Методическая статья

Флуоресцентная кальциевая визуализация в первичных эпителиальных культурах дыхательных путей человека с использованием автоматизированной сегментации клеток

DOI:

10.3791/69470

⸱

22 мая 2026 г.

 ,  , 
1Molecular Medicine, Hospital for Sick Children, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Physiology, University of Toronto

В этой статье

Краткое содержание

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Живоклеточная визуализация кальциевых сигналов широко используется для изучения мобилизации кальция в стабильных клеточных линиях, выращенных в монослойках. Этот протокол описывает флуоресцентную визуализацию кальциевых сигналов живыми клетками с использованием живых клеточных красителей на сложных первичных тканях, а также использует программное обеспечение машинного обучения для количественной оценки флуоресцентной интенсивности тысяч отдельных клеток одновременно, тем самым упрощая анализы.

Аннотация

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Сигнализация кальция имеет решающее значение во множестве биологических процессов, что подчёркивает необходимость разработки методов изучения потока кальция в первичной ткани. Изучение кальциевых сигналов при одноклеточном разрешении в сложных первичных эпителиальных культурах является сложным и поэтому остаётся слабо изученным. В данном исследовании представлены методы, адаптированные для мониторинга живой кальциевой сигнализации в эпителиальных культурах первичных дыхательных путей, а также новые подходы к анализу на основе машинного обучения. Используя первичные эпителиальные культуры дыхательных путей, полученные пациентами, дифференцированные на интерфейсе ALI (воздух-жидкость), загруженные внешним флуоресцентным индикаторным красителем, мобилизация кальция была измерена с одноклеточным разрешением с помощью эпифлуоресцентного микроскопа. Мы разработали новое программное обеспечение, использующее сегментацию клеток на основе машинного обучения для присвоения интенсивности флуоресценции отдельным клеткам со временем. В целом, адаптированная система визуализации и программное обеспечение позволяют быстро и объективно анализировать отдельные клетки в первичных эпителиальных культурах. Пошаговый протокол, представленный здесь, позволит в будущем изучать кальций в отдельных клетках и типах клеток, составляющих основные эпителиальные культуры.

Введение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Изменения внутриклеточной мобилизации кальция определяют широкий спектр клеточных процессов, включая изменения экспрессии генов и модуляцию врождённых иммунныхответов 1,2. Внутриклеточные уровни кальция могут изменяться за счёт высвобождения из внутриклеточных запасов кальция, таких как эндоплазматический ретикулум и митохондрии 1,2,3. Внеклеточный приток кальция в внутриклеточное пространство также может изменять цитозольный кальций как через пассивный, так и активныйтранспорт 2. Живые клетки при мобилизации кальция в основном анализируются с помощью внутриклеточных красителей или генетически закодированных красителей, GCaMP (Green Calcium-activated Multimer/Protein)4. В литературе часто встречаются AM (ацетоксиметил) конъюгированные красители, которые позволяют красителю проникать в плазматическуюмембрану 5,6,7,8. При попадании в клетку AM-часть расщепляется эндогенными внутриклеточными эстеразами, и краситель приобретает отрицательный заряд, который задерживается в цитозольномпространстве 9. Благодаря этому увеличенному заряду краситель может выкачиваться через органические анионные каналы, проживающие в плазматической мембране. Поэтому для предотвращения клеточного выделения красителя и сохранения оптимального цитозольного сигнала добавляется пробеницид, ингибитор органических транспортеров аниона. В исследованиях обычно используют Fura-2 AM, ратиометрический краситель, и Fluo-4AM, интенсивно-интенсивный краситель, для анализа кальциевых сигналов на стабильных клеточных линиях, культивируемых в монослойном виде. В этом исследовании используется протокол, адаптированный для эпифлуоресцентной визуализации многослойных культур, выращиваемых на границе воздух-жидкость, с использованием недавно разработанного интенсивного кальциевого красителя Cal-520 AM, который обладает повышенной чувствительностью по сравнению с Fluo-4 AM. Таким образом, он подходит для надёжного визуализации тонких сигналов с разрешением одной клетки из сложных первичных эпителиальных культур. Современная литература богата живыми кальциевыми визуализациями объёмных ответов стабильных клеточных линий. Однако сейчас общеизвестно, что in vivo ткани образуют разнообразный клеточный ландшафт, поддерживающий различные специфические роли в поддержании гомеостазатканей 12,13,14,15. Несмотря на эти общеизвестные данные, механизмы, с помощью которых различные типы клеток координируют сигналы кальция и регулируют гомеостаз ионов кальция, остаются неизвестными. Таким образом, представленные здесь методы позволят обнаруживать кальциевые сигналы на отдельных клетках и увеличать пропускную способность анализов в первичных дыхательных путях.

