Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Иммунокрашивание целого маунта яичников плода и новорождённых мышей

300 просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69455

⸱

28 апреля 2026 г.

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Syracuse University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает метод иммуномаркировки развивающихся мышиных яичников целым монтажом с применением к другим мелким тканям.

Аннотация

Яичниковый резерв состоит из яйцеклетки, доступных самке для размножения, и расположен в первичных фолликулах, каждый из которых содержит одну яйцеклетку, окружённую несколькими гранулезными клетками. Яйцеклетки изначально представляют собой первичные зародышевые клетки, которые формируются вне гонады и мигрируют к развивающемуся яичнику во время эмбрионального развития. Достигнув яичника, они превращаются в оогонии и делятся митозом с неполным цитокинезом, образуя кластеры взаимосвязанных клеток, называемые кистами зародышевых клеток. Во время кисты клетки входят в мейоз и становятся яйцеклетками. У мыши за два дня до рождения кисты начинают распадаться, и каждая яйцеклетка упаковывается в первичный фолликул. В этом процессе выживают только некоторые яйцеклетки, остальные проходят апоптоз. Регуляция разрушения кисты и формирования первичных фолликулов изучена лишь частично, и определение вовлечённых молекул имеет решающее значение для понимания этого процесса. Целостное иммунокрашивание развивающихся мышиных яичников может использоваться для определения локализации потенциальных регуляторных молекул и оценки влияния на формирование первичных фолликулов вследствие мутаций или других молекулярных изменений с помощью маркеров яйцеклетки и соматических клеток. Яичники забираются у мышей плода или новорожденных, фиксируются формальдегидом и блокируются. Затем яичники подвергаются воздействию антител против интересующего белка, а затем вторичные антитела, конъюгированные с флуоресцентной меткой, которые обнаруживают первичные антитела. В завершение яичники устанавливаются и осматриваются с помощью конфокальной микроскопии. Эта процедура может обнаруживать несколько интересующих белков и применяться к другим мелким тканям, таким как яички плода мыши.

Введение

Иммунокрашивание с целым монтажом в сочетании с конфокальной визуализацией является мощным методом анализа экспрессии белков и морфологии клеток в мелких тканях безсечения 1. В этом методе ткани сначала собираются, фиксируются и блокируются, а затем подвергаются воздействию антител против интересующих белков. Антитела либо напрямую конъюгируются с флуорофорами, либо затем маркируются вторичными антителами, конъюгированными с флюорофорами, которые распознают первичные антитела. Ткань затем инкубируется флуоресцентным красителем — 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) для визуализации клеточных ядер. Этот этап важен для обеспечения пространственной ориентации при визуализации ткани. В завершение ткань устанавливается и визуализируется с помощью конфокальной микроскопии. Другой метод, используемый для изучения морфологии тканей, включает встраивание ткани в парафин, секционирование и маркировку красителями, такими как гематоксилин и эозин, либо антителами. В качестве альтернативы можно подготовить замороженные срезы и иммунокрашивать. К сожалению, обе эти методы включают секционирование, что приводит к потере трёхмерной информации. Хотя серийные разделы могут помочь, анализ утомительен и требует просмотра большого количества разделов. Таким образом, универсальный метод крепления полезен, так как сохраняет трёхмерную структуру ткани, которую можно визуализировать с помощью оптического сечения.

Развитие первичных зародышевых клеток (ПГК) в яйцеклетки и сборка яйцеклетки в первичные фолликулы жизненно важны для женской фертильности. ПГК формируются внеэмбрионально и должны мигрировать в яичник во время эмбрионального развития. Когда ПГК прибывают в яичник, начиная примерно с эмбрионального дня (E) 10,5 у мыши, их классифицируют какоогонии 2. Оогонии проходят митоз, но с неполным цитокинезом, образуя взаимосвязанные кластеры клеток, называемые кистамизародышевых клеток 3. Оогонии входят в мейоз, начиная с E 13,5, затем становятся яйцеклетки и проходят через профазу I до стадии диплотена. По мере развития яйцеклетки кисты распадаются, позволяя каждому ооциту оказываться окружённым слоем гранулезных клеток, формируя первичные фолликулы, каждый из которых содержит диплотен-арестованный ооцит4. Происходит потеря большого количества яйцеклетки, совпадающих с распадом кисты, и считается, что это важно для контроля качества при формировании первичных фолликулов. Количество ооцитов, задержанных диплотеном, в первичных фолликулах составляет яичниковый резерв яйцеклетки, доступный для размножения, и напрямую связано с фертильностью. Если формирование фолликулов нарушено, это может привести к уменьшению резерва яичников, что ограничит репродуктивную продолжительность жизни женщин.

