Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.

Методическая статья

Эффективная очистка эластиновых полипептидов (ELP) из E. coli с использованием метода экстракции и осадки на основе органических растворителей

2.2K просмотров

⸱

DOI:

10.3791/69465

⸱

9 января 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  , 
1Bindley Bioscience Center, Department of Chemistry, Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

В этой статье

Краткое содержание

Этот протокол описывает быстрый, воспроизводимый метод экстракции и осадки на основе органических растворителей для очистки эластиноподобного полипептида (ELP) от Escherichia coli, предоставляя потенциально масштабируемую альтернативу традиционным методам очистки ELP.

Аннотация

Эластин-подобные полипептиды (ELP) — это инженерные биополимеры, построенные на основе повторяющихся пентапептидных последовательностей, имитирующих мотивы, встречающиеся в млекопитающим тропэластине. Их уникальные характеристики делают их идеальными кандидатами для широкого спектра биомедицинских приложений — от доставки лекарств и генов до тканевой инженерии и целенаправленной молекулярной визуализации. Традиционные методы очистки при экспрессии Escherichia coli (E. coli) могут быть неэффективны для ELP из-за формирования инклюзивных тел. Другие методы, такие как обратный переходный цикл (ITC), используют свойства ELP с более низкой критической температурой раствора (LCST) для отделения её от загрязнителей, таких как липополисахариды (LPS), но обычно требуют нескольких этапов нагрева и охлаждения, которые занимают много времени и могут привести к низкому восстановлению в зависимости от последовательности, концентрации и молекулярной массы конструкции ELP. Для решения этих проблем мы разработали рабочий процесс экстракции и осадки на основе органических растворителей, который использует внутреннюю гидрофобность ELP для обеспечения быстрой, надёжной и широко применяемой очистки непосредственно из гранул клеток E. coli . В этом методе используются полярные органические растворители для облегчения разрушения клеток и избирательного растворения ELP в одном этапе. Последующий этап осадков эффективно удаляет остаточные органические растворители, примеси с низкой молекулярной массой и эндотоксины, обеспечивая высокочистый ELP с уровнем LPS ниже 1 EU/mL менее чем за 3 часа. Данные атомной силовой микроскопии свидетельствуют о том, что белки ELP-слияния, очищенные таким образом, могут самособираться в обратные мицеллоподобные структуры, сохраняющие функцию синтеза белков. Этот быстрый метод очистки предлагает исследователям простой и потенциально масштабируемый способ очистки ELP, открывая новые возможности для использования ELP и их синтезных белков как гибких строительных блоков для материалов и биомедицинских применений.

Введение

Эластин-подобные полипептиды (ELP) — это биополимеры, состоящие из повторяющихся (VPGXG)n-мотивов 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Гостевой остаток X в пентапептидном блоке может быть любой аминокислотой, отличной от пролина. Вариации X можно использовать для настройки гидрофобности, термического переходного поведения и функциональных характеристик конструкции ELP для создания модульных биосовместимых материалов, которые широко исследованы в различныхбиомедицинских приложениях 10, 11 и 12 .

Хотя химический синтез может использоваться для получения коротких пептидов, он плохо подходит для высокомолекулярных ELP или для сохранения функциональности термоядерныхбелков 13,14. По таким причинам ELP обычно экспрессируются рекомбинантно в E. coli, что позволяет производить последовательно определённое производство в больших количествах. Однако такой подход также может принести трудности. Во время экспрессии в E. coli ELP часто накапливаются в плотных инклюзивных телах, требуя эффективных стратегий восстановления для извлечения функциональногобелка 15. Кроме того, экспрессия бактерий вводит нежелательные биомолекулы, такие как белки клеток хозяина, нуклеиновые кислоты и липополисахариды (эндотоксины), которые необходимо отделить от ELP при очистке. Традиционные стратегии растворения с использованием детергентных средств (например, додецилсульфат натрия (SDS) или Triton X-100) или хаотропных агентов, таких как мочевина, имели ограниченный успех для наших последовательностей слияния ELP. По нашему опыту, тритон и мочевина не смогли извлечь ELP из фазы гранул, тогда как SDS обеспечивал частичную растворимость, но мешал очистке аффинности и был трудно полностью удален из гидрофобной последовательности ELP.