Мы используем наши ранее опубликованные и тщательно проверенные первичные модели первичной эпителиальной культуры человеческого носового эпителия как инструмент для изображения живых клеток цитозольного кальция в более биологически значимой модели 16,17,18. Кратко, эпителиальные клетки изолируются из носовых щёток пациента и культивируются на полупроницаемой мембране на трансвелле, который подвешивают в культурной яме для поддержания интерфейса воздух-жидкость (ALI). Этот интерфейс, в сочетании со специализированными средами, был тщательно протестирован с использованием ортогональных методов для наличия различных типовклеток 16, 17, 18. Кроме того, было показано, что современные методы можно применить в первичных бронхиальных культурах, которые культивируются аналогично нашим первичнымносовым культурам 19.

В этой статье представлен адаптированный метод измерения и анализа живой кальциевой сигнализации с одноклеточным разрешением в этих первичных эпителиальных культурах дыхательных путей. Эти многослойные культуры трудно визуализировать с помощью микроскопии; Однако текущая система позволяет нам надежно сосредоточиться на отдельных слоях внутри многослойных культур, что позволяет обнаруживать мобилизацию кальция именно из этих слоёв. У такой системы есть несколько преимуществ: она не требует перфузионной системы, которая часто дорога и трудно адаптировать без использования специализированных микроскопов. Была использована эпифлуоресцентная микроскопия, которая обеспечивает улучшенное временное разрешение по сравнению с конфокальным изображением. Использование светодиодов, излучающих свет (LED) минимизирует фототоксичность по сравнению с лазерными конфокальными системами. В приведённом здесь протоколе используются экстринзические интензиометрические красители, так как они обеспечивают быстрые относительные изменения кальция во всей популяции клеток и совместимы с большинством систем флуоресцентной микроскопии. Это выгодно по сравнению с распространёнными рациометрическими красителями, которые требуют глубокого ультрафиолетового (УФ) возбуждения, недоступного во многих микроскопах. Кроме того, GCaMP требует трансфекции или трансдукции, что усиливает метод более целенаправленной кальциевой визуализации в определённых типах клеток. Из-за низкой эффективности трансдукции и трансфекции в первичных эпителиальных культурах этот метод плохо подходит для мониторинга всей популяции клеток.

Кроме того, в ходе исследования было разработано новое специализированное программное обеспечение на базе машинного обучения, позволяющее сегментировать отдельные клетки на основе живого ядерного окрашивания. Программное обеспечение может записывать значения интенсивности флуоресценции для каждой ячейки со временем. Для оптимизации методов изначально использовалась стабильная линия эпителиальной клетки (Calu-3). Затем эти методы были переведены для изучения мобилизации кальция в первичных эпителиальных культурах. Были оптимизированы такие параметры, как концентрация кальциевого красителя и пробеницида, время этапов инкубации, а также установка визуализации. Здесь кальциевые сигналы записываются с частотой кадров 0,2 кадра в секунду, что подходит для мониторинга кальциевых сигналов. Частоту кадров можно увеличить для более быстрого измерения кальциевых транзиентовна 20. Оптимальные переменные затем применялись и дополнительно оптимизировались в более сложных первичных носовых культурах.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Протокол

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Реагенты и используемое оборудование перечислены в Таблице материалов.

