Методическая статья

Определение микробной биомассы в почве с помощью цифровой капельной ПЦР (ddPCR)

DOI:

10.3791/69467

⸱

24 апреля 2026 г.

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Geography, Faculty of Environment, Science and Economy, University of Exeter

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В данном исследовании представлен быстрый метод ddPCR для количественной оценки микробной биомассы почвы и соотношения грибковых к бактериям. Хотя микробная биомасса, полученная с помощью ddPCR, демонстрирует лишь слабую корреляцию с оценками фумигации хлороформа, метод обеспечивает чувствительный, масштабируемый молекулярный подход к оценке количества микробов без дополнительного отбора проб почвы или использования агрессивных препаратов.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Почва представляет собой крупнейший наземный резерв органического углерода, однако за последние два столетия из почвы было потеряно более 133 Гт углерода. Точная количественная оценка микробной биомассы почвы, особенно грибов и бактерий, основных разлагателей, определяющих цикл углерода и питательных веществ, жизненно важна для понимания экологического функционирования и здоровья почвы. Традиционные подходы, включая экстракцию хлороформной фумигации и анализ PLFA, ограничены высокими требованиями к образцам и неопределённостями, связанными с преобразованием биохимических маркеров в оценки биомассы микробов. Здесь мы представляем оптимизированный рабочий процесс для количественного определения количества бактерий и грибков в почве с помощью цифровой капельной ПЦР (ddPCR), направленного на гены 16S и 18S рРНК. Метод позволяет абсолютную количественную оценку копий микробных генов, преобразование в количество клеток с помощью коэффициентов коррекции номера генов и последующую оценку микробной биомассы углерода. Мы применили этот протокол к почвам из пяти глобально распространённых сельскохозяйственных систем, различающихся по текстуре почвы, землепользованию и содержанию органических веществ. Оценки, полученные на основе ddPCR, были сравнины с обычными оценками хлороформной фумигации микробной биомассы углерода. ddPCR обеспечивал высокоточную количественную оценку количества микробов и давал более широкие и чувствительные оценки соотношения F:B между типами почвы, чем секвенирование целого генома. Хотя MBC, полученный на основе ddPCR, показал лишь слабую корреляцию со значениями фумигации хлороформа, этот метод предлагает эффективный молекулярный подход к оценке микробной биомассы и экологических показателей, таких как соотношение F:B. Этот протокол обеспечивает воспроизводимую и масштабируемую стратегию интеграции показателей численности микробов с анализом состава для продвижения оценки состояния почвы.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Почва является крупнейшим наземным органическим углеродным бассейном, содержащим больше углерода, чем растительность и атмосферный углерод вместевзятые1. За последние 200 лет из почв было потеряно более 133 гигатонн (Gt) углерода, и постоянные усилия по восстановлению и поддержанию запасов углерода в почве жизненно важны для глобального здоровьяпочвы 2. Учитывая огромную способность почв по накоплению углерода, точное определение основных вкладчиков в эти запасы углерода крайневажно 3. Микробы играют фундаментальную роль в цикле питательных веществ в почве, а микробная биомасса представляет собой значимый компонент органического углерода (SOC)3. Грибы и бактерии являются основными разлагателями почвенных сред и необходимы в биогеохимических циклах этихэкосистем 4,5. В почвах, где доминируют бактерии, разложение органического вещества и минерализация питательных веществ проходят гораздо быстрее, чем в грибковых5. Соотношение грибков к бактериям (F:B) всё чаще используется как индикатор состоянияпочвы 6,7; поэтому точная оценка как грибов, так и бактерий крайне важна.

Оценка микробной биомассы в почвах часто использует разрушительные химические обработки, такие как фумигация хлороформ8. Другие подходы избирательно нацелены на активное микробное сообщество с помощью таких методов, как субстрат-индуцированное дыхание или анализ фосфолипидов жирных кислот (PLFA) 9. Анализ PLFA широко используется для оценки состава микробных сообществ и оценки соотношения F:B. Однако значительные вариации размера клеток между различными грибными и бактериальными видами создают неопределённость при преобразовании концентраций PLFA в биомассу или популяционные соотношения F:B, что делает такие оценки потенциально ненадёжными10. Другие методы, такие как потоковая цитометрия, могут использоваться для увеличения пропускной способности образцов с целью определения количества бактерий в почвах; однако их точность может снижаться из-за того, что немикробные частицы имеют схожие размеры, формы и автофлуоресцентные характеристики смикробами 11. Для оценки микробной биомассы хлороформ требуется относительно большое количество почвы (>10 г), тогда как для методов на основе ДНК при проведении экстракций с коммерческими наборами достаточно образца 500 мг почвы. Предыдущее сравнение методов на основе ДНК и хлороформной фумигации показало, что хотя оба подхода способны оценивать микробную биомассу, их совместное использование обеспечивало более надёжную оценку микробной биомассыпочвы 12.

Оценка микробных сообществ — это недостаточно используемая метрика здоровья почвы, которая может изменить то, как мы измеряем и понимаемпочвы 13. Методы меташтрих-кодирования традиционно используются для определения микробного сообщества почвы, при этом относительная численность бактерий оценивается с помощью амплифицирующих областей гена 16S рРНК, тогда как грибные таксоны нацелены на ген 18S рРНК или область внутреннего транскрипционированного спейсера (ITS) 14. Методы метабаркодирования для грибов могут опираться на различные геномные целевые регионы, влияя на разнообразие и численность выявленных видов грибов. Неравномерная длина ITS среди видов грибов может способствовать предпочтительному амплификации и секвенированию, что приводит к неправильной оценке их численности, что приводит к неправильной оценке грибных сообществ15. Праймеры Fungiquant были разработаны для выявления специфических переменных областей в гене 18S рРНК, которые демонстрируют полное покрытие различных грибов и специфичность по сравнению с другимиэукариотами 16.