На сегодняшний день обратный переходный цикл (ITC) остаётся самым широко используемым методом очистки для ELP. Этот метод использует их поведение LCST для селективного осадка и ресолюбилизации ELP по температурным и солянымградиентам 16. Однако при белках с меньшей молекулярной массой ITC — это трудоёмкий многоступенчатый процесс, плохо подходящий для ELP, запертых в инклюзивных телах, требующий нескольких циклов ITC, что может привести к потере белка на каждомшаге 7,16.

Чтобы преодолеть эти ограничения, мы внедрили процесс экстракции и осадков на основе органических растворителей. В то время как Яхнин и др. впервые продемонстрировали гидрофобную стратегию распределения для очистки ГФП с использованием градиентов этанола исоли в 1998 году 17, разработанный нами новый метод использует смеси органических растворителей для прямого извлечения белков слияния ELP из клеток E. coli 7. Свит и др. и Дарджи и др. адаптировали этот подход к слиянию ELP, показав, что экстракция органическими растворителями обеспечивает быстрое восстановление функциональных ELP при сохранении структурной целостности ибиоактивности 8,9. Этот подход использует соникирование и органические растворители для лизирования бактериальных клеток и экстракции ELP за одну операцию, при этом большинство белков хозяина и нуклеиновых кислот осаживаются. Восстановление органической фазы, богатой ELP, за которым следует быстрое осаждение для изоляции ELP от растворителей и растворимых примесей, приводит к образованию высокочистых ELP. Этот подход также способен получить чистый ELP из гранул E. coli с уровнем эндотоксинов ниже 1 EU/mL менее чем затри часа, 7,8.

Исследования на сегодняшний день показывают, что этот метод способен очищать конструкции ELP и белки слияния ELP с разной молекулярной массой и изоэлектрической точкой без множества циклов ITC или этапов растворения (см. рисунок 1). Атомно-силовая микроскопия (AFM) и трансмиссионная электронная микроскопия (TEM) показывают, что белки ELP-fusion, очищенные таким образом, образуют обратные мицеллоподобные структуры (см. рисунок 2), что помогает сохранить структуру и функцию доменов слияния ELP при извлечении органического растворителя. Этот оптимизированный рабочий процесс позволяет быстрее и надёжнее очищать ELP для различных биомедицинскихприложений 7,8. Примечательно, что Aayush и соавторы сообщили, что ELP-конструкции, очищенные этим методом, сохраняют функцию связывания эпидермального фактора роста срецепторами 18, что подчёркивает, что этот метод не только производит чистый ELP-материал, но и поддерживает активность домена синтезного белка.

В качестве дополнительной демонстрации полезности этого метода при выделении слияния ELP-ферментов мы описываем детальный метод на основе органических растворителей для очистки конструкции мутазы ELP-Intein-Chorismate 2 (ELP-I-Cm2) (Рисунок 3). Этот метод может быть полезен для быстрой очистки других ELP для доставки лекарств и применения наноматериалов.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

