Method Article

Эффективная очистка эластиновых полипептидов (ELP) из E. coli с использованием метода экстракции и осадки на основе органических растворителей

DOI:

10.3791/69465

⸱

January 9th, 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Этот протокол описывает быстрый, воспроизводимый метод экстракции и осадки на основе органических растворителей для очистки эластиноподобного полипептида (ELP) от Escherichia coli, предоставляя потенциально масштабируемую альтернативу традиционным методам очистки ELP.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эластин-подобные полипептиды (ELP) — это инженерные биополимеры, построенные на основе повторяющихся пентапептидных последовательностей, имитирующих мотивы, встречающиеся в млекопитающим тропэластине. Их уникальные характеристики делают их идеальными кандидатами для широкого спектра биомедицинских приложений — от доставки лекарств и генов до тканевой инженерии и целенаправленной молекулярной визуализации. Традиционные методы очистки при экспрессии Escherichia coli (E. coli) могут быть неэффективны для ELP из-за формирования инклюзивных тел. Другие методы, такие как обратный переходный цикл (ITC), используют свойства ELP с более низкой критической температурой раствора (LCST) для отделения её от загрязнителей, таких как липополисахариды (LPS), но обычно требуют нескольких этапов нагрева и охлаждения, которые занимают много времени и могут привести к низкому восстановлению в зависимости от последовательности, концентрации и молекулярной массы конструкции ELP. Для решения этих проблем мы разработали рабочий процесс экстракции и осадки на основе органических растворителей, который использует внутреннюю гидрофобность ELP для обеспечения быстрой, надёжной и широко применяемой очистки непосредственно из гранул клеток E. coli . В этом методе используются полярные органические растворители для облегчения разрушения клеток и избирательного растворения ELP в одном этапе. Последующий этап осадков эффективно удаляет остаточные органические растворители, примеси с низкой молекулярной массой и эндотоксины, обеспечивая высокочистый ELP с уровнем LPS ниже 1 EU/mL менее чем за 3 часа. Данные атомной силовой микроскопии свидетельствуют о том, что белки ELP-слияния, очищенные таким образом, могут самособираться в обратные мицеллоподобные структуры, сохраняющие функцию синтеза белков. Этот быстрый метод очистки предлагает исследователям простой и потенциально масштабируемый способ очистки ELP, открывая новые возможности для использования ELP и их синтезных белков как гибких строительных блоков для материалов и биомедицинских применений.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Эластин-подобные полипептиды (ELP) — это биополимеры, состоящие из повторяющихся (VPGXG)n-мотивов 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Гостевой остаток X в пентапептидном блоке может быть любой аминокислотой, отличной от пролина. Вариации X можно использовать для настройки гидрофобности, термического переходного поведения и функциональных характеристик к....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Подготовка материалов

  1. Бактериальный штамм: используйте химически компетентные клетки Escherichia coli BL21(DE3) в качестве экспрессионных хозяев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Они были выбраны из-за высокой эффективности трансформации и пригодности для производства рекомбинантного белка.
  2. Плазмида экспрессии: используйте pET21(+) вектор, кодирующий белок-слияние ELP-I-Cm2 с резистентностью к ампициллину9. Купите плазмидный вектор на addgene. Вставьте ген Cm2 с помощью сайта BsrG I в конце интеина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность плазмидной ДНК этого белка приведена в

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

После прохождения финальных этапов протокола следующим шагом является визуализация результата извлечения и осадков с помощью анализа SDS-PAGE и окрашивания по Кумасси в синем цвете. Когда перед органической экстракцией происходит лизис, должна быть заметна заметная полоса ELP. В случае ELP-I-Cm2 эта полоса имеет 100 кДа (рисунок 3A).

Скрининг различных комбинаций органических растворителей показал разную эффективность экстракции (.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ITC ранее использовался для нехроматографической очисткиELP 19; однако это может быть трудоёмкий и малоурожайный процесс. В приведённых выше методах мы описываем подход к быстрой очистке белка слияния ELP-I-Cm2, демонстрируя, как метод экстракции и осадки на основе органических растворителей может быть эффективно использован для очистки широкого спектра слияний ELP и ELP. Протокол органического растворителя не только быстрее ITC, но и гораздо эффективнее для корот.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим Институт исследований рака Университета Пердью и программу NIH CCSG (CA23168) за поддержку этой работы.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-меркаптоэтанолБио-Рад161-0710Компонент SDS-PAGE
30% акриламид/бисакриламидTCIA3218Компонент SDS-PAGE
АцетонFisher ScientificA949Органический растворитель
АцетонитрилFisher ScientificA996Органический растворитель
АмпипилинЗолотая биотехнология — золотая биотехнологияA-301-25Антибиотик
APS (персульфат аммония)Био-Рад1610700Компонент SDS-PAGE
БутанолFisher ScientificL13171Органический растворитель
EDTAБиореагенты FisherBP118-500Компонент буфера лизиса
ЭтанолDecon LabsUN1170Органический растворитель
ЭтилацетатFisher ScientificE195Органический растворитель
ГлицеринResearch Products InternationalG22020-0.5Медиакомпонент Terrific Broth (TB)
Соляная кислотаFisher ScientificA144SI-212Компонент буфера лизиса
Мгновенное пятно КумасиAbcamAB119211Компонент SDS-PAGE
IPTGЗолотая биотехнология — золотая биотехнология12481C25Компонент экспрессии белков
ИзопропанолFisher ScientificA451-1Органический растворитель
K2HPO4 (монобазичный фосфат калия)Наука Уордса470302-246Часть 2 Компонент буфера
KH2PO4 (дибазичный фосфат калия)Наука Уордса470302-254Часть 2 Компонент буфера
L-ProlineResearch Products InternationalP5200-500.0Медиакомпонент Terrific Broth (TB)
ЛизоцимЗолотая биотехнология — золотая биотехнологияL-040-1Компонент буфера лизиса
МетанолFisher ScientificA452Органический растворитель
Native Sample BufferБио-Рад161-0738Компонент SDS-PAGE
Белковая лестницаЗолотая биотехнология — золотая биотехнологияP008-500Компонент SDS-PAGE
Разрешающий гель-буферБио-Рад1610798Компонент SDS-PAGE
Содим-додецилсульфат (SDS)Thermo ScientificJ18220-36Компонент SDS-PAGE
Гидроксид натрияFisher ScientificS318-500Компонент буфера лизиса
Буфер для укладки геляБио-Рад1610799Компонент SDS-PAGE
TEMEDБио-Рад1610801Компонент SDS-PAGE
База ТрисБиореагенты FisherBP-152Компонент буфера лизиса
ТриптонResearch Products InternationalT60065-1000.0Медиакомпонент Terrific Broth (TB)
Дрожжевый экстрактResearch Products InternationalY20025-1000.0Медиакомпонент Terrific Broth (TB)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
  2. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Elastin Like PolypeptidesELP PurificationOrganic Solvent ExtractionProtein PrecipitationE Coli ExpressionInclusion BodiesEndotoxin RemovalSDS PAGE AnalysisFusion Protein ActivitySelf Assembling Nanoparticles

Related Articles