У большинства бактерий и грибов есть более одной копии целевого гена, что приводит к искаженным оценкам количества клеток. Кроме того, у грибов часто есть многоядерные клетки с переменным количеством ядер наклетку 6. Существует значительное разнообразие в номере копий генов рРНК как внутри таксономических групп, так и между ними, обычно менее 15 копий у прокариот, а для грибов оценивается в диапазоне от 28 до 511. Из-за этой вариации молекулярные методы, используемые для анализа структур микробных сообществ, считаются полуколичественными, поскольку они могут искажать оценку относительной численности видов всообществе 18. Измеренные числа генных копий (GCN) регулярно преобразуются в численность клеток с использованием оценочного среднего GCN в интересующей таксономическойгруппе 18,19,20.

Некоторые исследования использовали метагеномные подходы, поскольку они предлагают ряд преимуществ по сравнению с меташтрих-кодированием, включая устранение амплификационного искажения и возможность всестороннего изучения всего микробногосообщества 21. Кроме того, они позволяют одновременно сравнивать составы грибов и бактерий, а также их взаимосвязьмежду собой 22. В целом RT qPCR часто используется для обнаружения содержания микроорганизмов и функции23. qPCR имеет ограничения по сравнению с цифровым капельным ПЦР (ddPCR) для абсолютной количественной оценки из-за своей чувствительности к ингибиторам, поскольку требует внешнегостандарта 24.

ddPCR — это прорывная технология, основанная на разделении отдельных реакций амплификации на отдельные капли. Шаблон впоследствии усиливается с помощью ПЦР в каждой капле как отдельная реакция. ddPCR обладает низкой чувствительностью к ингибиторам ферментов, лучшей точностью, повторяемостью, чувствительностью и стабильностью в количественном анализе бактерий и грибов по сравнению сqPCR 25. Кроме того, это метод, который можно использовать для абсолютной количественной оценки бактерий и грибов впочве 5. Поскольку ddPCR использует ту же экстракцию ДНК, что и для оценки сдвига состава микробов, данные о численности ddPCR можно напрямую связать с данными состава сообществ26 и использовать для количественной оценки микробной биомассы почвы.

В данном исследовании представлена методология количественной оценки грибов и бактерий в почвах с помощью цифровой капельной ПЦР (ddPCR). Этот оптимизированный метод был применён к почвам из пяти различных глобальных регионов и видов землепользования. Выборочные места были выбраны с учетом широкого спектра свойств почвы, экологических условий и методов управления, что позволило оценить устойчивость и универсальность нашего подхода в различных условиях. Эти данные позволили определить соотношение F:B как молекулярный биоиндикатор экологического качества почвы. Наконец, было проведено сравнение оценочной микробной биомассы между микробными данными ddPCR и традиционными методами фумигации хлороформа.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Общая схема этих протоколов показана на рисунке 1. Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Отбор проб почвы

  1. Собрать составные образцы верхнего слоя почвы (0–20 см) из пяти глобальных точек с тремя образцами из случайно выбранных точек в пределах площади 25 м от каждой точки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы были собраны из сельскохозяйственных систем, отражающих региональное землепользование, в котором они находились. Текстура почвы была охарактеризована с помощью лазерной дифракции, измеренной лазерным дифракционным анализатором размера частиц (Таблица 1). Образцы транспортировались при окружающей температуре и хранили при 4 °C до дальнейшего анализа.

2. Экстракция ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Проведите экстракцию ДНК с помощью набора для извлечения ДНК из почвы согласно инструкциям производителя. Температура в комнате для всех этапов составляла 20 °C.

  1. Кратко прокрутите трубку для взбивания бусинок объемом 2 мл, чтобы убедиться, что шарики осели на дне. Добавьте 100 мг почвы и 800 мкл раствора CD1. Кратко проведите вихрь для смешивания.
  2. Тщательно гомогенизируйте образцы с помощью гомогенизатора бусерной мельницы, при этом образцы лизируются в течение 40 с при 6 м s−1.
  3. Центрифугировать трубку для биения шариков для лизиса механической ячейки при 15 000 x г в течение 1 минуты при комнатной температуре.
  4. Перенесите супернатант в чистую микроцентрифугную трубку объёмом 2 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Супернатант всё ещё может содержать частицы почвы.
  5. Добавьте 200 мкл раствора CD2 и вихрь на 5 секунд.
  6. Центрифугу при 15 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре.
  7. Перенесите до 700 мкл супернатанта в чистую микроцентрифугную трубку объёмом 2 мл, избегая гранулы. Гранула должна быть видна.
  8. Добавьте 600 мкл раствора CD3 и вихрь на 5 секунд.
  9. Загрузите 650 мкл лизата на спин-колонку и центрифугите при 15 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре.
  10. Отбросьте проток и повторите шаг 2.9, чтобы убедиться, что весь лизат прошёл через спин-колонну.
  11. Вставьте спин-колонку в чистую трубку для сбора объёмом 2 мл.
  12. Добавьте 500 мкл раствора EA в спин-колонку. Центрифугу при 15 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре.
  13. Отбросьте проток и поместите спин-колонку обратно в ту же трубку объемом 2 мл.
  14. Добавьте 500 мкл раствора C5 в спин-колонку. Центрифугуйте при 15 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре.
  15. Отбросьте проток и поместите спин-колонку в новую сборную трубку объемом 2 мл.
  16. Центрифугуйте при температуре до 16 000 г в течение 2 минут при комнатной температуре.
  17. Вставьте спин-колонку в новую элюционную трубку объемом 1,5 мл.
  18. Добавьте 50–100 мкл раствора C6 в центр белой фильтрующей мембраны.
  19. Центрифугу при температуре 15 000 x g в течение 1 минуты при комнатной температуре. Отбросьте спин-колонку и оставите элют при -20 °C.