1. Подготовка материалов

  1. Бактериальный штамм: используйте химически компетентные клетки Escherichia coli BL21(DE3) в качестве экспрессионных хозяев.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Они были выбраны из-за высокой эффективности трансформации и пригодности для производства рекомбинантного белка.
  2. Плазмида экспрессии: используйте pET21(+) вектор, кодирующий белок-слияние ELP-I-Cm2 с резистентностью к ампициллину9. Купите плазмидный вектор на addgene. Вставьте ген Cm2 с помощью сайта BsrG I в конце интеина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность плазмидной ДНК этого белка приведена в Дополнительном файле 1.
  3. Среда для роста: подготовка отличного бульона (ТБ) для среды массой 1200 мл
    1. Подготовьте среду (часть 1), добавив 16 г триптона, 32 г дрожжевого экстракта, 16 г пролина, 6,8 мл глицерина в 1100 мл ультрачистой воды. Тщательно перемешайте, чтобы растворить все компоненты. Отрегулируйте итоговую объёмность до 1200 мл с помощью ультрачистой воды.
    2. Подготовьте буфер с калий-фосфатом (часть 2), смешав 23,1 гKH2PO4 и 125,4 г K2HPO 4, а затем увеличите объём до 1 л с ультрачистой водой.
    3. Автоклавуйте компоненты (части 1 и 2) отдельно. После автоклава собрать носитель, разделив туберкулёзную основу на четыре аликвота по 300 мл. Добавьте 33 мл фосфатного буфера в каждый аликвот при стерильных условиях.
  4. Добавки для экспрессии
    1. IPTG: Провести индукцию с помощью IPTG при конечной концентрации 1,2 мМ (например, добавить 396 мкл 1 М IPTG к культуре 330 мл).
    2. Антибиотик: Добавьте ампициллин до конечной концентрации 100 мкг/мл для обеспечения отбора плазмид.
  5. Буфер лизиса (pH 8,5): Подготовьте буфер с использованием 10 мМ трис-основания и 22 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Регулируйте pH до 8,5 с помощью HCl или NaOH по необходимости.
  6. Органические растворители для экстракции
    1. Использовать различные органические растворители (Таблица 1) для извлечения белока слияния ELP-I-Cm2 из включающих тел. Тестируйте эти растворители как по отдельности, так и в бинарных комбинациях (1:1 vol: vol) для оценки эффективности и чистоты ELP.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все использованные растворители были HPLC-класса, кроме ацетонитрила (Optima), этанола (USP класса) и 1-Бутанала (99% чистоты).
      ВНИМАНИЕ: Все перечисленные выше растворители летучие и воспламеняющиеся. С ними нужно обращаться внутри вытяжки с химическими дымами с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (лабораторный халат, нитриловые перчатки и защита глаз). Многие виды пластиковой изделки несовместимы с органическими растворителями. Полипропиленовая пластиковая посуда настоятельно рекомендуется для экспериментов по экстракции и осадке с органическими растворителями; В противном случае пластиковая посуда должна быть протестирована без ценного образца, чтобы убедиться, что она пригодна для использования. Утилизация отходов растворителей должна соответствовать процедурам, изложенным в соответствующих институциональных политиках по опасным отходам.

2. Лизис и подготовка клеток (рисунок 4A)

  1. Ресуспензия: взвесьте 1 г клеточной гранулы и снова суспензуйте её в 4 мл свежеприготовленного лизисного буфера. Аккуратно закрутите гранулу, пока гранула не будет полностью рассеяна и смешана с буфером.
  2. Ферментативный лизис: добавьте ~5 мг лизозима для улучшения пищеварения клеточной стенки. Дайте суспензии инкубировать при 4 °C в течение 1 часа. Это способствует частичному ферментативному перевариванию, ускоряя лизис клеток.
  3. Соникация: после инкубации соникуйте образец для завершения лизиса клетки и анализа геномной ДНК. Используйте короткие серии звуковой обработки микронаконечника (устройство мощностью 350 Вт, уровень мощности 3) с интервалами для предотвращения перегрева (например, 5 с включённым/10 с выключением, повторение по необходимости). Сониковать образцы на льду и применять ультразвуковую энергию, пока не получится равномерный лизат, свободный от видимых частиц, обычно в течение примерно 5-8 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После завершения соникации храните 100 мкл аликвота образца (или лизата) для анализа экспрессии ELP, чтобы отслеживать ход очистки до и после этапов экстракции и осадки.
  4. Центрифугирование и анализ экспрессии.
    1. Очистите лизат центрифугой при 10 000 г в течение 10 минут при 20 °C, затем аккуратно отделите супернатант (растворимую фракцию) от гранулы (нерастворимую/включённую фракцию).
    2. Оценить экспрессию ELP в обеих фракциях с помощью SDS-PAGE: извлечь аликвот (например, 10-20 мкл) супернатанта и ресуспензировать эквивалентную массу гранул в лизисном буфере (50 мМ Tris-HCl pH 8,0, 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA) в тот же объём; Смешайте каждый с 4x буфером Laemmli до финального 1x, нагрейте при 95 °C в течение 5 минут и загрузите в равные количества для прямого сравнения.
    3. Если целевая ЭЛП преимущественно растворима, приступайте к экстракции органическим растворителем с использованием очищенного супернатанта. Если он преимущественно нерастворим (включающие тела), выбросьте супернатант и продолжите процесс с включением тела (промывка/растворение и экстракция), обрабатывая гранулу органическим растворителем.
  5. Промывка и сушка гранул (только для ELP в включающих телах): Инвертировать трубки центрифуг для обеспечения гравитационного дренажа остатков буфера лизиса. Когда видимая жидкость стекла (~1-2 минуты), оставьте гранулу высохнуть при комнатной температуре на 5-10 минут, убедившись, что она свободна от избытка влаги, прежде чем приступить к органической экстракции.