Иммунокрашивание целого монтажа использовалось для выявления и анализа экспрессии белков в процессе развития эмбрионального, фетального и неонатального яйцеклетки. Исследуемые молекулы включают MSY2, SYCP3, ESR1, ESR2, CYP19A1, 3βHSD, KIT и STAT3 5,6,7,8,9. Эта техника также широко применялась для выяснения, как регулируется формирование первичных фолликулов. Плодовые или неонатальные яичники культивировались и подвергались воздействию сигнальных молекул или ингибиторов. Яйцеклетки в культивируемых яичниках проходят формирование первичных фолликулов, аналогичных in vivo10. Культура яичников успешно использовалась для изучения стероидныхгормонов 6,10,11,KIT 8 и PI3K, сигнализирующих12 на этом этапе развития яичника. После посева применяется иммунокрашивание целого монтажа с использованием антител против DEAD box helicase 4 (DDX4, также известного как Mouse vasa homolog (MVH)), белка, экспрессируемого в цитоплазме яйцеклетки. Затем яичники исследуются с помощью конфокальной микроскопии для оценки формирования первичных фолликулов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

Все процедуры с использованием мышей были рассмотрены и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Сиракузского университета (IACUC). Следующий протокол предназначен для маркировки яичников новорождённых мышей на 1–5 дни после родов (см. рисунок 1 для схемы). Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Сбор и восстановление яичников

  1. Усыпить новорождённых мышей C57BL/6 в соответствии с «Руководством по уходу и использованию лабораторных животных» Национального института здравоохранения и одобренными IACUC протоколами для животных. Вскрытие яичников в 1x фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для этой процедуры неонатальные мыши были эвтаназированы путем обезглавливания, как было одобрено нашим протоколом IACUC для животных. Самцов и самок штамма мышей C57BL/6 можно отличить у новорождённых по наличию небольшого тёмного пятна между аногенитальными отверстиями у самцов. Чтобы вскрыть яичники, сначала разрежьте желудок и вычерпните кишечник. Затем откройте брюшко с разрезом по средней линии хвоста и сделайте два горизонтальных разреза. Найдите яичники под каждой почкой, изолируйте каждый яичник и очистите лишнюю ткань.
  2. Место содержит непосредственно 600 мкл 5,3% параформальдегид (PFA; 16% EM класса PFA, разбавленный в 1x PBS) (фиксированный) в микрофужной трубке при комнатной температуре (RT). Инкубировать яичники в фиксированном положении на нутаторе ночью (O/N) при 4 °C.
    ВНИМАНИЕ: Параформальдегид токсичен. Используйте в вытяжной вытяжке или хорошо проветриваемом помещении. Надевайте перчатки, защиту для глаз и защитную одежду, чтобы предотвратить контакт кожи и глаз. Утилизировать их как опасные отходы.
  3. Быстро удалите фиксированную и промывайте яичники два раза на 1 мл 0,1% Triton X-100 в 1x PBS (PT), затем один раз в 1 мл PT на нутаторе минимум 30 минут при RT. Инкубировать в 1 мл PT + 5% BSA (блокировать) минимум 30 минут на RT на нутаторе или хранить при 4 °C до 2 недель.

2. Инкубация с первичными и вторичными антителами

  1. Инкубировать первичным антителом, разбавлённым в 500 мкл PT + 5% BSA O/N при 4 °C на нутаторе. Мойте три раза за 1 мл PT + 1% BSA, 30 минут на RT на Nutator.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление зависит от антитела. Репрезентативные данные, показанные здесь, помечены DDX4 с разбавленной 1:200. Антитела против двух разных белков могут использоваться одновременно, если первичные антитела производятся у двух разных видов, а одно вторичное не вырабатывается в виде, который распознаёт другая вторичная (не используйте козьи антимышины Alexa 488 и ослы против козла Alexa 568).
  2. Во время инкубации яичников первичным антителом инкубировать разбавленные вторичные антитела щепоткой эмбрионального порошка в 500 мкл PT + 5% BSA O/N при 4 °C на нутаторе (покрытом фольгой), чтобы уменьшить неспецифическое связывание вторичного антитела. Центрифугуйте вторичное антитело при 6000 x g в течение 30 секунд, чтобы собрать остатки порошка на дне. Убедитесь, что при переносе вторичной жидкости в пробирку не набирайте этот остаток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление зависит от антитела. Представленные здесь репрезентативные данные помечены козьим противокроличьим средством Alexa 488 разбавленной 1:200.
  3. Инкубировать с предварительно абсорбированным флуоресцентным вторичным антителом (изготовленным на этапе 2.2) в течение 2–4 часов на RT на нутаторе. С этого момента накрываете фольгой. Мойте три раза за 1 мл PT + 1% BSA, 30 минут на RT на нутаторе.