1. Поддержание и культивирование клеток Calu-3

  1. Поддерживать клетки Calu-3 в колбах T-25 в среде EMEM-культуры с добавлением 20% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. Предварительно разогревая материал и меняйте его в чередующиеся дни (5 мл/фляжка).
  2. Когда клетки на 70% слились в колбе, аспирируйте среду внутри колбы.
  3. Промой колбу 5 мл 1x физиологическим раствором с фосфатным буфером (PBS).
  4. Добавьте 1 мл TrypLE непосредственно в клетки на 10-15 минут при 37 °C, 5%CO2. Убедитесь, что все клетки отделились от дна колбы и диссоциированы в одноклеточную суспензию.
  5. Нейтрализуйте реакцию 4 мл свежей культуры (шаг 1.1), затем тщательно перемешайте клетки серологической пипеткой для равномерного посева.
  6. Поместить клетки на пластину с 96 лунками при слиянии 90%-100% (примерно 40 000 клеток на колодцу).
    1. Для засея колодцев добавьте 200 мкл/л/скважину хорошо смешанной клеточной суспензии.
    2. Дайте ячейкам прилипнуть к пластине с 96 лунками в течение ночи.
  7. Меняйте среду каждый день (200 мкл/скважину), пока не будете готовы к экспериментам.
  8. Дайте 2-5 дней после слияния скважин для начала экспериментов перед проведением экспериментов для дифференцировки.

2. Протокол загрузки клеток Calu-3 Cal 520 AM или Fluo-4 AM

ВНИМАНИЕ: Fluo-4 AM и Cal-520 AM растворяются в DMSO, что считается опасным. Пробенецид отмечен как острая опасность. Пожалуйста, надевайте перчатки и лабораторный халат при работе с химикатами, чтобы избежать контакта с кожей. Утилизировать все химикаты в специальные контейнеры для химических отходов.

  1. В день эксперимента извлеките среду из колодцев с помощью пипетирования и промывания ячеек дважды (200 мкл/скважины) в предварительно нагретом кальциевом буфере (140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 1 мМMgCl 2, 2 мМCaCl 2 и 10 мМ Hepes, скорректированное до pH 7,38 (NaOH) 291 мОм), чтобы удалить мёртвые клетки.
  2. Инкубировать клетки с 200 мкл/скважина коктейля 3 мкм Cal-520 AM, 2,5 мМ пробенецида и 1:5000 Hoechst ядерной окрашивания в кальциевом буфере (шаг 2.1) в течение 1 часа в инкубаторе, установленном при 37°C и 5%CO2.
    1. Для экспериментов с Fluo-4 AM инкубировать клетки с 200 мкл/скважина коктейля 3 мкм Fluo-4 AM, 2,5 мМ пробенецида и 1:5000 Hoechst ядерной окрашивания в кальциевом буфере (шаг 2.1) в течение 1 часа при 37 °C и 5%CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Держите тюбики с красителем в темноте, накрывая их алюминиевой фольгой.
  3. Во время инкубации готовьте тапсигаргин в кальциевом буфере (шаг 2.1). Корректируйте концентрацию промежуточных запасов, чтобы обеспечить правильные конечные концентрации внутри скважины.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь к 100 мкл существующего кальциевого буфера добавляют 50 мкл препарата. Поэтому был подготовлен трёхкратный промежуточный запас объёмом 6 мкм.
  4. Через 1 час аспирировать краситель с помощью пипетирования и дважды смывать внеклеточный краситель кальциевым буфером (шаг 2.1) (200 мкл/скважину).
  5. После промывки добавьте 100 мкл/скважину 2,5 мМ пробеницида, разбавленных в кальциевом буфере (шаг 2.1), чтобы сохранить содержание красителя в цитоплазматическом пространстве.
  6. Обмотайте пластину алюминиевой фольгой, чтобы защитить её от света. Клетки теперь готовы к съёмке.