3. Органическая экстракция (рисунок 4B)

ПРИМЕЧАНИЕ: У каждого ELP есть своё предпочтительное условие растворителя для получения экстракций высокой чистоты (например, производительность переменного тока на рисунке 1). Поэтому следует протестировать первоначальный скрининг из 28 органических растворителей и их комбинаций, а изоляты проанализировать PAGE для определения оптимальных условий эффективности растворимости для интересующей конструкции.

  1. Скрининг на растворители. Откройте отдельные растворители, показанные на шаге 1.6, и их смеси бинарных растворителей в соотношении 1:1 (v/v). Оценивайте дополнительные смеси (например, 1:2, 2:1, 4:1) для повышения эффективности процесса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящее время нет рекомендаций по рациональному выбору наиболее эффективных растворителей или комбинаций, поэтому необходима скрининговая кампания для отбора из растворителей, которые ранее успешно растворяли гидрофобные белковые агрегаты. Окончательный выбор органического экстрактора для очистки должен основываться на анализе SDS-PAGE изолятов, полученных из этого экрана.
  2. Процедура экстракции
    1. Добавление растворителя: Добавьте 4 мл органической смеси растворителя или растворителя в высушенный на воздухе гранул/супернатант, полученный после лизиса. Для смешанных комбинаций обязательно соблюдайте точные объемные соотношения (например, по 2 мл каждого для 1:1).
    2. Вихрь: Активно подвесить суспензию в течение 1 минуты, чтобы обеспечить тщательное смешивание и проникновение растворителя в гранулу.
    3. Инкубация (время удержания): Позволить суспензии инкубировать при 20 °C в течение 5 минут, обеспечивая достаточное время взаимодействия для агрегации и осадка внеклеточных белков, пока ELP растворяются в органической фазе.
    4. Центрифугирование: центрифугировать смесь при 13 000 × г в течение 10 минут при 20 °C, чтобы отделить растворимые белки от остаточных нерастворимых остатков.
    5. Сбор супернатантов: Аккуратно собирайте супернатант, не нарушая гранулу. Супернатант содержит растворимый ELP, а гранул содержит белки клеток хозяина, нуклеиновые кислоты и липиды.
    6. Измерение объёма: Точно запишите объём восстановленного супернатанта. Следует следить за тем, чтобы супернатант был свободен от частиц гранул. Это измерение критически важно для этапа осадков вниз по потоку.

4. Осадки белков

  1. Добавление антирастворителя: Добавьте ацетон или ацетонитрил в органический супернатант в 2,33 раза больше измеренного объёма супернатанта.
  2. Инкубация: Инкубировать смесь при 20 °C в течение 5-7 минут.
  3. Центрифугирование: центрифуга при 10 000 г в течение 10 минут при 20 °C.
  4. Обращение с пеллетами: после центрифугирования аккуратно сбросьте супернатант и высушите образец на воздухе, оставив пробирку открытой под мягким струёй азота на 10-15 минут, или инкубировать, положив открытые трубки центрифуг вверх ногами на салфетки без ворса в вытяжной вытяжке на 1 час при 20 °C (не нагревайте).

5. Обращение с белковыми гранулами и ресуспензия

  1. Ресуспензия: После осаждения и высыхания на воздухе белковую гранулу суспензировать в 50 мкл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Аккуратно натирайте пипеткой вверх и вниз, чтобы пеллет полностью растворился.
  2. Хранение: Храните восстановленный суспендированный белок при -20 °C для краткосрочного и среднесрочного использования. Избегайте повторяющихся циклов замораживания и разморозки, чтобы сохранить функциональную целостность белка.