3. Маркировка ядер DAPI и монтаж яичников на слайд

  1. Инкубировать в DAPI 1:1000 в PBS в течение 90 минут при RT. Промыть один раз 1 мл 1x PBS.
  2. Переносите яичники на микроскопический стекло с помощью широкого наконечника микропипетки объёмом 200 мкл. Удалите лишний PBS с помощью иглы или шприца. Добавьте 3 капли крепящего материала на яичники.
  3. Аккуратно нанесите накладку на яичники, чтобы крепящий материал распространялся по краям покрытия. Запечатайте края покрытия лаком для ногтей и дайте лаку высохнуть, затем храните при -20 °C.

4. Приготовление эмбрионального порошка

  1. Гомогенизация ~ E 12.5–E 14.5 мышиных эмбрионов в минимальном объёме ледяного объёма 1x PBS. Добавьте 4 тома ледяного ацетона, перемешайте и инкубуйте на льду в течение 30 минут.
    ВНИМАНИЕ: Ацетон горючий и раздражает глаза и кожу. Используйте в вытяжной вытяжке или хорошо проветриваемом помещении. Надевайте перчатки, защиту для глаз и защитную одежду, чтобы предотвратить контакт кожи и глаз. Утилизировать их как опасные отходы.
  2. Центрифугуйте при 10 000 г в течение 10 минут, удалите супернатант, затем промойте гранулу ледяным ацетоном и снова отверните.
  3. Разложите гранулы на листе фильтрующей бумаги, положите в пластиковый лоток и дайте высохнуть O/N в химическом капюшоне. Измельчите в мелкий порошок, дайте полностью высохнуть на воздухе и храните при -20 °C.

5. Анализ экспрессии белков с помощью конфокальной микроскопии

  1. После маркировки интересующего белка визуализируйте его с помощью конфокальной микроскопии. Для изучения экспрессии белка обычно используют 3–4 животных (6–8 яичников) и делаем несколько снимков каждого яичника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изображения, описанные в разделе с репрезентативными результатами, были получены либо на вращающемся дисковом конфокальном микроскопе, либо на конфокальном лазерном сканирующем микроскопе. Используемые параметры описаны в разделе с репрезентативными результатами и будут варьироваться в зависимости от используемого микроскопа.

6. Анализ формирования и развития первичных фолликулов с помощью конфокальной микроскопии

  1. После маркировки яичников для цитоплазматического маркера яйцеклетки, такого как DDX4, для каждого яичника случайным образом назначите две области или «ядра» для визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сердечник состоит из 4 основных оптических секций размером 212 × 212 мкм, каждый из которых разделен глубиной 15–20 мкм. Четыре оптических среза охватывают как кору, так и продолговатую область, чтобы убедиться, что все области яичника были оценены. Для каждого яичника будет 2 керна с 4 оптическими сечениями, всего 8 срезов (см. рисунок 2).
  2. После съёмки основного оптического участка для анализа возьмите Z-стек из 5 изображений сверху и 5 снизу основной секции, каждое с расстоянием 1 мкм друг от друга. Для каждого основного раздела подсчитайте общее количество яйцеклетки в секции
  3. Затем для каждого яйцеклетки в основном срезе определите, связана ли она с другой яйцеклетками, изучив основной секцию, а также стопку срезов, чтобы определить, были ли ооциты в основном сечении связаны с яйцеклетками выше или ниже плоскости фокуса. Наконец, для каждой отдельной яйцеклетки определите, на какой стадии развития фолликула она находится (первичная, первичная или вторичная).
    ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется проанализировать как минимум 4 животных (8 яичников) для получения статистически значимых данных.