3. Настройка микроскопии для стабильной клеточной линии Calu-3

  1. Используя эпифлуоресцентный микроскоп, оснащённый SuperFluor Objective, стабильным твердотельным источником света и CMOS-флуоресцентной камерой (размер пикселей 6,5 мкм). Интенсивность освещения установлена на уровне 500 мВт.
  2. Разместите пластину из ячеек на сцене с помощью адаптера на 96 лунок. Используя Brightfield, сфокусируйтесь на клеточном слое при низком увеличении, чтобы найти монослой клеток (используйте 5-10x воздушный объектив).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необязательный, но полезен для эффективного первого фокуса на клеточном слое.
  3. После определения ячеточного слоя используйте Brightfield, переходите на более высокое увеличение (объектив воздуха 20x) и снова фокусируйтесь на клеточном слое.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что на монослойном уровне с помощью Brightfield; Границы ячеек должны быть чёткими.
  4. Определите сигнал кальциевого красителя с помощью GFP (светодиод 475 нм). Убедитесь, что мощность светодиода находится в диапазоне 5%-10%, чтобы избежать фотоотбеливания, а время экспозиции подходит для визуализации базового зелёного сигнала без перенасыщения сигнала, обычно от 300 до 500 мс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения воспроизводимости и равномерной нагрузки красителем качественно проанализируйте клеточный слой; Большинство клеток должны демонстрировать одинаковую яркость. Сосредоточьтесь на полях зрения с ограниченным мертвым количеством мертвых клеток, которые будут интенсивно флуоресцентироваться до добавления стимулятора. Относительную базовую интенсивность флуоресценции можно измерить с помощью Фиджи (шаг 7.9). Исходная вариация флуоресценции между клетками должна быть близка к 10%-15%, если краситель нагружен равномерно (шаг 7.9).
  5. Определите ядерную окраску Hoechst с помощью светодиода DAPI (405 нм). Мощность светодиодов должна составлять от 2% до 5% с временем экспозиции от 50 до 100 мс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки в фокусе, ядра должны иметь чёткие контуры. Убедитесь, что ядерный сигнал не достигает насыщения, так как ядра могут мешать зелёному каналу.

4. Получение живого кальциевого видео

  1. Начинайте живое видео с интервалом в 1 кадр каждые 5 секунд (0,2 кадра в секунду) в течение 10 минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Захватывайте каждый люминесцентный канал (DAPI 405 нм и GFP 475 нм) на каждом кадре.
  2. После начала видео дайте 5 минут базового чтения перед добавлением агонистов.
  3. С помощью пипетки P200 добавьте 50 мкл тапсигаргина в 3x промежуточном запасе в колодцу, содержащую 100 мкл 2,5 мМ пробенецида в кальциевом буфере (шаг 2.1). Аккуратно повторно суспензируйте 1-2 раза внутри колодца, чтобы препарат равномерно распределялся. Читайте дальше 5 минут после добавления тапсигаргина.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этап добавления препарата критически важен; Кончик пипетки не должен соприкасаться с пластиной при смещении плоскости фокуса. Вместо этого наконечник пипетки плавут так, чтобы контактировать только с буфером внутри скважины. Если препараты смешивать слишком интенсивно, клетки могут отсоединиться от пластины и помешать сигналу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно обратите внимание на рамку, в которую добавлен препарат для дальнейшего анализа.
  4. Сохраните видео и снимок, сделанный до эксперимента. Переходите к анализу данных.