6. Валидация через SDS-PAGE

  1. Подготовка образцов: Смешайте очищенный белок с буфером загрузки SDS-PAGE 4× в соотношении 3:1 и кратковременно уведите вихрь для обеспечения однородности.
  2. Условия электрофореза: загрузите на гель SDS-PAGE с 15% для ELP-I-Cm2 и работайте при 100-120 В до тех пор, пока трекинг-краситель не достигнет дна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: % перекрёстного сшивания в геле должен основываться на размере интересующей конструкции ELP
  3. Окрашивания и визуализация: Окрашивайте гель с помощью морилки Instant Blue Coomassie или другой подходящей морилки в течение 2 часов при 20 °C. Очищайте краску, промывая деионизированной водой, пока не получится прозрачный фон. Проверьте белок, выделенный в тестах активности, чтобы подтвердить, что удержание активности произошло после процесса экстракции и очистки осадка органического растворителя.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

После прохождения финальных этапов протокола следующим шагом является визуализация результата извлечения и осадков с помощью анализа SDS-PAGE и окрашивания по Кумасси в синем цвете. Когда перед органической экстракцией происходит лизис, должна быть заметна заметная полоса ELP. В случае ELP-I-Cm2 эта полоса имеет 100 кДа (рисунок 3A).

Скрининг различных комбинаций органических растворителей показал разную эффективность экстракции (рисунок 3B

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

ITC ранее использовался для нехроматографической очисткиELP 19; однако это может быть трудоёмкий и малоурожайный процесс. В приведённых выше методах мы описываем подход к быстрой очистке белка слияния ELP-I-Cm2, демонстрируя, как метод экстракции и осадки на основе органических растворителей может быть эффективно использован для очистки широкого спектра слияний ELP и ELP. Протокол органического растворителя не только быстрее ITC, но и гораздо эффективнее для корот...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы благодарим Институт исследований рака Университета Пердью и программу NIH CCSG (CA23168) за поддержку этой работы.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
2-меркаптоэтанолБио-Рад161-0710Компонент SDS-PAGE
30% акриламид/бисакриламидTCIA3218Компонент SDS-PAGE
АцетонFisher ScientificA949Органический растворитель
АцетонитрилFisher ScientificA996Органический растворитель
АмпипилинЗолотая биотехнология — золотая биотехнологияA-301-25Антибиотик
APS (персульфат аммония)Био-Рад1610700Компонент SDS-PAGE
БутанолFisher ScientificL13171Органический растворитель
EDTAБиореагенты FisherBP118-500Компонент буфера лизиса
ЭтанолDecon LabsUN1170Органический растворитель
ЭтилацетатFisher ScientificE195Органический растворитель
ГлицеринResearch Products InternationalG22020-0.5Медиакомпонент Terrific Broth (TB)
Соляная кислотаFisher ScientificA144SI-212Компонент буфера лизиса
Мгновенное пятно КумасиAbcamAB119211Компонент SDS-PAGE
IPTGЗолотая биотехнология — золотая биотехнология12481C25Компонент экспрессии белков
ИзопропанолFisher ScientificA451-1Органический растворитель
K2HPO4 (монобазичный фосфат калия)Наука Уордса470302-246Часть 2 Компонент буфера
KH2PO4 (дибазичный фосфат калия)Наука Уордса470302-254Часть 2 Компонент буфера
L-ProlineResearch Products InternationalP5200-500.0Медиакомпонент Terrific Broth (TB)
ЛизоцимЗолотая биотехнология — золотая биотехнологияL-040-1Компонент буфера лизиса
МетанолFisher ScientificA452Органический растворитель
Native Sample BufferБио-Рад161-0738Компонент SDS-PAGE
Белковая лестницаЗолотая биотехнология — золотая биотехнологияP008-500Компонент SDS-PAGE
Разрешающий гель-буферБио-Рад1610798Компонент SDS-PAGE
Содим-додецилсульфат (SDS)Thermo ScientificJ18220-36Компонент SDS-PAGE
Гидроксид натрияFisher ScientificS318-500Компонент буфера лизиса
Буфер для укладки геляБио-Рад1610799Компонент SDS-PAGE
TEMEDБио-Рад1610801Компонент SDS-PAGE
База ТрисБиореагенты FisherBP-152Компонент буфера лизиса
ТриптонResearch Products InternationalT60065-1000.0Медиакомпонент Terrific Broth (TB)
Дрожжевый экстрактResearch Products InternationalY20025-1000.0Медиакомпонент Terrific Broth (TB)