3. Количественная оценка очищенной ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенная ДНК была количественно измерена с помощью флюорометра и двухцепочечного (dsDNA) широкого диапазона (BR) теста в соответствии с инструкциями производителя.

  1. Подготовьте рабочее решение с соотношением буфера к реагенту 199:1.
  2. Добавьте 10 мкл каждого стандарта ДНК к 190 мкл рабочего раствора.
  3. Добавьте 1–20 мкл очищенной ДНК к 180–199 мкл рабочего раствора. Конечный объём должен составлять 200 мкл. Вихрь и инкубировать стандартные и ДНК-образцы при температуре окружающей среды в течение 2 минут.
  4. Проанализируйте стандарты перед сдачей образцов ДНК на флюорометре, используя инструкции на экране.

4. Выбор грунта

  1. Для анализа почвенных микроорганизмов выбирайте конкретные праймеры на основе соответствующих источников. Для бактерий использовались праймеры 16S рРНК— 25,27, а для грибов— 18S рРНК-праймеры 16.
  2. Выполнить амплификацию с использованием мастер-смеси ПЦР реального времени (qPCR) на основе ДНК-связывающих красителей и термического циклера. Последовательности праймеров приведены в таблице 2.

5. Микробная количественная оценка с помощью ddPCR

  1. Оттаяние и вихрь — все реагенты на льду.
  2. Настройте реакцию ddPCR следующим образом: 0,1 мкл (10 мкм) вперёд и 0,1 мкл (10 мкм) обратного праймера 16S или 18S, 10 мкл ddPCR Evagreen Supermix, 0,5 нг шаблонной ДНК X μL, используя воду без нуклеазы (NFW) для регулировки итогового объёма реакции до 22 мкл. Создайте отрицательный контроль, добавив NFW вместо шаблона для каждого столбца.
  3. Вставьте DG8 в держатель картриджа.
  4. В образцовые ямы картриджа поместите всего 20 мкл реакционной смеси.
  5. Добавьте 70 мкл масла для генерации капель для Evagreen в картриджную яму, обозначенную как «масло».
  6. Вставьте картридж в генератор капель и закройте картридж прокладкой.
  7. Перенесите 40 мкл сгенерированных капель на 96-яковинную (полуюбку) пластину для усиления ПЦР.
  8. Запечатайте пластину с 96 лунками с помощью герметика (температура 180 °C в течение 5 секунд).
  9. Используйте следующие условия цикла с нагретой крышкой, установленной при 105 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: (a) Бактерии: 98 °C в течение 5 минут, 40 циклов; 94 °C за 30 с, 61°C за 60 с, 5 минут при 4 °C, 10 минут при 98 °C. (b) Грибы: 95 °C в течение 5 минут, 40 циклов; 95 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 1 минуты, 72 °C в течение 30 секунд, 5 минут при 4 °C и 5 минут при 90 °C.
  10. Перенесите пластину с 96 лунками на считыватель пластин.
  11. Оцените концентрацию копий каждой ямы с помощью версии QuantaSoft 1.2. Отрегулируйте порог амплитуды для разделения отрицательных и положительных капель.
  12. Вычислите количество копий генов на ng ДНК в реакции, умножая копии/мкл на итоговый объём реакции (20 мкл) и деля на общий вход шаблонной ДНК в реакцию следующим образом: (копирует μL-1 x объём реакции) / Общий вход ДНК в реакцию.
  13. Вычислите общее количество копий генов на ng извлечённой ДНК, умножив копии гена на ng на общее количество экстракционной ДНК (ng) следующим образом: (копии гена на ng x общее количество экстракций ДНК).
  14. Вычислите количество копий генов на грамм, деля общее количество копий генов на нг извлеченной ДНК на количество сухого веса обработанной при извлечении почвы (g), следующим образом:
    генные копии на грамм = (общее количество копий на ДНК на грамм извлечённой ДНК / грамм сухого веса почвы (GDW) обработанной при извлечении).
  15. Вычислите количество клеток на gdw, преобразуя копии генов с использованием среднего числа копий гена (GCN) следующим уравнением:
    Количество клеток = копии генов на грамм / Среднее количество копий гена клетки-1).
  16. Преобразуем количество клеток в микробный биомассовый углерод (MBC) с помощью следующего уравнения:
    MBC для 16S (мг C g-1 почвы) = клетки gdw-1 × (100 fg ячейки-1) × 10−15 (g fg-1) × 103(мг g-1)28
    MBC для 18S (мг C g-1 почва) = клетки gdw-1 × (6 fg ячейки-1) x 10−12 (g fg-1) × 103 (mg g-1)29
    Полный процесс описан на рисунке 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя копия гена 16S рРНК (средняя ± SD) для 46 бактериальных фил20 была рассчитана и использована как корректирующий фактор для бактерий, с итоговым значением 2,48. Для грибов число генных копий рассчитывалось с коррекционным коэффициентом 113 согласно Лофгрену и др. 17. Микробная биомасса углерода (MBC) оценивалась на основе подсчёта клеток, полученных с помощью ddPCR, с использованием предполагаемого содержания углерода в 100 фг на бактериальнуюклетку 28 и 6 пг на клеткугрибка 29.

6. Молекулярный анализ почвы на основе секвенирования целого генома

  1. Подготовьте библиотеку секвенирования в соответствии с протоколом Oxford Nanopore Technologies SQK-NBD114, используя Native Barcoding Kit 24 V14 (SQK-NBD114.24) (см. Таблицу материалов). Обязательно используйте один штрих-код, указанный в наборе, для каждого образца.
  2. Секвенируйте подготовленную библиотеку с помощью flowcell Oxford Nanopore Technologies R10.4.1.
  3. Выполните базовый вызов в MinKnow во время секвенирования, выбрав модель супер-точности (SUP) и убрав обрезку штрих-кода «ON». Версия Dorado: 0.7.2+9ac85c6.
  4. Выполнить таксономическую классификацию последовательностей ДНК с помощью таксономического классификатора Kraken2 (v2.1.3)30 по базе данных NCBI по неизбыточным белкам (nr), уверенность 0,05.
  5. Проверьте файлы отчётов Kraken2 на предмет общей классификации бактерий и грибов.
  6. Рассчитайте относительную численность бактерий и грибов для каждого образца.