5. Протокол загрузки первичных дыхательных ячеек Cal 520 AM или Fluo-4 AM

  1. В день эксперимента удалите базолатеральную среду из транс-скважины и дважды промыйте апикальную и базолатеральную стороны вставка, используя 750 мкл базолатерального и 300 мкл апикального кальциевого буфера (шаг 2.1).
  2. Инкубировать клетки с 600 мкл базолатеральной и 200 мкл апикальных красителей Cal-520 AM или Fluo-4 AM в течение 1 часа при 37 °C и 5% CO2. Подготовьте краситель так же, как и для клеток Calu-3: для кальциевых буферов с 3 мкм Cal-520 AM, 2,5 мМ пробенецида и 1:5000 Hoechst в кальциевом буфере (шаг 2.1). Для Fluo-4 AM 3 мкм Fluo-4 AM, 2,5 mM probenecid и 1:5000 Hoechst в том же кальциевом буфере.
  3. Во время инкубационного периода готовьте тапсигаргин в промежуточном запасе 3× для конечной концентрации 2 мкм (6 мкм промежуточного запаса).
  4. После этого аспирируйте краситель и дважды промывайте клетки апикальным буфером 300 мкл и 750 мкл базолатерального буфера с кальцием (шаг 2.1).
  5. После промывки добавьте 100 мкл апикального и 500 мкл базолатерального запаса 2,5 мл пробеницид в кальциевом буфере (шаг 2.1).
  6. Держа коробку передач глубоко внутри пластины, оберните пластину фольгой. Клетки теперь готовы к визуализации.

6. Подготовка микроскопии для первичных носовых вставок

  1. Приобретите чашку Петри с стеклянным дном, подходящую для съёмки, пинцета и тонкую малярную ленту. Убедитесь, что чашка Петри чистая, быстро протирая её 70% этанолом и давая полностью высохнуть.
  2. Поместите чашку Петри с стеклянным дном в небольшой круглый адаптер для эпифлуоресцентного микроскопа.
  3. С помощью пинцета аккуратно поместите вставку в центр стеклянной чаши.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не пролить буфер, который находится в апикальном отсеке вставки.
  4. Чтобы вставка не сдвинулась при добавлении препаратов, используйте малярную ленту, чтобы закрепить верхнюю часть пластика всерьёта на боковые стороны стеклянной чаши.
  5. Разместите адаптер с прикреплённой вставкой на стадию микроскопа и начните с фокусировки на клетках с помощью объектива 10x с ярким полем воздуха.
  6. Определите сигнал кальциевого красителя с помощью GFP (светодиод 475 нм). Убедитесь, что мощность светодиода находится в диапазоне 5%–10%, чтобы избежать фотоотбеливания, и время экспозиции подходит для визуализации базового зелёного сигнала без его перенасыщения, обычно от 300 до 500 мс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, ознакомьтесь с ПРИМЕЧАНИЕМ в разделе 3.4, чтобы убедиться в правильном нагрузке кальциевым красителем.
  7. Определите ядерную окраску Hoechst с помощью светодиода DAPI (405 нм). Мощность светодиодов должна составлять от 2% до 5% с временем экспозиции от 50 до 100 мс.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если клетки в фокусе, ядра должны иметь чёткие, очерченные контуры. Сосредоточьтесь на самом апикальном слое клеток. Отрегулируйте ось z микроскопа, чтобы определить самую высокую фокальную плоскость, где клетки остаются в чётком фокусе. Убедитесь, что ядра не достигают насыщения сигнала, так как ядерный сигнал может мешать зелёному каналу.
  8. Чтобы получить живое видео с кальцием, следуйте шагам 5.1-5.4. Во время этапа добавления препарата добавьте в центр вставки и медленно подвесьте с помощью пипетки P200.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно обратите внимание на рамку, в которую добавлен препарат для дальнейшего анализа.