Ссылки

  1. Despanie, J., Dhandhukia, J. P., Hamm-Alvarez, S. F., MacKay, J. A. Elastin-like polypeptides: therapeutic applications for an emerging class of nanomedicines. J Control Release. 240, 93-108 (2016).
  2. MacEwan, S. R., Chilkoti, A. Applications of elastin-like polypeptides in drug delivery. J Control Release. 190, 314-330 (2014).
  3. Jenkins, I. C., Milligan, J. J., Chilkoti, A. Genetically encoded elastin-like polypeptides for drug delivery. Adv Healthc Mater. 10 (13), e2100209(2021).
  4. Ju, Y., et al. Molecular targeting of immunosuppressants using a bifunctional elastin-like polypeptide. Bioconjug Chem. 30 (9), 2358-2372 (2019).
  5. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  6. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally responsive polypeptides. Nat Biotechnol. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  7. VerHeul, R., Sweet, C., Thompson, D. H. Rapid and simple purification of elastin-like polypeptides directly from whole cells and cell lysates by organic solvent extraction. Biomater Sci. 6 (4), 863-876 (2018).
  8. Sweet, C., Aayush, A., Readnour, L., Solomon, K. V., Thompson, D. H. Development of a fast organic extraction-precipitation method for improved purification of elastin-like polypeptides that is independent of sequence and molecular weight. Biomacromolecules. 22 (5), 1990-1998 (1990).
  9. Darji, S., Aayush, A., Estes, K. M., Strock, J. D., Thompson, D. H. Unravelling the mechanism of elastin-like polypeptide-enzyme fusion stabilization in organic solvents. Biomacromolecules. 25 (1), 272-281 (2024).
  10. Urry, D. W. Physical chemistry of biological free energy transduction as demonstrated by elastic protein-based polymers. J Phys Chem B. 101 (51), 11007-11028 (1997).
  11. Guo, Y., Liu, S., Jing, D., Liu, N., Luo, X. The construction of elastin-like polypeptides and their applications in drug delivery system and tissue repair. J Nanobiotechnology. 21, 418(2023).
  12. Yi, A., Sim, D., Lee, S. -B., Sarangthem, V., Park, R. -W. Application of bioengineered elastin-like polypeptide-based system for targeted gene delivery in tumor cells. Biomater Biosyst. 6, 100050(2022).
  13. Clement, H., et al. Comparison between the recombinant expression and chemical synthesis of a short cysteine-rich insecticidal spider peptide. J Venom Anim Toxins Trop Dis. 21, 19(2015).
  14. Miranda, L. P., Alewood, P. F. Accelerated chemical synthesis of peptides and small proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (4), 1181-1186 (1999).
  15. Eweje, F., et al. Self-assembling protein nanoparticles for cytosolic delivery of nucleic acids and proteins. Nat Biotechnol. , (2025).
  16. Hassouneh, W., Christensen, T., Chilkoti, A. Elastin-like polypeptides as a purification tag for recombinant proteins. Curr Protoc Protein Sci. 6 (11), 1-16 (2010).
  17. Yakhnin, A. V., Vinokurov, L. M., Surin, A. K., Alakhov, Y. B. Green fluorescent protein purification by organic extraction. Protein Expr Purif. 14 (3), 382-386 (1998).
  18. Aayush, A., Darji, S., Estes, K. M., Yeh, E., Thompson, D. H. Development of an elastin-like polypeptide-based nucleic acid delivery system targeted to EGFR+ bladder cancer cells using a layer-by-layer approach. Biomacromolecules. 25 (9), 5729-5744 (2024).
  19. Christensen, T., et al. Fusion order controls expression level and activity of elastin-like polypeptide fusion proteins. Protein Sci. 18 (7), 1377-1387 (2009).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Теги

Очистка ELPэкстракция органическими растворителямиосаждение белковэкспрессия в E. coliтельца включенияудаление эндотоксинованализ SDS-PAGEактивность гибридного белкасамособирающиеся наночастицы
Эффективная очистка эластиновых полипептидов (ELP) из E. coli с использованием метода экстракции и осадки на основе органических растворителей
Связаться с нами
Порекомендовать библиотеке

Конфиденциальность

Условия использования

Политики

© 2026 MyJoVE Corporation. Все права защищены.