7. Оценка углерода микробной биомассы почвы с помощью хлороформной фумигации

  1. Взвесьте свежие образцы почвы в заранее взвешенные противни и сушите их в духовке при 105 °C в течение 24 часов.
  2. Рассчитайте влажность почвы, вычитая массу сухой почвы из веса свежей и деля разницу на вес свежей почвы.
    Влажность (%) = ((W влажная –W сухая)/ Wсухая) × 100
  3. Используйте содержание влаги для расчёта сухого вещества в почве.
    Сухое вещество (%) = 100 – Содержание влаги (%)
  4. Добавьте 5 г почвы в две отдельные центрифугные трубки объемом 50 мл, маркированные как нефумигированные и дезинфицированные.
  5. Добавьте в общей сложности 25 мл 0,5 M K2SO 4 в нефумигированную маркированную трубку.
  6. Встряхивать необработанные образцы в орбитальном шейкере в течение 1 часа при комнатной температуре.
  7. Добавьте 2 мл безэтанолового хлороформa прямо в почву в трубках с надписью «фумигированный». Закройте крышки парапленкой и инкубуйте в темноте 24 часа при комнатной температуре.
  8. Центрифугуйте нефумигированный образец в течение 10 минут при 2500 г при комнатной температуре.
  9. Декантировать супернатант из нефумигированного образца, процедить через целлюлозный фильтр 0,45 мкм и хранить при -20 °C.
  10. Снимите крышки с профузированных образцов и спустите вентиляцию в вытяжке на 2 часа, затем выполните экстракцию K2SO4 (повторяя шаги 5-9) и храните при -20 °C.
  11. Измерьте концентрацию углерода экстракта как для «фумигированных», так и для «нефумигированных» образцов с помощью анализатора общего органического углерода.
  12. Вычислите микробную биомассу углерода (MBC) с помощью следующего уравнения: MBC = (содержание фумигированного C — нефумигированное содержание C)/0,45. Нормализуйте почву с сухим весом на грамм.

8. Оценка содержания органического вещества в почве

  1. Высушите фарфоровый тигель в конвекционной печи при 105 °C в течение 30 минут, затем взвесьте его после охлаждения до 20 °C(W C).
  2. Поместите до 2 г почвы в засохший тигель и взвесьте снова.
  3. Сушите образцы почвы в заполненном тигле в конвекционной печи при 105 °C в течение 24 часов.
  4. Поместите в герметичный осушитель для охлаждения и взвешивания снова (WS).
  5. Предварительно разогрейте глушительную печь до 550 °C, затем поместите тигель с почвой в печь на 4 часа.
  6. Снимите тигель с почвой из печи и поместите его в осушитель для охлаждения.
  7. Взвесьте тигель с почвой (WA).
  8. Измерьте процент SOM, вычисляя разницу сухой массы почвы до и после инкубации при температуре 550 °C.
    SOMLOI = [(WS –W A)/(WS –W C)] × 100

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Образцы почвы были собраны в пяти местах, а содержание органического вещества в почве определялось по потере при возгорании. Содержание органического вещества в почве варьировалось от 3,38% до 10,34 % на каждой из используемых в исследовании почвы (Таблица 1). Экстракция ДНК проводилась на каждом образце почвы в три экземпляжа, при этом урожайность ДНК варьировалась от 32 до 4 590 нг на грамм сухой почвы (рисунок 3A).

Концентрация ДНК значительно различалась между почвами с изменяющимся содержанием органического вещества (односторонний ANOVA p < 0,0001,R 2=0,97). Почва с самым низким содержанием органического вещества, почва A, не имела самой низкой концентрации ДНК. Однако почва E, обладающая самым высоким содержанием органического вещества, имела значительно большую концентрацию ДНК из всех других почв (A–D, p < 0,0001), тогда как почва B имела наименьшую, значительно отличаясь от A и D (p < 0,05). Протокол ddPCR проводился на ДНК, очищенной из каждого образца почвы с использованием праймеров генов 16S и 18S. Количество копий генов на грамм сухого массы почвы для каждого из генов 16S (рисунок 3B) и 18S рРНК (рисунок 3C) было определено с помощью ddPCR. Во всех образцах почвы было меньше копий гена 18S рРНК, чем гена 16S рРНК. Пост-хок тесты Тьюки показали, что почва B имела наименьшее количество копий генов 16S и 18S рРНК, со средним 8,8 x 107 и 4,6 x10 6 генов на грамм сухой почвы соответственно. Почва E значительно отличалась от всех остальных и имела наибольшее количество копий генов 16S и 18S рРНК с 4,4 x 109 и 2,5 x10 9 генов на грамм сухой почвы. Грибные копии в почвах A–D существенно не отличались друг от друга, тогда как бактериальные копии в почве D существенно отличались от почв B и E.

Для ДНК, очищенной из каждого образца почвы, применялось целогеномное секвенирование (WGS), а таксономические классификации проводились с использованием Kraken2 по базе данных NCBI nr. Общее количество последовательностей ДНК, классифицированных по бактериям и грибам, использовалось для расчёта грибкового соотношения (F:B) для каждой почвы и сопоставления с грибковыми и бактериальными соотношениями, рассчитанными на основе копий гена, оцененных ddPCR (Дополнительный рисунок 1). Значения соотношения F:B, полученные при ddPCR, варьировались от 0,022 до 0,66 по всем образцам почвы и были выше, чем при секвенировании целого генома. Наивысшее среднее значение F:B наблюдалось в почве E: F:B 0,56 для ddPCR и 0,038 для методов WGS. Кроме того, был выявлен более широкий диапазон значений F:B в почвенных образцах с помощью ddPCR вместо WGS. Кроме того, была обнаружена положительная корреляция между отношением F:B, определённым методом ddPCR, и данными WGS (r = 0,59,R 2 = 0,35, p = 0,019), как показано на дополнительном рисунке 1.