7. Анализ с использованием программного обеспечения Fiji

  1. Откройте приложение Fiji, выберите File \ Open, загрузите видеофайл, а в всплывающем окне оставьте все настройки по умолчанию.
  2. Если желаете, в разделе Image \ Adjust \ Brightness/Contrast измените яркость и контраст отдельных флуоресцентных каналов, чтобы получить максимально оптимальный обзор ячеек.
  3. Для облегчения трассировки ячеек объедините ядерные окрашивающие или яркие каналы с помощью каналов Image \ Colour \ Merge и выберите соответствующие файлы для каждого отдельного канала в всплывающем окне.
  4. Чтобы отследить конкретные ячейки по границам ячеек и ядерной окрашиванию, используйте Analyze \ Tools \ ROI Manager и ставьте галочку как «Показать все», так и метки в полученном всплывающем окне.
  5. Аккуратно обведите ячейки с помощью инструмента свободного выбора и нажмите t, чтобы добавить ячейку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что ячейки обведены во всех четырёх углах и в центре видео.
  6. Когда все ячейки будут точно отрисованы, внутри открытой вкладки со всеми ROI нажмите на More \ Multimeasure и нажмите OK в полученном всплывающем окне.
  7. Скопируйте весь лист в полученном всплывающем окне под названием «Результаты » в файл Excel.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Полученный лист будет содержать 6 подзаголовков (Area1, Mean1, Min1, Max1, IntDen1, RawIntDen1) для каждого ROI с числовым значением после каждого, соответствующему трассируемой ячейке. Важным значением для нижнего анализа будет среднее значение каждой ROI.
  8. Для мониторинга вариации между интенсивностью флуоресценции рассчитайте среднюю флуоресценцию на исходном уровне для каждой клетки и вычислите процентную дисперсию. Эксперименты обычно имеют дисперсию от 20% до 30%.
    figure-protocol-1
  9. Нормализуйте все показания, деля значения средней интенсивности на первое значение исходной линии для каждой из обведённых ячейок.
  10. Создайте дополнительный столбец для времени в секундах, при этом первый кадр соответствует кадру 0, а последующие временные точки увеличиваются на 5, что соответствует интервалу 0,2 кадра в секунду.
  11. Скопируйте данные в программное обеспечение для анализа и графиков и сгенерируйте кривую изменения флуоресценции по исходной линии со временем.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для создания графиков максимумов с одной ячейкой используйте функцию =MAX() в Excel, чтобы найти кадр, при котором достигается максимальная интенсивность флуоресценции для каждой ячейки, и построить график с помощью GraphPad Prism.

8. Анализ с использованием кальциевого комплекса

  1. Используя Fiji, откройте видеофайл и выполните шаги 8.1 и 8.2.
  2. Когда ядерный и зелёный каналы оптимизированы для просмотра, повторите один кадр видео, нажав на Image \ Duplicate. В полученном всплывающем окне снимите опцию Duplicate Hyper stack. Внутри того же всплывающего окна, в разделе каналов, тип 1. Сохраните его как PNG-файл изображения.
  3. Повторите шаг 9.2 и ниже каналов, тип 2.
    Объедините два изображения, следуя шагу 8.3. Загрузите изображение в графический интерфейс Cell-Pose (графический пользовательский интерфейс), чтобы создать маску ячейки.
  4. Загрузите изображение в графический интерфейс Cell-pose и сегментируйте с помощью ядерной окрашивания (канал 1) и цитоплазматических окрашиваний (канал 2), выбрав модель Cyto3.
  5. Сохраните изображение как PNG-файл, затем откройте PNG-файл на Фиджи и конвертируйте его в TIFF-файл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Графический интерфейс в позе клетки создаёт чёрно-белый PNG-файл.
  6. Откройте как файл маски, так и видеофайл в Calcium Suite, перетаскивая и оттаскивая, затем нажмите на «Анализировать данные » для создания скачиваемого графика, а также загружаемого .csv файла с нормализованными и сырыми значениями интенсивности для всех ячейок, подсчитанных программой.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Результаты

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Для измерения мобилизации кальция в живых клетках инкубируют клетки Calu-3 или дифференцированные первичные носовые культуры с помощью внутриклеточного красителя. Относительное изменение кальциева-зависимого сигнала измеряется как увеличение мобилизации кальция либо из внутриклеточных запасов кальция, либо из внеклеточного пространства в цитозоль. Устойчивое увеличение кальция в цитозол характеризуется увеличением флуоресценции после добавления тапсигаргина, хорошо охарактеризованного не...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Обсуждение

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

В этой статье были представлены методы анализа одноклеточной кальциевой сигнализации в живых первичных носовых и бронхиальных культурах, а также стабильной эпителиальной клеточной линии. Кальциевые репортёры Cal-520 AM и Fluo-4 AM являются полезными индикаторами кальция в обеих установках. Cal-520 AM более чувствительн, так как обладает более высокой квантовой выходностью 0,75 по сравнению с Fluo-4 AM (0,16) и немного вышей аффинностью к кальциям (Kd у Cal-520 AM — 320 нМ, а у Fluo-4 AM ...