7. Использование йодида пропидия в качестве альтернативного ядерного маркера

  1. После шага 2.3 инкубировать 30 минут в концентрации 0,1 мг/мл РНазы А (10 мкл по 10 мг/мл на 1 мл ПТ + 1% БСА). Удалить РНазу A и инкубировать в йодиде пропидия 10 мкг/мл (10 мкл 1 мг/мл в 1 мл PT + 1% BSA) в течение 20 минут на RT на нутаторе. С этого момента накройте трубку фольгой.
    ВНИМАНИЕ: Йодид пропидия токсичен и мутагенен. Используйте в вытяжной вытяжке или хорошо проветриваемом помещении. Надевайте перчатки, защиту для глаз и защитную одежду, чтобы предотвратить контакт кожи и глаз. Утилизировать их как опасные отходы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Toto-3 также может использоваться в качестве ядерного маркера.
  2. Удалите йодид пропидия и помойте 30 минут в 1 мл PT + 1% BSA. Пропустите шаг 3.1 (окрашивание DAPI).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

Показаны типичные результаты метода иммунокрашивки, описанного здесь. Изображения на рисунках 3, 4, 5 и 6 были сделаны на вращающемся дисковом конфокальном микроскопе с использованием масляного объектива 40x, NA 1.3, с временем экспозиции от 100 до 250 мс и мощностью лазера от 0,01 до 0,1%. На рисунке 3 новорождённые мышины...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

В этом отчёте описывается метод флуоресцентной маркировки целых яичников на наличие интересующих белков. Эта процедура широко применялась для определения экспрессии белков при формировании первичных фолликулов, а также для характеристики изменений в формировании фолликулов при различных условиях 4,5,6,7,8,9,10,11

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Визуализация проводилась в Центре визуализации Блатта при Сиракузском университете. Изображения на рисунке 7 были получены с Zeiss LSM980 с Airyscan2, поддерживаемым NIH S10 OD026946-01A1. Эта работа была поддержана грантами R03 HD102016 и R21 HD112756 от NIH (MEP).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Анти-Человеческий VASA (сделан из козьих зубов)R& DAF2030
анти-DDX4/MVH (сделано из кролика)AbcamAB13840
Анти-GCNA1/TRA98 (сделано в крысе)Abcamab82527
Бычий сывороточный альбумин (BSA)ФишерBP-1600
Обложки 22 x 22 #1.5Warner Instruments64-0721
DAPI (порошок)Сигма ОлдричD-9542Приготовьте раствор 5 мг/мл в dH2O
Область вскрытия
Alexa 568 против козла против ослаИнвитрогенA11057
Alexa 488 против мыши ОслаИнвитрогенA21202
Alexa 568 против кроликов против ослаИнвитрогенA10042
Alexa 647 против осла против кроликовИнвитрогенA31573
Alexa 488 против крыс от ослаИнвитрогенA21208
Доказательство этанола 200Pharmco111000200
Тонкие ножницы — SharpТонкие научные инструменты14060-09Для тонких работ по удалению яичников и обрезанию избыточной ткани
Щипцы (Дюмон Твизер, стиль 5)Наука об электронной микроскопии72705-01 (0209-5-PO)
Alexa 488 против козлов против кроликовИнвитрогенA11008
Микроцентрифугные трубки объёмом 1,5 млThermo Scientific3451PK
Микроскопические слайдыФишербранд12-550-123
Нутатинговый миксерLabNetS0500
Параформальдегид 16%Наука об электронной микроскопии15710
Чашки Петри размером 100 x 15 ммПроизводство биопластов940-10774
Фосфатно-буферный физиологический раствор 1X(Фишер) S271-1;                   (Сигма) P9541-500G; (Фишер) BP332-500; (Фишер) P285-500800 мл MQ H2O                            80 г NaCl                                        2.0 KCl                                                14,4 г Na2HPO4                  2,4 г KH2PO4                  Отрегулировать pH до 7,4 с помощью HCl; финальный том 1 L. Затем разбавьте с 10X до 1X для использования
Держатель значковТонкие научные инструменты26016-12держать иглу прямо, согнутой в лёгком изгибе
Наконечники фильтра пипеттOneTip(10uL) 1121-3810;                           (20 uL) 1120-1810;                   (200 uL) 1120-8810;         (1000 мкЛ XL) 1122-1830
Кончики пипетокOneTIp(10 мкЛ) 1111-3800;                   (200 uL) 1111-1800;         (1250 uL) 1112-1820
Пипетки 0.2-2, 2-20, 20-200, 100-1000Гилсон(0,1-2 мкЛ) F144054M;       (2-20 мкЛ) F144056M;     (20-200 мкЛ) F144058M;       (100-1000 мкЛ) F144059M
Йодид пропидия, 1 мг/мл в dH2OИнвитрогенP3566
Порошок RNase AСигма ОлдричRG513-50 мгПриготовьте раствор 10 мг/мл в ацетате натрия 0,1 млн (pH 5,2). Нагрейте до 100 oC в течение 15 минут. Охладите до RT и скорректируйте pH, добавив объём 0,1 M Tris-Cl (pH 7,4)
Прямая иглаПрямая игла изогнута в изгиб для отрезания избыточной ткани от яичника
Triton X-100Thermo ScientificX100-100ML
Туберкулиновый шприц 28G x 1/2Магнат/здравоохранение Кендалл Моноджект1180128012
VectashieldВекторные лабраторыиH-1900
Ножницы ВагнераТонкие научные инструменты14068-12Для обезглавливания и более крупных порезов
Кончик широкого диаметра пипетки 20 ulLabCon1026-965-008-9