Среднее количество генных копий для бактерий и грибов использовалось для преобразования рассчитанных копий генов в количество бактерий и грибных клеток в исходных образцах (дополнительный рисунок 2). Эти данные были объединены для оценки общего числа микробных клеток в почве (рисунок 3D) и существенно различались между почвами (односторонний ANOVA p < 0,0001). Парный сравнительный анализ Тьюки показал, что наибольшее содержание микроорганизмов наблюдалось в почве E, а самое низкое — в образцах, взятых из почвы B, что существенно отличалось от A, D и E.

Для оценки общего количества микробной биомассы углерода (MBC) на каждом образце почвы проводилась хлороформная фумигация в тройном виде (рисунок 4A). В используемых почвах было выявлено от 3,6 до 9,6 мг углерода на грамм сухой почвы, при этом существенных различий между образцами не наблюдалось (односторонний ANOVA p = 0,266). Среднее содержание углерода для бактериальных и грибковых клеток использовалось для преобразования оцененного ddPCR микробного количества клеток в оценочную оценочную сумму микробной биомассы углерода. Эти оценки, полученные на основе ddPCR, были сравнины с методом фумигации хлороформ (рисунок 4B). Для оценки связи между MBC, измеренным с помощью фумигации хлороформа, и методом ddPCR была проведена корреляция Пирсона (n = 15). Положительная корреляция была обнаружена между двумя методами (r = 0,43, R2 = 0,18, p-значение = 0,05). Выбросы почвы E, характеризующиеся самым высоким содержанием органического вещества, вероятно, внесли непропорционально значительный вклад в этот незначительный результат (рисунок 4B).

figure-results-1
Рисунок 1: Обзор обработки образцов почвы. На рисунке показаны молекулярные методы использования почвенной ДНК для микробной количественной оценки и традиционные методы измерения микробной биомассы, углерода и органического вещества почвы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой рисунка.

figure-results-2
Рисунок 2: Блок-схема процесса подсчёта клеток от копий ddPCR для 16S и 18S до окончательной оценки углерода микробной биомассы, показывающая шаги 5.11–5.16 протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой рисунка.

figure-results-3
Рисунок 3: Микробная количественная оценка почв. (A) Средняя концентрация ДНК, очищенная из каждого образца почвы. (B) Среднее общее количество копий гена 16S рРНК на грамм сухого массы почвы с использованием ddPCR. (C) Среднее общее количество копий гена 18S рРНК на грамм сухого массы почвы с использованием ddPCR. (D) Среднее общее количество микробных клеток на грамм сухого веса по образцам почвы. Все индикаторы ошибок показывают стандартную ошибку среднего. Были проведены односторонний тест ANOVA и последующий пост-хок тест Tukey для парных сравнений, и значимые различия показаны с помощью компактного буквенного отображения (порог значимости = 0,05). Образцы упорядочены от самого низкого к наибольшему OM%. Происхождение почвы (OM%) A: Нидерланды (3,38), B: Ирак (5,14), C: Китай (6,41), D: Великобритания (8,19) и E: Великобритания (10,34). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.

figure-results-4
Рисунок 4: Микробная биомасса углерода измеряется с помощью экстракции хлороформного фумигационного вещества и оценок на основе генов клеток. (A) MBC, извлеченный с помощью хлороформной фумигации, организованный от низкого до высокого содержания органического вещества. Индикаторы ошибок показывают стандартную ошибку среднего. Был проведён односторонний ANOVA и последующий пост-хок тест Tukey для парных сравнений, значимые различия показаны с помощью компактного буквенного отображения (порог значимости = 0,05). (B) MBC, оценённый по количеству клеток (cell gdw -1), полученный из числа копий гена ddPCR и преобразованный в биомассу углерода, с отображением общего количества органического вещества для того же образца. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

ОбразецПроисхождение почвыpHВлажность %Органическое вещество %ТекстураЗемлепользование
AТексель, Нидерланды7.1619.043.38Песчаный суглинокСадоводство
BНаджаф, Ирак7.588.335.14Илистый суглинокРис
CЦзянси, Китай4.118.456.41Илистый суглинокКунжут/рапс
DКембридж, Великобритания6.8121.88.19Илистый суглинокПшеница
EЭксетер, Великобритания5.4420.2710.34Илистый суглинокТравянистые угодья

Таблица 1: Физико-химические свойства и особенности землепользования пяти образцов почвы (A–E) для определения микробной биомассы.

ЦельBPВперёдРеверсСсылка
16S рРНК1805′- ACTCCTACGGGAGGCAGCAG5′- ATTACCGCGGCTGCTGG(Le Geay и др., 2024; Ovreås и др., 1997)
18S рРНК3515′-GGRAAACTCACCAGGTCCAG5′-GSWCTATCCCCAKCACCACCAKG(Лю и др., 2012)

Таблица 2: Пары праймеров, выбранные для таргетирования гена рРНК 16S и 18S с помощью ddPCR.