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Раскрытие информации

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы не заявляют о конкурирующих интересах.

Благодарности

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Авторы выражают признательность Тарини Гунавардене в культивировании первичной носовой ткани. А также Ву Шу из Университета Айовы за щедрое культивирование и отправку первичных бронхиальных культур. А также Габриэль Лангевелд и Диан Лю за помощь в анализе и проектировании адаптеров для визуализации. Мы также хотели бы поблагодарить Центр визуализации в Больнице для больных детей. Мы также признаём финансирование со стороны Cystic Fibrosis Canada и Фонда муковисцидоза США.

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье
ИмяКомпанияКаталожный номерКомментарии
24-колодцевая пластина Thermofisher 142475
24-колодцевые трансвелловые вставки Corning CLS3470-48EA
96-колодчатые плоские прозрачные микропластины из чёрного полистирола, обработанные TCCorning 3603
Cal-520 AMAAT Bioquest 21130Аликотирован и хранится при -20°; C, растворённый в DMSO
Программное обеспечение Calcium SuiteКод можно запросить, связавшись с нашей лабораторной группой
EMEM, 1xsWisent 320-005-CLХранится при 4°°; C 
Плодовая бычий сыворотка Wisent 080-450Аликотирован и хранится при -20°; C
Fluo-4 AM AAT Bioquest 20550Аликотирован и хранится при -20°; C, растворённый в DMSO
HEPESБиомагазинHEP001.5Хранится при комнатной температуре
Hoechst Thermofisher H3570Хранится при 4°°; C 
Человеческая эпителиальная колоректальная адеонкарцинома клеточная линия  ATCCHTB-55
Хлорид магния  Sigma 7786-30-3Хранится при комнатной температуре
Микротарелка 35 мм, низкое стеклянное дноТам же 80137Хранится при комнатной температуре 
Раствор пенициллина-стрептомицинаWisent 450-200-ELХранится при 4°°; C
Фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS)Wisent 3111-010-CLХранится при комнатной температуре 
хлорид калия Sigma 7447-40-7Хранится при комнатной температуре 
Probenecid ТермофишерP36400Аликотирован и хранится при -20°; C , растворимый в воде  
Хлорид натрия Bioshop SOD004Хранится при комнатной температуре 
Тапсигаргин ТермофишерT7458Аликотирован и хранится при -20°; C Распущена в DMSO 
Фермент TripLE Express (1X), фенол красный и bbsp;Термофишер12605010Хранится при 4°°; C

