, E. A., Zakon, H. H. Emerging from the bottleneck: benefits of the comparative approach to modern neuroscience. Trends Neurosci. 38 (5), 273-278 (2015).
  2. Bolker, J. A. Animal models in translational research: rosetta stone or stumbling block. Bioessays. 39 (12), 1-8 (2017).
  3. Moreno-Jiménez, E. P., Terreros-Roncal, J., Flor-García, M., Rábano, A., Llorens-Martín, M. Evidences for adult hippocampal neurogenesis in humans. J Neurosci. 41 (12), 2541-2553 (2021).
  4. Sorrells, S. F., et al. Positive controls in adults and children support that very few, if any, new neurons are born in the adult human hippocampus. J Neurosci. 41 (12), 2554-2565 (2021).
  5. Simard, S., Matosin, N., Mechawar, N. Adult hippocampal neurogenesis in the human brain: updates, challenges, and perspectives. Neuroscientist. 31 (4), 141-158 (2024).
  6. Bao, H., Song, J. Treating brain disorders by targeting adult neural stem cells. Trends Mol Med. 24 (12), 991-1006 (2018).
  7. Ghibaudi, M., Zanone, A., Bonfanti, L. Brain structural plasticity in large-brained mammals: not only narrowing roads. Neural Regen Res. 21 (5), 1669-1680 (2026).
  8. Bonfanti, L., La Rosa, C., Ghibaudi, M., Sherwood, C. C. Adult neurogenesis and "immature" neurons in mammals: an evolutionary tradeoff in plasticity. Brain Struct Funct. 229 (8), 1775-1793 (2024).
  9. Paredes, M. F., Sorrells, S. F., Garcia-Verdugo, J. M., Alvarez-Buylla, A. Brain size and limits to adult neurogenesis. J Comp Neurol. 524 (3), 646-664 (2016).
  10. Parolisi, R., Cozzi, B., Bonfanti, L. Humans and dolphins: decline and fall of adult neurogenesis. Front Neurosci. 12, 497(2018).
  11. Snyder, J. S. Recalibrating the relevance of adult neurogenesis. Trends Neurosci. 42 (3), 164-178 (2019).
  12. Bonfanti, L., Charvet, C. J. Brain plasticity in humans and model systems: advances, challenges, and future directions. Int J Mol Sci. 22 (17), 9358(2021).
  13. Duque, A., Arellano, J. I., Rakic, P. An assessment of the existence of adult neurogenesis in humans and value of its rodent models for neuropsychiatric diseases. Mol Psychiatry. 27, 377-382 (2022).
  14. Gómez-Climent, M. A., et al. A population of prenatally generated cells in the rat paleocortex maintains an immature neuronal phenotype into adulthood. Cereb Cortex. 18 (10), 2229-2240 (2008).
  15. Rotheneichner, P., et al. Cellular plasticity in the adult murine piriform cortex: continuous maturation of dormant precursors into excitatory neurons. Cereb Cortex. 28 (7), 2610-2621 (2018).
  16. Sorrells, S. F., et al. Immature excitatory neurons develop during adolescence in the human amygdala. Nat Commun. 10 (1), 2748(2019).
  17. La Rosa, C., Parolisi, R., Bonfanti, L. structural plasticity: from adult neurogenesis to immature neurons. Front Neurosci. 14, 75(2020).
  18. Bonfanti, L., Seki, T. The PSA-NCAM-positive "immature" neurons: an old discovery providing new vistas on brain structural plasticity. Cells. 10 (10), 2542(2021).
  19. Benedetti, B., Couillard-Després, S. Why would the brain need dormant neuronal precursors. Front Neurosci. 16, 877167(2022).
  20. Luzzati, F., Bonfanti, L., Fasolo, A., Peretto, P. DCX and PSA-NCAM expression identifies a population of neurons preferentially distributed in associative areas of different pallial derivatives and vertebrate species. Cereb Cortex. 19 (5), 1028-1041 (2009).
  21. Palazzo, O., La Rosa, C., Piumatti, M., Bonfanti, L. Do large brains of long-living mammals prefer non-newly generated, immature neurons. Neural Regen Res. 13 (4), 633-634 (2018).
  22. La Rosa, C., et al. Phylogenetic variation in cortical layer II immature neuron reservoir of mammals. Elife. 9, e55456(2020).
  23. Sherwood, C. C., Gómez-Robles, A. Brain plasticity and human evolution. Annu Rev Anthropol. 46, 399-419 (2017).
  24. Piumatti, M., et al. Non-newly generated, "immature" neurons in the sheep brain are not restricted to cerebral cortex. J Neurosci. 38 (4), 826-842 (2018).
  25. Pattaro, A., et al. Phylogenetic variation of layer II cortical immature neurons in dog and horse confirms covariance with brain size and neocortical surface. Brain Struct Funct. 230 (6), 115(2025).
  26. Ghibaudi, M., et al. Consistency and variation in doublecortin and Ki67 antigen detection in the brain tissue of different mammals, including humans. Int J Mol Sci. 24 (3), 2514(2023).
  27. Ben Abdallah, N. M., Slomianka, L., Vyssotski, A. L., Lipp, H. P. Early age-related changes in adult hippocampal neurogenesis in C57 mice. Neurobiol Aging. 31, 151-161 (2010).
  28. Ghibaudi, M., et al. Age-related changes in layer II immature neurons of the murine piriform cortex. Front Cell Neurosci. 17, 1205173(2023).
  29. Workman, A. D., Charvet, C. J., Clancy, B., Darlington, R. B., Finlay, B. L. Modeling transformations of neurodevelopmental sequences across mammalian species. J Neurosci. 33 (17), 7368-7383 (2013).
  30. Charvet, C. J., de Sousa, A. A., Vassilopoulos, T. Translating time: challenges, progress, and future directions. Brain Res Bull. 221, 111212(2025).
  31. Bartges, J., et al. AAHA canine life stage guidelines. J Am Anim Hosp Assoc. 48, 1-11 (2012).
  32. Ghibaudi, M., et al. Multispecies characterization of immature neurons in the mammalian amygdala reveals their expansion in primates. PLoS Biol. 23 (8), e3003322(2025).
  33. Ghibaudi, M., Boda, E., Bonfanti, L. From mice to humans: a need for comparable results in mammalian neuroplasticity. Neural Regen Res. 20 (2), 464-466 (2025).
  34. Smulders, T. V. The relevance of brain evolution for the biomedical sciences. Biol Lett. 5, 138-140 (2009).
  35. Keck, T. Bridging theory and experiment in (statistical) learning. Curr Opin Neurobiol. 94, 103106(2025).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Comparative NeurobiologyMammalian Brain VariationCortical Immature NeuronsBrain PlasticityNeurogenesis DifferencesBrain Size ComparisonPhylogenetic AnalysisNeurodevelopmental ProcessesCell Population Quantification

Похожие статьи