Дополнительный рисунок 1: Корреляция между соотношением F:B для всех образцов почвы, определяемым методом ddPCR и WGS. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Дополнительный рисунок 2: Количество клеток в различных образцах почвы, измеренных методом ddPCR, нацеливаясь на: (A) бактерии; и (B) грибы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Почвенные микробы являются основными разлагателями в наземных экосистемах и играют важную роль в цикле питательных веществ и хранении углерода в почве. Несмотря на важность почвенных микробов, точное количественное определение их абсолютного количества с помощью методов копирования генов сложно. Это связано со многими факторами, такими как переменное количество целевых генов у разных видов. Это исследование демонстрирует, как почвенная микробная биомасса можно количественно измерить с помощью ddPCR, нацеливаясь на прокариотов и эукариотов с использованием соответствующих кодирующих областей генов 16S и 18S рРНК. Наивысшее соотношение F:B было зафиксировано в почве E, где этот образец также имел наивысший процент органического вещества. Второе по величине соотношение F:B было обнаружено в образце C, что корелировало с высокой кислотностью этих почв. Это было ожидаемо для образцов C и E, поскольку рост грибков увеличивается при сниженииpH 31. Целое секвенирование генома проводилось на тех же экстрактах ДНК, что использовались для методов ddPCR. Сравнивалось соотношение F:B между WGS и ddPCR. Соотношение F:B, рассчитанное на основе данных WGS, было ниже для всех проанализированных образцов по сравнению с соотношением F:B, рассчитанным на основе данных ddPCR. Однако общий тренд соотношения F:B между образцами был визуально сопоставим для каждого метода. Это дало более высокие соотношения F:B на почвенных образцах по сравнению с секвенированием целого генома и показало большую вариабельность соотношения F:B в разных типах почвы. Более низкое соотношение F:B, наблюдаемое из данных WGS, вероятно, связано с различиями в размере генома между грибами и бактериями, а грибные последовательности могут быть недопредставлены безобогащения 32. Кроме того, несмотря на самое низкое содержание органического вещества в почве А, она не показала наименьшее количество микробных копий и микробной биомассы углерода, что подчёркивает то, что содержание органического вещества не всегда напрямую связано с микробной биомассой. Примечательно, что тенденции между концентрацией исходной ДНК (рисунок 3A) и полной концентрацией микробных клеток (рисунок 3D) визуально похожи, что говорит о том, что концентрация ДНК является хорошим показателем микробной биомассы.

ddPCR позволяет точно количественно определить количество копий генов в образцах почвы, и этот метод может использоваться для оценки общего числа микробных клеток. Однако существуют ограничения, которые необходимо учитывать. Количество копий генов 16S и 18S рРНК сильно варьируется между микробнымитаксонами 23. В результате использование одного корректирующего фактора для количества копий гена может привести к переоценке или недооценке количества микробов вобразце 33. Это ограничение можно устранить, включив предварительные знания о микробномсообществе 18, используя данные секвенирования целого генома и применяя соответствующие коррекции номера копий гена, соответствующие для специфической почвенной микробиоты. Хотя молекулярные методы по-прежнему предоставляют оценку, а не точное подсчёт, они обеспечивают более точное предсказание численности микробных клеток. В сочетании с данными о составе сообществ этот подход позволяет интерпретировать, выходящие за рамки относительногоколичества 19,34.

Микробная биомасса углерода (МБК), оцененная с помощью хлороформной фумигации, не показала значимых различий между анализируемыми образцами, хотя наблюдалась высокая степень вариации в МБК между образцами A–D. В то же время были обнаружены значительные различия в общем подсчёте микробных клеток, измеренных методом ddPCR, что указывает на то, что этот молекулярный подход может обеспечивать более высокую разрешающую способность по сравнению с традиционными методами. Однако вычисление микробной биомассы углерода по количеству микробных клеток имеет свои ограничения. Вариабельность размера клеток может влиять на преобразование подсчета клеток в биомассу. Подобно использованию одного коэффициента конверсии для количества копий гена, использование одного коэффициента конверсии для содержания углерода бактерий и грибов может привести к переоценке или недооценке углерода микробной биомассы.

Кроме того, методы на основе ДНК могут быть особенно проблематичными при сравнении почв, где наблюдаются значительные различия в степени доминирования между бактериями и грибами. И выход ДНК, и GCN также могут зависеть от выбора метода экстракции ДНК и дизайнапраймера 35,36, что затрудняет сравнения междулабораториями 37. Кроме того, как методы получения ДНК, так и ДНК могут быть подвержены переоценке из-за так называемой «реликтовой ДНК», то есть ДНК в мёртвых организмах или связанной сглинами 14,38. Несмотря на то, что методы ddPCR показали лучшую точность и повторяемость, некоторые недостатки включают сложные процессы, высокую стоимость и использование неспецифического ДНК-красителя при использовании химииEvagreen 5. Это может привести к слабым ложноположительным результатам, затрудняя отделение положительных капель от отрицательных, а небольшое нарушение порога может повлиять на соотношение F:B при низкомуровне копий генов 14. Для увеличения количества образцов, которые можно обработать с помощью этого метода ddPCR, можно использовать автоматизацию с помощью робототехники для обработки жидкостями для экстракции ДНК и установкиреакции 39. Кроме того, новая система ddPCR обеспечивает более эффективное мультиплексирование, генерируя капли для 96 образцов одновременно.

Важно отметить, что все измерения микробной биомассы являются оценочными и включают обобщённые коэффициенты преобразования для определения чисел37. Поэтому сравнения методов следует проводить с осторожностью, так как неизвестно, какие из них наиболее точны. Несмотря на это, методы фумигации хлороформ и экстракции широко используются в последние десятилетия, используя пары хлороформов для фумигации почвы. Это вызывает множество опасений из-за токсичности для человека и окружающей среды, а также эффективности в лизировании микробных клетокпочвы 40. Кроме того, фумигация хлороформов может привести к завышенной оценке MBC, полученного из неживых источников, таких как растительныеостатки 41. Наконец, этот метод также использует относительно большие объёмы почвы по сравнению с другими молекулярными методами, требующими очень низкие количества почвы (<500 мг).