Ссылки

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802(2020).
  2. Jairaman, A., Prakriya, M. Calcium signaling in airway epithelial cells: Current understanding and implications for inflammatory airway disease. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 44 (4), 772-783 (2024).
  3. Sammels, E., Parys, J. B., Missiaen, L., De Smedt, H., Bultynck, G. Intracellular Ca2+ storage in health and disease: a dynamic equilibrium. Cell Calcium. 47 (4), 297-314 (2010).
  4. Mao, T., O'Connor, D. H., Scheuss, V., Nakai, J., Svoboda, K. Characterization and subcellular targeting of GCaMP-type genetically encoded calcium indicators. PLoS One. 3 (3), e1796(2008).
  5. Ren, C., et al. Melatonin protects RPE cells from necroptosis and NLRP3 activation via promoting SERCA2-related intracellular Ca2+ homeostasis. Phytomedicine. 135, 156088(2024).
  6. Dwivedi, R., et al. The TMEM16A blockers benzbromarone and MONNA cause intracellular Ca2+ release in mouse bronchial smooth muscle cells. Eur J Pharmacol. 947, 175677(2023).
  7. Barreto-Chang, O. L., Dolmetsch, R. E. Calcium imaging of cortical neurons using Fura-2 AM. J Vis Exp. 23, e1067(2009).
  8. Hirst, R. A., Harrison, C., Hirota, K., Lambert, D. G. Measurement of [Ca2+]i in whole cell suspensions using fura-2. Methods Mol Biol. 114, 31-39 (1999).
  9. Tsien, R. Y. A non-disruptive technique for loading calcium buffers and indicators into cells. Nature. 290 (5806), 527-528 (1981).
  10. Di Virgilio, F., Steinberg, T. H., Swanson, J. A., Silverstein, S. C. Fura-2 secretion and sequestration in macrophages. A blocker of organic anion transport reveals that these processes occur via a membrane transport system for organic anions. J Immunol. 140 (3), 915-920 (1988).
  11. Liao, J., et al. A novel Ca2+ indicator for long-term tracking of intracellular calcium flux. BioTechniques. 70 (5), 271-277 (2021).
  12. Kageyama, T., Ito, T., Tanaka, S., Nakajima, H. Physiological and immunological barriers in the lung. Semin Immunopathol. 45 (4), 533-547 (2024).
  13. Quach, H., et al. Early human fetal lung atlas reveals the temporal dynamics of epithelial cell plasticity. Nat Commun. 15 (1), 5898(2024).
  14. Deprez, M., et al. A single-cell atlas of the human healthy airways. Am J Respir Crit Care Med. 202 (12), 1636-1645 (2020).
  15. Prescott, R. A., et al. A comparative study of in vitro air-liquid interface culture models of the human airway epithelium evaluating cellular heterogeneity and gene expression at single cell resolution. Respir Res. 24 (1), 213(2023).
  16. Gunawardena, T. N. A., et al. Correlation of electrophysiological and fluorescence-based measurements of modulator efficacy in nasal epithelial cultures derived from people with cystic fibrosis. Cells. 12 (8), 1174(2023).
  17. Laselva, O., et al. Functional rescue of c.3846G>A (W1282X) in patient-derived nasal cultures achieved by inhibition of nonsense-mediated decay and protein modulators with complementary mechanisms of action. J Cyst Fibros. 19 (5), 717-727 (2020).
  18. Terrance, M., et al. Primary human nasal epithelial cell culture. Methods Mol Biol. 2725, 213-223 (2024).
  19. Karp, P. H., et al. An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures. Methods Mol Biol. 115, 115-137 (2002).
  20. Perniss, A., et al. A succinate/SUCNR1-brush cell defense program in the tracheal epithelium. Sci Adv. 9 (31), eadg8842(2023).
  21. Sehgal, P., et al. Inhibition of the sarco/endoplasmic reticulum (ER) Ca2+-ATPase by thapsigargin analogs induces cell death via ER Ca2+ depletion and the unfolded protein response. J Biol Chem. 292 (48), 19656-19673 (2017).
  22. Cal 520® AM. , AAT Bioquest Inc. https://www.aatbio.com/products/cal-520-am (2025).
  23. Fluo 4® AM. , AAT Bioquest Inc. https://www.aatbio.com/products/fluo-4-am?unit=20552 (2025).
  24. Zaderer, V., Hermann, M., Lass-Flörl, C., Posch, W., Wilflingseder, D. Turning the world upside-down in cellulose for improved culturing and imaging of respiratory challenges within a human 3D model. Cells. 8 (10), 1292(2019).
  25. Becker, M. E., et al. Live imaging of airway epithelium reveals that mucociliary clearance modulates SARS-CoV-2 spread. Nat Commun. 15 (1), 9480(2024).
  26. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на повторное использование текста или иллюстраций этой статьи JoVE

Запросить разрешение

Теги

Похожие статьи