Ссылки

  1. Wong, F. C. K. Whole-mount immunofluorescence staining of early mouse embryos. Methods Mol Biol. 2214, 143-155 (2021).
  2. Monk, M., McLaren, A. X-chromosome activity in foetal germ cells of the mouse. J Embryol Exp Morphol. 63, 75-84 (1981).
  3. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Female mouse germ cells form synchronously dividing cysts. Development. 125, 3323-3328 (1998).
  4. Pepling, M. E., Spradling, A. C. Mouse ovarian germ cell cysts undergo programmed breakdown to form primordial follicles. Dev Biol. 234 (2), 339-351 (2001).
  5. Burks, D. M., et al. Molecular analysis of the effects of steroid hormones on mouse meiotic prophase I progression. Reprod Biol Endocrinol. 17 (1), 105(2019).
  6. Chen, Y., Breen, K., Pepling, M. E. Estrogen regulates oocyte cyst breakdown and primordial follicle assembly via multiple pathways in the neonatal mouse ovary. J Endocrinol. 202 (3), 407-417 (2009).
  7. Dutta, S., Mark-Kappeler, C. J., Hoyer, P. B., Pepling, M. E. The steroid hormone environment during primordial follicle formation in perinatal mouse ovaries. Biol Reprod. 91 (3), 68(2014).
  8. Jones, R. L., Pepling, M. E. Kit signaling regulates primordial follicle formation in the neonatal mouse ovary. Dev Biol. 382 (1), 186-197 (2013).
  9. Murphy, K., Carvajal, L., Medico, L., Pepling, M. E. Expression of STAT3 in germ cells of developing and adult mouse ovaries and testes. Gene Expr Patterns. 5 (4), 475-482 (2005).
  10. Chen, Y., Jefferson, W. N., Newbold, R. R., Padilla-Banks, E., Pepling, M. E. Estradiol, progesterone, and genistein inhibit oocyte nest breakdown and primordial follicle assembly. Endocrinology. 148 (8), 3580-3590 (2007).
  11. Pepling, M. E., et al. Differences in oocyte development and estradiol sensitivity among mouse strains. Reproduction. 139 (2), 349-357 (2010).
  12. Burton, J. J. N., Luke, A. J., Pepling, M. E. Regulation of mouse primordial follicle formation by PI3K signaling. Biol Reprod. 106 (3), 515-525 (2022).
  13. Burry, R. W. Controls for immunocytochemistry: An update. J Histochem Cytochem. 59 (1), 6-12 (2011).
  14. Pina, R., et al. Ten approaches that improve immunostaining: advances in immunofluorescence optimization. Int J Mol Sci. 23 (3), 1426(2022).
  15. Yau, C. N., et al. Principles of deep immunohistochemistry for 3D histology. Cell Rep Methods. 3 (5), 100458(2023).
  16. Buchwalow, I. B., Böcker, W. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , Springer-Verlag. (2010).
  17. Ino, H. Antigen retrieval by heating for double-label fluorescent immunohistochemistry with identical species-derived antibodies. J Histochem Cytochem. 52 (9), 1209-1217 (2004).
  18. Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary. Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).
  19. Boateng, R., et al. Whole ovary immunofluorescence, clearing, and multiphoton microscopy for 3D analysis of the ovarian reserve in mouse. J Vis Exp. (175), e62972(2021).
  20. Folts, L., et al. Oocount: A machine-learning-based approach to mouse ovarian follicle counting and classification. Biol Reprod. 113 (5), 1083-1101 (2025).
  21. Rinaldi, V. D., Bloom, J. C., Schimenti, J. C. Whole-mount immunofluorescence and follicle quantification of cultured mouse ovaries. J Vis Exp. (135), e57593(2018).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Больше статей

Примордиальные фолликулыцисты герминативных клетокмаркеры ооцитовмаркеры соматических клетокконфокальная микроскопияяичники плода мышиформирование фолликулов

Эта статья была опубликована

Видео скоро будет доступно

Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.