Это исследование доказывает, что методы измерения микробной биомассы почвы на основе ddPCR в различных почвах являются надёжными и не подвержены влиянию различных типов почв и потенциальных ингибиторов. Успех этого метода зависит от исходного образца ДНК, поэтому обеспечение эффективной очистки ДНК из образцов крайне важно. Этот метод демонстрирует перспективы для обнаружения и количественной оценки микробов в различных типах и текстурах почв, дополняя существующие методы оценки микробной биомассы и открывая ценные будущие применения в мониторинге состояния почвы и масштабируемости почвы для регионального или глобального мониторинга микробиома.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конфликте интересов.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Мы благодарим доктора Нину Линдстром-Фриггенс, доктора Лиз Кресси, доктора Джоанну Сарагосу-Кастеллс, Анджелу Эллиотт, доктора Киса Ян ван Грёниген и профессора Иэна Хартли. Мы также хотим поблагодарить землевладельцев за предоставление почв для этого исследования. Это исследование было профинансировано компанией Shell Research Ltd (CW648947-PT34767). Наборы данных, полученные в ходе текущего исследования, доступны в архиве NCBI Sequence Read Archive PRJNA1305539.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
Bettersizer S3 Plus Bettersize, КитайBT-803
ЦентрифугаThermoscientific SL16 
Хлороформ  ThermoScientificL14759. AU 
ddPCR 96-Well пластиныBio-Rad, Уотфорд, Великобритания12001925
ddPCR считыватель капель масло  Bio-Rad, Уотфорд, Великобритания1863004
Dessicator Дэвисил
Держатель патрона DG8Bio-Rad, Уотфорд, Великобритания1863051
Картриджи DG8 для генератора капель QX200/QX100Bio-Rad, Уотфорд, Великобритания1864008
Прокладки DG8 для генератора капель QX200/QX100Bio-Rad, Уотфорд, ВеликобританияQ33265
Профессиональный комплект DNeasy Power Soil Pro Цяген, Германия47017
двухцепочечный (dsDNA) набор для широкого диапазона (BR)Инвитроген, ГерманияQ33230
FastPrep-24 5G MP Biomedicals, Великобритания116005500
GridION Oxford Nanopore Technologies, ВеликобританияGRD-MK1CAPX
K2SO4Merck, Великобритания7778-80-5
Магнитные шарики с магнитным связываниемOmega Bio-tek, СШАM1378-01
Потоковая ячейка MinIONOxford Nanopore Technologies, ВеликобританияFLO-MIN114
Приглушённая печьКарболиты AAF1100
Нативный набор штрих-кодирования 24Oxford Nanopore Technologies, ВеликобританияSQK-NBD114.24
Термоуплотнение ПЦР-пластины, фольга, проколываемый и bbsp;Bio-Rad, Уотфорд, Великобритания1814040
PX1 PCR Plate SealerBio-Rad, Уотфорд, Великобритания1814000
Кубитный флуорометрИнвитроген, ГерманияQ33226
QX200 Droplet Digital PCR SystemBio-Rad, Уотфорд, Великобритания1864001
QX200 ddPCR EvaGreen SupermixBio-Rad, Уотфорд, Великобритания186-4033
Масло для генерации капель QX200 для EvaGreen Bio-Rad, Уотфорд, Великобритания1864005
Генератор капель QXDx Bio-Rad, Уотфорд, Великобритания12001049
SENSOQUEST LABCYCLER Генефлоу, Германия1120280125

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jobbágy, E. G., Jackson, R. B. The vertical distribution of soil organic carbon and its relation to climate and vegetation. Ecol Appl. 10 (2), 423-436 (2000).
  2. Sanderman, J., Hengl, T., Fiske, G. J. Soil carbon debt of 12,000 years of human land use. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (36), 9575-9580 (2017).
  3. He, Y., Li, J., Siemann, E., Li, B., Xu, Y., et al. Plant invasion increases soil microbial biomass carbon: meta-analysis and empirical tests. Glob Change Biol. 31 (3), e70109(2025).
  4. de Menezes, A. B., Richardson, A. E., Thrall, P. H. Linking fungal-bacterial co-occurrences to soil ecosystem function. Curr Opin Microbiol. 37, 135-141 (2017).
  5. Wang, D., et al. ddPCR surpasses classical qPCR technology in quantitating bacteria and fungi in the environment. Mol Ecol Resour. 22 (7), 2587-2598 (2022).
  6. Djemiel, C., et al. Biogeographical patterns of the soil fungal:bacterial ratio across France. mSphere. 8 (5), e0036523(2023).
  7. Bailey, V. L., Smith, J. L., Bolton, H. Fungal-to-bacterial ratios in soils investigated for enhanced C sequestration. Soil Biol Biochem. 34 (7), 997-1007 (2002).
  8. Vance, E. D., Brookes, P. C., Jenkinson, D. S. Microbial biomass measurements in forest soils: the use of the chloroform fumigation-incubation method in strongly acid soils. Soil Biol Biochem. 19 (6), 697-702 (1987).
  9. Frostegård, Å, Bååth, E., Tunlio, A. Shifts in the structure of soil microbial communities in limed forests as revealed by phospholipid fatty acid analysis. Soil Biol Biochem. 25 (6), 723-730 (1993).
  10. Cao, Z., Li, D., Han, X. The fungal to bacterial ratio in soil food webs, and its measurement. Acta Ecol Sin. 31 (20), 6050-6058 (2011).
  11. Frossard, A., Hammes, F., Gessner, M. O. Flow cytometric assessment of bacterial abundance in soils, sediments and sludge. Front Microbiol. 7, 903(2016).
  12. Joergensen, R. G., et al. A hitchhiker’s guide: Estimates of microbial biomass and microbial gene abundance in soil. Biol Fertil Soils. 60 (4), 457-470 (2024).
  13. Fierer, N., Wood, S. A., Bueno de Mesquita, C. P. How microbes can, and cannot, be used to assess soil health. Soil Biol Biochem. 153, 108111(2021).
  14. Laine, M. B., Taipale, S. J., Tiirola, M. Comparison of methods for assessing fungi-to-bacteria ratio of soil. Biol Fertil Soils. 61 (5), 941-954 (2025).
  15. De Filippis, F., Laiola, M., Blaiotta, G., Ercolini, D. Different amplicon targets for sequencing-based studies of fungal diversity. Appl Environ Microbiol. 83 (17), e00905-e00917 (2017).
  16. Liu, C. M., et al. FungiQuant: A broad-coverage fungal quantitative real-time PCR assay. BMC Microbiol. 12, 255(2012).
  17. Lofgren, L. A., et al. Genome-based estimates of fungal rDNA copy number variation across phylogenetic scales and ecological lifestyles. Mol Ecol. 28 (4), 721-730 (2019).
  18. Angly, F. E., et al. W. CopyRighter: A rapid tool for improving the accuracy of microbial community profiles through lineage-specific gene copy number correction. Microbiome. 2 (1), 11(2014).
  19. Kembel, S. W., Wu, M., Eisen, J. A., Green, J. L. Incorporating 16S gene copy number information improves estimates of microbial diversity and abundance. PLoS Comput Biol. 8 (10), e1002743(2012).
  20. Pan, P., Gu, Y., Sun, D. L., Wu, Q. L., Zhou, N. Y. Microbial diversity biased estimation caused by intragenomic heterogeneity and interspecific conservation of 16S rRNA genes. Appl Environ Microbiol. 89 (5), e0210822(2023).
  21. Chacón-Vargas, K., Torres, J., Giles-Gómez, M., Escalante, A., Gibbons, J. G. Genomic profiling of bacterial and fungal communities and their predictive functionality during pulque fermentation by whole-genome shotgun sequencing. Sci Rep. 10 (1), 15115(2020).
  22. Bahram, M., et al. Metagenomic assessment of the global diversity and distribution of bacteria and fungi. Environ Microbiol. 23 (1), 316-326 (2021).
  23. Smith, C. J., Osborn, A. M. Advantages and limitations of quantitative PCR (Q-PCR)-based approaches in microbial ecology: Application of Q-PCR in microbial ecology. FEMS Microbiol Ecol. 67 (1), 6-20 (2009).
  24. Hindson, B. J., et al. High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number. Anal Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).
  25. Le Geay, M., Mayers, K., Küttim, M., Lauga, B., Jassey, V. E. J. Development of a digital droplet PCR approach for the quantification of soil micro-organisms involved in atmospheric CO2 fixation. Environ Microbiol. 26 (6), e16666(2024).
  26. Hansen, P. M., Semenova-Nelsen, T. A., Platt, W. J., Sikes, B. A. Recurrent fires do not affect the abundance of soil fungi in a frequently burned pine savanna. Fungal Ecol. 42, 100852(2019).
  27. Ovreås, L., Forney, L., Daae, F. L., Torsvik, V. Distribution of bacterioplankton in meromictic Lake Saelenvannet, as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16S rRNA. Appl Environ Microbiol. 63 (9), 3367-3373 (1997).
  28. Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. Prokaryotes: The unseen majority. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (12), 6578-6583 (1998).
  29. Cheng, J. Y. W., Chan, C. K., Lee, C. T., Lau, A. P. S. Carbon content of common airborne fungal species and fungal contribution to aerosol organic carbon in a subtropical city. Atmos Environ. 43 (17), 2781-2787 (2009).
  30. Wood, D. E., Lu, J., Langmead, B. Improved metagenomic analysis with Kraken 2. Genome Biol. 20 (1), 257(2019).
  31. Rousk, J., Brookes, P. C., Bååth, E. Contrasting soil pH effects on fungal and bacterial growth suggest functional redundancy in carbon mineralization. Appl Environ Microbiol. 75 (6), 1589-1596 (2009).
  32. Xie, Z., Canalda-Baltrons, A., d’Enfert, C., Manichanh, C. Shotgun metagenomics reveals interkingdom association between intestinal bacteria and fungi involving competition for nutrients. Microbiome. 11 (1), 275(2023).
  33. Větrovský, T., Baldrian, P. The variability of the 16S rRNA gene in bacterial genomes and its consequences for bacterial community analyses. PLoS One. 8 (2), e57923(2013).
  34. Doyle, B., et al. Absolute quantification of prokaryotes in the microbiome by 16S rRNA qPCR or ddPCR. Nat Protoc. 20, 3471-3476 (2025).
  35. Frostegård, A., et al. Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from soils. Appl Environ Microbiol. 65 (12), 5409-5420 (1999).
  36. Lee, E., Lim, H. J., Son, A. Discrepancies in qPCR-based gene quantification and their dependencies on soil properties, inhibitor presence, and DNA extraction kit types. RSC Adv. 15 (25), 19656-19664 (2025).
  37. Buell, Z. W., et al. Interrelationships among methods of estimating microbial biomass across multiple soil orders and biomes. Soil Biol Biochem. 208, 109844(2025).
  38. Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nat Microbiol. 2 (3), 16242(2016).
  39. Child, H. T., et al. Automated environmental metagenomics using Oxford nanopore sequencing. BMC Genomics. 26 (1), 835(2025).
  40. Paliaga, S., Laudicina, V. A., Muscarella, S. M., Said-Pullicino, D., Badalucco, L. Comparison of different methods for estimating microbial biomass in biochar-amended soils. Soil Biol Biochem. 203, 109733(2025).
  41. Setia, R., Verma, S. L., Marschner, P. Measuring microbial biomass carbon by direct extraction: comparison with chloroform fumigation-extraction. Eur J Soil Biol. 53, 103-106 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

16S18S

Похожие статьи